Síntese e caracterização de novos complexos de platina(ii), análogos da picoplatina, como potenciais agentes antitumorais

Transcrição

1 RELATÓRIO ANUAL PIBIC Síntese e caracterização de novos complexos de platina(ii), análogos da picoplatina, como potenciais agentes antitumorais Aluna: Júlia Mano Mello Dias Orientador: Nicolás A. Rey Rio de Janeiro, julho de 2012

2 Departamento de Química Índice 1- Introdução 2- Objetivos 3- Experimental 3.1- Sínteses Síntese do complexo cis-[ptcl2(inh)nh3] (1) Síntese do complexo cis-[ptcl2(pza)nh3] (2) Síntese do complexo cis-[ptcl2(2-nitroanilina)nh3] (3) 3.2- Caracterizações e análises Análise elementar (CHN) Espectroscopia na região de infravermelho (IV) 4- Resultados e discussões 4.1- Reações (1) e (2) 4.2- Reação (3) 5- Conclusões 6- Referências bibliográficas 2

3 Departamento de Química 1- Introdução O câncer é a multiplicação e disseminação desenfreada de células que sofreram modificações genéticas e cresceram além do comum se infiltrando em tecidos e órgãos, podendo rapidamente invadir outras partes do corpo, caracterizando o processo - que é a maior causa de mortes pelo câncer - conhecido como metástase (Figura 1). Figura 1. Imagem microscópica de uma célula de câncer de pulmão (retirado de O surgimento dele vem de uma alteração em genes especiais do DNA que primeiramente estão desativados e quando ativos geram a cancerização das células. O que condiciona seu aparecimento é a intensidade da exposição ao seu agente causador; 80% a 90% dos cânceres estão relacionados a fatores ambientais; no entanto, condições internas ligadas à capacidade do organismo de se defender contra agressores externos também são responsáveis pelo seu desenvolvimento [1]. De acordo com a OMS o câncer se origina de uma única célula e por meio de um processo de vários estágios há a transformação de uma célula normal em cancerígena. As etapas que formam esse procedimento são resultado da interação entre os fatores genéticos do paciente e três categorias de agentes externos carcinogênicos: os físicos (radiação UV e ionizantes), químicos (como os componentes do tabaco, aflatoxina - um tipo de contaminante de comida - e arsênio) e biológicos (infecções de vírus, bactérias e parasitas). Outra 3

4 Departamento de Química condição que contribui para a disseminação do câncer é o envelhecimento. O mesmo órgão afirma que a incidência da doença aumenta com a idade do paciente. Isso se deve a uma combinação de acúmulo de risco com a diminuição da eficiência dos mecanismos de defesa das células. É previsto que a morte por câncer mundialmente continue crescendo e ultrapasse 13,1 milhões em 2030 [2]. Muitos tipos de câncer têm uma alta chance de cura caso sejam detectados cedo e tratados corretamente. Existem dois componentes necessários para uma detecção antecipada: um diagnóstico antecipado e o rastreamento. O primeiro é para que, ao se diagnosticar a doença, ela não se apresente num estágio tardio e o segundo é um exame em indivíduos assintomáticos para a confirmação provável de doença não reconhecida anteriormente. Antes de o indivíduo apresentar sintomas, determinar a doença permitiria realizar o tratamento em fases ainda mais iniciais, diminuindo a morbidade e a mortalidade devidas à doença. Diagnosticada, a enfermidade precisa ser tratada. Para isso existem os métodos de radioterapia e quimioterapia, transplante de medula óssea e também pode ser realizada uma cirurgia para a remoção do tumor. Nos casos mais avançados, os quais possuem pouca probabilidade de cura, é usado um tratamento paliativo para melhorar a qualidade de vida do paciente [2]. Como o presente projeto se propõe a sintetizar compostos químicos conhecidos como complexos de coordenação, o procedimento de interesse é a quimioterapia. Ela se utiliza de substâncias químicas os quimioterápicos - para destruir as células doentes ou controlar sua disseminação e, quando aplicada ao câncer, é chamada quimioterapia antineoplásica ou antiblástica. Dentre os tipos de medicamentos estão os agentes alquilantes, que provocam danos ao DNA alterando ou evitando a duplicação celular. Entre as principais drogas inclusas nessa categoria estão a cisplatina e seu análogo carboplatina [3]. A princípio, não se cogitava aplicar complexos metálicos na quimioterapia por se pensar que eram prejudiciais à saúde, era mais comum se usar compostos orgânicos, porém, a partir da descoberta da atividade citotóxica da cisplatina por Barnett Rosenberg, em 1965, cada vez mais se investe em pesquisas de complexos metálicos com potencial antitumoral [4]. Por meio de um eletrodo de platina, Rosenberg quis estudar o efeito de um campo elétrico no crescimento de bactérias Escherichia coli. Ele notou que, aplicando-se um campo elétrico na câmara, a divisão celular das 4

