ASSOCIAÇÃO ENTRE OS POLIMORFISMOS NOS GENES

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1 Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Nutrição Josué de Castro Programa de Pós-Graduação em Nutrição ASSOCIAÇÃO ENTRE OS POLIMORFISMOS NOS GENES RELACIONADOS À OBESIDADE E ÀS MUDANÇAS DE PESO CORPORAL E CONSUMO ALIMENTAR DE GESTANTES MAISA CRUZ MARTINS RIO DE JANEIRO 2017

2 Associação entre os polimorfismos nos genes relacionados à obesidade e às mudanças de peso corporal e consumo alimentar de gestantes MAISA CRUZ MARTINS Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição (PPGN), do Instituto de Nutrição Josué de Castro da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Nutricionais. Orientador: Prof. Dr. Gilberto Kac RIO DE JANEIRO Julho/2017

3 ASSOCIAÇÃO ENTRE OS POLIMORFISMOS NOS GENES RELACIONADOS À OBESIDADE E ÀS MUDANÇAS DE PESO CORPORAL E CONSUMO ALIMENTAR DE GESTANTES Maisa Cruz Martins Tese submetida à banca examinadora e ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição do Instituto de Nutrição Josué de Castro da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Doutor em Ciências Nutricionais. Examinada por: Prof. Dra. Elisa Maria de Aquino Lacerda Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Nutrição Josué de Castro Revisora Prof. Dra. Gloria Valéria da Veiga Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Nutrição Josué de Castro Prof. Dra. Denise Pires de Carvalho Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho Prof. Dr. Claudio José Struchiner Fundação Oswaldo Cruz Escola Nacional de Saúde Pública Prof. Dra. Vivian Wahrlich Universidade Federal Fluminense Faculdade de Nutrição Emília de Jesus Ferreiro RIO DE JANEIRO, RJ - BRASIL Julho de 2017 Prof. Dr. Gilberto Kac Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Nutrição Josué de Castro Orientador

4 Martins, Maisa Cruz Associação entre os polimorfismos nos genes relacionados à obesidade e às mudanças de peso corporal e consumo alimentar de gestantes/maisa Cruz Martins Rio de Janeiro: UFRJ/INJC, XXVI, 156 p.: il.; 29,7 cm. Orientador: Gilberto Kac Tese UFRJ/INJC/Programa de Pós-graduação em Nutrição, Referências Bibliográficas: p Gestantes. 2. Polimorfismos de nucleotídeo único. 3. Peso pré-gestacional. 4. Ganho de peso gestacional. 5. Retenção de peso pós-parto. 6. Consumo alimentar. 7. Estudo de coorte. I. Martins, Maisa Cruz. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, INJC, Programa de Pós-graduação em Nutrição. III. Título. iv

5 Dedicatória A todos que, mesmo sem saber a importância dos gestos e palavras, contribuíram para a conclusão deste trabalho e da realização deste sonho. v

6 Agradecimentos Primeiramente gostaria de agradecer a Deus por ter me permitido evoluir constantemente. Sou grata por Sua constante presença em minha vida, que me alenta e sustenta nos momentos alegres e difíceis, auxiliando para que me transforme em alguém melhor. Apesar do processo solitário a que qualquer investigador está destinado ao escrever uma tese, este trabalho é o resultado de significativas contribuições que recolhi durante minha trajetória profissional em diversas instituições, convivendo com pessoas dedicadas ao ensino e a aprendizagem. Assim, agradeço especialmente às professoras Leonor Maria Pacheco Santos e Ana Marlúcia Oliveira Assis, que incentivaram e contribuíram para minha formação profissional. A caminhada para chegar até este momento foi repleta de desafios e conquistas. Agradeço ao meu orientador, Gilberto Kac, a disponibilidade manifestada para orientar este trabalho e a confiança no meu potencial, impondo desafios com determinação. Obrigada pelos ensinamentos, pela dedicação e por tornar o tempo de trabalho uma ótima convivência. À Janet Trujillo, agradeço a iniciação no campo da genética e as valiosas contribuições durante a elaboração dos artigos que fazem parte deste trabalho. Ao meu pai João, in memoriam, agradeço os ensinamentos e o incentivo aos estudos. À minha mãe Damiana, por sua simplicidade e por entender minha busca pelo crescimento pessoal e profissional. Aos meus irmãos Rosa, Beto e Sérgio e sobrinhos, agradeço o orgulho e carinho que sentem de mim, mesmo a distância. Agradeço à minha grande amiga e família de coração, Janaina Castrioto, o permanente estímulo que, por vezes, se tornou decisivo em determinados momentos da elaboração desta tese. Sou grata às minhas amigas e colegas de trabalho Vanessa Chaia e Marcelly Lopes pela compreensão e apoio nos momentos em que precisei me afastar das atividades do LANUTRI para concluir esta tese. Agradeço aos amigos que acompanharam minha trajetória, tanto de perto quanto de longe, entendendo muitas vezes a minha ausência. Um agradecimento especial às minhas vi

7 amigas nutricionistas Heloisa Gomes, Simone Pinho, Sônia Borba, Audrey Cintra, Thaís Ferreira e Isabela da Matta, pela nossa amizade e convívio saudável. Aos membros da equipe do Observatório de Epidemiologia Nutricional, que sempre estiveram disponíveis para auxiliar nos momentos que precisei, especialmente às minhas colegas de doutorado Dayana Farias e Jaqueline Lepsch. Muito obrigada a todos! Sou grata à professora Elisa Maria de Aquino Lacerda pela disponibilidade e atenção para revisar esse documento, as quais foram importantes para o aprimoramento deste trabalho. Agradeço aos membros da banca, por terem aceitado o convite e pelo tempo dedicado na leitura crítica do presente trabalho. Aos professores e funcionários do Programa de Pós-graduação em Nutrição do Instituto de Nutrição Josué de Castro, sou grata pela atenção e dedicação em nos atender. Às gestantes que participaram do estudo, sem as quais não seria possível realizar esse trabalho. Enfim, o meu profundo e sentido agradecimento a todas as pessoas que contribuíram para a concretização desta tese, estimulando-me intelectual e emocionalmente. Rio de Janeiro, julho de Maisa Cruz Martins vii

8 RESUMO Introdução: Acompanhando o cenário da epidemia global da obesidade, grande parcela das mulheres está iniciando a gestação com peso acima do recomendado, ganhando peso excessivamente ao longo da gestação e retendo percentual elevado do peso acumulado nesse período. Entre os diversos fatores que contribuem para o excesso de massa corporal, as diferenças genéticas desempenham importante papel no processo de expressividade do fenótipo da obesidade, provavelmente por meio de mecanismos de controle da saciedade/apetite e preferências alimentares. Objetivo: Estudar a associação entre os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) nos genes relacionados à obesidade (FTO - massa de gordura e obesidade associadas, rs ; MC4R - melanocortina-4 receptor, rs ; LEP leptina, rs e LEPR - receptor da leptina, rs ) e mudanças de peso corporal e consumo alimentar de gestantes. Método: Coorte prospectiva de gestantes acompanhadas em um Centro Municipal de Saúde, localizado no bairro da Tijuca no município do Rio de Janeiro, nos seguintes períodos: 5-13, e semanas gestacionais e dias pós-parto. Foram realizadas medidas antropométricas (massa corporal e estatura) e dosagens das concentrações plasmáticas de leptina. Foram obtidos dados de consumo alimentar por meio de um questionário de frequência alimentar (QFA), referentes aos períodos pré-gestacional e gestacional. Os SNPs foram analisados por reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR). As associações entre os polimorfismos dos genes e as variáveis dependentes (peso pré-gestacional, ganho de peso gestacional, retenção de peso pós-parto, concentração plasmática de leptina e consumo alimentar) foram investigadas por meio de modelos regressão longitudinal linear de efeitos mistos, regressão linear múltipla e modelos de regressão de Poisson, ajustados por fatores obstétricos, socioeconômicos, demográfico e ingestão energética total. Resultados: O SNP do gene do FTO-rs (alelo-a) foi significativamente associado ao excesso de peso prégestacional e à percentagem mais elevada de energia derivada dos carboidratos no período pré-gestacional. Este SNP também foi associado à percentagem mais elevada de energia total e à percentagem mais elevada de energia dos alimentos ultraprocessados durante a gestação. O SNP do gene MC4R-rs (alelo-c) foi positivamente associado à percentagem mais elevada de energia derivada de alimentos ultraprocessados ao longo da gestação. Os SNPs nos genes LEP-rs e LEPR-rs não foram estatisticamente associados às viii

9 concentrações plasmáticas de leptina ao longo da gestação e aos componentes do consumo alimentar, contudo, o gene LEP-rs foi significativamente associado ao maior risco de ganho de peso gestacional excessivo. Conclusão: Os SNPs em genes relacionados à obesidade estão associados as mudanças do peso corporal e do consumo alimentar de gestantes. Palavras-chave: Gestantes; Polimorfismos de nucleotídeo único; Peso pré-gestacional; Ganho de peso gestacional; Retenção de peso pós-parto; Consumo alimentar; Estudo de coorte. ix

10 ABSTRACT Introduction: A large proportion of women are initiating gestation above the recommended weight, gaining excessive weight during pregnancy and retaining a high percentage of the gestational weight gain as a result of the global epidemic of obesity. Among the many factors contributing to overweight, genetic differences play an important role in the process of expressiveness of the obesity phenotype, probably through control mechanisms of satiety/appetite and food preferences. Objective: To study the association between single nucleotide polymorphisms (SNPs) in obesity-related genes (FTO - fat mass and obesity, rs ; MC4R - melanocortin 4 receptor, rs ; LEP leptin, rs e LEPR - leptin receptor, rs ) and changes in body weight and dietary intake during gestation. Method: Prospective cohort of pregnant women attending a Municipal Health Center, located in the district of Tijuca in the city of Rio de Janeiro, in the following periods: 5-13, and gestational weeks and days postpartum. Anthropometric measurements (weight and height) and plasma concentration of leptin were performed. Food intake data were obtained through a food frequency questionnaire (FFQ), referring to the pre-gestational and gestational periods. SNPs were analyzed by real-time polymerase chain reaction (PCR). The associations between the gene polymorphisms and the dependent variables (pre-gestational weight, gestational weight gain, postpartum weight retention, plasma leptin concentration and dietary intake) were investigated by longitudinal mixed effects regression models, multiple linear regression and Poisson regression models, adjusted for obstetric, socioeconomic, demographic factors and energy intake. Results: The FTO-rs (A-allele) gene SNP was significantly associated with pre-pregnancy overweight and with the highest percentage of energy from carbohydrates in pre-pregnancy. This SNP was also associated with the highest percentage of total energy and with the highest percentage of energy from ultraprocessed foods during pregnancy. The SNP of the MC4R-rs gene (C-allele) was positively associated with the highest percentage of energy derived from ultraprocessed foods throughout pregnancy. SNPs in the genes LEP-rs and LEPR-rs were not statistically associated with plasma concentrations of leptin throughout pregnancy and with food consumption components, however, the LEP-rs gene was significantly associated with the increased risk of excessive gestational weight gain. Conclusion: SNPs in x

11 genes related to obesity are associated with changes in body weight and dietary intake of pregnant women. Keywords: Pregnant women; Single nucleotide polymorphisms; Pre-gestational weight; Gestational weight gain; Postpartum weight retention; Food consumption; Cohort study. xi

12 SUMÁRIO APRESENTAÇÃO INTRODUÇÃO REFERENCIAL TEÓRICO Epidemiologia do excesso de peso Avaliação da composição corporal Avaliação da composição corporal na população geral Avaliação da composição corporal em gestantes Principais fatores condicionantes da obesidade Informações básicas sobre genética humana Estrutura do material genético humano Variação genética Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) SNPs em genes candidatos à obesidade FTO (gene de massa de gordura e obesidade associadas) MC4R (gene receptor da melanocortina-4) LEP e LEPR (genes da leptina e do seu receptor) Determinantes do ganho de peso materno IMC pré-gestacional Ganho de peso gestacional Retenção de peso pós-parto Leptina Consumo alimentar JUSTIFICATIVA HIPÓTESES xii

13 5 OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos MÉTODOS Delineamento do estudo Aspectos éticos Critérios de elegibilidade Critérios de exclusão Captação das participantes do estudo Capacitação da equipe e controle de qualidade dos dados Procedimentos para coleta dos dados Logística da coleta de dados Variáveis do estudo Informações demográficas, socioeconômicas obstétricas e de estilo de vida Medidas antropométricas Consumo alimentar Dados bioquímicos e genéticos Concentração plasmática de leptina Polimorfismos genéticos (FTO, MC4R, LEP e LEPR) Análises estatísticas Análise descritiva Análise gráfica Análise de regressão linear múltipla Análise de regressão de Poisson Análise de regressão longitudinal de efeitos mistos xiii

14 7 RESULTADOS Artigo 1. Association of the FTO (rs ) and MC4R (rs ) gene polymorphisms with maternal body weight during pregnancy Associação dos polimorfismos dos genes FTO (rs ) e MC4R (rs ) com o peso corporal materno durante a gestação Artigo 2. Leptin (rs ) and leptin receptor (rs ) gene polymorphisms and body weight changes and leptin concentrations throughout pregnancy Polimorfismos nos genes da leptina (rs ) e do receptor da leptina (rs ) e mudanças do peso corporal e das concentrações de leptina ao longo da gestação Artigo 3. Associations between obesity candidate gene polymorphisms (FTO, MC4R, LEP and LEPR) and dietary intake in pregnant women Associações entre polimorfismos nos genes candidatos à obesidade (FTO, MC4R, LEP e LEPR) e ingestão dietética em mulheres gestantes CONCLUSÕES CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS DA TESE DE DOUTORADO APÊNDICES ANEXOS xiv

15 LISTA DE QUADROS Quadro 1. Panorama dos estudos populacionais brasileiros sobre prevalências do excesso de peso e obesidade em indivíduos adultos Quadro 2. Panorama dos estudos populacionais brasileiros sobre prevalências do excesso de peso e obesidade em indivíduos adultos, de acordo com o sexo Quadro 3. Recomendações e classificação do ganho de peso gestacional, de acordo com IMC materno pré-gestacional Quadro 4. Classificação das variáveis do estudo, de acordo com os artigos da tese Quadro 5. Produtos alimentares que representaram o grupo de alimentos ultraprocessados Quadro 6A. Quadro demonstrativo das técnicas de análise estatística do artigo Quadro 6B. Quadro demonstrativo das técnicas de análise estatística do artigo Quadro 6C. Quadro demonstrativo das técnicas de análise estatística do artigo xv

16 LISTA DE TABELAS ARTIGO 1 Table 1. Maternal characteristics according to the FTO (rs ) and the MC4R (rs ) gene polymorphisms Tabela 1. Características maternas de acordo com o polimorfismo nos genes FTO (rs ) e MC4R (rs ) Table 2. Associations of adiposity risk alleles (FTO and MC4R) with body weight changes before, during pregnancy and early postpartum Tabela 2. Associações dos alelos de risco de adiposidade (FTO e MC4R) com as mudanças de peso corporal antes e durante a gestação e no pós-parto Table 3. Longitudinal analysis between FTO (rs ), MC4R (rs ) and trajectory of body weight during pregnancy Tabela 3. Análise longitudinal entre FTO (rs ), MC4R (rs ) e a trajetória do peso corporal durante a gestação Supplementary Table 1. Descriptive characteristics of the study population, by participation or non-participation in the genetic study Tabela suplementar 1. Características descritivas da população estudada, por participação ou não participação no estudo genético Supplementary Table 2. Associations of combined effect of FTO (rs ) and MC4R (rs ) with body weight changes before, during pregnancy and immediate postpartum Tabela suplementar 2. Associações de efeito combinado do FTO (rs ) e MC4R (rs ) com mudanças de peso corporal antes e durante a gestação e no pós-parto xvi

17 ARTIGO 2 Table 1. Maternal characteristic of the study population stratifying for prepregnancy BMI categories Tabela 1. Características maternas da população estudada estratificando por categorias de IMC pré-gestacional Table 2. Genotype and allele frequencies of the LEP-rs and of the LEPRrs polymorphisms of the study population stratifying for pre-pregnancy BMI categories Tabela 2. Frequências dos genótipo e dos alelos dos polimorfismos LEP-rs e LEPR-rs da população estudada estratificando por categorias de IMC prégestacional Table 3. Distribution of the pre-pregnancy body weight and BMI, total GWG and plasma leptin concentrations according to genotypes of the LEP-rs and of the LEPR-rs genes Tabela 3. Distribuição do peso corporal e do IMC pré-gestacional, GPG total e concentrações plasmáticas de leptina de acordo com os genótipos dos genes LEPrs e LEPR-rs Table 4. Associations of the LEP-rs and LEPR-rs polymorphisms with pre-pregnancy BMI, GWG and leptin concentrations Tabela 4. Associações dos polimorfismos LEP-rs e LEPR-rs com IMC pré-gestacional, GPG e concentrações de leptina Table 5. Longitudinal analysis between LEP-rs and LEPR-rs gene polymorphisms and maternal body weight and leptin concentration throughout pregnancy Tabela 5. Análise longitudinal entre os polimorfismos dos genes LEP-rs e LEPR-rs e o peso corporal materno e a concentração de leptina ao longo da gestação xvii

18 ARTIGO 3 Table 1. Maternal descriptive characteristics and dietary intake of the study sample Tabela 1. Características descritivas maternas e a ingestão dietética da amostra do estudo Table 2. Distribution of daily dietary intake before and during pregnancy and variation according to genotypes of the FTO-rs , MC4R-rs , LEPrs and LEPR-rs genes polymorphisms, considering the dominant genetic model for all genes Tabela 2. Distribuição da ingestão dietética diária antes e durante a gestação e a variação de acordo com os genótipos dos genes FTO-rs , MC4R-rs , LEP-rs e LEPR-rs , considerando o modelo genético dominante para todos os genes Table 3. Linear regression models between FTO-rs , MC4R-rs , LEP-rs and LEPR-rs gene polymorphisms and daily dietary intake before and during pregnancy, considering the dominant genetic model for all genes Tabela 3. Modelos de regressão linear entre os polimorfismos dos genes LEPrs , MC4R-rs , LEP-rs e LEPR-rs e a ingestão dietética diária durante os períodos pré-gestacional e gestacional, considerando o modelo genético dominante para todos os genes Table 4. Longitudinal analysis between FTO, MC4R, LEP and LEPR gene polymorphisms and daily dietary intake, according to genotypes Tabela 4. Análise longitudinal entre os polimorfismos dos genes FTO, MC4R, LEP e LEPR e o consumo dietético diário, de acordo com os genótipos Supplementary Table 1. Genotype distribution and allele frequencies of the FTOrs , MC4R-rs , LEP-rs and LEPR-rs gene polymorphisms Tabela suplementar 1. Distribuição dos genótipos e da frequência alélica dos polimorfismos dos genes FTO-rs , MC4R-rs , LEP-rs e LEPR-rs xviii

19 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estrutura simplificada dos elementos do material genético humano Figura 2. Polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) Figura 3. Localização cromossômica do gene FTO Figura 4. Localização cromossômica do gene MC4R Figura 5. Localização cromossômica do gene LEP Figura 6. Localização cromossômica do gene LEPR Figura 7. Coleta de dados em cada ponto de acompanhamento do estudo Figura 8. Fluxograma do tamanho amostral dos artigos apresentados na tese ARTIGO 1 Figure 1. Flowchart illustrating the recruitment and selection of the study population Figura 1. Fluxograma do recrutamento e da seleção da população estudada Supplementary Figure 1. Trajectory of body weight during pregnancy by FTO (rs ) polymorphism Figura suplementar 1. Trajetória do peso corporal durante a gestação de acordo com o polimorfismo FTO (rs ) ARTIGO 2 Figure 1. Flowchart illustrating the recruitment and selection of the study population Figura 1. Fluxograma do recrutamento e da seleção da amostra estudada ARTIGO 3 Figure 1. Flowchart illustrating the recruitment and selection of the study sample Figura 1. Fluxograma do recrutamento e da seleção da amostra do estudo xix

20 LISTA DE APÊNDICES Apêndice A. Do-files das análises estatísticas do artigo Apêndice B. Do-files das análises estatísticas do artigo Apêndice C. Do-files das análises estatísticas do artigo xx

21 LISTA DE ANEXOS Anexo 1. Aprovação do Comitê de Ética Anexo 2. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Anexo 3. Protocolo de extração do DNA Anexo 4. Publicação do Artigo 1 no periódico Nutrition xxi

22 LISTA DE ANEXOS ONLINE Anexo online 1. Questionário de Frequência Alimentar (QFA) do primeiro trimestre gestacional Anexo online 2. Questionário Geral-1do primeiro trimestre gestacional Anexo online 3. Questionário Geral-2 do segundo trimestre gestacional Anexo online 4. Questionário Geral-3 do terceiro trimestre gestacional Anexo online 5. Questionário de Frequência Alimentar (QFA) do terceiro trimestre gestacional Anexo online 6. Questionário Geral-4 do pós-parto xxii

23 LISTA DE ABREVIATURAS ABNT ADP/BodPod AIC ANOVA BIA BIC BMI CEP CFM CHO CI CMS CNPq CNS CONEP DAFEE DC DCNT DEXA DUM ELISA FAPERJ FAO FFQ FTO GHO GPG GW GWG HB IBGE Associação Brasileira de Normas Técnicas Pletismografia por deslocamento do ar Akaike Information Criterion Análise de variância Bioimpedância elétrica Bayesian Information Criterion Body Mass Index Comitê de Ética em Pesquisa Conselho Federal de Medicina Carboidratos Confidence Intervals Centro Municipal de Saúde Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Conselho Nacional de Saúde Comissão Nacional de Ética em Pesquisa Laboratório de Desenvolvimento de Alimentos para Fins Especiais e Educacionais Dobras Cutâneas Doenças Crônicas não Transmissíveis Densitometria com emissão de raio X de dupla energia Data da Última Menstruação Enzyme-linked Immunosorbent Assay Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Organização para a Alimentação e Agricultura das Nações Unidas Food Frequency Questionnaire Massa de gordura e obesidade associadas - Fat mass and obesity associated Global Health Observatory Ganho de Peso Gestacional Gestational Weeks Gestational Weight Gain Heitor Beltrão Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística xxiii

24 IC 95% Intervalo de Confiança de 95% IMC Índice de Massa Corporal INJC Instituto de Nutrição Josué de Castro IOM Institute of Medicine IPUB Instituto de Psiquiatria da Universidade Federal do Rio de Janeiro IQR Inter Quartile Range LEP Leptina LEPR Receptor da Leptina LIP Lipídeos LME Longitudinal Mixed Effects LTPA Leisure-Time Physical Activity MC4R Receptor da Melanocortina-4 - Melanocortin-4 receptor NCBI National Center for Biotechnology NCDs Non-Communicable Chronic Diseases OMS Organização Mundial da Saúde PAFL Prática de Atividade Física de Lazer PC Perímetro da Cintura PET Tomografia por Emissão de Pósitrons POF Pesquisa de Orçamentos Familiares PRT Proteínas QFA Questionário de Frequência Alimentar RM Ressonância Magnética RR Relative Risks SD Standard Deviations SG Semanas de Gestação SMS Secretaria Municipal de Saúde STATA Stata Data Analysis and Statistical Software TACO Tabela Brasileira de Composição de Alimentos TC Tomografia Computadorizada TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido UERJ Universidade do Estado do Rio de Janeiro UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro USDA United States Department of Agriculture xxiv

25 DENOMINAÇÕES E CONCEITOS BÁSICOS DE GENÉTICA Alelo Cromossomo DNA Expressividade Fenótipo Gene Gene dominante Gene recessivo Genoma GWAS Genotipagem Qualquer uma das formas alternativas de um gene especifico que esta localizado no mesmo locus em um cromossomo homólogo, sendo responsáveis por variações em uma característica geneticamente hereditária. Estrutura constituída por DNA. É a forma de armazenamento do DNA. Corresponde ao material hereditário (ácido desoxirribonucleico) que contém dentro de sua estrutura a informação genética necessária para especificar todos os aspectos da embriogênese, desenvolvimento, crescimento, metabolismo e reprodução. Corresponde ao grau em que um genótipo particular é expresso no fenótipo. São as características observáveis de um indivíduo, por exemplo cor dos olhos ou presença de uma doença particular. Corresponde a uma região de DNA cromossômico ou unidade de informação genética que contém instruções específicas para a síntese de proteínas. São genes que se manifestam tanto em homozigose, quanto em heterozigose. São genes que só se manifestam quando estão em homozigose. Conjunto completo do DNA de um organismo, incluindo todos os seus genes. Estudos de associação ampla do genoma nos quais SNPs são testados em amostras individuais de DNA para observar suas associações com doenças. Processo de determinação do genótipo ou conteúdo genômico utilizando o DNA, mediante procedimento de laboratório. xxv

26 Genótipo Herança simples ou mendeliana Herança monogênica Hereditariedade Heterozigoto Homozigoto Lócus Penetrância Seleção natural SNP Variação genética Constituição genética do indivíduo. Corresponde à passagem de genes de uma geração para outra. Refere-se ao tipo de herança em que uma característica é determinada pela expressão de um único gene ou alelo, não por vários genes como na herança poligênica. Transmissão de características dos pais para seus filhos por meio do material genético Significa que os alelos presentes em um lócus genético são diferentes. Exemplo: Aa. Significa que os alelos presentes em um lócus genético são idênticos. Exemplo: AA ou aa. Posição (local) ocupado pelo gene no cromossomo. Loci é o plural de lócus. A proporção de indivíduos com um genótipo específico que manifesta esse genótipo ao nível do fenótipo. Resultado das interações entre variações genéticas em uma população e o ambiente. Corresponde alteração de uma única base na sequência do DNA (Polimorfismo de nucleotídeo único). Alteração genética dentro de uma população. xxvi

27 APRESENTAÇÃO APRESENTAÇÃO Esta tese de doutorado apresenta resultados de um estudo realizado com mulheres gestantes provenientes do projeto intitulado Saúde mental e estado nutricional na gestação e no pós-parto: estudo prospectivo com ensaio clínico randomizado aninhado. Este projeto foi desenvolvido no Centro Municipal de Saúde Heitor Beltrão (CMS HB), da Secretaria Municipal de Saúde (SMS) do Rio de Janeiro. O recrutamento das mulheres ocorreu durante o período de novembro de 2009 a outubro de 2011, sendo a coleta de dados finalizada em junho de O estudo foi realizado por pesquisadores do Observatório de Epidemiologia Nutricional do Instituto de Nutrição Josué de Castro (INJC) e contou com a parceria do Instituto de Psiquiatria da Universidade Federal do Rio de Janeiro (IPUB - UFRJ). A pesquisa foi financiada pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). A presente tese intitulada Associação entre os polimorfismos nos genes relacionados à obesidade e às mudanças de peso corporal e consumo alimentar de gestantes foi desenvolvida com a finalidade de investigar se os polimorfismos de genes relacionados à obesidade estão associados com mudanças no peso corporal e no consumo alimentar de gestantes. Este documento está estruturado nas seguintes seções: introdução, na qual é realizada abordagem geral sobre a temática que envolve esta tese; referencial teórico, no qual é traçada uma estruturação conceitual sobre os principais pilares da tese para o entendimento do estudo; justificativa; hipóteses; objetivos; métodos; resultados; conclusões, considerações finais; referências bibliográficas, apêndices e anexos. A seção de resultados/discussão é composta por três manuscritos científicos. O primeiro artigo foi publicado na revista Nutrition e intitulado Association of the FTO (rs ) and MC4R (rs ) gene polymorphisms with maternal body weight during pregnancy. O segundo artigo foi aceito para publicação na revista Nutrition Research e intitula-se Leptin (rs ) and leptin receptor (rs ) gene polymorphisms and body weight changes and leptin concentrations throughout pregnancy. O terceiro manuscrito foi submetido à British Journal of Nutrition para publicação e intitula-se Associations between obesity candidate gene polymorphisms (FTO, MC4R, LEP and LEPR) and dietary intake in pregnant women. A seção considerações finais é fundamentada nos principais resultados dos três manuscritos realizados. As referências da tese obedecem a norma NB-66 da Associação 27

28 APRESENTAÇÃO Brasileira de Normas Técnicas (ABNT), enquanto as referências dos artigos atendem aos requisitos técnicos das revistas. 28

29 INTRODUÇÃO 1 INTRODUÇÃO A prevalência do excesso de peso tem aumentado nas últimas décadas de forma constante em todos os grupos etários e sociais, configurando-se na atualidade como um dos problemas prioritários de saúde pública (WHO, 2014). Consequentemente, a proporção de mulheres com excesso de peso em idade reprodutiva tem aumentado em diversas partes do mundo (Ng et al., 2014; Gilmore, Klempel-Donchenko e Redman, 2015), inclusive no Brasil (IBGE, 2010, 2015; Brasil, 2017). A obesidade está associada ao risco concomitante ou aumentado de quase todas as doenças crônicas não transmissíveis (DCNT), incluindo diabetes tipo 2, alguns tipos de câncer, dislipidemia, doenças cardiovasculares e osteoartrite (Hruby e Hu, 2015). A obesidade também desempenha papel significativo nos transtornos reprodutivos em mulheres como distúrbios menstruais, infertilidade, dificuldades na reprodução assistida e aborto espontâneo (Dağ e Dilbaz, 2015) O período gestacional é caracterizado por adaptações fisiológicas para suprir as demandas da gestação e da lactação, e o estado nutricional pré-gestacional materno constitui um dos principais determinantes para o ganho de peso durante este período (Institute of Medicine, 2009). O ganho de peso gestacional (GPG) excessivo está associado a mudanças de peso no pós-parto, ou seja, quanto maior o ganho de peso neste período, maior será a retenção de peso no pós-parto (Siega-Riz et al., 2009). A compreensão dessas associações é complexa, pois o excesso de peso adquirido em uma gestação pode ter um efeito cumulativo em longo prazo sobre o ganho de peso em gestações subsequentes (Gilmore, Klempel-Donchenko e Redman, 2015), ampliando a trajetória de ganho de peso e contribuindo para o desenvolvimento ou agravamento da epidemia da obesidade em mulheres (Nehring et al., 2011; Mannan, Doi e Mamun, 2013; Rong et al., 2015). A obesidade materna é um fator de risco bem estabelecido para resultados obstétricos e neonatais adversos, incluindo aumento do risco de diabetes gestacional, parto por cesariana, pré-eclâmpsia, complicações no nascimento e macrossomia (Ovesen, Rasmussen e Kesmodel, 2011; Shin e Song, 2015; Marchi et al., 2015). Além disso, evidências sugerem que a obesidade materna e o GPG excessivo também possuem influência adversa em longo prazo sobre a saúde do filho, por meio do processo de programação metabólica (Cnattingius et al., 2012; Gomes et al., 2015; Lawrence et al., 2014). Tais constatações traduzem-se em alerta crescente de impacto social e econômico para o sistema de saúde pública (Morgan et al., 29

30 INTRODUÇÃO 2014), o que salienta a relevância de maiores investigações sobre as possíveis causas do excesso de peso materno. A teoria convencional sustenta que a obesidade é o resultado de um desequilíbrio de longo prazo entre a ingestão e o gasto energético, que favorece o balanço energético positivo (Agurs-Collins e Bouchard, 2008). Tradicionalmente, esse desequilíbrio ocorre devido à ingestão de alimentos e bebidas de alta densidade energética, geralmente de baixo custo, combinado com estilo de vida sedentário (Hill, Wyatt e Peters, 2012; Hall et al., 2012). No entanto, a fisiopatologia da obesidade é complexa e as causas do balanço de energia positivo envolvem uma interação complexa entre fatores ambientais, socioeconômicos e genéticos, tornando a gestão e a prevenção da obesidade desafiadoras (Choquet e Meyre, 2011b; Hurt et al., 2011; Hruby e Hu, 2015). Os estudos genéticos têm contribuído significativamente para a compreensão da fisiologia da regulação da massa corporal, por meio de modelos animais e da investigação dos fatores genéticos relacionados às formas raras e comuns de obesidade humana. Desde o mapeamento do genoma humano ( ), vários polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) de genes com potencial de associação com o excesso de peso têm sido identificados, a exemplo do FTO (massa de gordura e obesidade associadas), MC4R (receptor da melanocortina-4), LEP (leptina) e LEPR (receptor da leptina). Estes genes têm sido frequentemente estudados em decorrência de estarem envolvidos em vias centrais ou periféricas de controle da ingestão e gasto energético (Sonestedt et al., 2009; Stutzmann et al., 2009; Boumaiza et al., 2012). Nesse sentido, é concebível que estas variantes genéticas também possam estar associadas ao peso pré-gestacional e as mudanças de peso corporal materno durante a gestação e no pós-parto, bem como aos componentes da ingestão alimentar. Contudo, ainda são escassos os estudos que abordam os efeitos da genética sobre esses desfechos. 30

31 REFERENCIAL TEÓRICO 2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 EPIDEMIOLOGIA DO EXCESSO DE PESO A natureza global da epidemia de obesidade foi formalmente reconhecida pela Organização Mundial de Saúde (OMS) em 1997 (WHO, 2000) e, desde então, sua prevalência ascendente vem sendo observada em todo mundo (Ng et al., 2014). Um dos aspectos mais preocupantes da epidemia de obesidade é que a prevalência também tem aumentado rapidamente entre crianças e adolescentes (WHO, 2014; Lobstein et al., 2015). Em 2014, a OMS estimou que mais de 1,9 bilhões de pessoas com idade 18 anos apresentavam índice de massa corporal [IMC = peso (kg)/estatura (m 2 )] 25,0 kg/m 2 (excesso de peso), correspondendo a 39% da população adulta no mundo, destes 13% apresentavam IMC 30,0 kg/m 2 (obesidade) (WHO, 2016). A região das Américas foi a que apresentou a maior prevalência de excesso de peso (61%, destes 27% de obesidade) e a região sudeste da Ásia a mais baixa (22%, destes 5% de obesidade) (WHO, 2014). Resultados de estudos populacionais no Brasil confirmam as altas prevalências de excesso de peso e obesidade na população adulta (Quadro 1). Quadro 1. Panorama dos estudos populacionais brasileiros sobre prevalências do excesso de peso e obesidade em indivíduos adultos. Pesquisas Ano de realização Faixa etária (anos) Excesso de peso (% IMC 25,0 kg/m 2 ) Obesidade (% IMC 30,0 kg/m 2 ) POF (IBGE, 2010) ,0 14,8 PNS (IBGE, 2015) ,9 20,8 VIGITEL (Brasil, 2017) ,8 18,9 Abreviaturas: POF = Pesquisa de Orçamentos Familiares PNS = Pesquisa Nacional de Saúde VIGITEL = Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas por Inquérito Telefônico As mulheres tendem a apresentar prevalência de obesidade superior à observada nos homens. De acordo com as estimativas da OMS em 2014, 40% das mulheres e 38% dos homens apresentavam excesso de peso, destes 15% das mulheres e 11% dos homens eram obesos (WHO, 2014). De acordo com dados epidemiológicos de 186 países, o IMC médio em homens aumentou de 21,7 kg/m² em 1975 para 24,2 kg/m² em 2014, e em mulheres de 22,1 kg/m² em 1975 para 24,4 kg/m² em A prevalência de obesidade aumentou de 3,2% em 31

32 REFERENCIAL TEÓRICO 1975 para 10,8% em 2014 nos homens e de 6,4% a 14,9% em mulheres (NCD Risk Factor Collaboration, 2016). Dados de 2014 do Global Health Observatory (GHO) para o Brasil sugerem que as prevalências de excesso de peso e obesidade para homens e mulheres ( 18 anos) eram de 55,2% e 53,0%; 17,1% e 24,0%, respectivamente (GHO-WHO, 2014). Dados de pesquisas populacionais realizadas no Brasil também demonstram esta tendência (Quadro 2). Dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) indicam que nos 34 anos decorridos de a , a prevalência de excesso de peso em adultos aumenta em quase três vezes no sexo masculino (de 18,5% para 50,1%) e em quase duas vezes no sexo feminino (de 28,7% para 48,0%). No mesmo período, a prevalência de obesidade aumenta em mais de quatro vezes para homens (de 2,8% para 12,5%) e em mais de duas vezes para mulheres (de 8,0% para 16,9%) (IBGE, 2010). Quadro 2. Panorama dos estudos populacionais brasileiros sobre prevalências do excesso de Pesquisas peso e obesidade em indivíduos adultos, de acordo com o sexo. Ano de realização Faixa etária (anos) Excesso de peso (% IMC 25,0 kg/m 2 ) Obesidade (% IMC 30,0 kg/m 2 ) Homens Mulheres Homens Mulheres PNDS (Brasil, 2009) ,1-16,1 POF (IBGE, 2010) ,1 48,0 12,5 16,9 PNS (IBGE, 2015) ,6 58,2 16,8 24,4 VIGITEL (Brasil, 2017) ,7 50,5 18,1 19,6 Abreviaturas: PNDS = Pesquisa Nacional de Demografia e Saúde da Criança e da Mulher POF = Pesquisa de Orçamentos Familiares PNS = Pesquisa Nacional de Saúde VIGITEL = Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas por Inquérito Telefônico Foi observado na maioria dos países desenvolvidos que a taxa de aumento do IMC desde 2000 foi mais lenta do que nas décadas anteriores (Ng et al., 2014). No entanto, como a taxa de aumento do IMC foi acelerada em países não desenvolvidos, o aumento global do IMC não diminuiu (NCD Risk Factor Collaboration, 2016). Por outro lado, Hurt et al. (2011) consideram que a população atingiu um ponto de saturação e que a parcela ainda não afetada pode ser considerada como não suscetível à obesidade, dando falsa impressão da estabilidade da prevalência de obesidade na população. Em decorrência da relevância econômica e dos problemas de saúde pública derivados do aumento do IMC na população, em 2013, a OMS incluiu a temática adiposidade entre os 32

33 REFERENCIAL TEÓRICO objetivos do Plano Global de enfrentamento das DCNT até o ano de A meta em relação à obesidade é conter o aumento da prevalência para corresponder às taxas de 2010 (WHO, 2014). Contudo, esta meta não será alcançada caso as tendências de aumento da prevalência do excesso de peso observadas pós-2000 sejam mantidas (NCD Risk Factor Collaboration, 2016). 2.2 AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO CORPORAL Avaliação da composição corporal na população geral A obesidade pode ser definida de uma maneira simplificada como o acúmulo excessivo de gordura corporal, sob a forma de tecido adiposo, sendo conseqüência de balanço energético positivo, capaz de acarretar prejuízos à saúde dos indivíduos (WHO, 2000). A obesidade possui etiologia complexa e multifatorial, envolvendo a interação de fatores sociais, comportamentais, culturais, fisiológicos, metabólicos e genéticos (Agurs-Collins e Bouchard, 2008; Hurt et al., 2011; Bray et al., 2016). Mais recentemente, a alteração induzida por epigenética na expressão genética emergiu como uma forma alternativa na qual os componentes ambientais podem influenciar o fenótipo da obesidade (Fleisch, Wright e Baccarelli, 2012). Do ponto de vista da composição corporal, a obesidade é caracterizada pela elevada quantidade de massa gorda (Caballero, 2007; Flegal et al., 2009; WHO, 2014). Por conseguinte, medições acuradas da adiposidade são importantes para permitir diagnóstico e tratamento apropriados da obesidade (Madden e Smith, 2014). As técnicas in vivo não medem a composição corporal diretamente, apenas predizem medidas das propriedades do corpo (Wells e Fewtrell, 2006). Os métodos indiretos são baseados em suposições quanto à densidade de tecidos corporais, concentrações de água e eletrólitos e/ou inter-relações biológicas entre os componentes do corpo e os tecidos corporais (Wells e Fewtrell, 2006; Duren et al., 2008), não existindo um método universalmente recomendado para a avaliação da composição corporal. Estes métodos variam de acordo com suas bases físicas, custo, acurácia e praticidade, e apresentam vantagens e desvantagens (Duren et al., 2008). Os métodos indiretos baseados em imagem, particularmente tomografia computadorizada (TC), ressonância magnética (RM) e densitometria com emissão de raio X de dupla energia (DEXA), são considerados tecnologias de referência padrão-ouro para a 33

34 REFERENCIAL TEÓRICO análise da composição corporal (Prado e Heymsfield, 2014). Porém, constituem tecnologias de alto custo e exigem pessoal qualificado para sua utilização, inviabilizando uso em estudos populacionais e ou em atendimentos coletivos em redes de saúde pública (Cornier et al., 2011; Seabolt, Welch e Silver, 2015). O método duplamente indireto da bioimpedância elétrica (BIA) é considerado acessível financeiramente, comparado aos métodos de imagem (Kyle et al., 2004a; Hurst et al., 2015). Contudo, a utilização deste método pode resultar em estimativas imprecisas nas situações em que o balanço hidroeletrolítico está alterado e em mulheres obesas (Bosaeus et al., 2014). O método antropométrico, que também corresponde a um método duplamente indireto de avaliação da composição corporal, tem sido o mais utilizado para fins epidemiológicos e prática clínica por ser considerado mais prático e menos oneroso (Lee et al., 2014; Bray et al., 2016). Entre as diversas técnicas antropométricas para estimar a gordura corporal, destacamse as medidas de espessura de dobras cutâneas (DC), perímetro da cintura (PC) e medidas de dimensão corporal, como peso e estatura para o cálculo do IMC. O IMC é o parâmetro mais utilizado para estimar a composição corporal por ser considerado não invasivo, relativamente simples e de baixo custo (Romero-Corral et al., 2008; Okorodudu et al., 2010; Gómez-Ambrosi et al., 2012; Arroyo-Johnson e Mincey, 2016). Este índice é classificado pela OMS em seis categorias para indivíduos adultos, com base nas tendências gerais da relação entre o IMC e DCNT ou taxas de mortalidade (WHO, 2000): <18,5 kg/m 2 = baixo peso; 18,5 24,9 kg/m 2 = peso normal; 25,0 29,9 kg/m 2 = sobrepeso; 30,0 34,9 kg/m 2 = obesidade grau I; 35,0 39,9 kg/m 2 = obesidade grau II e 40 kg/m 2 = obesidade grau III. Geralmente as pessoas com pesos corporais elevados apresentam maiores quantidades de gordura corporal (Duren et al., 2008). Contudo, o IMC não é capaz de atender aos fatores de variação na composição corporal (idade, sexo e etnia) (Hunma et al., 2016; Hung et al., 2017) e de fornecer informações sobre quantidade e distribuição da gordura corporal (Romero-Corral et al., 2008; Flegal et al., 2009; Okorodudu et al., 2010; Lee et al., 2014; Ablove et al., 2015). Neste sentido, a inclusão de outras medidas antropométricas tais como o PC e o espessamento de DC, em conjunto com o IMC, seria desejável e adequado para identificar os indivíduos com risco aumentado de desenvolver obesidade e doenças associadas (Bhurosy e Jeewon, 2013; Lee et al., 2014). 34

35 REFERENCIAL TEÓRICO As consequências para a saúde associadas à obesidade dependem não só da quantidade de gordura em excesso, mas também da sua distribuição corporal que pode variar consideravelmente, inclusive entre indivíduos obesos (Klein et al., 2007). A adiposidade visceral (intra-abdominal) é considerada a medida mais crítica para a avaliação do risco à saúde, independente da gordura corporal total (Caballero, 2007; Lee et al., 2014) Avaliação da composição corporal em gestantes A massa corporal na maioria dos indivíduos é mantido relativamente estável por interações complexas entre os reguladores de curto e longo prazo do balanço energético, mesmo considerando as flutuações diárias na ingestão e no gasto de energia (Augustine, Ladyman e Grattan, 2008). Em contrapartida, a gestação é caracterizada por um período heterogêneo no ciclo de vida das mulheres, na qual adaptações fisiológicas, metabólicas e nutricionais são fundamentais para a saúde materna, o desenvolvimento fetal, o parto e a lactação (Augustine, Ladyman e Grattan, 2008; Yogev e Catalano, 2009), resultando em mudanças na composição corporal materna (Catalano e demouzon, 2015). Além disso, o aumento no tecido adiposo materno é também uma importante resposta adaptativa à gestação (Straughen, Trudeau e Misra, 2013). A utilização de métodos baseados em imagens é limitada em gestantes em decorrência da exposição a radiações ionizantes (TC e DEXA) ou dispendiosos para serem aplicados em estudos populacionais (Straughen, Trudeau e Misra, 2013; Van der Wijden et al., 2013; Marshall et al., 2016). O método da pletismografia por deslocamento do ar (ADP/BodPod), fundamentado na densidade corporal para calcular a proporção da gordura corporal, tem sido limitado devido à incapacidade de avaliar a densidade corporal das gestantes independentes do feto e dos tecidos de suporte, além de sofrer influência da densidade e da composição do tecido livre de gordura ao longo da gestação (Widen e Gallagher, 2014). A inviabilidade de separação dos tecidos materno/fetal e a hidratação do tecido livre de gordura também interferem na validade e na interpretação dos resultados da composição corporal obtidos pelo método da BIA (Kyle et al., 2004b; Straughen, Trudeau e Misra, 2013; Widen e Gallagher, 2014). O método antropométrico é o mais utilizado para estimar a composição corporal materna durante a gestação. Medidas de DC e do perímetro do braço têm sido utilizadas para esta finalidade (Van der Wijden et al., 2013; Dodd et al., 2015). Contudo, estimativas de alterações na gordura corporal durante a gestação derivadas de DC são propensas a erro de 35

36 REFERENCIAL TEÓRICO medição, especialmente devido à dificuldade de obter medidas válidas e confiáveis em decorrência da presença de edemas e da variabilidade do grau de hidratação (Widen e Gallagher, 2014). O IMC se correlaciona significativamente com o percentual de gordura corporal no início da gestação, porém, esta correlação se enfraquece no final da gestação em consequência da contribuição do teor de água corporal total no GPG (Sewell et al., 2007). Portanto, o IMC pode ser considerado um indicador limitado da variação de tecido adiposo materno ao longo da gestação (Dodd et al., 2015; Marshall et al., 2016). O GPG excessivo tem sido associado ao maior acúmulo de tecido adiposo materno (Berggren et al., 2016). Contudo, o GPG é uma medida complexa, que reflete a combinação de acúmulo de gordura materna, a expansão do volume plasmático relacionado à gestação, o edema periférico, a massa placentária, a massa fetal e o volume de líquido amniótico (Institute of Medicine, 2009; Widen e Gallagher, 2014). Pode, portanto, também não ser considerado o melhor indicador que reflete o diagnóstico da adiposidade materna (Van der Wijden et al., 2013). De forma geral, a obtenção de estimativas da composição corporal materna durante a gestação ainda são propensas a erros (Widen e Gallagher, 2014). Atualmente, o Ministério da Saúde Brasileiro adota recomendações de ganho total de peso, segundo estado nutricional inicial da gestante (Institute of Medicine, 2009), e classifica o estado nutricional de acordo com categorias de IMC por semana gestacional (Atalah Samur et al., 1997). 2.3 PRINCIPAIS FATORES CONDICIONANTES DA OBESIDADE A obesidade é uma das DCNT mais relevantes na saúde pública devido a sua associação com doenças cardiovasculares (Bastien et al., 2014), diabetes (Abdullah et al., 2010) e câncer (Renehan et al., 2008), bem como pela sua associação com altas taxas de mortalidade por todas as causas (Flegal et al., 2013). Além de promover os agravos à saúde, a obesidade também impacta em consequências econômicas relativas ao custo financeiro destinado aos cuidados com a saúde (consultas, internações, medicamentos, etc.) e a perda de produtividade (Finkelstein et al., 2010; Malik, Willett e Hu, 2013). Somam-se, ainda, prejuízos psicossociais relacionados à questão da discriminação a indivíduos sob essa condição patológica (Preiss, Brennan e Clarke, 2013). 36

37 REFERENCIAL TEÓRICO O fenômeno da globalização tem contribuído sobremaneira para as modificações no estilo de vida da população, com impacto sobre a incidência da obesidade e de suas comorbidades associadas em vários países (Caballero, 2007; Malik, Willett e Hu, 2013). A prevalência da obesidade nos países em desenvolvimento estava associada inicialmente ao maior status socioeconômico, porém, com a acessibilidade aos alimentos densos em energia, esta epidemia se espalhou para os grupos socioeconômicos menos privilegiados (Canoy e Buchan, 2007). O consumo frequente de alimentos e bebidas com grande densidade energética - frequentemente servidos em grandes porções - e o estilo de vida sedentário favorecem o balanço energético positivo, contribuindo para o acúmulo de tecido corporal gorduroso (Malik, Willett e Hu, 2013; Popkin e Hawkes, 2016). Todavia, observa-se grande variabilidade na suscetibilidade ao desenvolvimento da obesidade, detectada entre os indivíduos expostos aos mesmos fatores de risco ambiental, o que sugere que as diferenças genéticas também atuam neste processo de expressividade do fenótipo da obesidade (Bouchard, 2007; Herrera, Keildson e Lindgren, 2011; Hurt et al., 2011). A multicausalidade da obesidade implica que nenhum dos fatores isolados podem, decisivamente, explicar o aumento da incidência de obesidade (Hurt et al., 2011). Porém, levando em consideração que o aumento da prevalência da obesidade ocorreu em um curto período de tempo, os fatores ambientais e comportamentais do estilo de vida provavelmente contribuem significativamente para a epidemia global desta doença (Agurs-Collins e Bouchard, 2008). As intervenções para o tratamento da obesidade variam de modificações no estilo de vida, que envolvem a educação alimentar e o aumento do gasto energético por meio da prática de atividade física, a opções de farmacoterapia e intervenções cirúrgicas (Wyatt, 2013). Provavelmente, o conhecimento das bases genéticas em conjunto com as influências ambientais que levam à obesidade poderá permitir identificar populações vulneráveis e intervir de modo a controlar esta epidemia em gerações futuras. 2.4 INFORMAÇÕES BÁSICAS SOBRE GENÉTICA HUMANA Estrutura do material genético humano O material genético em humanos está presente em cada célula do corpo, na sua maioria no núcleo de células, sendo constituído por 46 cromossomos dispostos em 23 pares. Desses 23 pares, 22 são iguais nos homens e mulheres e são chamados autossômicos, 37

38 REFERENCIAL TEÓRICO numerados do maior ao menor. O par remanescente compreende os cromossomos sexuais: dois cromossomos X em mulheres e um cromossomo X e outro Y em homens (Nussbaum, McInnes e Willard, 2015). Cada cromossomo é composto de ácido desoxirribonucleico (DNA) o qual tem uma estrutura linear e é essencialmente uma sequência de pares de bases complementares, os quais estão ligados entre si por limites químicos. As quatro bases de DNA são as moléculas: Adenina, Guanina, Citosina e Timina, abreviadas por A, G, C e T, respectivamente. Cada uma dessas bases pode formar um par complementar com uma e somente uma outra base. Assim, podem ocorrer quatro diferentes pares de bases complementares: A-T, G-C, T-A e C-G (a ordem das bases não importa) (Nussbaum, McInnes e Willard, 2015). Uma representação simplificada da estrutura do material genético é mostrada na Figura 1. Figura 1. Estrutura simplificada dos elementos do material genético humano. Fonte: figura adaptada do site Variação genética A sequência genética no mesmo cromossomo é aproximadamente 99,5% idêntica para todos os indivíduos da população (Shaw, 2013). No entanto, é precisamente a pequena fração de sequência de DNA diferente entre os indivíduos que é responsável pela variabilidade geneticamente determinada entre os seres humanos (Nussbaum, McInnes e Willard, 2015). A variação genética ocorre em diferentes escalas e refere-se tanto à diferença entre as populações de uma espécie quanto à diferença entre os indivíduos de uma população, tornando cada indivíduo único em suas características fenotípicas (Kassem, Girolami e Sanoudou, 2012). Esta variação depende, entre outros fatores, da natureza e da quantidade de mutações gênicas de uma população e da frequência dos alelos que influenciam uma característica em uma determinada população(klaauw, van der e Farooqi, 2015). 38

39 REFERENCIAL TEÓRICO Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) Os SNPs (do inglês single nucleotide polymorphisms) correspondem a alteração de uma única base na sequência do DNA (A,C,G, ou T) em um determinado local cromossômico (lócus) (Karki et al., 2015; Nussbaum, McInnes e Willard, 2015) (Figura 2). Os SNPs representam 90% dos polimorfismos genéticos (Shawky, 2014). Os SNPs são o tipo mais comum de variação genética em seres humanos e ocorrem em média uma vez em cada pares de bases (Goldstein e Cavalleri, 2005; Ke, Taylor e Cardon, 2008). Figura 2. Polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP). Neste exemplo há uma substituição de um T (Timina) por um G (Guanina) que causa a mudança de um A (Adenina) por um C (Citosina) na fita complementar do DNA Fonte: Figura adaptada de Nussbaum et al. (2015) (Nussbaum, McInnes e Willard, 2015). Os SNPs possuem tipicamente dois alelos. A frequência de um SNP é dada em termos da frequência do alelo menor (frequência do alelo menos comum). Por exemplo, um SNP com uma frequência do alelo menor (T) de 0,40 implica que 40% de uma população tem o alelo T versus o alelo maior (o alelo principal), que se encontra em 60% da população (Bush e Moore, 2012). Neste contexto, a denominação de SNP frequentemente se restringe a aqueles polimorfismos em que a frequência do alelo menor aparece em ao menos 1% da população (Liao e Lee, 2010; Shaw, 2013). Para efeitos de estudos genéticos, os SNPs são tipicamente utilizados como marcadores de uma região genômica, com a grande maioria deles apresentando impacto mínimo em sistemas biológicos (Bush e Moore, 2012). Em geral, os SNPs ocorrem com menos frequência nas regiões de codificação (denominadas de éxons) do genoma do que nas regiões não codificantes (denominadas de íntrons), logo SNP não ocorre aleatoriamente no gene (Kim e Misra, 2007; Liao e Lee, 2010; Shaw, 2013). Os SNPs em regiões não 39

40 REFERENCIAL TEÓRICO codificantes, embora não alterem proteínas codificadas, servem como importantes marcadores genéticos ou físicos para estudos de genômica comparativa ou evolutiva, pois afetam a expressão de genes que podem causar doenças (Shawky, 2014). Os SNPs, quando presentes nas regiões de codificação, podem causar alterações na estrutura das proteínas e, portanto, promover o desenvolvimento de doença (Kim e Misra, 2007). Ao longo dos últimos anos, milhões de polimorfismos em genes humanos foram validados no SNP database (dbsnp banco de dados incorporado ao National Center for Biotechnology - NCBI). Atualmente, o banco conta com SNPs descritos para o Homo sapiens, sendo validados (dbsnp build 150 fevereiro/2017). Cada SNP depositado no dbsnp tem um registro particular indicado como #rs (refsnp) seguido de um número definido pela ordem de depósito no banco. Estes avanços na descoberta de um número expressivo de SNPs contribuíram para considerável aumento do número de publicações científicas, na tentativa de associar estes polimorfismos a doenças ou à suscetibilidade a estas (Ke, Taylor e Cardon, 2008; Albuquerque, Manco e Nóbrega, 2016). Se um SNP aumenta a suscetibilidade a uma doença específica de interesse, devemos notar que sua presença é mais comum entre os indivíduos afetados por esta condição do que entre os indivíduos não afetados. Assim, por meio da genotipagem de grande número de indivíduos, as ferramentas de genética populacional são capazes de destacar a base genética de doenças poligênicas como a obesidade comum (Kim e Misra, 2007; Albuquerque, Manco e Nóbrega, 2016). Porém, as bases genéticas das doenças geralmente são complexas pela interação entre vários genes e o ambiente. 2.5 SNPs EM GENES CANDIDATOS À OBESIDADE Os genes com função biológica conhecida que regulam direta ou indiretamente os processos de desenvolvimento das características investigadas são conhecidos como genes candidatos (Farooqi e O Rahilly, 2007; Zhu e Zhao, 2007). O objetivo central da genética humana é identificar fatores de risco genéticos para doenças comuns e complexas. Existem diversas tecnologias, diferentes desenhos de estudos e ferramentas analíticas para identificar fatores de risco genéticos. Estudos de análise de ligação (Genome-Wide Linkage Studies GWLS) e, mais recentemente, estudos de associação ampla do genoma (Genome Wide Association Studies - GWAS) têm sido as principais ferramentas 40

41 REFERENCIAL TEÓRICO para identificar variantes para doenças mendelianas e complexas, respectivamente (Londin et al., 2013). Os GWLS avaliam marcadores amplamente espaçados em todo o genoma para determinar se eles são herdados juntamente com a doença em famílias com numerosos indivíduos afetados (Ott, Wang e Leal, 2015). Este tipo de análise é utilizada na identificação de mutações causadoras de doença monogênica (mendeliana) para estudar a transmissão de um segmento cromossômico de uma geração para a outra em uma genealogia (Londin et al., 2013). A abordagem GWAS tem conduzido, desde 2005, à descoberta e avanço nos insights sobre os determinantes genéticos da obesidade comum (Singh, Kumar e Mahalingam, 2017). Os GWAS medem e analisam variações de sequência de DNA de todo o genoma humano para identificar fatores de risco genéticos para doenças que são comuns na população (Bush e Moore, 2012). O objetivo final do GWAS é identificar associação entre uma variável genética e uma condição especificada, bem como identificar os fundamentos biológicos da susceptibilidade à doença para desenvolver novas estratégias de prevenção e tratamento. A variação genética mais comumente estudada é o SNP (Ott, Wang e Leal, 2015). A obesidade tem uma expressão fenotípica heterogênea e os mecanismos moleculares envolvidos na sua origem parecem ser muitos e diversos. A obesidade monogênica não sindrômica refere-se a um único transtorno genético que leva a uma forma altamente penetrante da doença (Bell, Walley e Froguel, 2005; Choquet e Meyre, 2011a; Waalen, 2014), promovendo acúmulo excessivo de gordura corporal independentemente de interações com outros genes ou fatores ambientais (González Jiménez et al., 2012). Este tipo de obesidade é raro, afetando aproximadamente 5% da população, grave e geralmente de início precoce (Farooqi e O Rahilly, 2005). Ao contrário da obesidade monogênica, a obesidade poligênica é causada por alterações de múltiplos genes que interagem com os fatores ambientais e conferem diferentes graus de suscetibilidade à obesidade (Albuquerque et al., 2015). O estudo da obesidade poligênica é mais complexo do que a obesidade monogênica e configura-se como a hipótese mais aceita para as formas comuns de obesidade (Singh, Kumar e Mahalingam, 2017). Entre os vários genes estudados em associação com a obesidade, destacam-se os genes FTO (massa de gordura e obesidade associadas; rs ), MC4R (melanocortina-4 receptor; rs ), LEP (leptina; rs ) e LEPR (receptor da leptina; rs ), 41