5 Departamento de Química bactérias era inibida, fazendo com que elas formassem filamentos alongados, processo este conhecido como indução de crescimento filamentoso [5]. A atividade antitumoral da cisplatina é dada pela formação de adutos com as bases nitrogenadas que compõem o DNA (Figura 2). Figura 2. Interação da cisplatina com as bases nitrogenadas do DNA; adenina (a) e guanina (b) (retirado de Existem dois tipos de adutos: monofuncionais (a platina faz apenas uma ligação com o DNA) e bifuncionais. Este último pode acontecer de três formas: intrafita (as duas ligações ocorrem na mesma fita), interfita (cada ligação é feita em fitas diferentes) e intermolecular (uma ligação da platina é feita com o DNA e a outra com um aminoácido ou uma proteína); os dois primeiros casos são mostrados na Figura 3. O aduto encontrado em maior quantidade para a cisplatina é o que corresponde à ligação intrafita, o que sugere ser a formação desse o maior responsável pela sua atividade anticancerígena, já que provoca lesões mais difíceis de reparar. O seu efeito citotóxico é, portanto, causado pela inibição da transcrição e replicação, que são essenciais para a divisão celular, impedindo a duplicação do DNA e levando à apoptose. A síntese de proteínas e RNA também é afetada, mas em menor grau [6]. 5

6 Departamento de Química Figura 3. Ligações intrafita (esquerda) e interfita (direita) da cisplatina com o DNA (retirado de Apesar de possuir importante aplicação antitumoral, a cisplatina apresenta certa resistência celular além de uma série de efeitos colaterais como nefrotoxicidade, neurotoxicidade, ototoxicidade e toxicidade gastrointestinal (náuseas e vômitos). Sendo assim, é necessário que se busquem complexos de coordenação semelhantes a ela, mas que causem menos danos ao organismo do paciente. Com essa finalidade, esse projeto se dispõe a sintetizar complexos de Pt(II) derivados da cisplatina e análogos da picoplatina (Figura 4), uma nova droga de platina que já passou pelas fases I e II de testes clínicos e apresenta a habilidade de atingir linhagens de células tumorais resistentes à terapia convencional [7]. Figura 4. Estrutura da picoplatina. Fabricada pela empresa Poniard, a picoplatina é usada no tratamento experimental de muitas variedades de câncer. A sua utilização, em associação com docetaxel e prednisona, numa coorte de 32 pacientes com câncer de próstata metastático 6

7 Departamento de Química que não respondiam aos tratamentos hormonais levou a um aumento do tempo de sobrevida dos pacientes. Na busca de novos ligantes para a síntese de novos compostos de coordenação de platina(ii), foram escolhidos para este trabalho dois fármacos com interessantes potenciais biológicos e amplamente conhecidos por suas utilizações no tratamento da tuberculose: a pirazinamida e a isoniazida (respectivamente PZA, C5H5ON3 e INH, C6H7ON3 - Figura 5) [8]. Figura 5. Estruturas do PZA e INH respectivamente. A isoniazida (INH), sintetizada primeiramente em 1952, é um derivado sintético do ácido isonicotínico, oxidativamente ativado pela enzima katg e é droga de primeira escolha no tratamento da tuberculose. Como a interação de um antibiótico com metais pode modular a atividade biológica do antibiótico, é interessante unir os dois. Já a pirazinamida, introduzida na clínica a partir de 1970, quando receitada para o tratamento de tuberculose durante dois meses permite a redução no tempo de cura de nove para seis meses [9]. As estruturas de INH e PZA têm diferentes possíveis sítios de coordenação (nitrogênios aromáticos, oxigênio de amida), sendo assim opções válidas de se explorar, já que podem se ligar de diferentes maneiras aos íons metálicos, além de serem compostos já liberados para uso clínico. O outro ligante explorado é a 2-nitroanilina (Figura 6). Apesar dela não ser um fármaco em si e sim um intermediário sintético de pigmentos como o yellow 5 e o orange 2, decidiu-se pela sua inclusão no estudo devido à sua relativa semelhança com a 2-metilpiridina presente na estrutura da picoplatina. 7