42 REFERENCIAL TEÓRICO conhecidos por codificar proteínas envolvidas na regulação do balanço energético. É concebível que essas variantes genéticas envolvidas na susceptibilidade da obesidade possam desempenhar papel importante na regulação do peso e do consumo alimentar durante a gestação. Contudo, são escassos ou inexistentes os estudos que abordam os efeitos da genética sobre os desfechos gestacionais, principalmente sobre as mudanças relacionadas ao peso (peso pré-gestacional, GPG e retenção de peso) e ao consumo alimentar materno FTO (fat mass and obesity associated gene de - massa de gordura e obesidade associadas) Entre vários genes estudados para obesidade, destaca-se o FTO, que é um gene relacionado à massa gorda e ao aumento do IMC. O FTO foi o primeiro gene de suscetibilidade à obesidade identificado em 2007 por meio de GWAS (Frayling et al., 2007) e tem sido constantemente associado a desfechos relacionados à obesidade poligênica em várias populações (Dina et al., 2007; Scuteri et al., 2007; Rodríguez-López et al., 2010; Herrera, Keildson e Lindgren, 2011; Vasan et al., 2012; Singh, Kumar e Mahalingam, 2017). O gene FTO está localizado na região cromossômica 16q12.2, e seu tamanho é de pares de bases (Figura 3). Entre os diversos polimorfismos deste gene, a variante rs , localizada no intron, tem sido amplamente investigada e corresponde a substituição da base Timina por Adenina (T A). O alelo-a desta variante está diretamente relacionado a um maior acúmulo de gordura corporal, de modo que os adultos homozigotos para o alelo de risco (AA) têm peso 2-3 kg maior e chance 1,67 vez maior de desenvolver obesidade, em comparação com indivíduos sem o alelo de risco (Frayling et al., 2007). Figura 3. Localização cromossômica do gene FTO Fonte: Supõe-se que, devido a sua alta expressão no hipotálamo, região que está diretamente ligada ao controle do apetite e ao metabolismo energético, sua ação ocorre pela estimulação dessa região cerebral para poupar os estoques de gordura corporal (Dina et al., 2007). Este efeito pode ocorrer a partir da diminuição da saciedade e/ou do aumento da capacidade de captação de gordura pelos adipócitos (Frayling et al., 2007). Entretanto, seu mecanismo de ação ainda não foi esclarecido (Waalen, 2014). 42

43 REFERENCIAL TEÓRICO MC4R (melanocortina-4 receptor - receptor da melanocortina-4) As mutações MC4R representam a forma mais comum de obesidade monogênica humana, afetando 0,2-5,8% dos indivíduos com obesidade grave precoce (Farooqi et al., 2003; Hinney et al., 2006). Além disso, o GWAS forneceu evidências convincentes de que também a variação comum no MC4R contribui para a susceptibilidade da obesidade na população, e ele foi o segundo gene identificado de susceptibilidade à obesidade poligênica (Loos et al., 2008). Este gene está localizado no cromossomo 18q21.32 e seu tamanho corresponde a pares de bases (Figura 4). Figura 4. Localização cromossômica do gene MC4R Fonte: A variante rs do gene MC4R corresponde a substituição da Timina por Citosina (T C). Esta variante apresenta papel importante no controle do apetite e na homeostase energética e, consequentemente, é de grande relevância para o fenótipo de excesso de peso corporal (Farooqi et al., 2003; Obregón et al., 2016). Neste sentido, o polimorfismo rs (MC4R) tem sido fortemente associado com a obesidade e o maior IMC em adultos e crianças (Loos et al., 2008; Beckers et al., 2011) LEP e LEPR (leptin and leptin receptor - leptina e seu receptor) Os polimorfismos dos genes da leptina (LEP) e do seu receptor (LEPR) estão relacionados à via biológica para a regulação da ingestão alimentar e do gasto energético, com provável associação com a obesidade e suas complicações (Guizar-Mendoza et al., 2005; Khosropour, Shojaee e Lotfi, 2016). O polimorfismo no gene da LEP codifica a proteína leptina, que é um dos importantes sinais periféricos na regulação do peso corporal. Este gene está localizado no cromossomo 7q32.1 e seu tamanho corresponde a pares de bases (Figura 5). Figura 5. Localização cromossômica do gene LEP Fonte: 43

44 REFERENCIAL TEÓRICO A variante LEP-rs corresponde à transição Guanina para Adenina (G A) na região promotora do gene (Boumaiza et al., 2012), sendo o alelo-a associado com o aumento da produção e secreção de leptina (Constantin et al., 2010; Sahin et al., 2013) e com o IMC (Hinuy et al., 2008; Dasgupta et al., 2015). A leptina exerce sua ação biológica por meio da ligação e ativação da forma longa dos receptores de leptina (LEPR), que é expresso extensivamente em muitas regiões cerebrais (Gautron e Elmquist, 2011). O gene LEPR está localizado no cromossomo 1p31.3 e seu tamanho corresponde a pares de bases (Figura 6). Figura 6. Localização cromossômica do gene LEPR Fonte: Dentre os SNPs descritos no gene LEPR, o rs corresponde a uma substituição de uma base Adenina por uma Guanina (A G) (Liu et al., 2015). Alguns estudos encontraram correlação entre a obesidade e o SNP do gene LEPR (Yiannakouris et al., 2001; Hastuti et al., 2016). 2.6 DETERMINANTES DO GANHO DE PESO MATERNO IMC pré-gestacional A maioria das evidências para os riscos associados à obesidade materna baseia-se no IMC do início da gestação, devido a dificuldades na obtenção acurada do IMC pré-gestacional (Heslehurst, 2011). O IMC elevado, antes ou no início da gestação, está associado ao risco de complicações durante a gestação e no período pós-parto, tais como pré-eclâmpsia, diabetes gestacional, hipertensão, parto por cesariana, hemorragia pós-parto (Gaillard et al., 2013; Li et al., 2013); e também com desfechos neonatais adversos que incluem anormalidades de crescimento fetal: macrossomia (Gaudet et al., 2014; Poorolajal e Jenabi, 2016), aumento do número de abortos (Bodnar et al., 2015) e defeito no tubo neural (Rasmussen et al., 2008). Em geral, as correlações entre IMC pré-gestacional elevado e desfechos fetais adversos parecem ser mais consistentes e mais fortes do que para o GPG excessivo (Nohr et al., 2008; Gaillard et al., 2013), especialmente em relação ao grau de adiposidade ao nascer (Sewell et al., 2006). De acordo com Villamor e Cnattingius (2006), um aumento modesto do peso entre gestações dentro da categoria de IMC saudável, ou suficiente para passar da categoria 44

45 REFERENCIAL TEÓRICO saudável para excesso de peso, seria suficiente para aumentar o risco médio de resultados adversos graves em gestação subsequente (Villamor e Cnattingius, 2006). Estudo retrospectivo de coorte envolvendo mulheres no Missouri, Estados Unidos, demonstrou que mulheres que iniciaram a primeira gestação com excesso de peso aumentaram as probabilidades de apresentar recém-nascido grande para idade gestacional, pré-eclâmpsia, parto por cesariana e óbitos neonatais em uma segunda gestação em 54%, 156%, 85% e 37%, respectivamente (Tabet et al., 2015). O IMC pré-gestacional também se caracteriza por ser um dos principais determinantes para o GPG. As recomendações das agências reguladoras, como o Institute of Medicine (IOM) dos Estados Unidos, são de que as mulheres com sobrepeso e obesidade ganhem menos peso durante a gestação do que aquelas com peso normal ou baixo peso (Institute of Medicine, 2009). Assim, é imprescindível avaliar o estado nutricional no início da gestação para determinar a recomendação adequada de ganho de peso e realizar orientação nutricional apropriada para cada caso Ganho de peso gestacional O GPG adequado é necessário para um resultado favorável da gestação. Entretanto, os componentes específicos do ganho de peso possuem estimativas imprecisas e variáveis entre as mulheres (Poston, Harthoorn e Van Der Beek, 2011; Gilmore, Klempel-Donchenko e Redman, 2015). Os componentes maternos contribuem com aproximadamente 65% e os produtos de concepção contribuem com os 35% restantes (Institute of Medicine, 2009). O GPG total é composto pela água corporal, proteína (massa livre de gordura) e gordura (massa gorda) do feto, bem como pela placenta, útero, líquido amniótico, expansão do volume de sangue materno, glândulas mamárias e tecido adiposo materno (Gilmore, Klempel- Donchenko e Redman, 2015). O padrão de GPG é relativamente pequeno no 1º trimestre, havendo um ganho mais acentuado no 2º trimestre em relação ao 3º trimestre (Institute of Medicine, 2009). Em resposta à crescente evidência que o GPG excessivo e a retenção de peso no pósparto predispõem tanto as mães quanto seus filhos a DCNT, o IOM revisou suas recomendações de 1990 e lançou novas recomendações do ganho de peso em 2009 (Institute of Medicine, 2009). Contudo, não existe consenso quanto ao que constitui o GPG ideal (Ohadike et al., 2016). Atualmente, as recomendações estabelecidas pelo IOM são as mais aceitas e têm sido utilizadas como referência em muitos estudos. De acordo com esta 45

46 REFERENCIAL TEÓRICO recomendação, as gestantes são inicialmente classificadas segundo o IMC pré-gestacional para, posteriormente, determinar a faixa de adequação do GPG (Institute of Medicine, 2009). Estas recomendações também são adotadas em vários países, inclusive no Brasil (Ministério da Saúde, 2006), e encontram-se detalhadas no Quadro 3. Mais recentemente, o Consórcio Internacional de Crescimento Fetal e Neonatal para o século 21 (Intergrowth-21 st ) publicou padrões de GPG segundo a idade gestacional, para mulheres saudáveis, usando dados de populações diversas (Brasil, China, Índia, Itália, Kênia, Oman, Reino Unido e Estados Unidos), que podem ser usados para orientar recomendações sobre o GPG adequado em todo o mundo (Ismail et al., 2016). Quadro 3. Recomendações e classificação do ganho de peso gestacional, de acordo com IMC Estado nutricional prégestacional (IMC, kg/m 2 ) materno pré-gestacional. Recomendação de ganho de peso durante a gestação (kg) Total de ganho de peso Ganho de peso médio por semana no 2 e 3 trimestre Baixo peso (< 18,5) 12,5 18,0 0,51 Peso adequado (18,5 24,9) 11,5 16,0 0,42 Sobrepeso (25,0 29.9) 7,0 11,5 0,28 Obesidade ( 30,0) 5,0 9,0 0,22 Classificação do ganho de peso gestacional total (kg) Insuficiente Adequado Excessivo Baixo peso (< 18,5) < ,0 > 18,0 Peso adequado (18,5 24,9) < 11,5 11,5 16,0 > 16,0 Sobrepeso (25,0 29.9) < 7,0 7,0 11,5 > 11,5 Obesidade ( 30,0) < 5,0 5,0 9,0 > 9,0 Fonte: Institute of Medicine (2009) Embora a obesidade materna seja, por si só, um fator de risco significativo para desfechos maternos e neonatais adversos, os riscos da maioria destas complicações são amplificados pelo GPG excessivo, incluindo diabetes gestacional, pré-eclâmpsia, recémnascidos grandes para sua idade gestacional, parto por cesariana, retenção de peso pós-parto e obesidade infantil (Institute of Medicine, 2009; Drehmer et al., 2013; Gaillard et al., 2013; Lau et al., 2014). As mulheres tendem a ganhar mais peso entre as gestações em vez de reduzir (Poston et al., 2016). Linearmente, o GPG está associado com mudanças de peso no pós-parto, ou seja, quanto maior o GPG, maior a retenção de peso no pós-parto (Nohr et al., 2008), especialmente entre as mulheres obesas (Institute of Medicine, 2009). O GPG excessivo 46

47 REFERENCIAL TEÓRICO nestas mulheres está associado principalmente com excesso de tecido adiposo e não ao tecido magro (Berggren et al., 2016). O excesso de peso pré-gestacional e o GPG excessivo pode ter efeito cumulativo em longo prazo sobre o ganho de peso em gestações subsequentes (Yogev e Catalano, 2009; Siega-Riz et al., 2009), ampliando a trajetória de ganho de peso e contribuindo para o desenvolvimento ou agravamento da epidemia da obesidade em mulheres. Evidências sugerem que a obesidade materna e o GPG excessivo não estão associados apenas a resultados adversos da gestação, mas também têm influência transgeracional sobre os resultados de saúde relacionados à obesidade infantil e adulta (Rooney, Mathiason e Schauberger, 2011; Cnattingius et al., 2012; Lawrence et al., 2014). A obesidade pré-gestacional materna e o GPG excessivo são fatores de risco modificáveis comuns e importantes para os desfechos materno e fetais. As mulheres também estão ficando grávidas em uma idade mais avançada e com um número crescente de condições médicas crônicas, como hipertensão e diabetes (Catalano e demouzon, 2015). Logo, estratégias preventivas centradas na melhoria da saúde materna no período prégestacional e gestacional podem melhorar os resultados de saúde em curto e longo prazos (Gaillard et al., 2016). De acordo com o IOM, as mulheres identificadas com excesso de peso devem ser consideradas gestantes de risco e devem receber atenção diferenciada, ou seja, uma avaliação clínica e laboratorial específica, assim como serem referenciadas para avaliação especializada por um nutricionista (Institute of Medicine, 2009) Retenção de peso pós-parto A retenção do peso ganho durante a gestação é altamente variável, podendo representar fator determinante da obesidade em mulheres, e está associada a uma complexa rede de inter-relações incluindo o GPG excessivo, o estado nutricional pré-gestacional, a amamentação, a raça, a idade, a paridade, o estado civil, a prática de atividade física e o consumo alimentar (Lacerda e Leal, 2004; Endres et al., 2015). As recomendações atuais orientam que as mulheres iniciem a gestação com o peso adequado e sigam as recomendações do IOM para o GPG. No entanto, muitas mulheres acumulam excesso de peso adquirido durante a gestação, aumentado o risco para o sobrepeso e a obesidade nas gestações posteriores e ao longo da vida. É possível que essas mulheres tenham mudanças sutis nos mecanismos reguladores do apetite, diferenças na resistência à insulina ou diferenças na taxa metabólica basal que as tornem suscetíveis ao GPG excessivo, e 47

48 REFERENCIAL TEÓRICO essas alterações persistem ao longo do tempo promovendo maior adiposidade materna (McClure et al., 2013; Endres et al., 2015). Os dados de estudos epidemiológicos sugerem que o mecanismo que liga o GPG excessivo à adiposidade a curto, médio e a longo prazos está associado à retenção de peso no pós-parto. Em estudo realizado nos Estado Unidos, aproximadamente 75% das mulheres eram mais pesadas em relação ao seu peso pré-gestacional (47,4% das mulheres apresentaram mais que 4,5 kg e 24,2% mais que 9 kg) um ano após o parto (Endres et al., 2015). Outro estudo realizado no mesmo país mostrou que o GPG excessivo não estava associado significativamente apenas ao peso materno aos 8 anos pós-parto, mas especificamente com à gordura abdominal (McClure et al., 2013). Em um estudo brasileiro, mulheres com GPG excessivo retiveram significativamente mais peso aos 9 meses pós-parto, comparadas com aquelas com GPG adequado ou insuficiente (Kac et al., 2004). Em um estudo realizado na capital da Suécia observou-se que a retenção de peso um ano pós-parto foi um importante determinante do sobrepeso 15 anos depois (Linné et al., 2004). Em um estudo realizado na Austrália, demonstrou-se que as mulheres que ganharam peso gestacional acima das recomendações do IOM tiveram um risco aumentado duas vezes de sobrepeso e quase 5 vezes de obesidade 21 anos após a gestação, comparando com as mulheres com ganho de peso adequado (Mamun et al., 2010). De acordo com os estudos apresentados, o GPG pode ser considerado o preditor mais importante para a retenção de peso pós-parto. A estratégia de monitoramento do ganho de peso ao longo da gestação é essencial para reduzir o risco de obesidade materna e prevenir desfechos obstétricos adversos Leptina Ambientes obesogênicos e o comportamento humano têm potencial para contribuir para o aumento agudo na prevalência de sobrepeso e obesidade na população. No entanto, não se deve omitir a biologia desta discussão. Vários outros fatores biológicos correlatos comuns do ganho de peso ou da obesidade incluem os mecanismos de ação da leptina e outros hormônios, e a regulação do apetite e saciedade (Agurs-Collins e Bouchard, 2008). A leptina é um hormônio que desempenha papel importante em vários processos fisiológicos, incluindo a regulação da função endócrina, função imunológica, inflamação, reprodução e angiogênese (Miehle, Stepan e Fasshauer, 2012). Este hormônio se destaca pela 48

49 REFERENCIAL TEÓRICO atividade de regulação da ingestão alimentar e o controle do gasto energético por meio da ação de receptores da leptina localizados no hipotálamo, que detecta e integra esses sinais promovendo a manutenção da homeostase energética e do peso corporal (Gautron e Elmquist, 2011) (Zhou e Rui, 2013). Esta adipocina é produzida e secretada predominantemente por adipócitos no tecido adiposo branco (Castellano Filho et al., 2013), mas também pode ser sintetizada pela placenta durante a gestação (Maymó et al., 2011). A leptina tem como particularidade ser secretada de forma pulsátil, exibindo um ritmo circadiano com os níveis mais baixos no meio da tarde e os níveis mais altos à meia-noite (Park e Ahima, 2015). Os indivíduos obesos geralmente exibem altos níveis de expressão de leptina no tecido adiposo e apresentam níveis elevados de leptina circulante, e estes níveis elevados não conseguem reduzir o excesso de adiposidade, indicando resistência à leptina (Minocci et al., 2000; Zhou e Rui, 2013; Park e Ahima, 2015; Khosropour, Shojaee e Lotfi, 2016). A gordura subcutânea produz mais leptina do que a gordura visceral, o que pode, em parte, contribuir para níveis mais elevados de leptina nas mulheres em comparação com os homens (Minocci et al., 2000). Durante a gestação as concentrações plasmáticas de leptina materna estão significativamente mais elevadas, em comparação a mulheres não gestantes, e não é acompanhado pelo efeito central clássico na regulação da ingestão alimentar. Uma possível função do aumento dos níveis de leptina materna é intensificar a mobilização das reservas de gordura materna para incrementar a disponibilidade e apoiar a transferência transplacentária de nutrientes (Hauguel-de Mouzon, Lepercq e Catalano, 2006). Porém, o exato papel da hiperleptinemia temporária durante a gestação ainda não está completamente esclarecido (Augustine, Ladyman e Grattan, 2008). O aumento da concentração de leptina materna precede o aumento fisiológico do IMC materno e declina rapidamente após o parto, sugerindo que a placenta contribui substancialmente para elevar a concentração da leptina materna, e não apenas o tecido adiposo materno (Hauguel-de Mouzon, Lepercq e Catalano, 2006). As concentrações elevadas de leptina materna têm sido associadas ao IMC materno e tendem a aumentar progressivamente ao longo da gestação (Misra e Trudeau, 2011; Castellano Filho et al., 2013; Franco-Sena et al., 2015). Embora as mulheres obesas apresentem maiores concentrações de leptina no início da gestação, elas apresentam menor 49

50 REFERENCIAL TEÓRICO taxa de aumento de leptina ao longo da gestação em comparação com as mulheres sem excesso de peso, provavelmente devido ao seu menor GPG (Misra e Trudeau, 2011; Castellano Filho et al., 2013) Consumo alimentar A alimentação desempenha papel primordial durante todo o ciclo de vida dos indivíduos, uma vez que nutrientes e energia são essenciais para a manutenção do organismo. O estado nutricional materno adequado antes e durante a gestação é importante para o crescimento e desenvolvimento do feto (Thompson et al., 2010). Idealmente, as mulheres em idade fértil deveriam consumir uma variedade de alimentos saudáveis para manter uma nutrição adequada e continuar com estes hábitos durante a gestação (Kaiser e Allen, 2008; Ramakrishnan et al., 2012; Nnam, 2015). Resultados adequados da gestação dependem da ingestão de nutrientes suficientes para atender aos requisitos maternos e fetais. As necessidades nutricionais maternas de energia e proteína encontram-se aumentadas durante a gestação para garantir o crescimento e o desenvolvimento fetal adequados; o desenvolvimento da placenta e dos tecidos maternos; o suprimento das maiores demandas metabólicas e a manutenção do peso materno e da prática de atividade física (Nnam, 2015). As recomendações alimentares e nutricionais variam de acordo com as diferenças individuais relacionadas ao estado nutricional materno, à faixa etária e ao estado de saúde da mulher (Kaiser e Allen, 2008). A energia é o principal determinante no ganho de peso gestacional. Evidência disponível sugere que a eficiência do metabolismo energético pode aumentar durante a gestação, mas os mecanismos envolvidos não são bem compreendidos (Abu-Saad e Fraser, 2010). A recomendação adicional de energia estabelecida em 1989 pelo Food and Nutrition Board/National Research Council (FNB/NRC), para as mulheres que iniciam a gestação com um peso saudável, corresponde a 300 kcal/dia a partir do 2º trimestre de gestação (National Research Council, 1989). Em 2004, o custo energético total da gestação de mulheres saudáveis indicado por especialistas da Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) e da OMS (FAO/WHO/UNU) foi de aproximadamente kcal, associado a estimativa de ganho de peso gestacional total entre 10 a 14 kg com média de 12 kg e recémnascidos 3,3 kg e menores índices de complicações materno-fetais. A recomendação deste grupo corresponde a um adicional de 85 kcal no primeiro trimestre, 285 kcal no segundo trimestre e 475 kcal no terceiro trimestre (FAO/WHO, 2004). O IOM recomenda um 50

51 REFERENCIAL TEÓRICO adicional 340 kcal no segundo trimestre e 452 kcal no terceiro trimestre (Institute of Medicine, 2009). De acordo com a American Dietetic Association, a maioria das mulheres gestantes precisa de a kcal/dia (Kaiser e Allen, 2008). As recomendações nutricionais na obesidade gestacional não são totalmente claras. A ingestão excessiva de energia durante a gestação pode ser tão prejudicial quanto a sua deficiência, especialmente em mulheres com sobrepeso e as obesas (Marangoni et al., 2016). De acordo com o IOM dos Estados Unidos, a distribuição do aporte de energia dos macronutrientes na dieta pode variar entre 10-35% de proteína, 20-35% de lipídios e 46-65% de carboidratos (Institute of Medicine, 2009). Entre os macronutrientes, geralmente a recomendação de ingestão de proteína requer mais atenção durante a gestação. A demanda proteica aumenta progressivamente para sustentar a síntese proteica, a fim de fornecer suporte nutricional para deposição e manutenção dos tecidos maternos e o crescimento fetal, especialmente durante o terceiro trimestre (Abu-Saad e Fraser, 2010). Estas adaptações são complexas e mudam gradualmente ao longo da gestação. O National Research Council (1989) recomenda um adicional de 10 g/dia de proteína ao longo da gestação. Em 2007, o comitê FAO/WHO/UNU revisou a recomendação de 1985 e estimou as necessidades proteicas adicionais de 1g, 9g e 31g/dia no 1º, 2º, 3º trimestres, respectivamente (WHO, 2007). A qualidade das gorduras na alimentação das gestantes é mais importante do que a sua quantidade total. Alguns ácidos graxos poli-insaturados (ácidos graxos ômega-6 e omega-3) são essenciais para o desenvolvimento humano e a saúde, mas não podem ser sintetizados pelo corpo humano, por isso devem ser obtidos por meio da alimentação. Durante a gestação, a alimentação e as reservas corporais de ácidos graxos poliinsaturados essenciais são fundamentais para atender às necessidades materna e fetal (Abu-Saad e Fraser, 2010; Marangoni et al., 2016). O consumo de um quantitativo maior de alimentos para satisfazer as necessidades energéticas, aliado ao aumento da absorção e eficiência da utilização de nutrientes que normalmente ocorre na gestação, geralmente são suficientes para satisfazer as necessidades da maioria dos nutrientes específicos. No entanto, a ingestão inadequada de micronutrientes é prejudicial durante as fases de desenvolvimento e crescimento do feto. Neste sentido, a suplementação de vitaminas e minerais pode ser apropriada em algumas situações, até mesmo antes da concepção (Kaiser e Allen, 2008; Nnam, 2015). 51

52 REFERENCIAL TEÓRICO A ingestão alimentar habitual materna é um dos determinantes do ganho de peso na gestação, e está associado direta ou indiretamente ao desenvolvimento de complicações durante a gestação. Estudos associam o maior consumo de alimentos não saudáveis no período gestacional, como alimentos processados e ultraprocessados, com o aumento do ganho de peso gestacional (Uusitalo et al., 2009) e a elevação da retenção de peso pós-parto (Martins e Benicio, 2011). A identificação de padrões alimentares tornou-se recentemente uma ferramenta útil em estudos epidemiológicos que procuram explorar a relação entre exposições dietéticas e desfechos relacionados ao estado de saúde (Thompson et al., 2010; Grieger, Grzeskowiak e Clifton, 2014). Neste contexto, os estudos sugerem que os padrões alimentares caracterizados por alta concentração de alimentos ricos em gorduras saturadas, açúcar refinado ou sódio estão associados aos desfechos adversos da gestação, quando comparados aos padrões alimentares caracterizados por uma variedade de frutas, vegetais e grãos integrais (Zhang et al., 2006; Brantsæter et al., 2009; Stuebe, Oken e Gillman, 2009; Ramakrishnan et al., 2012; Grieger, Grzeskowiak e Clifton, 2014; Englund-Ögge et al., 2014). Considerando que a gestação é um período em que as mulheres são mais propensas a mudar seu padrão de ingestão de alimentos devido à preocupação com a saúde da criança, a identificação e a compreensão dos fatores alimentares, juntamente com outros fatores que influenciam o ganho de peso gestacional, pode contribuir para formulação de estratégias de promoção de hábitos alimentares saudáveis antes e durante a gestação com o objetivo de reduzir o risco de resultados adversos da gestação (Grieger, Grzeskowiak e Clifton, 2014). 52

53 JUSTIFICATIVA 3 JUSTIFICATIVA A crescente prevalência da obesidade é bastante preocupante, pois está relacionada ao aumento do risco de doenças crônicas, como doenças cardíacas, hipertensão arterial, dislipidemias, diabetes, entre outras. A complexidade clínico-epidemiológica que envolve a temática da obesidade está fortemente associada aos fatores ambientais, especialmente aos hábitos alimentares e ao estilo de vida sedentário, aliados a fatores genéticos. A variação interindividual da obesidade e fenótipos relacionados têm origem em múltiplos determinantes genéticos, desta forma, a ciência tem avançado na identificação de genes específicos que possam estar associados à obesidade. Contudo, estudos de associação entre os polimorfismos nos genes relacionados à obesidade e às mudanças de peso corporal e consumo alimentar de gestantes ainda são escassos ou inexistentes. A interação entre genes e ambiente é importante no desenvolvimento da obesidade e pode apresentar importantes implicações em nível de saúde pública. A expectativa dos estudos genéticos é que os genes envolvidos na regulação da adiposidade corporal possam potencialmente responder a intervenções ambientais, alterando sua expressão. Assim, marcadores genéticos poderão auxiliar na identificação de indivíduos com maior chance de se beneficiar de intervenções sobre seu estilo de vida (hábitos dietéticos e prática de atividade física), direcionando a abordagem terapêutica para indivíduos de risco e minimizando os impactos negativos à saúde. Considerando o aumento progressivo da prevalência do sobrepeso e da obesidade em mulheres em idade fértil e a relevância epidemiológica das consequências da obesidade materna e do GPG excessivo, bem como o ciclo transgeracional de obesidade, investigações de fatores genéticos associados aos fenótipos da obesidade materna contribuem com avanços em direção a uma compreensão mais abrangente sobre a temática, podendo direcionar novas estratégias de prevenção da obesidade materna. Dessa forma, os resultados obtidos nesta tese de doutorado poderão contribuir para o direcionamento de novas evidências científicas que subsidiem políticas públicas de controle e prevenção dos desfechos relacionados ao excesso de peso materno. 53

54 HIPÓTESES 4 HIPÓTESES As hipóteses relacionadas aos estudos desta tese de doutorado são: Hipótese 1 Mulheres que apresentam algum dos polimorfismos nos genes estudados (FTO-rs ; MC4R-rs ; LEP-rs e LEPR-rs ) são mais suscetíveis ao excesso de peso pré-gestacional e ao ganho de peso gestacional excessivo. Hipótese 2 Mulheres portadoras dos polimorfismos nos genes LEP-rs e LEPR-rs apresentam maiores concentrações plasmáticas de leptina ao longo da gestação. Hipótese 3 Mulheres que apresentam algum dos polimorfismos nos genes isolados estudados (FTOrs ; MC4R-rs ; LEP-rs e LEPR-rs ) apresentam maior ingestão energética total, bem como maiores percentuais de energia derivados dos lipídios, carboidratos e de alimentos ultraprocessados. 54

55 OBJETIVOS 5 OBJETIVOS 5.1 OBJETIVO GERAL Estudar a associação entre os polimorfismos em genes relacionados à obesidade (FTOrs , MC4R-rs , LEP-rs e LEPR-rs ) e as mudanças de peso corporal e consumo alimentar em gestantes. 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Artigo 1 (i) Avaliar a associação entre os SNPs dos genes FTO e MC4R e o peso pré-gestacional e as mudanças do peso corporal materno durante a gestação e no pós-parto Artigo 2 (ii) Investigar se os SNPs dos genes da LEP e LEPR influenciam no peso pré-gestacional, no ganho de peso gestacional e nas concentrações plasmáticas de lep tina ao longo da gestação Artigo 3 (iii) Investigar a associação dos SNPs dos genes do FTO, MC4R, LEP e LEPR com a ingestão energética total e o percentual de energia derivados de macronutrientes e alimentos ultraprocessados durante os períodos pré-gestacional e gestacional. 55

56 MÉTODOS 6 MÉTODOS 6.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO O conjunto de dados utilizados nesta tese advém de um estudo de coorte prospectiva (projeto matriz) realizado no CMS HB, localizado no bairro da Tijuca no município do Rio de Janeiro, durante o período de novembro de 2009 a outubro de A execução do projeto correspondeu a coleta de dados em quatro períodos do seguimento: 13 semanas de gestação (SG) = 1 0 trimestre, SG = 2 0 trimestre e SG = 3 0 trimestre, e no pós-parto imediato (30 a 45 dias), conforme detalhamento na Figura ASPECTOS ÉTICOS O projeto de pesquisa que deu origem ao estudo da presente tese foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Secretaria Municipal de Saúde e Defesa Civil do município do Rio de Janeiro (Anexo 1) e pelo CEP do Hospital Maternidade Escola da UFRJ (Processo n ). A participação das mulheres na pesquisa esteve condicionada à assinatura de duas vias do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo 2), que foi obtida de forma livre e espontânea, após terem sido feitos todos os esclarecimentos pertinentes ao estudo. A constituição do biorrepositório foi devidamente aprovada (registro número 16647) pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP). 6.3 CRITÉRIOS DE ELEGIBILIDADE Os critérios de elegibilidade foram estabelecidos atendendo as exigências do projeto matriz. Deste modo, foram recrutadas mulheres que atenderam aos seguintes critérios de elegibilidade: (i) ter no máximo 13 SG; (ii) estar entre 20 e 40 anos de idade; (iii) estar livre de doenças infecto-parasitárias e DCNT, exceto obesidade; (iv) realizar o acompanhamento pré-natal no local de estudo. Do total das 299 mulheres que inicialmente aceitaram participar do estudo, 40 não atenderam aos seguintes critérios de elegibilidade: 12 mulheres confirmaram diagnóstico de doenças infecto-parasitárias; 2 mulheres confirmaram diagnóstico de DCNT; 16 mulheres estavam com mais de 13 SG no baseline; 10 mulheres abandonaram o acompanhamento do pré-natal na unidade de saúde. Desta forma, 259 mulheres atenderam aos requisitos de elegibilidade do estudo. 56

57 CAPTAÇÃO DAS GESTANTES MÉTODOS PERÍODO GESTACIONAL PÓS-PARTO 1 0 Trimestre (5-13 semanas) 2 0 Trimestre (20-26 semanas) 3 0 Trimestre (30-36 semanas) dias PRIMEIRA ENTREVISTA - Coleta de sangue (SNPs e Leptina) - Antropometria (Estatura e Massa corporal) - QFA (Consumo alimentar prégestacional) SEGUNDA ENTREVISTA - Coleta de sangue (Leptina) - Antropometria (Massa corporal) - Questionário Geral-2 (Dados demográficos, socioeconômicos, obstétricos e de estilo de vida) PRIMEIRA ENTREVISTA - Coleta de sangue (Leptina) - Antropometria (Massa corporal) - Questionário Geral-3 (Dados demográficos, socioeconômicos, obstétricos e de estilo de vida) - Questionário Geral-4 (Dados demográficos, socioeconômicos, obstétricos e de estilo de vida) - Antropometria (Massa corporal) - Questionário Geral-1 (Dados demográficos, socioeconômicos, obstétricos e de estilo de vida) SEGUNDA ENTREVISTA - QFA (Consumo alimentar gestacional) Figura 7. Coleta de dados em cada ponto de acompanhamento do estudo Abreviaturas: QFA = Questionário de frequência alimentar; SNPs = Polimorfismos de nucleotídeo único 57

58 MÉTODOS 6.4 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO Os critérios gerais de exclusão do presente estudo corresponderam a: (i) mulheres que abortaram durante o acompanhamento do estudo (n = 25); (ii) mulheres que apresentaram gestação gemelar (n = 4); (iii) mulheres que tiveram bebês natimortos (n = 5). Assim, a amostra inicial do estudo resultou em 225 mulheres. 6.5 CAPTAÇÃO DAS PARTICIPANTES DO ESTUDO A captação das mulheres para o estudo aconteceu durante o período de novembro de 2009 a outubro de A captação/recrutamento das mulheres na unidade de estudo ocorreu mediante abordagem às gestantes que compareceram pela primeira vez à consulta de pré-natal e às mulheres que obtiveram resultado positivo no teste imunológico de gravidez realizado na unidade. Visando subsidiar análises sobre potenciais vieses de seleção, as mulheres elegíveis inicialmente responderam a um questionário contendo as seguintes questões: data da última menstruação, idade, escolaridade, peso pré-gestacional, número de filhos prévios, informações sobre DCNT, doenças infecciosas, local da residência e local no qual seria realizado o pré-natal. Aquelas que se enquadravam nos critérios de elegibilidade, previamente estabelecidos na linha de base do estudo foram convidadas a participar do projeto. Do total de 322 mulheres convidadas a participar do estudo, 299 (92,7%) concordaram e tiveram a primeira entrevista agendada, após assinatura do TCLE. 6.6 CAPACITAÇÃO DA EQUIPE E CONTROLE DE QUALIDADE DOS DADOS A coleta de dados foi realizada por equipe composta por alunos de graduação e pósgraduação do Observatório de Epidemiologia Nutricional do INJC-UFRJ. A equipe foi devidamente capacitada, mediante treinamento prático na unidade do estudo durante o período de agosto a outubro de A entrada de novos entrevistadores na equipe foi condicionada a realização de novos treinamentos. Estratégias de controle da qualidade e consistência das informações foram adotadas mediante a elaboração de manuais e protocolos para a coleta dos dados. Foi realizado um estudo piloto no CMS HB, no período de setembro a outubro de 2009, com o objetivo de testar os instrumentos elaborados para a coleta de dados, propor e executar modificações nos questionários e aperfeiçoar as técnicas de aferição e logística. 58

59 MÉTODOS Após a realização das entrevistas para a coleta de dados, os questionários eram imediatamente revisados pelos entrevistadores e posteriormente por um revisor, visando minimizar erros de preenchimento. 6.7 PROCEDIMENTOS PARA COLETA DE DADOS A coleta de dados de campo ocorreu entre novembro de 2009 e junho de Os dados foram coletados mediante agendamentos prévios com a gestante. Para minimizar as perdas de seguimento, as participantes foram contatadas por telefone no dia anterior às entrevistas para confirmação do agendamento e para lembrá-las, quando necessário, das recomendações de jejum de 12 horas, em caso de coleta de sangue. A remarcação da entrevista também foi realizada por telefone para as gestantes que não puderam comparecer no dia em que estavam agendadas. Na impossibilidade do contato telefônico, cartas foram enviadas com a mesma finalidade. Em casos nos quais a gestante não compareceu a consulta do pré-natal próxima à data provável do parto, foram realizados contatos telefônicos para saber se o parto já havia ocorrido e, em caso positivo, para agendar a entrevista do pós-parto. 6.8 LOGÍSTICA DA COLETA DE DADOS No primeiro trimestre gestacional foram realizadas duas entrevistas. Na primeira entrevista foi aplicado um questionário semiquantitativo de frequência alimentar (QFA) para coletar informações sobre consumo alimentar referente ao período pré-gestacional (Anexo online 1). Também foram realizadas as medidas de massa corporal e de estatura e coleta de amostras de sangue. Na segunda entrevista foi aplicado o Questionário Geral-1 (Anexo online 2) para obtenção dos dados demográficos, socioeconômicos, obstétricos e de estilo de vida. No segundo trimestre gestacional foi aplicado o Questionário Geral-2 (Anexo online 3) e realizadas a aferição da massa corporal e nova coleta de amostra de sangue. No último trimestre da gestação foram realizadas duas entrevistas. Na primeira foi aplicado o Questionário Geral-3 (Anexo online 4), novamente aferida a massa corporal das gestantes e realizada nova coleta de amostra de sangue. Na segunda entrevista foi aplicado o QFA para obter dados de consumo alimentar referente ao período gestacional (Anexo online 5). 59

60 MÉTODOS A última coleta de dados ocorreu aproximadamente de quatro a seis semanas após o parto. Neste momento foi aplicado o Questionário Geral-4 do pós-parto (Anexo online 6) e realizada aferição da massa corporal das mulheres. 6.9 VARIÁVEIS DO ESTUDO A seleção das variáveis para compor os modelos finais das regressões pontuais e longitudinais se deu com base na plausibilidade biológica da associação e nos valores de p 0,20 na análise bivariada para cada uma das variáveis, conforme detalhado em cada artigo. No Quadro 4 são apresentadas as variáveis dependentes e independentes, de acordo com as análises das associações dos polimorfismos com os desfechos dos Artigos (A1, A2 e A3). A descrição das variáveis encontra-se a seguir. Quadro 4. Classificação das variáveis do estudo, de acordo com os artigos da tese. Variáveis do estudo Tipo da variável Dependente Independente Covariáveis Idade materna A1 A2 A3 Escolaridade materna A1 A2 Cor da pele referida pela mulher A1 A2 A3 PAFL A1 A2 Sexo da criança A1 Paridade A1 A2 A3 Idade gestacional A1 A2 A3 Hábito de fumar A1 A2 Renda familiar per capita A3 Ingestão energética no 1 0 trimestre A2 IMC pré-gestacional A1 A2 A1 A3 GPG no 1 0, 2 0 e 3 0 trimestres (g/sg) A1 GPG total (kg) A1 A1 GPG insuficiente A1 A2 GPG excessivo A1 A2 Retenção de peso pós-parto (g/sg) A1 IMC pós-parto (kg/m 2 ) A1 Peso materno (kg) A1 A2 A2 Leptina plasmática no 1 0, 2 0 e 3 0 trimestres (ng/dl) A2 A2 Leptina plasmática ao longo da gestação A2 Ingestão energética total (kcal/dia) A3 % de energia dos CHO A3 % de energia das PTN A3 % de energia dos LIP A3 % de energia dos alimentos ultraprocessados A3 SNP no gene FTO A1 A3 SNP no gene MC4R A1 A3 SNP no gene LEP A2 A3 SNP no gene LEPR A2 A3 Abreviaturas: A1 = Artigo 1; A2 = Artigo 2; A3 = Artigo 3; PAFL = prática de atividade física de lazer antes da gestação; IMC = índice de massa corporal; GPG = ganho de peso gestacional; SG = semana gestacional; CHO = carboidratos; PTN = proteínas; LIP = lipídios; SNP = polimorfismo de único nucleotídeo; FTO = massa de gordura e obesidade associadas; MC4R = melanocortina-4 receptor; LEP = leptina; LEPR = receptor da leptina. 60

61 MÉTODOS Informações demográficas, socioeconômicas, obstétricas e de estilo de vida As informações demográficas, socioeconômicas, obstétricas e de estilo de vida foram coletadas por meio de questionário geral estruturado respondido pelas participantes a cada trimestre da gestação e no pós-parto (Anexos online 2-4 e 6). As entrevistas foram realizadas presencialmente em local reservado (sala) na unidade de estudo. As variáveis relacionadas a este tópico e avaliadas no presente estudo foram: idade (anos), escolaridade (anos), paridade (número de filhos), idade gestacional (em semanas) sexo da criança, tabagismo durante a gestação (nunca fumou, fumante atual ou ex-fumante), prática de atividade física de lazer antes da gestação (sim ou não), cor da pele referida pelas mulheres (branca, parda/mulata/morena/cabocla) e renda per capita familiar. A idade gestacional foi avaliada em semanas e calculada a partir dos dados obtidos na primeira ultrassonografia (USG) realizada antes de 24 SG (Butt et al., 2014). Na ausência de informação sobre a semana gestacional pela USG, foi utilizada a data da última menstruação (DUM) para estimar a SG (n = 2) Medidas antropométricas A avaliação antropométrica foi realizada pela obtenção das medidas de massa corporal e estatura materna, de acordo com as técnicas de Lohman et al. (1988). A estatura foi medida apenas na primeira entrevista ( 13 SG), enquanto a massa corporal foi aferida nos três trimestres da gestação e no pós-parto. A aferição da massa corporal foi realizada em balança plataforma eletrônica com display digital (Filizola, São Paulo, Brasil), com precisão de 100 g e capacidade máxima de 150 kg. Devido à precisão da balança digital, a medição foi realizada apenas uma única vez em cada procedimento. Posteriormente, foi obtido a última medida de massa corporal materna registrada em prontuário médico durante a última consulta ao pré-natal. Também foi registrado a informação do peso pré-gestacional relatado pela gestante na primeira entrevista (baseline), quando era do seu conhecimento. A estatura foi medida em duplicata utilizando estadiômetro portátil (Seca, Hamburgo, Alemanha), com escala de medição de 0,5 cm. No caso de a diferença entre as medidas ser maior que 0,5 cm, uma terceira medida foi aferida e a média das duas medidas mais próximas foi utilizada nas análises. 61

62 MÉTODOS O IMC pré-gestacional foi obtido pela razão do peso pré-gestacional informado pela gestante na primeira entrevista e o quadrado da estatura aferida no baseline [peso (kg)/estatura (m 2 )]. O IMC pós-parto também foi calculado, considerando a massa corporal aferida neste período. A classificação do estado nutricional das mulheres obedeceu ao recomendado pela OMS (WHO, 2000): <18,5 kg/m 2 = baixo peso; 18,5 24,9 kg/m 2 = peso normal; 25,0 29,9 kg/m 2 = sobrepeso; 30,0 kg/m 2 = obesidade. O GPG total foi obtido pela diferença entre o último peso registrado em prontuário durante a última consulta ao pré-natal e o peso pré-gestacional informado pela gestante. As mulheres foram classificadas de acordo com as categorias de GPG (insuficiente, adequado e excessivo) com base nas recomendações do IOM descritas no Quadro 3. O GPG por trimestre da gestação também foi calculado e dividido pela SG correspondente. A retenção de peso pós-parto foi calculada pela diferença entre o peso aferido no pósparto e o peso pré-gestacional informado pela gestante no baseline Consumo alimentar As informações referentes ao consumo alimentar foram coletadas no baseline e no terceiro trimestre (30 36 SG). A primeira avaliação referiu-se ao consumo alimentar da mulher nos seis meses anteriores à concepção e a segunda correspondeu aos últimos seis meses anteriores à última entrevista. Para obtenção dos dados de consumo alimentar foi utilizado um QFA desenvolvido para a população adulta do Rio de Janeiro e validado utilizando o recordatório de 24 horas. Os coeficientes de correlação na validação para energia, carboidrato, proteína e gordura foram 0,44, 0,34, 0,44, e 0,41 respectivamente (Sichieri e Everhart, 1998). Este instrumento foi utilizado para o presente estudo (Anexos online 1 e 5). O QFA foi composto por 82 itens alimentares, incluindo bebidas não alcoólicas e alcoólicas, e 8 opções de respostas de frequência de consumo. As respostas de frequências de consumo apresentadas pelo instrumento foram posteriormente convertidas em frequências diárias de consumo da seguinte forma: >3 vezes/dia=4; 2 a 3 vezes/dia=2,5; 1 vez/dia=1; 5 a 6 vezes/semana=0,79; 2 a 4 vezes/semana=0,43; 1 vez/semana=0,14; 1 a 3 vezes/mês=0,07 e nunca ou quase nunca=0. As porções em medidas caseiras dos alimentos referidos no QFA foram quantificadas em gramas (g) e/ou mililitros (ml), mediante a utilização de tabela para avaliação de consumo alimentar em medidas caseiras (Pinheiro et al., 2004). 62

63 MÉTODOS Em seguida, as medidas quantificadas foram multiplicadas pelas frequências diárias de consumo de cada alimento para calcular o consumo diário de cada alimento. A Tabela Brasileira de Composição de Alimentos (TACO) (NEPA-UNICAMP, 2011) foi utilizada como base de dados principal para estimar o valor energético total dos alimentos consumidos no artigo 2. Itens alimentares não encontrados na TACO foram adicionados da tabela americana United States Department of Agriculture (USDA, 2011). No artigo 3 desta tese foi investigado o percentual de energia dos alimentos ultraprocessados. Estes alimentos foram classificados de acordo com as diretrizes do Guia Alimentar para População Brasileira (Ministério da Saúde, 2014), que considera os alimentos ultraprocessados como formulações industriais que são total ou predominantemente preparadas a partir de substâncias que são extraídas de alimentos (por exemplo, óleos, gorduras, açúcar, proteínas e amido), derivados de constituintes alimentares (por exemplo, gorduras hidrogenadas e amido modificado) ou sintetizados em laboratório a partir de substratos alimentares ou outras fontes orgânicas (por exemplo, corantes, aromatizantes, intensificadores de sabor e vários aditivos que são utilizados para dar aos produtos propriedades sensoriais atraentes). Também foi considerada a classificação NOVA, que agrupa os alimentos segundo a extensão e o propósito do processamento a que são submetidos (Monteiro et al., 2017). O Quadro 5 apresenta os produtos alimentares que representaram o grupo de alimentos ultraprocessados neste estudo Quadro 5. Produtos alimentares que representaram o grupo de alimentos ultraprocessados. Grupo de alimentos Produtos alimentares Pães Pão/pão francês/pão de forma. Massas Miojo/macarrão; lasanha/nhoque/ravióli. Bolo; biscoito recheado; biscoito doce/maizena /Maria ; biscoito Bolos e biscoitos salgado/cream cracker. Fast food Pizza; batata frita, chips/palha; hambúrguer. Salgados (risoli, coxinha, pastel, kibe); salgadinhos tipo Cheetos, Fofura, Snacks Torcida. Gorduras Margarina; maionese. Derivados do leite Iogurte; requeijão cremoso. Embutidos Salsicha/salsichão/linguiça; frios (mortadela, presunto, apresuntado, salame). Sorvete; balas; Chocolate em pó/nescau ; chocolate barra/ bombom; doce à base Doces de leite (pudim, doce leite). Refrigerantes à base de cola (Coca-Cola, Pepsi ) e outros refrigerantes Refrigerantes (guaraná, Fanta, Guaravita ). Bebida alcoólica destilada Vodka. Para os propósitos do artigo 3, os macronutrientes (lipídios, proteínas e carboidratos) e o consumo de bebidas alcoólicas (gramas/dia) foram calculados somando dados para o respectivo macronutriente/álcool em todos os itens alimentares. Estes valores foram então 63

64 MÉTODOS convertidos em energia multiplicando a quantidade total (g) de macronutrientes/álcool pelo número de kcalorias por grama (1 g de lipídio = 9 kcalorias, 1 g de proteína ou carboidrato = 4 kcalorias e 1 g de etanol = 7 kcalorias). As percentagens de energia derivadas das ingestões de lipídeos, carboidratos e proteínas foram calculadas dividindo o valor energético do macronutriente especifico pela soma de energia de todos os componentes (isto é, carboidratos, proteínas, gorduras e álcool) e depois multiplicando por 100. A percentagem diária de energia de alimentos ultraprocessados foi calculada dividindo a energia diária desses alimentos pela energia total consumida (kcal) e depois multiplicando por Dados bioquímicos e genéticos A coleta de amostra de sangue foi realizada por punção venosa periférica, utilizando materiais descartáveis. A coleta foi realizada por profissional da área de enfermagem no laboratório do CMS HB (local do estudo). Após a coleta, as amostras de sangue foram manipuladas e acondicionadas de acordo com os protocolos de realizações dos exames laboratoriais Concentração plasmática de leptina Foram realizadas coletas de sangue venoso periférico nas participantes do estudo nos três trimestres de acompanhamento, após jejum de 12 horas. O sangue coletado foi imediatamente centrifugado e as alíquotas de soro armazenadas a -80 o C em frasco para criogenia contendo gás nitrogênio, até serem transportadas para o Laboratório de Desenvolvimento de Alimentos para Fins Especiais e Educacionais (DAFEE) do INJC da UFRJ, no qual as amostras foram armazenadas e analisadas posteriormente. A concentração plasmática da leptina foi realizada pelo método Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), utilizando-se kits comerciais (Millipore, St. Charles, USA) com sensibilidade de 0,5 ng/ml Polimorfismos genéticos (FTO, MC4R, LEP e LEPR) Foi realizada uma coleta de sangue no primeiro trimestre da gestação de aproximadamente 5 ml, para determinação dos polimorfismos genéticos. O sangue foi coletado em tubos estéreis e armazenado em ultra freezer (-80ºC) para posterior análise. A primeira etapa da análise foi realizada no Laboratório de Metabolismo Macromolecular Firmino Torres de Castro, do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da UFRJ, e consistiu 64

65 MÉTODOS na extração total do DNA genômico a partir de leucócitos provenientes de sangue periférico venoso pelo método do fenol clorofórmio, de acordo com protocolo em anexo (Anexo 3). A segunda etapa foi realizada no Laboratório de Bioquímica Nutricional do INJC da UFRJ e consistiu na amplificação do fragmento de DNA extraído para avaliação dos polimorfismos estudados por discriminação alélica (TaqMan Genotyping Master Mix assay, Life Technologies detalhe do produto no link abaixo), adotando-se a técnica da reação em cadeia do DNA polimerase (PCR) em tempo real (StepOnePlus, Life Technologies, Guilford, CT, USA). A acurácia dos dados obtidos foi avaliada pela análise em duplicata de 10% da amostra, com obtenção de 99% de concordância. Link do produto: ANÁLISES ESTATÍSTICAS Foi construído banco de dados no software Stata Data Analysis and Statistical Software (STATA), versão Os dados foram digitados em duplicata e analisados quanto à consistência, antes de proceder à etapa de análise. Os do-files detalhados sobre as análises estatísticas dos dados apresentados nas tabelas principais dos artigos apresentados encontramse nos Apêndices A-C. Foram considerados estatisticamente significativos valores de p < 0,05. Na Figura 8 encontra-se o detalhamento do tamanho da amostra analisado, de acordo com os artigos apresentados nesta tese. Abaixo serão descritas as análises estatísticas realizadas neste estudo e, em seguida, serão apresentados nos Quadros 6A-C as análises estatísticas específicas dos Artigos desta tese. 65

66 MÉTODOS Gestantes convidadas a participar do estudo: N=322 Gestantes que concordaram participar do estudo: N = 299 (92.7%) 30 gestantes não atenderam aos critérios de eligibilidade: Confirmação do diagnóstico de doenças infecciosas (n=10) e parasitárias (n=2); DCNT (n=2); >13 semanas gestacional no baseline (n=16). Mulheres elegíveis a participarem do estudo: N = gestantes excluídas: Aborto (n=25); Gestação gemelar (n=4); Natimortos (n=5). Amostra inicial do estudo após os critérios de elegibilidade e exclusão: N = 235 sem dados do baseline (n=5) perdas de seguimento (n=9) abandonaram o pré-natal na unidade de estudo (n=10) N = 211 Gestantes Artigo 1: N = 136 Não soube informar peso pré-gestacional (n=8); Não genotipagem (n=67) Artigo 2: N = 147 Glicose plasmática 126 mg/dl (n=2); Não genotipagem (n=62) Artigo 3: N = 149 Não genotipagem (n=62 Figura 8. Fluxograma do tamanho amostral dos artigos apresentados na tese. Abreviaturas: DCNT = Doenças crônicas não transmissíveis. 66

67 MÉTODOS Análise descritiva Foram realizadas análises descritivas com o objetivo de verificar as características da amostra do estudo. Procedimentos clássicos como cálculo de médias e intervalos de confiança de 95% (IC 95%) ou desvio padrão (DP); medianas e intervalo interquartil (IQR) foram realizados para as variáveis contínuas simétricas e assimétricas, respectivamente. Para as variáveis categóricas foram apresentadas as medidas de frequência e proporção. Para testar diferenças entre estratos foram utilizados os testes t de Student ou análise de variância (ANOVA) para as variáveis simétricas e Mann Whitney U test ou Kruskal-Wallis para as variáveis assimétricas. Testes do chi-quadrado ou teste exato de Fisher foram utilizados para as variáveis categóricas. A normalidade foi testada por meio da construção de histogramas e, adicionalmente, pelo teste de Shapiro-Wilk Análise gráfica Gráficos foram construídos a partir de análises de regressão longitudinal de efeitos mistos com o objetivo de representar visualmente a evolução do peso materno ao longo da gestação, de acordo com os genótipos do gene FTO-rs Analise de regressão linear múltipla: Modelos ajustados de regressão linear múltipla foram utilizados com o objetivo de verificar a existência de associação entre as variáveis dependentes do artigo 1 (GPG e retenção de peso pós-parto), artigo 2 (concentração plasmática de leptina por trimestre gestacional) e artigo 3 (ingestão energética diária, percentual de energia dos macronutrientes e dos alimentos ultraprocessados) e os polimorfismos estudados Análise de regressão de Poisson Foi utilizada a regressão de Poisson com variância robusta para estimar os riscos relativos (RR) e IC 95%. Esta regressão foi utilizada para estimar a associação entre os polimorfismos estudados e as categorias de IMC pré-gestacional (< 25 e 25 kg/m 2 ) (Artigos 1 e 2) e IMC pós-parto (< 25 e 25 kg/m 2 ) (Artigo 1). Foi considerado o IMC 25,0 kg/m 2 como categoria de excesso de peso. Esta análise também foi utilizada para avaliar as associações entre os polimorfismos e as categorias de GPG (insuficiente e excessivo) (Artigos 1 e 2). 67

68 MÉTODOS Análise de regressão longitudinal de efeitos mistos Modelos de regressão longitudinal de efeitos mistos (LME longitudinal mixed effects) foram empregados para avaliar se houve alteração significativa nos desfechos ao longo da gestação, comparando entre os genótipos dos polimorfismos. As variáveis de desfechos utilizadas nesta análise foram o peso materno (Artigos 1 e 2), concentrações de leptina plasmática (Artigo 2), ingestão de energia total e percentual de energia dos macronutrientes e do grupo de alimentos ultraprocessados (Artigo 3). Esses modelos de regressão consideram a dependência entre as observações de um mesmo indivíduo e a semana gestacional exata da análise, não agrupando as mulheres apenas por trimestre gestacional. O modelo LME acomoda covariáveis tempo-dependentes e tempo-independentes e possibilita analisar dados com medidas repetidas não equidistantes. Nos modelos de regressão de LME dos Artigos 1 e 2 foi utilizada a idade gestacional linear e quadrática (variáveis referentes ao tempo), pois as mudanças longitudinais de peso corporal e concentração plasmática da leptina ao longo da gestação se assemelham a uma parábola. Para o Artigo 3 foi considerada apenas a idade gestacional linear. A idade gestacional foi analisada como variável de efeito aleatório no modelo para permitir variações individuais no peso, nas concentrações de leptina e na ingestão de energia ao longo do tempo, enquanto os polimorfismos e as demais variáveis foram analisados como efeitos fixos, permitindo assim verificar o efeito da variação comum entre as mulheres. As análises de regressão de LME do Artigo 3 foram realizadas com dados de consumo alimentar nos dois períodos de acompanhamento (pré-gestacional e gestacional). 68