8 Departamento de Química Figura 6. Estrutura da 2-nitroanilina. 2- Objetivos Síntese e caracterização de novos complexos potencialmente menos ofensivos ao organismo para o tratamento do câncer, usando a cisplatina como precursor e compostos bioativos (pirazinamida PZA e isoniazida INH) ou um intermediário sintético de certos pigmentos (2-nitroanilina) como ligantes, tendo como base que os mesmos possuem uma similaridade estrutural com a picoplatina. 3- Experimental 3.1- Sínteses Síntese do complexo cis-[ptcl2(inh)nh3] (1) Dissolveu-se 1 mmol (0,137 g) de INH em aproximadamente 5 ml de água deionizada, mantendo-o sob agitação à temperatura ambiente. Em seguida, pesou-se 1 mmol (0,300 g) de cisplatina (estequiometria 1:1), a qual foi adicionada sobre a solução bem lentamente. A mistura permaneceu sob agitação durante 24 h com o balão coberto por papel alumínio evitando-se, assim, a fotorredução da platina. O precipitado formado é filtrado e lavado com água fria, álcool e éter etílico e seco no vácuo Síntese do complexo cis-[ptcl2(pza)nh3] (2) O procedimento utilizado foi exatamente igual ao anterior, obedecendo a relação estequiométrica de 1 mmol (0,123 g) de PZA para 1 mmol (0,300 g) de cisplatina. Departamento de Química 8

9 Síntese do complexo cis-[ptcl2(2-nitroanilina)nh3] (3) Dissolveu-se 0,5 mmol (0,069 g) de 2-nitroanilina em quantidade suficiente de acetonitrila, mantendo-o sob agitação à temperatura ambiente. Em seguida, dissolveu-se ao máximo 0,5 mmol (0,150 g) de cisplatina (estequiometria 1:1) em água deionizada, usando-se um pouco de aquecimento para ajudar na solubilização, e esta solução foi lentamente gotejada sobre a outra observando-se a homogeneização total da mistura. Esta permaneceu sob agitação durante 48 h com o balão coberto por papel alumínio evitando-se, assim, a fotorredução da platina. O precipitado formado é filtrado e lavado com água fria, e seco no vácuo Caracterizações e análises Análise elementar (CHN) A quantificação dos teores de carbono, hidrogênio e nitrogênio foi realizada em um Analisador Elementar (CHNS-O), modelo EA 1110, da CE Instruments. As amostras foram pesadas em balança analítica com precisão de 1,0 x 10-4 g em cápsulas de estanho. Os elementos carbono, hidrogênio e nitrogênio foram analisados simultaneamente, mediante curva de calibração obtida com padrões secos e de alta pureza, com tempo de queima de 600 segundos, sob temperatura de 1000 ºC e fluxo de gás hélio. As análises foram realizadas em duplicata Espectroscopia na região de infravermelho (IV) A espectroscopia no infravermelho se baseia no fato de que as ligações químicas das substâncias possuem freqüências de vibração específicas, as quais correspondem a níveis de energia da molécula. Essas freqüências dependem da forma da superfície de energia potencial da molécula, da geometria molecular, das massas dos átomos e, eventualmente, do acoplamento vibrônico. Os espectros foram obtidos através de um Espectrômetro de Absorção na Região do Infravermelho, modelo 2000 FT-IR, da Perkin Elmer. Os dados foram coletados com intervalos de 0,5 cm -1. Departamento de Química 9