69 MÉTODOS Quadro 6A. Quadro demonstrativo das técnicas de análise estatística do Artigo 1 OBJETIVO ANÁLISE ESTATÍSTICA VARIÁVEIS DEPENDENTES VARIÁVEIS DE CONTROLE Avaliar a associação entre SNPs (FTO e MC4R) e GPG. Regressão linear múltipla GPG por trimestre de gestação GPG total Modelo 1 = sexo da criança, PAFL, idade materna, cor da pele, paridade e idade gestacional. Avaliar a associação entre SNPs (FTO e MC4R) e retenção de peso pós-parto. Regressão linear múltipla Retenção de peso pós-parto por semana pós-parto Modelo 2 = Modelo 1 + IMC pré-gestacional. Modelo 1 = sexo da criança, PAFL, idade materna, cor da pele e paridade. Avaliar o risco relativo de excesso de peso prégestacional (IMC 25,0 kg/m 2 ), de acordo com SNPs dos genes FTO e MC4R. Avaliar o risco relativo de GPG insuficiente e GPG em excesso, de acordo com SNPs dos genes FTO e MC4R. Avaliar o risco relativo de excesso de peso pósparto (IMC 25,0 kg/m 2 ), de acordo com SNPs dos genes FTO e MC4R. Avaliar a trajetória do peso materno ao longo do período da gestação, de acordo com SNPs dos genes FTO e MC4R. Modelo 2 = Modelo 1 + GPG total. Regressão de Poisson Excesso de peso pré-gestacional Modelo 1 = PAFL, idade materna, cor da pele, escolaridade materna, paridade e hábito de fumar. Regressão de Poisson GPG insuficiente GPG em excesso Modelo 2 = Modelo 1 + estatura materna. Modelo 1 = sexo da criança, PAFL, idade materna, cor da pele, paridade. Modelo 2 = Modelo 1 + IMC pré-gestacional. Regressão de Poisson Excesso de peso pós-parto Modelo 1 = PAFL, idade materna, cor da pele, escolaridade materna, paridade e hábito de fumar. Regressão longitudinal de efeitos mistos (LME) Peso materno ao longodo período da gestação Modelo 2 = Modelo 1 + IMC pré-gestacional. Obs.: Idade gestacional foi utilizada como variável de efeito aleatório em todos os modelos. Variáveis fixas: Modelo 1 = SG e SG 2. Modelo 2 = Modelo 1 + sexo da criança, escolaridade materna, PAFL, idade materna, cor da pele, paridade, hábito de fumar e estatura materna. Modelo 3 = Modelo 2 - estatura materna + IMC pré-gestacional. Abreviaturas: SG = semana gestacional; SNP = polimorfismo de único nucleotídeo; FTO = massa de gordura e obesidade associadas; MC4R = melanocortina-4 receptor; PAFL = prática de atividade física de lazer antes da gestação; GPG = ganho de peso gestacional; IMC = índice de massa corporal. Notas: Variáveis categóricas: sexo da criança; PAFL (sim ou não); cor da pele (branca e não branca); hábito de fumar (nunca fumou e fumante + ex-fumante); paridade (0, 1 e 2). 69

70 MÉTODOS Quadro 6B. Quadro demonstrativo das técnicas de análise estatística do Artigo 2 OBJETIVO ANÁLISE ESTATÍSTICA VARIÁVEIS DEPENDENTES VARIÁVEIS DE CONTROLE Avaliar a associação entre SNPs (LEP e LEPR) e concentrações plasmáticas de leptina. Avaliar o risco relativo de excesso de peso prégestacional (IMC 25,0 kg/m 2 ), de acordo com SNPs dos genes LEP e LEPR. Rregressão linear múltipla Leptina no 1 0 trimestre Leptina no 2 0 trimestre Leptina no 3 0 trimestre PAFL, SG, idade materna, cor da pele, hábito de fumar e peso corporal materno no trimestre. Regressão de Poisson Excesso de peso pré-gestacional PAFL, idade materna, cor da pele, paridade, hábito de fumar, ingestão energética pré-gestacional e escolaridade materna. Avaliar o risco relativo de GPG insuficiente e GPG em excesso, de acordo com SNPs dos genes LEP e LEPR. Regressão de Poisson GPG insuficiente GPG em excesso PAFL, SG do parto, idade materna, cor da pele, paridade, hábito de fumar, leptina do primeiro trimestre e IMC pré-gestacional. Avaliar a trajetória do peso materno ao longo do período da gestação, de acordo com SNPs dos genes LEP e LEPR. Regressão longitudinal de efeitos mistos (LME) Peso materno ao longo do período da gestação Obs.: idade gestacional foi utilizada como variável de efeito aleatório no modelo. Variáveis fixas: SG, SG 2, PAFL, idade materna, cor da pele, hábito de fumar, paridade, escolaridade materna e estatura materna. Avaliar a trajetória da concentração plasmática de leptina ao longo do período da gestação, de acordo com SNPs dos genes LEP e LEPR. Regressão longitudinal de efeitos mistos (LME) Concentração plasmática de leptina ao longo do período da gestação Obs.: idade gestacional foi utilizada como variável de efeito aleatório no modelo. Variáveis fixas: SG, SG 2, PAFL, idade materna, cor da pele, hábito de fumar e peso materno ao longo da gestação. Abreviaturas: SG = semana gestacional; SNP = polimorfismo de único nucleotídeo; LEP = leptina; LEPR = receptor da leptina; PAFL = prática de atividade física de lazer; GPG = ganho de peso gestacional; IMC = índice de massa corporal. Notas: Variáveis categóricas: PAFL (sim ou não); cor da pele (branca e não branca); hábito de fumar (nunca fumou e fumante + ex-fumante); paridade (0 e 1). 70

71 MÉTODOS Quadro 6C Quadro demonstrativo das técnicas de análise estatística do Artigo 3 OBJETIVO ANÁLISE ESTATÍSTICA VARIÁVEIS DEPENDENTES VARIÁVEIS DE CONTROLE Avaliar a associação entre SNPs (FTO, MC4R, LEP e LEPR) e ingestão energética (kcal/dia) durante os períodos pré-gestacional e gestacional. Avaliar a associação entre SNPs (FTO, MC4R, LEP e LEPR) e % energético dos macronutrientes durante os períodos prégestacional e gestacional. Avaliar a associação entre SNPs (FTO, MC4R, LEP e LEPR) e % energético dos alimentos ultraprocessados durante os períodos prégestacional e gestacional. Avaliar a trajetória da ingestão energética materno ao longo do período da gestação, de acordo com SNPs dos genes FTO, MC4R, LEP e LEPR. Avaliar a trajetória do % energético dos macronutrientes ao longo do período da gestação, de acordo com SNP dos genes FTO, MC4R, LEP e LEPR. Avaliar a trajetória do % energético dos alimentos ultraprocessados ao longo do período da gestação, de acordo com SNP dos genes FTO, MC4R, LEP e LEPR. Regressão linear múltipla Regressão linear múltipla Rregressão linear múltipla Regressão longitudinal de efeitos mistos (LME) * Considerando as gestantes com QFA nos 2 pontos. Regressão longitudinal de efeitos mistos (LME) * Considerando as gestantes com QFA nos 2 pontos. Regressão longitudinal de efeitos mistos (LME) * Considerando as gestantes com QFA nos 2 pontos. Ingestão energética total: Pré-gestacional e gestacional % de energia CHO % de energia PRO % de energia LIP Pré-gestacional e gestacional % de energia dos alimentos ultraprocessados Pré-gestacional e gestacional: Ingestão energética total ao longo do período da gestação % de energia CHO ao longo da gestação % de energia PRO ao longo da gestação % de energia LIP ao longo da gestação % de energia dos alimentos ultraprocessados ao longo da gestação. Modelo ajustado idade materna, cor da pele, paridade, SG do 1 0 trimestre, renda per capita, IMC pré-gestacional. Modelo ajustado idade materna, cor da pele, paridade, SG do 1 0 trimestre, renda per capita, IMC pré-gestacional. Modelo ajustado idade materna, cor da pele, paridade, SG 1 0 trimestre, renda per capita, IMC pré-gestacional. Obs.: Idade gestacional foi utilizada como variável de efeito aleatório no modelo. Variáveis fixas: SG, idade materna, cor da pele, paridade, renda per capita, IMC pré-gestacional. Obs.: SG (idade gestacional) foi utilizada como variável de efeito aleatório no modelo. Variáveis fixas: SG, idade materna, cor da pele, paridade, renda per capita, IMC pré-gestacional. Obs.: SG (idade gestacional) foi utilizada como variável de efeito aleatório no modelo. Variáveis fixas: SG, idade materna, cor da pele, paridade, renda per capita, IMC pré-gestacional. Abreviaturas: CHO = carboidratos; PRO = proteínas; LIP = lipídeos; SG = semana gestacional; SNP = polimorfismo de único nucleotídeo; FTO = massa de gordura e obesidade associadas; MC4R = melanocortina-4 receptor; LEP = leptina; LEPR = receptor da leptina; IMC = índice de massa corporal; PAFL = prática de atividade física de lazer. Notas: Variáveis categóricas: PAFL (sim ou não); cor da pele (branca e não branca); hábito de fumar (nunca fumou e fumante + ex-fumante); paridade (0 e 1). 71

72 RESULTADOS 7. RESULTADOS A seção de resultados foi dividida em três artigos elaborados para a tese de doutorado, sendo o primeiro publicado, o segundo aceito para publicação e o terceiro submetido para publicação. 7.1 Artigo 1 Association of the FTO (rs ) and MC4R (rs ) gene polymorphisms with maternal body weight during pregnancy. Associação dos polimorfismos dos genes FTO (rs ) e MC4R (rs ) com o peso corporal materno durante a gestação. 7.2 Artigo 2 Leptin (rs ) and leptin receptor (rs ) gene polymorphisms and body weight changes and leptin concentrations throughout pregnancy. Polimorfismos nos genes da leptina (rs ) e do receptor da leptina (rs ) e mudanças do peso corporal e das concentrações de leptina ao longo da gestação. 7.3 Artigo 3 Associations between obesity candidate gene polymorphisms (FTO, MC4R, LEP and LEPR) and dietary intake in pregnancy women. Associações entre polimorfismos nos genes candidatos à obesidade (FTO, MC4R, LEP e LEPR) e ingestão dietética em mulheres gestantes. 72

73 RESULTADOS (Artigo 1) 7.1 ARTIGO 1. ASSOCIATION OF THE FTO (RS ) AND MC4R (RS ) GENE POLYMORPHISMS WITH MATERNAL BODY WEIGHT DURING PREGNANCY (Anexo 4) Publicado no periódico Nutrition em 2016 (v. 32, n. 11, p , 2016) Abstract Objective: Fat mass and obesity (FTO) and melanocortin 4 receptor (MC4R) genes have been consistently associated with the risk of obesity, but few studies have examined the association of the obesity-risk alleles with gestational outcomes. Our aim was to evaluate the association between single-nucleotide polymorphisms (SNPs) of the FTO (rs ) and MC4R (rs ) genes with changes in maternal body weight during pregnancy. Methods: A sample of 136 pregnant women were followed in a prospective cohort at 5-13, and gestational weeks and days postpartum. SNPs were analyzed by realtime PCR. Associations between polymorphisms and the outcomes were investigated through longitudinal linear mixed-effects models, multiple linear regression models and Poisson regression models. Results: A SNP in the FTO (rs ) gene but not in the MC4R (rs ) gene was significantly associated with pre-pregnancy BMI 25 kg/m 2 (RRFTO=2.1; 95%CI 1.4 to 3.1). Neither SNP was statistically associated with excessive gestational weight gain (GWG) and postpartum weight retention (PPWR). For FTO (rs ) gene, women with the AA genotype were heavier in the body weight trajectory of pregnancy, but not when their weight had been adjusted for pre-pregnancy BMI (βfto=0.5 kg; 95%CI -1.9 to 3.0). These women started pregnancy heavier but gained less weight (FTO*gestational age=-0.1; 95%CI: -0.2 to 0.03) when compared to those with at least one T allele. Conclusions: The FTO (rs ) AA genotype is positively associated with pre-pregnancy excessive weight. We found no evidence of a significant effect of the MC4R (rs ) or the FTO (rs ) gene polymorphisms on the GWG and PPWR. Keywords: pregnancy, weight gain, weight retention, polymorphism, cohort study. 73

74 RESULTADOS (Artigo 1) Introduction Pregnancy is a complex process in women lifecycle, in which several metabolic adaptations happen to support fetal development, delivery and lactation. Excessive gestational weight gain (GWG) is associated with increased risks of pregnancy-induced hypertension, caesarean delivery and a large-for-gestational age infant [1, 2]. It is also the primary factor contributing to increased postpartum weight retention [3, 4] and may contribute to the epidemic of obesity among women of childbearing age [5, 6]. An individual s susceptibility to obesity is thought to result from a combination of their genetics, behavior and environment [7, 8]. Genetic factors play an important role in the development of obesity. Up to date, several single nucleotide polymorphisms (SNPs) of obesogenic genes associated with the increased risk of overweight or obesity and with behavioral risk factors have been published [8, 9]. In particular, the variant rs T/A of the fat mass and obesity-associated protein (FTO) gene, located in the intron 1 on chromosome 16q12.2 [10], and the variant rs T/C of the melanocortin-4 receptor (MC4R) gene, mapped 188 kb downstream of the gene and encoded by a single exon gene on chromosome 18q22 [11], have been well documented as major contributors to obesity populations [10, 12-15]. Given the relevance of maternal and fetal fat to overall GWG, it is conceivable that genetic variants that are known to be associated with adiposity might be associated with GWG [16]. To the best of our knowledge, few studies were able to investigate the longitudinal association between polymorphism (FTO and MC4R) and the body weight throughout pregnancy. The results are still inconclusive [16-18], requiring more research for elucidating the role of these genetic markers on pregnancy body weight change. Thus, the aim of the present study was to examine the association of the FTO (rs ) and MC4R (rs ) gene polymorphisms with changes in maternal body weight during pregnancy. Methods Study design We analyzed data of a prospective cohort of pregnant women who received prenatal care at public health center in the city of Rio de Janeiro, Brazil, from November 2009 to October Data were collected at three time points during the pregnancy: 5 th to 13 th (first 74

75 RESULTADOS (Artigo 1) trimester), 20 th to 26 th (second trimester) and 30 th to 36 th (third trimester) gestational weeks and in early postpartum (30 to 45 days). Pregnant women were enrolled in the cohort if they were between their 5 th and 13 th weeks of gestation, between 20 and 40 years of age, without any history of infectious or chronic diseases (except obesity) and had the intention to attend the prenatal care in the selected public health center. Figure 1 shows the flow the recruitment and selection of the participants from the current study. At enrollment, 299 women were interviewed, and only those meeting the eligibility criteria were included in the baseline sample and follow-up. Women were excluded for the following reasons: confirmed pre-gestational infection diagnosis or non-communicable diseases (n=14), > 13 gestational weeks at enrollment (n=16), or abandoned prenatal care at the public health center (n=10). We further excluded from the analysis pregnant women who suffered stillbirths (n=5) or miscarriages (n=25); had twin pregnancies (n=4); did not attend the baseline visit (n=5); were missing self-reported pre-pregnancy weight (n=8); and were lost to follow-up (n=9). We also excluded data from 67 participants because we did not have genotype SNPs. After these exclusions data from 136 participants were available for analysis. In general, no differences were observed in relation to the anthropometric and socioeconomic variables when we compared women who were lost to genotyping with those who had data; although, the women included in this study were younger and presented a lower frequency of pre-pregnancy LTPA than those without genetic information (Supplementary Table 1). However, the analyses of outcomes of interest were adjusted for these variables. Anthropometric measurements At enrollment, the women were asked to record their pre-pregnancy weight. Their weights (kg) were measured during pregnancy and postpartum using a digital scale (Filizzola PL 150, Filizzola Ltda, Brazil). We also obtained the weight recorded in the last visit of prenatal care (36 th to 42 th week). Height (cm) was measured only in the first trimester using a portable stadiometer (Seca Ltda, Hamburg, Germany). Pre-pregnancy body mass index (BMI) [weight (kg)/height 2 (m)] was calculated using the self-reported pre-pregnancy weight, and the postpartum BMI, by using the weight measured in the early postpartum. 75

76 RESULTADOS (Artigo 1) Total GWG (kg) was estimated using the difference between the last weight measured prior to delivery and the self-reported pre-pregnancy weight. Maternal weight gains up to the first, second and third trimesters were calculated and divided by the weeks of gestation. In addition, women were classified according to categories of GWG (insufficient, normal and excessive) based on the Institute of Medicine (IOM) recommendations [19]. Postpartum weight retention (PPWR) was calculated by the difference between the early postpartum weight and the self-reported pre-pregnancy weight. The gestational age (weeks) was estimated based on the first ultrasound performed prior to the 24 th week of gestation. For those without an ultrasound or when the first ultrasound was performed after the 24 th week of gestation, the gestational age was calculated based on the reported date of the last menstrual period (n=2). Covariates Structured interviews were conducted to obtain the following maternal data: maternal age at baseline (years), self-reported skin color (white/black or mixed), living with partner (yes/no), education (years of schooling), self-reported pre-pregnancy leisure-time physical activity (LTPA) (no/yes), smoking habit (non-smoking, former smoker and current smokes), parity (number of deliveries) and the sex of the child. The total energy intake (kcal/d) was assessed with a validated food frequency questionnaire (FFQ) [20], which was administered in the first and third trimesters of the pregnancy. Genotyping At baseline visit, blood samples (5 ml) were collected, processed and stored at -80º C until polymorphisms analysis. DNA was extracted by phenol-chloroform method. SNP rs and rs of the MC4R and FTO genes, respectively, were analyzed by Real Time PCR amplification (StepOnePlus, Life Technologies) using an allelic discrimination assay (TaqMan Genotyping Master Mix assay, Life Technologies). Duplicates were performed in 10% of sample with 99% agreement rates. Statistical analyses The continuous variables in asymmetric distributions were expressed as the medians and interquartile range (IQR), whereas the measurement data in symmetric distributions were 76

77 RESULTADOS (Artigo 1) presented as the means and standard deviations (SD) and absolute and relative frequencies to describe categorical ones. We employed additive and recessive models for the FTO (rs ) gene because previous studies had demonstrated that one risk allele has little or no effect and two are required to cross the threshold [10] [12]. We employed only the dominant model for the MC4R (rs ) gene because the number of minor allele homozygotes was small in our sample (n=4). The participants were further classified into two groups to investigate the combined effect of MC4R (rs ) and FTO (rs ): (1) those with at least one risk allele of each polymorphism or (2) those carrying only one risk allele from one of the polymorphisms or none of the risk alleles. Multiple linear regression models were performed to examine the associations between the changes in maternal body weight, assessed as GWG and PPWR and the maternal genotypes. In addition, Poisson s regression with robust variance was used to address the association between genotypes and GWG categories according to IOM [19] and also with prepregnancy BMI classified into two categories (<25 or 25 kg/m²), allowing an estimation of the relative risks (RR) and it s 95% confidence interval (95% CI). Longitudinal linear mixed-effects (LME) models were performed to test the association between the polymorphisms and weight trajectories during pregnancy. These models do not assume linear weight gain over the period of gestation but allow for the gradient of weight across pregnancy. LME models account for random variation among individuals and between individuals [21], which allows for the estimation of subject-specific means. These models also account for unbalanced data due to measurements at irregular time points of observation. Gestational age (weeks) was included in all models both as random and fixed effects to adjust for variations in weight over time. The FTO/MC4R polymorphisms and all other covariates were analyzed as fixed-effects. The quadratic gestational age term was included in all models to adjust for the longitudinal changes in weight during pregnancy that resemble a parabola. We also tested the interaction term between genotypes and gestational age to evaluate whether the association between weight and genotypes differed between the gestational weeks. The dependencies in the data were handled with an unstructured covariance matrix. The multivariable analyses were adjusted for potential confounders. Covariates were chosen as potential confounding factors based on the biological plausibility of the association and their p-values in the bivariate analysis with each of the outcome variables. All covariates 77

78 RESULTADOS (Artigo 1) that presented a p-value 0.20 in the bivariate analysis were selected to compose the final model of each outcome variable in the regression analyses. Because the association between pre-pregnancy BMI and gestational weight gain is nonlinear, both linear and quadratic terms were included in the models. Different models were constructed for each outcome and we used the restricted loglikelihood and Akaike s information criterion as global fit criteria to select the best model. A significance level at 5% was considered in all the analysis. Statistical analyses were performed using STATA software (version 12.0, College Station, Texas, USA). Ethical procedures The study protocol was approved by the Ethics Committee of the Municipality Secretary of Health of Rio de Janeiro City (Protocol number: ). All subjects enrolled in this study gave written informed consent for their participation after an explanation of the study. Results The median age of participants was 27 (IQR: 22 to 31) years old, and 73.5% women reported as having black or mixed skin color (Table 1). The genotype frequencies were TT=33.8%, AT=49.3% and AA=16.9% for the FTO (rs ) and TT=64.0%, CT=33.1% and CC=2.9% for the MC4R (rs ). These frequencies were in Hardy Weinberg equilibrium for both SNPs. The AA genotype of the FTO (rs ) gene, for the additive and recessive models, was significantly associated with higher pre-pregnancy mean weights (p=0.01; p<0.01, respectively) and BMI (p<0.01) and with higher gestational body weight at the first (p=0.02; p=0.01, respectively) and the second (p=0.05; p=0.02, respectively) trimesters in comparison to the other genotypes, but not with maternal height. Women having the polymorphic MC4R (rs ) genotype did not show any statistically significant difference for pre-pregnancy weight, BMI or maternal height (Table 1). Women with the AA genotype of the FTO (rs ) gene presented a higher risk of pre-pregnancy excessive weight compared to those with AT/TT genotypes (RR=2.1; 95%CI 1.4 to 3.1), even after adjustment for maternal pre-pregnancy LTPA, age, skin color, education, parity, smoking and height (Table 2). 78

79 RESULTADOS (Artigo 1) The risk alleles of both polymorphisms were no longer statistically associated with GWG after adjusting for pre-pregnancy BMI. In our adjusted models, neither the FTO (rs ) (RR=0.9; 95%CI 0.5 to 1.6) nor the MC4R (rs ) (RR=1.1; 95%CI 0.7 to 1.7) risk alleles were associated with a higher risk of excessive GWG according to IOM guidelines (Table 2). Similar results were found for the combined effect of the MC4R (rs ) and FTO (rs ) (Supplementary Table 2). We did not find a significant association between these SNPs and the PPWR (Tables 1 and 2). Women with the AA genotype were at a higher risk of postpartum overweight than the TT/AT carriers (RR=1.7; 95%CI 1.3 to 2.3); however, this result lost significance after adjustment for the pre-pregnancy BMI (RR=1.0; 95%CI 0.8 to 1.2) (Table 2). Homozygous women for the A allele of the FTO (rs ) gene were approximately 9 kg heavier during pregnancy, compared to those with the TT/AT alleles in our adjusted models for gestational age, education, smoking, skin color, sex of the child, age, pre-pregnancy LTPA, parity and height. The result lost significance after adjustment for the pre-pregnancy BMI (βfto=0.5 kg; 95%CI -1.9 to 3.0) (Table 3). Women with the AA genotype of the FTO (rs ) gene presented a lower rate of change of weight trajectories during pregnancy (βfto*time =-0.1; 95%CI -0.2 to -0.03), compared to those with the TT/AT (Supplementary Figure 1 and Table 3). We found no association between the MC4R (rs ) polymorphism and weight trajectories during pregnancy in our adjusted models for gestational age, education, smoking, skin color, sex of the child, age, prepregnancy LTPA, parity and pre-pregnancy BMI (Table 3). Discussion This study has three main findings. First, we observed that the FTO (rs ) polymorphism but not the MC4R (rs ) polymorphism was positively associated with pre-pregnancy excessive weight. Secondly, we did not find a significant association between any of the polymorphisms and GWG or PPWR. Finally, we observed that women who were homozygous for the FTO (rs ) risk allele were heavier when beginning pregnancy but gained less weight throughout gestation than those with the AT or TT genotypes. We investigated the FTO SNP rs and the MC4R SNP rs in our study because they have shown to have a strong association with body weight in previous studies [10, 12-15]. The association of these genes polymorphisms with the obesity phenotype 79

80 RESULTADOS (Artigo 1) in a multiethnic group such as the Brazilian population has not been previously reported. The minor allele frequency observed in this study (0.42 and 0.20 for rs A-allele and rs C-allele, respectively) were quite similar to those in the international HapMap project CEU data (0.45 and 0.26, respectively) and within the range of reported values in other studies (0.44 and 0.24, respectively) [10, 14]. The mechanisms underlying the physiological relationship between FTO (rs ) and MC4R (rs ) and alterations of body weight are yet to be elucidated. It is known that FTO and MC4R are highly expressed in the hypothalamic region [22, 23], an area that is known to be involved in the regulation of appetite. Habitual diet is one of the many environmental factors that potentially contribute to inter-individual differences in body fat mass. In this study, we did not find significant association between FTO SNP rs and MC4R SNP rs with energy intake, which is in line with the findings of Hasselbalch et al. [24], but inconsistent with the findings of other studies [25, 26]. The dietary information collected on our study is based on an extensive self-reported FFQ and several components of dietary intake were studied. We identified that pregnant women with the risk alleles (AA) of FTO (rs ) had a higher risk to have pre-pregnancy overweight BMI (RR=2.1 (95%CI , p<0.01), which is consistent with the findings of Lawlor et al. [16] study, where FTO (rs ) was associated with pre-pregnancy BMI. These British pregnant women presented mean difference per risk allele of 0.40 kg/m 2 (95%CI ). In contrast, Groth et al. [18] reported that the FTO (rs ) risk alleles were not associated with pre-pregnancy BMI in a study of low-income black pregnant women. Our sample is composed of low-income women, but the degree of miscegenation in Brazil is very high and the racial/ethnic composition of this study was based only in self-reported skin color (73.5% black or mixed). Different populations are exposed to the different environmental and genetic influences that may interact with genetic variants. On the other hand, our results are consistent with investigations that have indicated that FTO plays a key role in changes in adiposity-related phenotypes in populations around the world [12, 13, 27]. In our study, carriers of two copies of the risk allele of FTO (rs ) had significantly higher body weight than the homozygous subjects showing the major allele, which is in agreement with the results of previous studies [10, 28]. Common variants near MC4R have been reproducibly associated with the fat mass, weight and risk of obesity [9, 14, 29]. Lawler et al. [16] found no association between 80

81 RESULTADOS (Artigo 1) MC4R (rs ) and pre-pregnancy BMI but found a positive association with the prepregnancy weight (p=0.001). Such association was not observed in our study. Other studies have also failed to find a significant association [30, 15]. A longitudinal study investigating the life-course effects of variants in the FTO gene (rs ) and near the MC4R gene (rs ) demonstrated that the effects strengthen throughout childhood and peak at age 20 before weakening during adulthood [31]. In our study, at baseline, the median maternal age was 27 (IQR: 22 to 31) years old. The effects of the FTO and MC4R genes on pre-pregnancy weight may have occurred due to the effects of the genes on promoting weight gain during the youngest age and may continue at the same level throughout life, depending on the effect size of the polymorphism and exposure to an obesogenic environment [30]. In this study, no association was found between the risk alleles of the FTO/MC4R genes with GWG by trimester, total GWG and risk of excessive GWG, according to the IOM categories in our adjusted models. Lawlor et al. [16] indicated that the FTO (rs ) and MC4R (rs ) genes were not statistically associated with GWG by the period of pregnancy and by IOM categories. Stuebe et al. [17] found higher GWG among African American participants with two MC4R (rs ) risk alleles compared with women with no MC4R (rs ) risk alleles but among Caucasian women, MC4R carriage was inversely associated with weight gain. For FTO (rs ) gene, Stuebe et al. [17] reported that Caucasian women homozygous for the risk allele, so in thin as in obese, gained more weight than low-risk allele carriers, but among women of average pre-pregnancy BMI, weight gain was similar in spite of allele carriage; although, they found no association between this SNP and the greater GWG. GWG includes several other components (i.e. the fetus, amniotic fluid, and placenta). In addition, during pregnancy, women go through many biological, hormonal and behavioral changes, which could have the potential to mask smaller genetic associations and may interact and modify the susceptibility to obesity by the FTO and MC4R variants, influencing the genetic contributions on GWG [19]. We observed that women with the AA genotype of the FTO (rs ) gene had higher body weight during pregnancy; however, the association was no longer significant after adjustment for the pre-pregnancy BMI. These women gained less weight compared to those with the AT/TT genotypes based on the LME models. This discrepancy might reflect the fact that obese women tend to gain less weight during pregnancy [32]. We also did not 81

82 RESULTADOS (Artigo 1) find an association between the MC4R (rs ) polymorphism and weight trajectories during pregnancy. We did not observe an association between the FTO (rs ) and MC4R (rs ) polymorphisms on the PPWR at <45 days after adjustment for the prepregnancy BMI, which is in agreement with the study by Lawlor et al. [16], where the PPWR was calculated at approximately 8 weeks after delivery. The PPWR is presumably due to a combination of several factors, such as dietary intake, lack of physical activity, lactation, smoking status, pre-pregnancy BMI, GWG and parity [33] and also genetics [4]. Our study has strengths and limitations. The main strength is the availability of standardized longitudinal weight measurements across pregnancy, which allowed analysis of the genetic associations with the changes of body weight over time. In addition, we controlled our results for important confounding variables, such as gestational age, education, smoking, skin color, pre-pregnancy LTPA, age and parity. On the other hand, some limitations from our study must be highlighted. We relied on self-reported pre-pregnancy weight as is the case in most studies of GWG, and misclassification of GWG may not be ruled out as for women who inaccurately reported their pre-pregnancy weights. However, previous studies have shown that self-reported pre-pregnancy weight is a good approximation of the true weight [34, 35]. Another limitation of our study is the small sample size, which resulted in a lower power for detecting a statistically significant effect of the polymorphism in the weight changes during pregnancy. Besides that, we were able to find that FTO (rs ) polymorphism showed some association with pre-pregnancy BMI, but not with MC4R (rs ) polymorphism. This could be due to the lower power of the study, or indeed, to a real small effect size in this relationship. Our results agreed in the direction and significance of the association when compared to the other two studies on the same topic (Lawlor and Stuebe), that definitely presented a bigger sample size to detect an effect size for the studied polymorphisms [16, 17]. In conclusion, our study found that the SNP in the FTO gene (rs ) but not in the MC4R gene (rs ) was significantly associated with pre-pregnancy excessive weight. However, these women gained less weight throughout gestation than women with the AT and TT genotypes, and neither of the polymorphisms were statistically associated with excessive GWG and PPWR. The characterization of effects of the genetic factor implicated in weight gain during pregnancy and postpartum may potentially guide targeted intervention for preventing obesity and the avoidance of adverse pregnancy complications. However, further replications of association studies with different ethnicities and larger cohorts or cohort 82

83 RESULTADOS (Artigo 1) consortiums and a sampling strategy that collects additional time points throughout the pregnancy are necessary to improve our understanding of the specific roles of FTO and MC4R in gestational weight. 83

84 RESULTADOS (Artigo 1) References [1] Li N, Liu E, Guo J, Pan L, Li B, Wang P, et al. Maternal prepregnancy body mass index and gestational weight gain on pregnancy outcomes. PloS One 2013;8:e doi: /journal.pone [2] Gaillard R, Durmuş B, Hofman A, Mackenbach JP, Steegers EA, Jaddoe VW. Risk factors and outcomes of maternal obesity and excessive weight gain during pregnancy. Obesity 2013;21: [3] Mannan M, Doi SA, Mamun AA. Association between weight gain during pregnancy and postpartum weight retention and obesity: a bias-adjusted meta-analysis. Nutr Rev 2013;71: [4] Rong K, Yu K, Han X, Szeto IM, Qin X, Wang J, et al. Pre-pregnancy BMI, gestational weight gain and postpartum weight retention: a meta-analysis of observational studies. Public Health Nutr 2015;18: [5] Ng M, Fleming T, Robinson M, Thomson B, Graetz N, Margono C, et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during : a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study The Lancet 2014;384: [6] Raatikainen K, Heiskanen N, Heinonen S. Transition from Overweight to Obesity Worsens Pregnancy Outcome in a BMI-dependent Manner. Obesity 2006;14: [7] Warrington NM, Wu YY, Pennell CE, Marsh JA, Beilin LJ, Palmer LJ, et al. Modelling BMI trajectories in children for genetic association studies. PloS One 2013;8:e [8] Albuquerque D, Stice E, Rodríguez-López R, Manco L, Nóbrega C. Current review of genetics of human obesity: from molecular mechanisms to an evolutionary perspective. Mol Genet Genomics 2015:1 31. [9] Speliotes EK, Willer CJ, Berndt SI, Monda KL, Thorleifsson G, Jackson AU, et al. Association analyses of 249,796 individuals reveal 18 new loci associated with body mass index. Nat Genet 2010;42: [10] Frayling TM, Timpson NJ, Weedon MN, Zeggini E, Freathy RM, Lindgren CM, et al. A common variant in the FTO gene is associated with body mass index and predisposes to childhood and adult obesity. Science 2007;316: [11] Farooqi IS, Keogh JM, Yeo GSH, Lank EJ, Cheetham T, O Rahilly S. Clinical spectrum of obesity and mutations in the melanocortin 4 receptor gene. N Engl J Med 2003;348: doi: /nejmoa [12] Dina C, Meyre D, Gallina S, Durand E, Körner A, Jacobson P, et al. Variation in FTO contributes to childhood obesity and severe adult obesity. Nat Genet 2007;39:

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87 RESULTADOS (Artigo 1) Pregnant women at enrollment: did not meet eligibility criteria: confirmed pre-gestational infection diagnosis or noncommunicable diseases [n=14], >13 gestational weeks at enrollment [n=16] or abandoned prenatal care at the public health center [n=10]. Folow-up: 259 participants Stillbirth [n=05] Miscarriage [n=25] Twin pregnancies [n=4] 225 participants 13 Missing data: did not attend baseline visit [05], missing selfreported pre-pregnancy weight [n=08]. Losses to follow-up: only information at baseline [n=09]. 203 participants of the current study 64 did not have blood samples for genotyping and 03 had only genotiping for one of the polymorphisms. Final sample 136 participants included in study with FTO and MC4R data Figure 1 - Flowchart illustrating the recruitment and selection of the study population 87

88 RESULTADOS (Artigo 1) Table 1 - Maternal characteristics according to the FTO (rs ) and the MC4R (rs ) gene polymorphisms Descriptive Characteristic N Total FTO (rs ) MC4R (rs ) Recessive model Additive model Dominant model TT/AT AA p-value TT AT AA p TT CT/CC p-value Maternal age 1, years (22 to 31) 27 (23 to 31) 24 (22 to 32) (23 to 31) 27 (22 to 31) 24 (22 to 32) (22 to 32) 27 (22 to 31) 0.90 Self-reported skin color Black or mixed 100 (73.5) 85 (75.2) 15 (65.2) (69.6) 53 (79.1) 15 (65.2) (70.1) 39 (79.6) 0.23 Education 1, years (6 to 11) 9 (6 to 11) 9 (7 to 11) (5 to 11) 10 (7 to 11) 9 (7 to 11) (6 to 11) 9 (6 to 11) 0.73 Living with partner Yes 111 (81.6) 93 (82.3) 18 (78.3) (89.1) 52 (77.6) 18 (78.3) (81.6) 40 (81.6) 0.99 Smoking habit at baseline Non-smoking 97 (71.3) 80 (70.8) 17 (73.9) (67.4) 49 (73.1) 17 (73.9) (70.1) 36 (73.5) 0.68 Pre-pregnancy LTPA No 108 (80.6) 88 (79.3) 20 (87.0) (80.0) 52 (78.8) 20 (87.0) (78.8) 41 (83.7) 0.49 Parity (40.4) 45 (39.8) 10 (43.5) 16 (34.8) 29 (43.3) 10 (43.5) 39 (44.8) 16 (32.6) 1 45 (33.1) 40 (35.4) 5 (21.7) (37.0) 23 (34.3) 5 (21.7) (27.6) 21 (42.9) (26.5) 28 (24.8) 8 (34.8) 13 (28.2) 15 (22.4) 8 (34.8) 24 (27.6) 12 (24.5) Sex of the child Male 64 (47.8) 54 (48.2) 10 (45.5) (40.0) 36 (53.7) 10 (45.4) (55.8) 16 (33.3) 0.01 Calorie intake 1, kcal/d ( to ) ( to ) ( to ) ( to ) ( to ) ( to ) ( to ) ( to ) Self-reported pre-pregnancy weight 3, kg < Maternal height 3, cm Pre-pregnancy BMI 3, kg/m < b b a < Pregnancy weight in 1 st trimester 3, kg b b a Pregnancy weight in 2 nd trimester 3, kg Pregnancy weight in 3 rd trimester 3, kg Postpartum weight retention 3, kg Abbreviations: FTO - fat mass and obesity-associated gene; MC4R - melanocortin-4 receptor gene; LTPA - leisure time physical activity; BMI - body mass index. Data are presented as: 1 median (IQR), p-value refers to Mann-Whitney U test or Kruskal-Wallis; 2 absolute frequency (%), p-value refers to Pearson χ 2 tests or Fisher's exact test; 3 mean + SD, p-value refers to Student's t test or analysis of variance (ANOVA). Different letters in the same row indicate significant differences (Tukey's test p < 0.05)

89 RESULTADOS (Artigo 1) Table 2 - Associations of adiposity risk alleles (FTO and MC4R) with body weight changes before, during pregnancy and early postpartum FTO recessive model (rs ) risk alleles (AA) MC4R dominant model (rs ) risk alleles (CT/CC) Characteristics Crude Adjusted Crude Adjusted Model 1 Model 2 Model 1 Model 2 β (95% CI) β (95% CI) β (95% CI) β (95% CI) β (95% CI) β (95% CI) GWG in 1 st trimester 1, g/wk ( to 18.7) ( to 21.0) ( to 116.8) 10.5 ( to 152.2) 43.9 ( to 193.5) 93.7 (-52.3 to 239.6) GWG in 2 nd trimester 1, g/wk ( to 6.5) ( to 5.2) ( to 48.5) -2.4 (-82.9 to 78.0) 33.2 (-50.9 to 117.3) 40.2 (-41.4 to 121.7) GWG in 3 rd trimester 1, g/wk ( to 14.5) ( to 23.4) ( to 14.6) 25.6 (-53.8 to 104.9) 36.9 (-43.4 to 117.1) 26.0 (-56.2 to 108.2) Total GWG 1, kg -3.6 (-6.2 to -1.1) * -3.4 (-6.1 to -0.7) * -1.9 (-4.5 to 0.7) -0.8 (-2.8 to 1.3) -0.1 (-2.2 to 2.1) 0.3 (-1.7 to 2.4) PPWR 2, g/wk ( to 52.6) ( to 109.0) ( to 428.9) ( to 158.8) ( to 270.2) ( to 138.9) RR pre-pregnancy BMI 3 overweight (BMI 25 kg/m 2 ) 2.2 (1.4 to 3.2) ** 2.1 (1.4 to 3.1) ** 2.1 (1.4 to 3.1) ** 1.0 (0.6 to 1.6) 1.1 (0.7 to 1.7) 1.1 (0.7 to 1.7) RR total GWG by IOM category 4 insufficient a 0.8 (0.5 to 1.5) 0.8 (0.5 to 1.4) 0.8 (0.4 to 1.5) 0.9 (0.6 to 1.3) 0.9 (0.5 to 1.5) 0.9 (0.5 to 1.4) excessive b 1.0 (0.5 to 1.7) 1.0 (0.6 to 1.7) 0.9 (0.5 to 1.6) 1.0 (0.7 to 1.5) 1.1 (0.7 to 1.7) 1.1 (0.7 to 1.7) RR postpartum BMI 5 overweight (BMI 25 kg/m 2 ) 1.7 (1.3 to 2.2) ** 1.7 (1.3 to 2.3) ** 1.0 (0.8 to 1.2) 1.1 (0.8 to 1.5) 1.2 (0.8 to 1.6) 0.9 (0.7 to 1.2) Abbreviations: FTO - fat mass and obesity-associated gene; MC4R - melanocortin-4 receptor; GWG - gestational weight gain; CI - confidence interval; RR - relative risk; PPWR - postpartum weight retention. * p<0.05; ** p<0.01 Calculated as the difference between post- and pre-pregnancy weights and adjusted for weeks since birth. Note that estimates in this row is relative risk (RR); Wald tests were used to derive the p values. 1 Model 1 was adjusted for sex of the child, pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported, parity and gestational age; Model 2= Model 1 plus pre-pregnancy BMI (linear and quadratic terms). 2 Model 1 was adjusted for sex of the child, pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported and parity; Model 2= Model 1 plus total weight gain. 3 Model 1 was adjusted for pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported, years of education, parity and smoking maternal status; Model 2= Model 1 plus maternal height. 4 Model 1 was adjusted for sex of the child, pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported and parity; Model 2= Model 1 plus pre-pregnancy BMI (linear and quadratic terms). 5 Model 1 was adjusted for pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported, years of education, parity and smoking maternal status; Model 2= Model 1 plus pre-pregnancy BMI (linear and quadratic terms). a Pre-pregnancy BMI: kg/m 2 (GWG <11.5 kg); kg/m 2 (GWG <7.0 kg); 30.0 kg/m 2 (GWG <5.0 kg). b Pre-pregnancy BMI: kg/m 2 (GWG >16.0 kg); kg/m 2 (GWG >11.5 kg); 30.0 kg/m 2 (GWG >9.0 kg). 89

90 RESULTADOS (Artigo 1) Table 3 - Longitudinal analysis between FTO (rs ), MC4R (rs ) and trajectory of body weight during pregnancy Trajectory of maternal weight * Model 1 1 Model 2 2 Model 3 3 β (95% CI) p β (95% CI) p β (95% CI) p FTO (rs ) TT or AT vs. AA 8.7 (3.2 to 14.2) (3.9 to 13.6) < (-1.9 to 3.0) Interaction term FTO#gestational age -0.1 (-0.2 to -0.03) (-0.2 to -0.03) (-0.2 to -0.03) Likelihood AIC MC4R (rs ) TT vs. CT or CC 2.7 (-1.5 to 6.9) (-1.0 to 6.4) (-0.2 to 3.6) Likelihood AIC Aggregate score (FTO/MC4R) TT/TT or A or C vs. A e C 2.3 (-2.2 to 6.9) (-1.8 to 6.2) (-1.6 to 2.5) Likelihood AIC Abbreviations: BMI - body mass index; CI - confidence interval; FTO - fat mass and obesity-associated gene; MC4R - melanocortin-4 receptor; AIC - Akaike s information criterion. β = Linear mixed-effect regression coefficient. p-value refers to the maximum likelihood estimator. 1 Model 1 was adjusted for gestational age (weeks) and also for quadratic gestational age; 2 Model 2 = Model 1 plus years of education, smoking maternal status, self-reported skin color, sex of the child, maternal age, pre-pregnancy LTPA, parity and maternal height; 3 Model 3 = Model 2 minus maternal height and plus pre-pregnancy BMI (linear and quadratic terms). * Weight at 0 week gestation (referred to as self-reported pre-pregnancy weight ) and weight change from 5 to 13 weeks, from 20 to 26 weeks, from 30 to 36 weeks and last weight before to delivery. 90

91 RESULTADOS (Artigo 1) Supplementary Table 1 - Descriptive characteristics of the study population, by participation or non-participation in the genetic study Characteristic Women enrolled in the cohort Participants of the genetic study Non-participants of the genetic study N N N p-value Descriptive Maternal age 1, years (22, 31) (22, 31) (21, 28) 0.04 Self-reported skin color Black or mixed 147 (72.4) 100 (73.5) 47 (70.2) 0.61 Education 1, years (7, 11) (6, 11) 67 9 (7, 11) 0.85 Living with partner Yes 162 (79.8) 111 (81.6) 51 (76.1) 0.36 Smoking habit at baseline Non-smoking 150 (73.9) 97 (71.3) (79.1) 0.24 Pre-pregnancy LTPA No 148 (74.4) 108 (80.6) 40 (61.5) <0.01 Parity (38.9) 55 (40.4) 24 (35.8) 1 76 (37.4) 45 (33.1) 31 (46.3) (23.7) 36 (26.5) 12 (17.9) Sex of the child Male 99 (49.5) 64 (47.8) 35 (53.0) 0.48 Calorie intake 1, kcal/d 200 2, , , (1,889.1, 2,855.5) (1,895.1, 2,641.7) (1,872.4, ) 0.19 Self-reported pre-pregnancy weight 3, kg Maternal height 3, cm Pre-pregnancy BMI 3, kg/m Pregnancy weight in 1 st trimester 3, kg Pregnancy weight in 2 nd trimester 3, kg Pregnancy weight in 3 rd trimester 3, kg Postpartum weight retention 3, kg Abbreviations: LTPA refers to leisure time physical activity; BMI refers to Body Mass Index.Data are presented as: 1 median (IQR), p-value refers to Mann-Whitney U test; 2 absolute frequency (%), p-value refers to Pearson χ 2 tests or Fisher's exact test; 3 mean + SD, p-value refers to Student's t test. 91

92 RESULTADOS (Artigo 1) Supplementary Table 2 - Associations of combined effect of FTO (rs ) and MC4R (rs ) with body weight changes before, during pregnancy and immediate postpartum FTO and MC4R risk alleles (AA or AT and CC or CT) Characteristics Crude Adjusted Model 1 Model 2 β (95% CI) β (95% CI) β (95% CI) GWG in 1 st trimester 1, g/wk (-203.6, 103.9) (-190.9, 128.4) 20.9 (-135.7, 177.5) GWG in 2 nd trimester 1, g/wk (-123.1, 50.3) -2.7 (-92.6, 87.3) 5.8 (-81.3, 92.9) GWG in 3 rd trimester 1, g/wk (-133.2, 38.2) (-104, 67.0) (-118.9, 55.9) Total GWG 1, kg -2.3 (-4.5, -0.1) * -1.6 (-3.8, 0.8) -1.1 (-3.3, 1.0) PPWR 2, g/wk (-983.5, -79.7) * (-915.0, 18.7) (-319.6, 158.2) RR pre-pregnancy BMI 3 overweight (BMI 25 kg/m 2 ) 1.2 (0.8, 2.0) 1.2 (0.8, 1.9) 1.2 (0.8, 1.9) RR total GWG by IOM category 4 insufficient a 0.7 (0.4, 1.2) 0.7 (0.4, 1.3) 0.7 (0.4, 1.3) excessive b 1.1 (0.7, 1.8) 1.3 (0.8, 2.0) 1.2 (0.8, 1.9) RR postpartum BMI 5 overweight (BMI 25 kg/m 2 ) 1.2 (0.9, 1.7) 1.2 (0.9, 1.7) 1.0 (0.7, 1.3) Abbreviations: FTO refers to fat mass and obesity-associated gene; MC4R refers to melanocortin-4 receptor; GWG refers to gestational weight gain; CI refers to confidence interval; RR - relative risk; PPWR - postpartum weight retention. * p<0.05; ** p<0.01 Calculated as the difference between post- and pre-pregnancy weights and adjusted for weeks since birth. Note that estimates in this row is relative risk (RR); Wald tests were used to derive the p values. 1 Model 1 was adjusted for sex of the child, pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported, parity and gestational age; Model 2= Model 1 plus pre-pregnancy BMI (linear and quadratic terms). 2 Model 1 was adjusted for sex of the child, pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported and parity; Model 2= Model 1 plus total weight gain. 3 Model 1 was adjusted for pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported, years of education, parity and smoking maternal status; Model 2= Model 1 plus maternal height. 4 Model 1 was adjusted for sex of the child, pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported and parity; Model 2= Model 1 plus pre-pregnancy BMI (linear and quadratic terms). 5 Model 1 was adjusted for pre-pregnancy LTPA, maternal age, skin color self-reported, years of education, parity and smoking maternal status; Model 2= Model 1 plus pre-pregnancy BMI (linear and quadratic terms). a Pre-pregnancy BMI: kg/m 2 (GWG <11.5 kg); kg/m 2 (GWG <7.0 kg); 30.0 kg/m 2 (GWG <5.0 kg). b Pre-pregnancy BMI: kg/m 2 (GWG >16.0 kg); kg/m 2 (GWG >11.5 kg); 30.0 kg/m 2 (GWG >9.0 kg). 92

93 RESULTADOS (Artigo 1) Supplementary Figure 1 - Trajectory of body weight during pregnancy by FTO (rs ) polymorphism Note: β (95% CI): -0.1 (-0.2 to -0.03); p=0.007 a) TT or AT genotypes (n=113) and AA genotype (n=23). b) Fitted values were predicted using a linear mixed-effect (LME) regression model adjusted for gestational age (linear and quadratic terms), years of education, smoking maternal status, self-reported skin color, sex of the child, maternal age, self-reported pre-pregnancy leisure-time physical activity, parity and pre-pregnancy BMI (linear and quadratic terms). c) Weight at 0 week gestation (referred to as self-reported pre-pregnancy weight ) and weight change from 5 to 13 weeks, from 20 to 26 weeks, from 30 to 36 weeks and last weight before to delivery. 93

94 RESULTADOS (Artigo 2) 7.2 ARTIGO 2. LEPTIN (RS ) AND LEPTIN RECEPTOR (RS ) GENE POLYMORPHISMS AND BODY WEIGHT CHANGES AND LEPTIN CONCENTRATIONS THROUGHOUT PREGNANCY Aceito para publicação no periódico Nutrition Research em 2017 ABSTRACT Leptin gene (LEP) and leptin receptor gene (LEPR) polymorphisms have been associated with body weight and leptin concentration. We hypothesized that LEP-rs and LEPRrs genes are related to risk of pre-pregnancy overweight/obesity (BMI 25 kg/m2), as well as excessive gestational weight gain (GWG) and high concentrations of leptin throughout pregnancy. We investigated a prospective cohort of 147 Brazilian pregnant women that was followed through 5-13, and gestational weeks. Genetic variants of the LEP and LEPR were analyzed by real-time PCR and leptin by enzyme linked immunosorbent assay. Maternal body weight and plasma leptin concentrations were measured throughout pregnancy. Statistical analyses included multiple linear regression, linear mixedeffects and Poisson regression models. Genotype AA carriers for the LEP-rs gene kept lower body weight throughout pregnancy compared to those with GG or GA+GG carriers ([βaavsgg= kg; 95% CI, to -1.61, p=0.01]; [βaavsga+gg= kg; 95%CI, to -1.25, p=0.02]). The A-allele was significantly associated with an increased risk for excessive GWG ([RRLEP-GAvsGG, 2.16; 95% CI, ]; [RRLEP-AAvsGG, 2.37; 95% CI, ]). Neither LEP-rs nor LEPR-rs polymorphisms were significantly associated with pre-pregnancy overweight/obesity risk and leptin concentrations throughout pregnancy. In conclusion, our results indicate that women carriers of AA genotype for LEP-rs displayed lower body weight throughout pregnancy compared to those that were GG or GA+GG carriers. LEP-rs was significantly associated with an increased risk for excessive GWG, but the results do not support significant associations of the LEP-rs and LEPR-rs with pre-pregnancy overweight/obesity risk and leptin concentrations throughout pregnancy. Keywords: Polymorphisms, leptin, pregnancy, body weight gain, cohort study 94

95 RESULTADOS (Artigo 2) 1. INTRODUCTION Obesity is currently considered to be one of the major public health problems worldwide. Consequently, the number of overweight women is increasing and has already reached 40% of the overall female population, while 15% were classified as obese in 2014 [1]. Inevitably, the number of women entering pregnancy with obesity is also rising. Higher maternal body weight before pregnancy and excessive gestational weight gain (GWG) results in a significant increase in pregnancy adverse outcomes, including preeclampsia, gestational diabetes mellitus, cesarean delivery, postpartum complications [2] and a greater risk of maternal mortality [3]. With the rise of obesity prevalence, molecular epidemiology studies have evaluated the association of different genetic polymorphisms in genes such as FTO, MC4R, PPARG, ADBR2, INSIG2, with the risk of obesity [4,5]. Several single nucleotide polymorphisms (SNPs) of adipokine genes, such as leptin (LEP) and leptin receptor (LEPR), are studied because they interact at the central level, particularly in the hypothalamus. The LEPrs SNP is a G to A transition at nucleotide position upstream of the ATG start site in the LEP gene 5 promoter region [6] and the A-allele has been associated with increased leptin production and secretion from adipocytes as compared with the G allele [7]. The LEPR-rs SNP is an A to G transition in codon 223 (CAG to CGG) at position 668 in exon 6, and causes a non-conservative change (glutamine to arginine) [8] and potentially a disruption in the leptin-signaling pathway, contributing to the impact on body weight [9]. Leptin has important effects in controlling body weight, metabolism [10] and reproductive functions [11]. Therefore, it could be anticipated that genetic variations in the leptin gene can modulate its circulating levels and may affect various pathophysiological states, one of which is obesity [12]. It is secreted predominantly by adipocytes in white adipose tissue [13], but during pregnancy leptin is also synthesized by the placenta [14] and its levels are much higher during pregnancy than that of non-pregnant women [15]. In pregnant women, studies have demonstrated an association between serum leptin concentrations and pre-pregnancy body mass index (BMI) [16], and GWG [13], indicating that mechanisms mediating leptin/leptin receptor synthesis may be sensitive to the fluctuation of maternal weight as the pregnancy progresses. Although some studies have demonstrated significant associations between SNPs of LEP and LEPR genes and body weight [6,17] and leptin concentrations [12,18] in the adult 95

96 RESULTADOS (Artigo 2) population, little is known about associations of these polymorphisms with pre-pregnancy weight, GWG and plasma repeated measure leptin concentrations throughout pregnancy. The hypothesis of the present study is that the SNPs in the LEP-rs and LEPR-rs genes are related to the risk of pre-pregnancy overweight/obesity, as well as excessive GWG and high concentrations of leptin throughout pregnancy. Therefore, the aims of this study were to (1) assess whether LEP-rs and LEPR-rs SNPs can influence the prepregnancy body weight and GWG, and further (2) verify whether these SNPs can influence the leptin concentrations throughout pregnancy in a prospective cohort of Brazilian pregnant women. 2. METHODS AND MATERIALS 2.1. Research design We analyzed data from a prospective cohort of pregnant women who received prenatal care at a public health center in the city of Rio de Janeiro from November 2009 to October Data were collected over three visits during pregnancy: 5 to 13 (baseline), 20 to 26 and 30 to 36 gestational weeks (GW) Subjects A total of 299 pregnant women were enrolled in the study if they were between 5 and 13 GW, between 20 and 40 years of age, devoid of any history of infectious or noncommunicable chronic diseases (NCDs) (except obesity), and had the intention to attend the prenatal care in the selected public health center. Following the baseline clinical evaluation, women were excluded for several reasons. Thus, the baseline sample consisted of 147 pregnant women (143 participants with LEP and LEPR SNPs, two with only LEP and two with only LEPR SNPs). A subsample of pregnant women participated in a clinical trial nested within the main cohort with omega-3 supplementation (fish oil) after the second trimester (n=36). Therefore, we excluded from the analysis the plasma leptin concentration data from these women in the third trimester. We also excluded these women from the longitudinal and GWG analysis (Figure 1). 96

97 RESULTADOS (Artigo 2) The ethics committee of the Municipality Secretary of Health of Rio de Janeiro City (Protocol number: , 13 August 2009) approved the study. Written informed consent was obtained from the study participants. All ethical procedures of this study involving human beings followed the Brazilian Resolution 196/ Anthropometric measurements At enrollment, women self-reported their pre-pregnancy body weight. Maternal body weight (kg) was measured during pregnancy using a digital scale (Filizzola PL 150, Filizzola Ltda, Brazil). We also obtained the weight recorded on the medical record at the last visit of the prenatal care (between 36 to 42 GW). Height (cm) was measured at the baseline visits using a portable stadiometer (Seca Ltda, Hamburg, Germany) in duplicates according to standardized procedures [19], and the means of these measures was used. Pre-pregnancy BMI was calculated using self-reported pre-pregnancy weight (kg) divided by the square of height (in meters), and classified into two categories: underweight or normal weight (BMI < 25 kg/m2) and overweight/obese (BMI 25 kg/m2). GWG (kg) was estimated by using the difference between the weight recorded on the medical record at the last visit of the prenatal care and the self-reported pre-pregnancy weight. GWG was classified as insufficient, adequate or excessive according to the Institute of Medicine of the United States of America (IOM) [3] Laboratory assays At the baseline visit, venous blood samples (5 ml) were collected, processed, and stored at -800C until polymorphisms analysis were performed. DNA was extracted from whole blood samples by a proteinase K and phenol-chloroform method. SNPs rs of the LEP gene and rs of the LEPR genes were determined by real-time polymerase chain reaction amplification method (StepOnePlus, Life Technologies, Guilford, CT, USA) using an allelic discrimination assays (TaqMan Genotyping Master Mix assay, Life Technologies). The accuracy of genotyping was evaluated by performing duplicate analysis of 10% of sample with 99% agreement rates. Maternal venous blood samples (5 ml) were collected in EDTA tubes after a 12-hour fasting period for all follow-ups. The blood samples were centrifuged (5,000 rpm for 5 min), 97