10 Os espectros de infravermelho foram medidos em duas regiões de freqüências diferentes: cm -1 e cm -1. Para a região do infravermelho médio ( cm -1 ), foram feitas pastilhas dos compostos em KBr, e para a região do infravermelho afastado, as pastilhas foram preparadas com polietileno. Essa técnica é usada de forma comparativa, analisando os deslocamentos e surgimento de novas bandas no espectro dos compostos formados, em comparação com as dos compostos de partida. Através dessa comparação, obtêm-se informações sobre a estrutura do complexo formado. 4- Resultados e discussões 4.1- Reações (1) e (2) A primeira síntese com INH gerou precipitado amarelo em uma solução límpida, mas quando enviado para análise, foi observado que os resultados teóricos não ficavam muito próximos dos experimentais. Concluímos que isso sucedeu devido a erros experimentais e a reação foi refeita, porém dessa vez o precipitado resultante foi a própria cisplatina, como confirmado pelo CHN. Já para os resultados da reação com o PZA também foi obtido um precipitado amarelo em solução límpida. Concluiu-se que o precipitado obtido era cisplatina pura, já que o CHN não indicava percentagens significativas de carbono, assim como aconteceu na segunda síntese com INH. Tabela 1. Resultados do CHN para as sínteses (1) e (2) com os resultados teóricos entre parênteses. Complexo esperado %m/m C %m/m H %m/m N 1ª síntese 19,6 (17,2) 2,0 (2,4) 10,2 (13,3) cis-[ptcl2(inh)nh3] 2ª síntese <0,3 (17,2) 1,9 (2,4) 9,7 (13,3) cis-[ptcl2(inh)nh3] cis-[ptcl2(pza)nh3] <0,3 (14,8) 1,9 (1,9) 9,1 (13,8) As sínteses foram repetidas alterando-se o tempo de reação, porém, tendo em vista que os resultados das reações envolvendo o PZA não foram conclusivos, a pesquisa teve mais foco na reação com INH. Para a reação (2), alterou-se o tempo de reação de 24 para 48 h e, depois, para 72 h e todos esses procedimentos resultaram em Departamento de Química 10

11 soluções amareladas límpidas. As soluções foram colocadas no rotavapor para que se eliminasse o excesso de solvente forçando-se, assim, a precipitação. Porém apesar de o solvente ter sido eliminado, a formação de precipitado não foi observada. A adição de éter também foi outro método tentado para se forçar a formação de precipitado. Para detectar se houve a formação do complexo, utilizou-se a espectroscopia IV. Confirmando as observações da análise elementar de CHN, os resultados, mais uma vez, não foram conclusivos. Espectros de infravermelho de PZA, cisplatina e INH, respectivamente. Departamento de Química 11

12 Departamento de Química 12

13 De acordo com os espectros, é possível se assinalar as bandas de maior importância: PZA: cm -1 νassnh cm -1 νsimnh cm -1 ν(c=o) , 1477 e 1438 cm -1 νring [ν(c=c) e ν(c=n)] do anel pirazínico Cisplatina: e 3210 cm -1 vnh , 1542, 1315 e 1300 cm -1 δnh3 INH: cm -1 νnh cm -1 νnh cm -1 ν(c=o) cm -1 δnh , 1556, 1492 e 1412 cm -1 νring [ν(c=c) e ν(c=n)] do anel piridínico Espectros do produto obtido na reação de síntese de cis-[ptcl2(pza)nh3] Departamento de Química 13

14 É possível concluir, através da comparação desses dois espectros com o de PZA, que ambas as sínteses resultaram em cisplatina pura. Apesar de poder se observar a presença de algumas bandas do PZA no segundo espectro, elas estão em intensidades muito baixas, o que nos leva a concluir que o primeiro espectro é da cisplatina pura, enquanto o segundo é principalmente de cisplatina, com algumas impurezas orgânicas (possivelmente vindas de quantidades residuais de PZA). Departamento de Química 14

15 Espectro do produto obtido na reação de síntese de cis-[ptcl2(inh)nh3] A reação com o INH também não obteve os resultados esperados. Não é possível ver as bandas de importância majoritárias da isoniazida e as poucas que podem ser associadas estão em baixa intensidade. Concluímos que não houve reação entre os reagentes nas condições experimentais utilizadas Reação (3) Depois de 48 h de reação, a solução apresentava coloração laranja límpida. Após 2 h a uma temperatura de 80 ºC no rotavapor, a mesma foi deixada para esfriar. O precipitado formado foi filtrado a vácuo e lavado com o solvente (acetonitrila) gelado. O produto se mostrou solúvel no solvente, desaparecendo quase que por completo (3.1). Quando colocado na geladeira durante 1 h houve nova precipitação e, dessa vez, a lavagem foi realizada somente com água gelada (3.2). Tabela 2. Resultados de CHN para a síntese (3) com os resultados teóricos entre parênteses. Complexo esperado %m/m C %m/m H %m/m N (3.1) cis-[ptcl2(2- nitroanilina)nh3] (3.2) cis-[ptcl2(2- nitroanilina)nh3] 46,3 (16,9) 11,2 (3,3) 25,9 (9,9) 52,6 (16,9) 5,4 (3,3) 21,9 (9,9) 15

16 Departamento de Química Espectro correspondente ao reagente 2-nitroanilina Espectro correspondente ao precipitado inicial (3.1) Departamento de Química 16

17 Espectro correspondente ao precipitado final (3.2) O espectro correspondente ao precipitado final (3.2) é praticamente igual àquele do reagente 2-nitroanilina, o que sugere que não houve reação. Já o precipitado inicial (3.1) apresenta alguns deslocamentos de bandas, o que poderia indicar uma interação platina-(2-nitroanilina). Entretanto, nesse espectro, não são observadas muitas bandas características do grupamento NH 3 da cisplatina, o que significa que o composto obtido deve apresentar uma estrutura diferente daquela proposta inicialmente. Isto está em concordância com a discrepância entre os dados experimentais e calculados observada na análise elementar de CHN. 1- Conclusões A platina, por ser relativamente inerte, leva um longo tempo para reagir, o que torna o procedimento mais complicado, apesar da manipulação não ser muito complexa. A principal conclusão que podemos tirar dos dados obtidos é que as rotas sintéticas propostas no plano original precisam ser redefinidas. Fatores como tempo de reação, o solvente no qual a mesma é efetuada e a temperatura do meio são fatores importantes. As análises realizadas mostram que, nos casos de PZA e INH, não foi possível se obter o complexo de platina esperado partindo-se da cisplatina. Contudo, trabalhos anteriores do nosso grupo de pesquisa mostraram ser possível a obtenção de compostos de platina desses ligantes usando-se, como sal de partida, o tetracloroplatinato(ii) de potássio [10]. 17

18 Já no caso do ligante 2-nitroanilina, os resultados obtidos foram mais promissores, pois deslocamentos de bandas no espectro do nosso produto indicam uma interação metalligante que deve ser mais bem estudada. As porcentagens obtidas pelo CHN, entretanto, mostram que o complexo obtido não segue a formulação proposta originalmente. Outras análises estão sendo realizadas para poder se efetuar uma proposição estrutural melhor fundamentada para o composto de coordenação sintetizado. Com base na boa atividade da picoplatina, espera-se que os novos complexos, uma vez padronizada a sua síntese, mostrem resultados semelhantes aos dela: elevada atividade e poucos efeitos colaterais. Pretende-se ainda realizar uma série de estudos biológicos em células tumorais humanas da cepa K562 (leucemia mielóide crônica), em colaboração com o grupo da Profa. Dra. Elene Cristina Pereira-Maia, do Departamento de Química da UFMG. 18

19 6- Referências Bibliográficas [1] (último acesso julho 2012) [2] (último acesso julho 2012) [3] Controle do câncer: uma proposta de integração ensino-serviço. 2 ed. rev. atual. Rio de Janeiro: Pro-Onco [4] quimicanova.sbq.org.br/qn/qnol/1997/vol20n4/v20_n4_09.pdf - Ana Paula Soares Fontes, Sérgio Gama de Almeida, Letícia de Andrade Nader. Compostos de Platina em Quimioterapia do Câncer. Artigo de Revisão. Química Nova, 20 (4) (1997). [5] B. Rosenberg, L. VanCamp, T. Krigas. Nature. 205, 698 (1965). [6] Nature Reviews Cancer. Lloyd Kelland, Volume 7 (2007) [7] Zhang, J. et al. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 2009, 9, [8] Frieden, T. R. e Driver, C. R. Tuberculosis 83(1-3), (2003). [9] Graef, L. E. Desenvolvimento e Validação de um Método Analítico Quantitativo por Eletroforese Capilar para Tuberculostáticos de Primeira Escolha. Universidade Federal do Paraná. [10] Relatórios de IC dos discentes Lucas Sartori Vieira e Bruna Oquim Pires. 19