98 RESULTADOS (Artigo 2) and the plasma was separated and stored at 800C until analysis. Plasma leptin (ng/dl) levels were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) using commercial kits (Millipore, St. Charles, Missouri, USA) with sensitivities of 0.5 ng/dl Covariates Structured interviews were conducted to obtain the following maternal data: age at baseline (years), self-reported skin color (white/black or brown), education (years of schooling), self-reported pre-pregnancy leisure-time physical activity (LTPA) (no/yes), smoking habit at baseline (nonsmoking, former smoker and current smoker), calorie intake (kcal/d) and parity (number of deliveries). The total calorie intake (kcal/d) was assessed with a validated food frequency questionnaire (FFQ) [20], which was administered in the first trimester of the pregnancy. The gestational age (week) was estimated based on the first ultrasound performed prior to 24 weeks of gestation, however the reported date of the last menstrual period was used if the ultrasound was not available (n=2) Statistical analysis Data are reported as means and standard deviation (SD), as medians and interquartile ranges (IQRs) or as counts and percentages. Due to the positive skew observed in the distribution of the leptin concentrations, the data was log transformed before statistical analysis and subsequently back-transformed for easy interpretation of the results as geometric means and 95% confidence interval (95% CI). Data were analyzed using STATA statistics software (version 12.0, College Station, TX, USA) and a significance level at 5% was assumed in all the analysis. Comparisons between SNPs and maternal characteristics were assessed by Student s t test or analysis of variance, Mann Whitney U test or Kruskal-Wallis and chi-square test or Exact Fisher test, according to the distribution of the variables. The potential associations between polymorphisms and plasma leptin concentrations were evaluated using multiple linear regression analysis adjusted by covariates. Poisson s regression with robust variance was used to address the association between genotypes and pre-pregnancy BMI categories (< 25 and 25 kg/m2) and also with GWG categories according to the IOM [3] adjusted by covariates, allowing an estimation of the relative risks (RR) and 95% CI. 98

99 RESULTADOS (Artigo 2) Longitudinal linear mixed-effects (LME) models were performed to test the association between the SNPs and the changes of plasma leptin concentrations and body weight throughout pregnancy. LME regression coefficients account for the dependency between observations of the same individual and for the exact gestational age of date collection, not grouping women by gestational trimesters. Gestational age was included in all models as both random and fixed effects to adjust for the overall and the individual variations in leptin concentrations and body weight over time. The LEP/LEPR polymorphisms and all other covariates were analyzed as fixed-effects only. The quadratic gestational age term was included in all models to adjust for the longitudinal changes in plasma leptin concentrations and body weight that resemble a parabola. The dependencies in the data were handled with an unstructured covariance matrix. The variables included in the adjusted models were chosen based on the biological plausibility of the associations with both polymorphisms and outcomes. The pre-pregnancy BMI models were adjusted for self-reported pre-pregnancy LTPA, maternal age, self-reported skin color, parity, maternal smoking status, calorie intake in the first trimester and years of education. The models having GWG as the outcome were adjusted for self-reported prepregnancy LTPA, gestational age at delivery, maternal age, self-reported skin color, parity, maternal smoking status, first trimester log leptin, and pre-pregnancy BMI. The models having plasma leptin concentrations as the outcome were adjusted for self-reported prepregnancy LTPA, gestational age, maternal age, self-reported skin color, maternal smoking status and maternal body weight throughout pregnancy. 3. RESULTS 3.1. Maternal characteristic The sample consisted of pregnant women with the following medians (IQR): age of 27 years (22-31 years), 9 years of education (7-11 years), 74.8% of women self-reported as having black or brown (mixed race) skin color and 72.8% reported being nonsmokers at baseline. There were 34.7% of pregnant women with pre-pregnancy BMI 25 kg/m2 (21.8% were overweight [n=32] and 12.9% with obesity [n=19]), and 65.3% with pre-pregnancy BMI < 25 kg/m2 (3.4% were underweight [n=5] and 61.9% with normal weight [n=91]) (data not shown). Women who were overweight/obese prior to pregnancy gained less weight than 99

100 RESULTADOS (Artigo 2) underweight or normal weight women during pregnancy (10.9 ± 7.0 vs ± 5.0; p=0.02) and were more likely to have gained excessive GWG (p<0.01) when compared to underweight or normal weight women. We found an increase in the geometric means of leptin concentration from the first to the second trimester followed by a slight decline in the third trimester ([15.5; 95% CI = ] [27.4; 95% CI = ] [24.2; 95% CI = ], respectively). Overweight/obese women had higher leptin concentrations in all gestation trimesters (p<0.01) when compared to underweight or normal weight women (Table 1) Genotypes frequencies The minor allele frequencies for LEP-rs and for LEPR-rs genes were 31.4% and 50.3%, respectively. The genotype distributions were in Hardy-Weinberg equilibrium. We found no significant differences between the distribution of genotypes and pre-pregnancy BMI categories (< 25 vs. 25 kg/m2) (Table 2) Associations of the LEP and LEPR SNPs with pre-pregnancy body weight and GWG Homozygous subjects for the A-allele of the LEP-rs tended to have lower prepregnancy body weight (AA=59.1 kg, GG=63.7 kg, GA=62.1 kg) when compared with carriers of the G-allele (GG or GA), although differences were not statistically significant (p=0.44) (Table 3). Women who carried the A-allele of the LEP-rs were at a higher risk for excessive GWG than the GG carriers ([RRLEP-GAvsGG, 2.16; 95% CI, ]; [RRLEP-AAvsGG, 2.37; 95% CI, ]) according to the adjusted Poisson s regression models (Table 4). Genotype AA carriers for rs SNP began pregnancy with lower body weight compared to those GG or GA+GG carriers, and this pattern was maintained throughout pregnancy ([βaavsgg = kg; 95% CI, to -1.61; p=0.01] [βaavsga+gg = kg; 95%CI, to -1.25; p=0.02]) after adjustment for the confounders (Table 5). 100

101 RESULTADOS (Artigo 2) 3.4. Associations of the LEP and LEPR polymorphisms with plasma leptin concentrations We did not find significant differences between geometric means of the leptin concentrations according to the genotypes groups of the LEP-rs and LEPRrs genes (Table 3). These SNPs were not associated with log-transformed leptin concentrations throughout pregnancy trimesters in any of the different genetic models tested (co-dominant, recessive and dominant) (Table 4), or with changes in leptin concentrations during pregnancy (Table 5). 4. DISCUSSION In this study, women carriers of the AA genotype for LEP-rs presented with lower body weight throughout pregnancy compared to those that were GG or GA+GG carriers; however, the A-allele was significantly associated with a higher risk for excessive GWG. We reported a lack of association between the LEP-rs and LEPR-rs SNPs with pre-pregnancy overweight/obesity risk and leptin concentrations throughout pregnancy. To our knowledge, this is the first study examining the association between LEPrs and LEPR-rs polymorphisms and GWG and leptin concentration throughout pregnancy, proving it difficult to compare our data. Increased maternal body weight before pregnancy and excessive GWG may also be a primary contributor to the future development of obesity in women [21]. Considering the prepregnancy body weight and BMI, our results are in line with studies that indicate that the SNP rs may not be considered a relevant obesity marker for Spanish [22], Romanian [23], and Malaysian populations [24], but differs from other studies that found an association with obesity [6,12,17]. Alternatively, we found a significant association for GA or AA genotypes with a higher risk for excessive GWG when compared to the GG genotype. The associations of LEP-rs SNP with obesity in Brazilian subjects have been contentious. Hinuy et al. reported that women carrying the GG genotype had four times the higher risk of obesity when compared to the A-allele carriers [25]. However, Duarte et al. [26] in a multiethnic group and Oliveira et al. [27] in a group of European-Caucasian ethnicity reported a lack of association between the LEP polymorphism and obesity. The frequency of the LEP-rs A-allele 101

102 RESULTADOS (Artigo 2) (0.31) observed in our study was similar to the range of those found in additional studies in Brazilian population [25 27]. According to four systematic reviews, LEPR-rs did not show an overall statistically significant association to obesity-related outcomes (waist circumference or BMI) in the general population [28 31]. In Brazilian subjects, the LEPR-rs was associated with an increased risk for obesity (OR= 2.14; 95%CI: 1.01 to 4.52) in European descent [27] and nonsmokers Caucasian population [32], and in a multiethnic sample (OR= 1.79; 95%CI: 1.11 to 2.90) [26]. It is worth nothing that these results were performed in both men and women, and the mean age was higher than in our study with pregnant women. The G allele frequency of 0.50 for rs in this study was very similar to 0.45, the overall rate (varied from ) observed in different Caucasian populations [30]. However, this is a difference from the study in multiethnic subjects in the same city of our study (varied from ) [26]. It is important to point out that the racial/ethnic evaluation of this study was based on a self-reported measure. Independently of how skin color was assessed, the distribution of frequency of minor alleles was similar between black/brown and white women (A-allele LEP=0.30 and 0.35; G-allele LEPR=0.51 and 0.49, respectively). We reported that overweight/obese women had higher leptin concentrations in all gestation trimesters. In humans, levels of circulating leptin are directly proportional to BMI and the percentage of body fat [33] and, in general, women show higher leptin concentrations compared to men [34]. In individuals with normal body weight, leptin acts in the hypothalamus to decrease appetite and increase energy expenditure, but obese individuals present high circulating leptin levels, which may reflect either leptin tolerance or leptin resistance [35]. Our results revealed no significant associations between the LEP-rs and LEPR-rs polymorphisms and leptin concentrations throughout pregnancy. However, we cannot determine the proportion of placental leptin. There is strong evidence that suggests that the placenta, rather than the maternal adipose tissue, makes a substantial contribution to the rise in maternal leptin plasma concentrations [14]. According to placental perfusion studies, 98.4% of placental leptin is released into the maternal circulation [36]. Placenta and white adipose tissue express the same gene, except for the presence of a specific upstream placental enhancer, which suggests that leptin expression is regulated in a tissue-specific manner [37]. 102

103 RESULTADOS (Artigo 2) The potential effect of the LEP-rs and LEPR-rs SNP on leptin expression in adults is controversial. The AA genotype of the LEP-rs was associated with increased leptin concentration in obese individuals from a South Indian population when compared to the wild-type GG genotype [12]. In Brazilian women, the G allele contributed to increased leptin concentration [25]. However, in a study conducted by Oliveira et al. [27] with both Brazilian men and women, the rs SNP was not associated with leptin concentration, a result similar with the ones observed on the present investigation. The LEPRrs G-allele was associated with leptinemia in Brazil [27], whereas it reported a nonsignificant trend toward a higher serum leptin concentration to this allele in Romanian subjects [23]. It is possible that the discrepant results of the associations between these polymorphisms, body weight and leptin concentration may be due to a cumulative effect combining several different factors, which together may have affected the outcomes. These include a wide difference in the obesogenic environments from where the subjects are recruited for the study, ethnic diversity, subject s characteristics, selected set of confounders and interaction amongst genes. The main strengths are the availability of standardized longitudinal weight and plasma leptin concentration measurements in the first, second and third pregnancy trimester, which allowed analysis of the genetic associations with the changes of body weight and leptin concentrations over time. In addition, we investigated two polymorphisms in the same group of subjects and adjusted our results for important confounders. However, our study has some limitations such as the sample size of our cohort, which may not be sufficient to detect weak effects of gene variants and diminished the statistical power for some outcomes of the study. An additional limitation is that we relied on self-reported pre-pregnancy weight, and misclassification of GWG and pre-pregnancy BMI may not be ruled out for women who inaccurately reported their pre-pregnancy weights. However, this is the case in most studies of GWG. Pregnancy is a complex process during which several metabolic and body adaptations are required to support the adequate growth and development of the fetus, delivery, lactation and the requirements to maintain the health of the mother, and these patterns of alterations are a result of a variety of interactions amongst genes and environmental factors. The hypothesis of the present study is that the polymorphisms in the LEP-rs and LEPR-rs genes are related to pre-pregnancy overweight/obesity risk, as well as excessive GWG and 103

104 RESULTADOS (Artigo 2) high concentrations of leptin throughout pregnancy. Our results indicate that the LEPrs was significantly associated with a higher risk for excessive GWG, but the results do not support significant associations of the LEP-rs and LEPR-rs with prepregnancy overweight/obesity risk and leptin concentrations throughout pregnancy. We solely confirm the hypothesis that LEP-rs is associated with GWG. It is recommended to further evaluate these results in a larger cohort and in other ethnic populations to demonstrate the validity of our findings. Acknowledgements We would like to acknowledge Professor Rosane Silva for her technical support in the genotyping analysis and allowing us to conduct DNA extraction in the Laboratory of Macromolecular Metabolism Firmino Torres de Castro, Biophysics Institute, Rio de Janeiro Federal University (UFRJ). We also thank Professor Maria das Graças Tavares do Carmo for allowing us to work at the Laboratory of Nutritional Biochemistry of the Nutrition Institute, UFRJ. This study was supported by the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) and the Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support of Rio de Janeiro State (FAPERJ). The funders had no role in the design, analysis, or writing of this article and the authors declare that they do not have any conflict of interest. 104

105 RESULTADOS (Artigo 2) REFERENCES [1] WHO. Global status report on noncommunicable diseases Switzerland: World Health Organization; [2] Gaillard R, Durmuş B, Hofman A, Mackenbach JP, Steegers EAP, Jaddoe VWV. Risk factors and outcomes of maternal obesity and excessive weight gain during pregnancy. Obes Silver Spring Md 2013;21: doi: /oby [3] Institute of Medicine and National Research Council, editor. Weight gain during pregnancy: reexamining the guidelines. Washington, DC: The National Academies Press; [4] Herrera BM, Lindgren CM. The Genetics of Obesity. Curr Diab Rep 2010;10: doi: /s z. [5] Albuquerque D, Stice E, Rodríguez-López R, Manco L, Nóbrega C. Current review of genetics of human obesity: from molecular mechanisms to an evolutionary perspective. Mol Genet Genomics 2015;290: doi: /s [6] Boumaiza I, Omezzine A, Rejeb J, Rebhi L, Ouedrani A, Ben Rejeb N, et al. Relationship between leptin G2548A and leptin receptor Q223R gene polymorphisms and obesity and metabolic syndrome risk in Tunisian volunteers. Genet Test Mol Biomark 2012;16: doi: /gtmb [7] Hoffstedt J, Eriksson P, Mottagui-Tabar S, Arner P. A polymorphism in the leptin promoter region (-2548 G/A) influences gene expression and adipose tissue secretion of leptin. Horm Metab Res 2002;34: doi: /s [8] Liu Y, Chen S-Q, Jing Z-H, Hou X, Chen Y, Song X-J, et al. Association of LEPR Gln223Arg polymorphism with T2DM: A meta-analysis. Diabetes Res Clin Pract 2015;109:e21-6. doi: /j.diabres [9] Yiannakouris N, Yannakoulia M, Melistas L, Chan JL, Klimis-Zacas D, Mantzoros CS. The Q223R polymorphism of the leptin receptor gene is significantly associated with obesity and predicts a small percentage of body weight and body composition variability. J Clin Endocrinol Metab 2001;86: doi: /jcem [10] Morris DL, Rui L. Recent advances in understanding leptin signaling and leptin resistance. Am J Physiol Endocrinol Metab 2009;297:E doi: /ajpendo [11] Cervero A, Domínguez F, Horcajadas JA, Quiñonero A, Pellicer A, Simón C. The role of the leptin in reproduction. Curr Opin Obstet Gynecol 2006;18: doi: /01.gco [12] Dasgupta S, Salman M, Siddalingaiah LB, Lakshmi GL, Xaviour D, Sreenath J. Genetic variants in leptin: Determinants of obesity and leptin levels in South Indian population. Adipocyte 2015;4: doi: / [13] Castellano Filho DS, do Amaral Correa JO, Dos Santos Ramos P, de Oliveira Montessi M, Aarestrup BJV, Aarestrup FM. Body weight gain and serum leptin levels of non- 105

106 RESULTADOS (Artigo 2) overweight and overweight/obese pregnant women. Med Sci Monit Int Med J Exp Clin Res 2013;19: doi: /msm [14] Hauguel-de Mouzon S, Lepercq J, Catalano P. The known and unknown of leptin in pregnancy. Am J Obstet Gynecol 2006;194: doi: /j.ajog [15] Henson MC, Castracane VD. Leptin in pregnancy. Biol Reprod 2000;63: [16] Misra VK, Trudeau S. The influence of overweight and obesity on longitudinal trends in maternal serum leptin levels during pregnancy. Obes Silver Spring Md 2011;19: doi: /oby [17] Sahin DS, Tumer C, Demir C, Celik MM, Celik M, Ucar E, et al. Association with leptin gene C G>A polymorphism, serum leptin levels, and body mass index in Turkish obese patients. Cell Biochem Biophys 2013;65: doi: /s [18] Ben Ali S, Kallel A, Ftouhi B, Sediri Y, Feki M, Slimane H, et al. Association of G- 2548A LEP polymorphism with plasma leptin levels in Tunisian obese patients. Clin Biochem 2009;42: doi: /j.clinbiochem [19] Lohman T, Roche A, Martorell R. Antropometric Standardization Reference Manual. vol. 4. 3rd ed [20] Sichieri R, Everhart JE. Validity of a Brazilian food frequency questionnaire against dietary recalls and estimated energy intake. Nutr Res 1998;18: [21] Rooney BL, Schauberger CW, Mathiason MA. Impact of perinatal weight change on long-term obesity and obesity-related illnesses. Obstet Gynecol 2005;106: doi: /01.aog a. [22] Portolés O, Sorlí JV, Francés F, Coltell O, González JI, Sáiz C, et al. Effect of genetic variation in the leptin gene promoter and the leptin receptor gene on obesity risk in a population-based case-control study in Spain. Eur J Epidemiol 2006;21: doi: /s [23] Constantin A, Costache G, Sima AV, Glavce CS, Vladica M, Popov DL. Leptin G- 2548A and leptin receptor Q223R gene polymorphisms are not associated with obesity in Romanian subjects. Biochem Biophys Res Commun 2010;391: doi: /j.bbrc [24] Fan S-H, Say Y-H. Leptin and leptin receptor gene polymorphisms and their association with plasma leptin levels and obesity in a multi-ethnic Malaysian suburban population. J Physiol Anthropol 2014;33:15. doi: / [25] Hinuy HM, Hirata MH, Forti N, Diament J, Sampaio MF, Armaganijan D, et al. Leptin G-2548A promoter polymorphism is associated with increased plasma leptin and BMI in Brazilian women. Arq Bras Endocrinol Metabol 2008;52: [26] Duarte S, Francischetti E, Genelhu V, Cabello P, Pimentel M. LEPR p. Q223R, beta3- AR p. W64R and LEP c.-2548g> A gene variants in obese Brazilian subjects. Genet Mol Res GMR 2006;6:

107 RESULTADOS (Artigo 2) [27] Oliveira R de, Cerda A, Genvigir FDV, Sampaio MF, Armaganijan D, Bernik MMS, et al. Leptin receptor gene polymorphisms are associated with adiposity and metabolic alterations in Brazilian individuals. Arq Bras Endocrinol Amp Metabol 2013;57: doi: /s [28] Heo M, Leibel RL, Boyer BB, Chung WK, Koulu M, Karvonen MK, et al. Pooling analysis of genetic data: the association of leptin receptor (LEPR) polymorphisms with variables related to human adiposity. Genetics 2001;159: [29] Heo M, Leibel RL, Fontaine KR, Boyer BB, Chung WK, Koulu M, et al. A metaanalytic investigation of linkage and association of common leptin receptor (LEPR) polymorphisms with body mass index and waist circumference. Int J Obes Relat Metab Disord 2002;26: doi: /sj.ijo [30] Paracchini V, Pedotti P, Taioli E. Genetics of leptin and obesity: a HuGE review. Am J Epidemiol 2005;162: doi: /aje/kwi174. [31] Yu Z, Han S, Cao X, Zhu C, Wang X, Guo X. Genetic polymorphisms in adipokine genes and the risk of obesity: a systematic review and meta-analysis. Obes Silver Spring Md 2012;20: doi: /oby [32] Mattevi VS, Zembrzuski VM, Hutz MH. Association analysis of genes involved in the leptin-signaling pathway with obesity in Brazil. Int J Obes Relat Metab Disord 2002;26: [33] Minocci A, Savia G, Lucantoni R, Berselli ME, Tagliaferri M, Calò G, et al. Leptin plasma concentrations are dependent on body fat distribution in obese patients. Int J Obes Relat Metab Disord 2000;24: [34] Hellström L, Wahrenberg H, Hruska K, Reynisdottir S, Arner P. Mechanisms behind gender differences in circulating leptin levels. J Intern Med 2000;247: [35] Jung CH, Kim M-S. Molecular mechanisms of central leptin resistance in obesity. Arch Pharm Res 2013;36: doi: /s y. [36] Linnemann K, Malek A, Sager R, Blum WF, Schneider H, Fusch C. Leptin Production and Release in the Dually in Vitro Perfused Human Placenta 1. J Clin Endocrinol Metab 2000;85: [37] Bi S, Gavrilova O, Gong D-W, Mason MM, Reitman M. Identification of a placental enhancer for the human leptin gene. J Biol Chem 1997;272:

108 RESULTADOS (Artigo 2) Pregnant women at enrollment: N = did not meet eligibility criteria: confirmed pre-gestational infection diagnosis or NCDs [n=14], >13 gestational weeks at enrollment [n=16] or abandoned prenatal care at the public health center [n=10] Folow-up: N = 259 participants Miscarriage [n=25] Stillbirth [n=5] Twin pregnancies [n=4] Fasting plasma glucose 126 mg/dl [n=2] N = 223 participants Missing data: did not attend baseline visit [n=5] Losses to follow-up: only information at baseline [n=9] Present study: N = did not have blood samples for genotyping Final sample: N = participants with LEP and LEPR SNPs - 02 participants with only LEP SNP - 02 participants with only LEPR SNP 1 0 and 2 0 trimesters = 147 women Women participated in a clinical trial [n=36] 3 0 trimester = 111 women Figure 1 - Flowchart illustrating the recruitment and selection of the study population Note: NCDs = non-communicable chronic diseases; LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; SNP = single nucleotide polymorphism 108

109 RESULTADOS (Artigo 2) Table 1. Maternal characteristic of the study population stratifying for pre-pregnancy BMI categories. Variables Study population Underweight or normal weight (BMI < 25 kg/m 2 ) Overweight/obese (BMI 25kg/m 2 ) N n n p-value Maternal age (y) (22-31) (21 31) (24 34) Self-reported skin color, n (%) Black or brown (mixed race) 110 (74.8) 74 (77.1) 36 (70.6) Education (y) (7 11) (7 11) 51 9 (6 11) Smoking habit at baseline, n (%) Nonsmoking 107 (72.8) 75 (78.1) 32 (62.8) Calorie intake (kcal/d) at first trimester 146 2,299 (1,895 2,802) 95 2,207 (1,895 2,641) 51 2,436 (1,883 2,975) Pre-pregnancy LTPA, n (%) No 119 (81.5) 77 (80.2) 42 (84.0) Parity, n (%) (38.8) 39 (40.6) 18 (35.3) 1 90 (61.2) 57 (59.4) 33 (64.7) Self-reported pre-pregnancy weight (kg) ± ± ± 11.9 < Total gestational weight gain (kg) ± ± ± Adequacy of gestational weight gain a, n (%) Insufficient 38 (34.5) 29 (40.3) 9 (23.7) Normal 38 (34.6) 28 (38.9) 10 (26.3) < Excessive 34 (30.9) 15 (20.8) 19 (50.0) Leptin b (ng/dl) First trimester ( ) ( ) ( ) < Second trimester ( ) ( ) ( ) < Third trimester ( ) ( ) ( ) < Abbreviations: LTPA = leisure-time physical activity; BMI = body mass index. Data are presented as medians (IQRs) or means ± SD (continuous variables) and percentages (categorical variables). p-value refers to 1 Mann-Whitney U test; 2 Pearson χ 2 tests and 3 Student's t. a According to the Institute of Medicine of the United States of America (IOM ). b Log transformed values were used, but estimates provided in the table were back-transformed and data are presented as geometric means (95% confidence interval). 109

110 RESULTADOS (Artigo 2) Table 2. Genotype and allele frequencies of the LEP-rs and of the LEPR-rs polymorphisms of the study population stratifying for pre-pregnancy BMI categories. Gene/Genotypes/Allele Study population Underweight or normal weight (BMI < 25 kg/m 2 ) Overweight/obese (BMI 25 kg/m 2 ) N (%) n (%) n (%) p- value LEP-rs GG 69 (47.6) 42 (44.7) 27 (52.9) GA 61 (42.1) 39 (42.5) 22 (43.1) AA 15 (10.3) 13 (13.8) 2 (3.9) G-allele 199 (68.6) 123 (65.4) 76 (74.5) A-allele 91 (31.4) 65 (34.6) 26 (25.5) p-value (HW) LEPR-rs AA 38 (26.2) 26 (27.7) 12 (23.5) AG 68 (46.9) 42 (44.7) 26 (51.0) GG 39 (26.9) 26 (27.6) 13 (25.5) A-allele 144 (49.7) 94 (50.0.) 50 (49.0) G-allele 146 (50.3) 94 (50.0) 52 (51.0) p-value (HW) Abbreviations: LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; SNPs = single nucleotide polymorphisms; BMI = body mass index; HW = Hardy Weinberg equilibrium. p-value (HW) refers to Pearson χ 2 tests. Comparison between underweight or normal weight and overweight/obese subjects, p-value refers to 1 Fisher's exact test or 2 Pearson χ 2 tests. 110

111 RESULTADOS (Artigo 2) Table 3. Distribution of the pre-pregnancy body weight and BMI, total GWG and plasma leptin concentrations according to genotypes of the LEP-rs and of the LEPR-rs genes. Gene/Genotypes Pre-pregnancy body Pre-pregnancy BMI Leptin weight (kg) (kg/m 2 Total GWG (kg) (ng/dl) by trimester ) First Second Third n Means ± SD n Means ± SD n Means ± SD n Means (95% CI) n Means (95% CI) n Means (95% CI) LEP-rs GG ± ± ± ( ) ( ) ( ) GA ± ± ± ( ) ( ) ( ) AA ± ± ± ( ) ( ) ( ) p-value * (GG vs GA vs AA) p-value (GA vs GG) p-value (AA vs GG) p-value (AA vs GA+GG) p-value (GA+AA vs GG) LEPR-rs AA ± ± ± ( ) ( ) ( ) AG ± ± ± ( ) ( ) ( ) GG ± ± ± ( ) ( ) ( ) p-value (AA vs AG vs GG) p-value (AG vs AA) p-value (GG vs AA) p-value (GG vs AG+AA) p-value (AG+GG vs AA) Abbreviations: LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; BMI = body mass index; GWG = gestational weight gain. Comparison of the groups was performed using analysis of variance or Student's test. a Log transformed values were used for testing differences, but estimates provided in the table were back-transformed and data are presented as geometric means (95% confidence interval). 111

112 RESULTADOS (Artigo 2) Table 4. Associations of the LEP-rs and LEPR-rs polymorphisms with pre-pregnancy BMI, GWG and leptin concentrations. Pre-pregnancy BMI a (kg/m 2 ) Total GWG by IOM category b (log) Leptin by trimester c Overweight/obese ( 25 ) Insufficient 1 Excessive 1 First Second Third RR (95% CI) RR (95% CI) RR (95% CI) β(95% CI) β(95% CI) β(95% CI) LEP-rs Co-dominant (GA vs GG) 1.00 ( ) 0.56 ( ) 2.16 ( ) ** ( to 0.122) ( to 0.066) ( to 0.088) (AA vs GG) 0.36 ( ) 0.58 ( ) 2.37 ( ) * ( to 0.144) ( to 0.217) ( to 0.214) Recessive (AA vs GA+GG) 0.37 ( ) 0.77 ( ) 1.60 ( ) ( to 0.123) ( to 0.238) ( to 0.224) Dominant (GA+AA vs GG) 0.89 ( ) 0.59 ( ) 2.18 ( ) ** ( to 0.114) ( to 0.078) ( to 0.099) LEPR-rs Co-dominant (AG vs AA) 1.28 ( ) 1.32 ( ) 1.41 ( ) ( to 0.081) ( to 0.127) ( to 0.090) (GG vs AA) 1.15 ( ) 0.48 ( ) 1.88 ( ) ( to 0.076) ( to 0.066) ( to 0.132) Recessive (GG vs AG+AA) 0.94 ( ) 0.41 ( ) 1.51 ( ) ( to 0.053) ( to 0.023) ( to 0.131) Dominant (AG+GG vs AA) 1.21 ( ) 0.97 ( ) 1.63 ( ) ( to 0.069) ( to 0.097) ( to 0.097) Abbreviations: LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; BMI = body mass index; GWG = gestational weight gain; LTPA = leisure-time physical activity; IOM = Institute of Medicine of the United States of America. Estimates in column RR=relative risk, Wald tests were used to derive the p-values. * p-value < 0.05; ** p-value < a Model adjusted for pre-pregnancy LTPA, maternal age, self-reported skin color, parity, maternal smoking status, calorie intake at first trimester and years of education. b Model adjusted for pre-pregnancy LTPA, gestational age at delivery, maternal age, self-reported skin color, parity, maternal smoking status, log leptin first trimester and pre-pregnancy BMI. c Model adjusted for pre-pregnancy LTPA, gestational age, maternal age, self-reported skin color, maternal smoking status and maternal body weight (kg) by trimester. 1 According to the Institute of Medicine of the United States of America (IOM 2009). Total number of observations LEP-rs : [Pre-pregnancy BMI (GA vs GG, n=124; AA vs GG, n=78; recessive and dominant, n=138)]; [Total GWG by IOM category (GA vs GG, n=62; AA vs GG, n=45; recessive and dominant, n=70)]; [(log) Leptin by trimester: First (GA vs GG, n=128; AA vs GG, n=82; recessive and dominant, n=143); Second (GA vs GG, n=122; AA vs GG, n=76; recessive and dominant, n=135); Third (GA vs GG, n=84; AA vs GG, n=57; recessive and dominant, n=96)]. Total number of observations LEPR-rs : [Pre-pregnancy BMI (AG vs AA, n=103; GG vs AA, n=73; recessive and dominant, n=139)]; Total GWG by IOM category (AG vs AA, n=53; GG vs AA, n=42; recessive and dominant, n=70)]; [(log) Leptin by trimester: First (AG vs AA, n=105; GG vs AA, n=76; recessive and dominant, n=143); Second (AG vs AA, n=99; GG vs AA, n=72; recessive and dominant, n=135); Third (AG vs AA, n=72; GG vs AA, n=55; recessive and dominant, n=97)]. 112

113 RESULTADOS (Artigo 2) Table 5. Longitudinal analysis between LEP-rs and LEPR-rs gene polymorphisms and maternal body weight and leptin concentration throughout pregnancy. Maternal weight (kg) a,1 (log) Leptin b β (95% CI) p-value * β(95% CI) p-value LEP-rs Co-dominant (GA vs. GG) 2.20 (-2.52 to 6.93) ( to 0.077) 0.83 (AA vs. GG) ( to -1.61) ( to 0.128) 0.77 Recessive (AA vs. GA+GG) ( to -1.25) ( to 0.133) 0.64 Dominant (GA+AA vs. GG) (-4.51 to 4.19) ( to 0.077) 0.74 LEPR-rs Co-dominant (AG vs. AA) 2.50 (-2.31 to 7.31) ( to 0.087) 0.73 (GG vs. AA) 1.53 (-4.21 to 7.27) ( to 0.068) 0.61 Recessive (GG vs. AG+AA) (-5.40 to 4.11) ( to 0.041) 0.38 Dominant (AG+GG vs. AA) 1.85 (-2.60 to 6.31) ( to 0.075) 0.99 Abbreviations: LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; LTPA = leisure-time physical activity. a Model adjusted for gestational age (wk) and quadratic gestational age, pre-pregnancy LTPA, maternal age, self-reported skin color, maternal smoking status, parity, years of education and maternal height. b Model adjusted for gestational age (wk) and quadratic gestational age, pre-pregnancy LTPA, maternal age, self-reported skin color, maternal smoking status and maternal weight throughout pregnancy (kg). 1 Weight at 0 wk gestation (referred to as self-reported pre-pregnancy weight) and weight change from 5 to 13 wk, from 20 to 26 wk, from 30 to 36 wk, and last weight before to delivery. β= Linear mixed-effect regression coefficient; p-value refers to the maximum likelihood estimator. Observations LEP-rs : Maternal weight [GA vs GG: total number of observations (data) = 456; total number of groups (women = 95), and mean of 4.8 observations per group]; [AA vs GG: total number of observations (data) = 315; total number of groups (women = 66), and mean of 4.8 observations per group]; [Recessive and Dominant: total number of observations (data) = 519; total number of groups (women = 108), and mean of 4.8 observations per group]. (log) Leptin [AG vs AA: total number of observations (data) = 334; total number of groups (women = 129), and mean of 2.6 observations per group]; [AA vs GG: total number of observations (data) = 215; total number of groups (women = 83), and mean of 2.6 observations per group]; [Recessive and Dominant: total number of observations (data) = 374; total number of groups (women = 144), and mean of 2.6 observations per group]. Continued on next page 113

114 RESULTADOS (Artigo 2) Table 2 (Continued) Observations LEPR-rs : Maternal weight [GA vs GG: total number of observations (data) = 383; total number of groups (women = 80), and mean of 4.8 observations per group]; [GG vs AA: total number of observations (data) = 297; total number of groups (women = 61), and mean of 4.9 observations per group]; [Recessive and Dominant: total number of observations (data) = 520; total number of groups (women = 108), and mean of 4.8 observations per group]. (log) Leptin [GA vs GG: total number of observations (data) = 276; total number of groups (women = 106), and mean of 2.6 observations per group]; [GG vs AA: total number of observations (data) = 203; total number of groups (women = 76), and mean of 2.7 observations per group]; [Recessive and Dominant: total number of observations (data) = 375; total number of groups (women = 144), and mean of 2.6 observations per group]. The group refers to the number of women with at least one data point in time and observations refers to the total number of data points in time for all women. 114

115 RESULTADOS (Artigo 3) 7.3 ARTIGO 3. ASSOCIATIONS BETWEEN OBESITY CANDIDATE GENE POLYMORPHISMS (FTO, MC4R, LEP AND LEPR) AND DIETARY INTAKE IN PREGNANT WOMEN Submetido ao periódico British Journal of Nutrition em 2017 ABSTRACT The purpose of this study was to investigate the associations between the obesity candidate genes (FTO, MC4R, LEP and LEPR) with a focus on the daily total energy intake and percentage of energy from macronutrients and ultra-processed foods before and during pregnancy. A sample of 149 pregnant women was followed in a prospective cohort at a Public Health Center in Rio de Janeiro, Brazil. A food frequency questionnaire was administered at 5-13 weeks of gestation (to assess pre-pregnancy dietary intake) and weeks (to assess dietary intake during pregnancy). Genotyping was performed using real-time polymerase chain reaction. The means and variations of energy intake and percentage of energy from macronutrients and ultra-processed foods, according to the genotypes were compared using ANOVA or Student s t test. Associations between polymorphisms and the outcomes were investigated through multiple linear regression and longitudinal linear mixed-effects models. A-allele of the FTO-rs was positively associated with the percentage of energy from carbohydrates (β=2.7; 95% CI 0.5, 4.8; p=0.016) in pre-pregnancy, and with total energy intake (β=0.054; 95% CI 0.003, 0.106; p=0.039) and mean percentage of energy from ultraprocessed foods (β=6.3; 95% CI 1.4, 11.1; p=0.012) during pregnancy, compared with the TT genotype. C-allele of the MC4R-rs was associated with higher percentage of energy from ultra-processed foods throughout pregnancy, compared with the TT genotype (β=4.2; 95% CI 0.4, 8.0; p=0.030). These findings suggest significant associations between FTOrs and MC4R-rs genes and the components of dietary intake in pregnant women. Keywords: Dietary intake, Pregnant women, Polymorphisms. 115

116 RESULTADOS (Artigo 3) Introduction Dietary intake is an important human behavior that is intimately related to health (1). The availability of low-cost high energy-dense foods, along with decreased physical activity, are often considered to be the biggest contributors to the rising prevalence of obesity and dietrelated non-communicable diseases (NCDs) (2,3). Maternal obesity is becoming more prevalent (4) and women are more likely to retain gestational weight with each successive pregnancy contributing to the development or aggravation of the obesity epidemic (5). Maternal obesity and excessive gestational weight gain (GWG) are major risk factors for gestational diabetes, preeclampsia and fetal adiposity (6,7). Consequently, obesity in pregnancy is placing a considerable burden on healthcare services and resources (8). Although environmental factors contribute to an important role in the development of obesity, genetic factors also have a substantial contribution on its etiology (9). Studies of candidate genes for obesity-susceptibility have allowed the identification of important genes and single nucleotide polymorphisms (SNPs) involved in the mechanisms of dietary consumption, such as energy intake, food preferences, and satiety responsiveness (1,10,11). The rs SNP of the fat mass and obesity-associated (FTO) gene, along with the rs SNP of the leptin (LEP) gene and the rs SNP of the leptin receptor (LEPR) gene has been associated with high total energy intake (12,13). Further, the rs SNP of the melanocortin-4 receptor (MC4R) gene has been associated with food intake and eating behavior patterns (14,15). Nutritional demands increase during pregnancy due to the metabolic and physiological changes (16). Given the potential importance of weight management interventions in pregnancy, and due to the profound effect that diet can have on weight gain and regulation, the purpose of this study was to investigate the associations between obesity predisposing gene SNPs (FTO-rs ; MC4R-rs ; LEP-rs and LEPR-rs ) and daily total energy intake, percentage of energy from macronutrients and ultra-processed foods (i.e., energy-dense foods). We hypothesized that FTO, MC4R, LEP and LEPR gene SNPs may be related with an increased total energy intake, as well as increased energy from carbohydrate, fat and ultra-processed foods before and during pregnancy. 116

117 RESULTADOS (Artigo 3) Methods Study design and subjects This study comprised a prospective cohort of pregnant women attending a prenatal care service offered by a public health center in Rio de Janeiro, Brazil. The enrollment of women occurred from November 2009 to October 2011, and the follow-up lasted until July A total of 322 pregnant women were invited and 299 (92.7%) agreed to participate in the study. Elegibility criterias were: until 13 weeks of gestation, years of age, had no history of infectious or NCDs (except obesity), and intended to attend prenatal care in the selected health center. The follow up times occurred at between 5-13 (baseline), and gestational weeks (GW). Following recruitment, 79 women were excluded. After exclusions, the baseline total sample comprised 220 pregnant women. From the baseline to the third-time visit (30-36 GW), 9 follow-up losses occurred. Furthermore, we excluded women who did not have blood samples for genotyping (n=62). The final sample of the present study was composed of 149 women with genotyping (FTO, n=146; MC4R, n=145; LEP, n=147 and LEPR, n=147) (Figure 1). The Rio de Janeiro Municipal Health Secretary Research Ethics Committee approved the study procedures (reference number: ). All participants signed a term of consent freely and spontaneously, detailing all procedures to be carried out, according to the Brazilian Resolution 466/2012. Dietary intake assessments The dietary intake was evaluated utilizing a semi-quantitative food frequency questionnaire (FFQ), based on a version originally developed and validated for the adult population of Rio de Janeiro (17). Dietary intake data was collected at two time intervals: a) 5-13 GW (covering 6 months prior to the first interview, herein called the pre-pregnancy); b) at GW (covering the last 6 months prior to the last interview, herein called during pregnancy). The FFQ was composed of 82 food items with eight frequency options that were 117

118 RESULTADOS (Artigo 3) transformed into daily frequency, as follows: >3 times/day=4, 2 3 times/day=2.5, 1 time/day=1, 5 6 times/week=0.79, 2 4 times/week=0.43, 1 time/week=0.14, 1 3 times/month=0.07, and never or hardly ever=0. Portion sizes were converted into grams or milliliters, based on the Brazilian household measures table (18). The daily nutrient amount for a given food was calculated by multiplying the usual portion size per daily frequency and its nutrient content, based on data from the Brazilian Table of Food Composition (19) and added food items from the United States Department of Agriculture National Nutrient Database for Standard (20). Macronutrients and alcohol consumptions (grams/day) were calculated by summing the data for the respective macronutrient/alcohol across food and drinks, respectively. These values were then converted into energy by multiplying the total grams of the macronutrient/alcohol by the number of calories per gram. Ultra-processed foods were classified in accordance with the official Brazilian national food and nutrition guideline (21) and with the new food classification system, which considers the extent and the purpose of industrial food processing (22). Ultra-processed foods were represented in this study by the following food products: sweet or savoury packaged snacks, French fries, ice-cream, chocolate, candies (confectionery), mass-produced packaged breads and buns; margarines, mayonnaise, cookies (biscuits), cakes, yoghurts, pre-prepared pies and pasta and pizza dishes; sausages, burgers, hot dogs, and other reconstituted meat products; noodles, fried or baked salted pastries, soft drinks and alcoholic beverage (vodka). DNA isolation and SNP genotyping Venous blood samples (5 ml) were collected at baseline, processed and stored at C until polymorphism analyses. DNA was isolated from whole blood samples by the proteinase K and phenol-chloroform technique. Genotyping was performed by real-time polymerase chain reaction amplification method (StepOnePlus, Life Technologies, Guilford, CT, USA) using an allelic discrimination assays (TaqMan Genotyping Master Mix assay, Life Technologies). The accuracy of genotyping was evaluated by performing a duplicate analysis of 10% of the sample with 99% agreement rates. 118

119 RESULTADOS (Artigo 3) Covariates assessment A standardized questionnaire was administered at baseline (5-13 GW) to obtain the following maternal variables: age (years), education (years of schooling), per capita family income (Real-R$), leisure time physical activity (LTPA) practice before pregnancy (yes/no), smoking habits (nonsmoking, former smoker and current smoker), alcohol consumption (no/yes), parity (number of deliveries), and self-reported skin color (white/black/mixed). Pre-pregnancy body mass index (BMI) was calculated using the self-reported prepregnancy weight at baseline and height measured with a portable stadiometer (Seca, Ltd, Hamburg, Germany) until 13 weeks of gestation according to standardized procedures (23). The gestational age was estimated based on the first ultrasound performed prior to 24 weeks of gestation (24), however the reported date of the last menstrual period was used if the ultrasound data was not available (n=2). Statistical analyses The maternal characteristics were described as a number with frequency (%) or medians with interquartile range (IQR= 25 th -75 th percentiles) and mean with 95% confidence interval (CI). Data that were not normally distributed (energy intake and percentage of energy from protein) were logarithmic-transformed (log10) prior to data analysis and subsequently back-transformed using the inverse of the natural logarithm function. Comparisons between genotypes and outcomes were performed using a Student s t test and analysis of variance (ANOVA). The variation ( ) in the total energy intake and the percentage of energy of each macronutrient, along with ultra-processed foods, between before and during pregnancy by genotypes was calculated (Delta= variable value during pregnancy - variable value in prepregnancy). We did not employ a recessive genetic model for analyses because the number of minor allele homozygotes for all SNPs was small in our sample. Crude and adjusted linear regression models were performed to assess cross sectional associations between genotype at a candidate SNP and the outcomes. The variables included in the adjusted models were selected according to the biological plausibility of the association 119

120 RESULTADOS (Artigo 3) with total energy intake. The following variables attended this condition and were included in the adjusted models: maternal age, self-reported skin color, parity, gestational age, per capita income and pre-pregnancy BMI. We further employed linear mixed-effect (LME) regression models to investigate the longitudinal associations between polymorphisms and alterations in total energy intake and the percentage of energy from macronutrients and ultra-processed foods from pre-pregnancy to pregnancy. The models were adjusted for maternal age, self-reported skin color, parity, gestational age, per capita income and pre-pregnancy BMI. LME models account for random variation of intra-individuals and between individuals. Gestational age (in weeks) represents the time variable in all models and was considered a fixed and random effect. The gene polymorphisms, and all other covariates, were analyzed as fixed-effect variables. Dependencies in the data were handled with an unstructured covariance matrix. Statistical analyses were conducted using STATA (version 12.0, College Station, TX, USA) software and a significance level at 5% was assumed in all the analysis. Results Characteristics of the study sample The 149 women comprised a median (IQR) age of 27 (22 31) years and 9.0 (7-11) years of education. There were 34.9% of women with a pre-pregnancy BMI 25 kg/m 2. The difference of geometric mean of the total energy intake between before and during pregnancy was not statistically significant (Table 1). Genotype frequencies The minor allele frequencies of the FTO-rs , MC4R-rs , LEPrs and LEPR-rs were 42.0% (A-allele), 19.0% (C-allele), 31.0% (A-allele) and 50.0% (G-allele), respectively, and the genotype distributions were in accordance with Hardy-Weinberg equilibrium (p>0.05) (online Supplementary Table S1). 120

121 RESULTADOS (Artigo 3) Daily total energy intake Considering women with FFQ data before and during pregnancy, carriers of the A- allele of FTO presented an increased total energy intake geometric mean during pregnancy (TT vs. AT+AA = [2091; 95% CI 1904, 2297]; [2353; 95% CI 2202, 2513]; p=0.041, respectively), and positive variation from pre-pregnancy to pregnancy (TT vs. AT+AA = [ ; 95% CI , -24.7]; [112.6; 95% CI -68.2, 293.6]; p=0.015, respectively) (Table 2). During pregnancy, the multivariate linear regression model was statistically significant following adjustment for the potential confounders (β=0.054; 95% CI 0.003, 0.106; p=0.039) (Table 3). Percentage of energy from carbohydrates The percentage of energy from carbohydrates was higher in A-allele carriers of FTOrs before pregnancy (TT vs. AT+AA = [54.6; 95% CI 52.7, 56.4]; [57.0; 95% CI 55.8, 58.2]; p=0.020, respectively) (Table 2), even after adjustment for confounders (β=2.7; 95% CI 0.5, 4.8; p=0.016) (Table 3). Percentage of energy from protein Women who carried A-allele of the LEP-rs tended to present a higher percentage of energy from (log) protein (GG vs. GA+AA = [15.4; 95% CI 14.6, 16.2]; [16.6; 95% CI 15.8, 17.4]; p=0.036, respectively) during pregnancy, and presented a positive variation (GG vs. GA+AA = [-0.5; 95% CI -1.4, 0.4]; [0.8; 95% CI -0.0, 1.6]; p=0.031, respectively) from pre-pregnancy to pregnancy (Table 2), but lost significance in dominant genetic model after adjustment for confounders (Table 3). The A-allele of the FTO-rs gene was negatively, and significantly, associated with the percentage of energy from (log) protein before (β = ; 95% CI , ; p=0.009) and during pregnancy (β = ; 95% CI , ; p=0.012) when compared to the TT carriers in the adjusted model (Table 3), and maintained this pattern throughout pregnancy (β = ; 95% CI , ; p=0.037) (Table 4). 121

122 RESULTADOS (Artigo 3) Percentage of energy from fat The percentage of energy from fat was reduced from pre-pregnancy to pregnancy. However, carriers of the A-allele of FTO-rs tended to reduce less these values (TT vs. AT+AA = [-3.0; 95% CI -5.0, -0.9]; [-0.7; 95% CI -1.8, 0.3]; p=0.031, respectively) (Table 2). Percentage of energy from ultra-processed foods Women who carried A-allele of the FTO-rs gene tended to present a higher percentage of energy from ultra-processed foods (TT vs. AT+AA = [40.6; 95% CI 36.9, 44.3]; [45.6; 95% CI 47.7, 48.5]; p=0.041, respectively) during pregnancy (Table 2), even after adjustment for confounders (β = 6.3; 95% CI 1.4, 11.1; p=0.012) (Table 3). The percentage of energy from ultra-processed foods was reduced from pre-pregnancy to pregnancy. However, carriers of the A-allele of FTO-rs tended to reduce less these values (TT vs. AT+AA = [-6.4; 95% CI -10.2, -2.6]; [-1.1; 95% CI -3.9, 1.7]; p=0.026, respectively) (Table 2). We found in the adjusted linear mixed-effect models that women carrying the C-allele of the MC4R-rs began pregnancy with higher percentage of energy from ultraprocessed foods compared with the TT genotype, and the level remained higher throughout pregnancy (β=4.2; 95% CI 0.4, 8.0; p=0.030) (Table 4). Discussion This study has several main findings. The A-allele of the FTO-rs was positively associated with the percentage of energy from carbohydrates before pregnancy, and was positively associated with total energy intake and with percentage of energy from ultraprocessed foods during pregnancy. Additionally, the FTO risk allele was negatively associated with the percentage of energy from protein before and during pregnancy and throughout pregnancy. The C-allele of the MC4R-rs presented higher percentage of energy from ultra-processed foods throughout pregnancy. The minor allele frequency observed in this study for FTO-rs A-allele (0.42) and MC4R-rs C-allele (0.19) were quite similar to the range of reported values in 122

123 RESULTADOS (Artigo 3) other published studies with Brazilian women (0.40/0.45 for FTO-rs and 0.23/0.15 for MC4R-rs C allele) (25). Many of the genetic variants associated with weight increases are highly expressed in the hypothalamus, a crucial neural center for energy balance and regulation of food intake (26). Research involving humans have suggested that the risk allele of FTO-rs gene may influence food consumption parameters including total energy intake (27,28), food preferences (29,27) and appetite regulation (10,30), suggesting that diet may mediate the effect of the FTO on obesity. However, these associations have not been replicated in other studies (31,32). We observed that this variant was negatively associated with the percentage of energy from protein before and during pregnancy. Protein is considered the most satiating macronutrient (33) thus, it is plausible that the A-allele of the FTO was related to modifications on food cravings and appetite with increased energy intake from ultra-processed foods. A study showed that subjects homozygous for FTO-rs appears to determine neural responses to circulating concentrations of the hunger hormone ghrelin (34), which may lead to increased energy intake in those carrying the risk allele. The role of FTO in the pathogenesis of obesity has additionally been demonstrated in a rodent model, which indicated that increased expression of FTO leads to increased fat mass and obesity via hyperphagia (35). MC4R gene is the most common cause of severe early monogenic obesity (36) and an important contributor to polygenic obesity in humans (15), however, their expression is variable, their penetrance incomplete, and both expression and penetrance are age dependent (37). In addition, the incomplete penetrance and the variable expression of MC4R mutations suggest an important environmental influence. The rs C-allele has been associated with high snack consumption (14) and with high intakes of total energy and dietary fat in women of European ancestry (38). We observed that MC4R-rs genotypes were not associated with daily energy intake and percentage of energy from macronutrients. This is consistent with the results of a published study in European adults (32). However, we found that the intake of energy from ultraprocessed foods was significantly increased in subjects with MC4R minor alleles throughout pregnancy. MC4R-rs C allele displayed a positive association with ramen and processed foods including canned tuna, fish cake, ham and cheese when compared to the rs T-allele in a study with Korean middle-aged adults (39). 123

124 RESULTADOS (Artigo 3) The phenotypic features of MC4R deficiency include hyperphagia (15,36) through the leptin-melanocortin signaling system (40), and the severity of hyperphagia may decline with age and was greater in homozygous compared to heterozygous cases (36,37). In our study, the majority of the pregnant women were heterozygous with only four homozygous subjects with the minor allele. There are limited studies evaluating the association of LEP-rs and its receptor (lepr-rs ) with food intake in the adult population. Research conducted in Brazil on children (4 years of age) found that G-allele carriers of the LEPR-rs , but not LEPrs , had a higher total energy intake (41). In Tunisian adults, subjects with the AA genotype for LEP-rs and GG genotype for LEPR-rs genes had a significantly higher daily energy intake (13). We did not find an association between these SNPs and total energy intake. There is evidence to conclude that obesity candidate gene SNPs may be associated with dietary intake parameters, and their identification may contribute to prevent future health problems. However, phenotype intensity is potentially modulated by environmental and individual characteristics (15), and the genetic contribution to population phenotypic differentiation is driven by differences in causal allele frequencies, effect sizes, and genetic architecture (42). Our study did have limitations and strengths that need to be highlighted. One of the limitations is the moderate sample size, which resulted in a lower power for detecting a statistically significant effect of the polymorphisms on the dietary intake parameters. An additional limitation is that some of the associations may have been attenuated by an imprecision of dietary intake measurements. The predominant strength refers to the use of a validated FFQ and trained interviewers to administer the FFQ who followed standardized procedures. Further, the longitudinal design that allowed analysis of the genetic associations with phenotypes over time was an additional strength. Moreover, we controlled our results for important confounders, such as maternal age, self-reported skin color, parity, gestational age, per capita income and pre-pregnancy BMI. In conclusion, the A-allele carriers of the FTO-rs had a higher percentage of energy from carbohydrates before pregnancy, and had a higher total energy intake and percentage of energy from ultra-processed foods during pregnancy. The FTO risk allele also was negatively associated with the percentage of energy from protein before and during pregnancy and throughout pregnancy, compared with those with the TT-genotype. The C- 124

125 RESULTADOS (Artigo 3) allele carriers of the MC4R-rs presented a higher percentage of energy from ultraprocessed foods throughout pregnancy, compared with those with TT-genotype. Future studies using high-quality dietary data are required to consolidate whether obesity-susceptible genes are associated with dietary intake to prevent obesity in genetically predisposed individuals. Acknowledgments We would like to acknowledge Professor Rosane Silva for her technical support in the genotyping analysis and allowing us to conduct DNA extraction in the Laboratory of Macromolecular Metabolism Firmino Torres de Castro, Biophysics Institute, Rio de Janeiro Federal University (UFRJ). We also thank Professor Maria das Graças Tavares do Carmo for allowing us to work at the Laboratory of Nutritional Biochemistry of the Nutrition Institute, UFRJ. Financial Support This study was supported by the Carlos Chagas Filho Research Foundation from the State of Rio de Janeiro (FAPERJ) (grant numbers E-26/ /2010, E-26/ /2012; E- 26/ /2012; E-26/ /2013). The funders had no role in the design, analysis, or writing of this article and the authors declare that they do not have any conflict of interest. Conflict of interest The authors declare no conflict of interest. Authorship The authors contributions are as follows: M. C. M. performed statistical analysis, participated in the interpretation of results and writing of the manuscript. J. T., A. A. F. V, D. R. F and E. L. R. contributed to the discussion and data interpretation. G. K. participated in the designing the work and reviewed the manuscript. Supplementary material accompanies this paper. 125

126 RESULTADOS (Artigo 3) REFERENCES 1. Tanaka T (2014) Genetics of energy and macronutrient intake in humans. Curr. Nutr. Rep. 3, Malik VS, Willett WC & Hu FB (2013) Global obesity: trends, risk factors and policy implications. Nat. Rev. Endocrinol. 9, Ng M, Fleming T, Robinson M, et al. (2014) Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during : a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study The Lancet 384, Valsamakis G, Kyriazi EL, Mouslech Z, et al. (2015) Effect of maternal obesity on pregnancy outcomes and long-term metabolic consequences. Horm. Athens 14, Yogev Y & Catalano PM (2009) Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36, Ovesen P, Rasmussen S & Kesmodel U (2011) Effect of prepregnancy maternal overweight and obesity on pregnancy outcome. Obstet. Gynecol. 118, Marchi J, Berg M, Dencker A, et al. (2015) Risks associated with obesity in pregnancy, for the mother and baby: a systematic review of reviews. Obes. Rev. 16, Morgan KL, Rahman MA, Macey S, et al. (2014) Obesity in pregnancy: a retrospective prevalence-based study on health service utilisation and costs on the NHS. BMJ Open 4, e Herrera BM & Lindgren CM (2010) The genetics of obesity. Curr. Diab. Rep. 10, Dougkas A, Yaqoob P, Givens DI, et al. (2013) The impact of obesity-related SNP on appetite and energy intake. Br. J. Nutr. 110, Mariman EC, Bouwman FG, Aller EE, et al. (2015) Extreme obesity is associated with variation in genes related to the circadian rhythm of food intake and hypothalamic signaling. Physiol. Genomics 47, Sonestedt E, Roos C, Gullberg B, et al. (2009) Fat and carbohydrate intake modify the association between genetic variation in the FTO genotype and obesity. Am. J. Clin. Nutr. 90, Boumaiza I, Omezzine A, Rejeb J, et al. (2012) Relationship between leptin G2548A and leptin receptor Q223R gene polymorphisms and obesity and metabolic syndrome risk in Tunisian volunteers. Genet. Test. Mol. Biomark. 16, Stutzmann F, Cauchi S, Durand E, et al. (2009) Common genetic variation near MC4R is associated with eating behaviour patterns in European populations. Int. J. Obes. 33,

127 RESULTADOS (Artigo 3) 15. Cecil J, Dalton M, Finlayson G, et al. (2012) Obesity and eating behaviour in children and adolescents: contribution of common gene polymorphisms. Int. Rev. Psychiatry 24, Plećaš D, Plešinac S & Kontić-Vučinić O (2014) Nutrition in pregnancy: Basic principles and recommendations. Srp. Arh. Celok. Lek. 142, Sichieri R & Everhart JE (1998) Validity of a Brazilian food frequency questionnaire against dietary recalls and estimated energy intake. Nutr. Res. 18, Pinheiro ABV, Lacerda EM de A, Benzecry EH, et al. (2004) Tabela para avaliação de consumo alimentar em medidas caseiras. 5th ed. São Paulo: Atheneu. 19. NEPA-UNICAMP (2011) Tabela Brasileira de Composição de Alimentos (TACO). 4th ed. Campinas-SP: NEPA/UNICAMP. 20. USDA (2011) National Nutrient Database for Standard Reference, Release (accessed March 2017). 21. Ministry of Health of Brazil (2015) Dietary Guidelines for the Brazilian Population. 2nd ed. Brasilia, DF, Brazil: Ministry of Health of Brazil. 22. Monteiro CA, Cannon G, Levy R, et al. (2016) NOVA. The star shines bright. [Food classification. Public health]. World Nutr. 7, Lohman TG, Roche AF & Martorell R (1988) Anthropometric standardization reference manual. Champaign, IL: Human Kinetics Books. 24. Butt K, Lim K, Bly S, et al. (2014) Determination of gestational age by ultrasound. J. Obstet. Gynaecol. Can. 36, Da Cunha PA, de Carlos Back LK, Sereia AFR, et al. (2013) Interaction between obesity-related genes, FTO and MC4R, associated to an increase of breast cancer risk. Mol. Biol. Rep. 40, Hofker M & Wijmenga C (2009) A supersized list of obesity genes. Nat. Genet. 41, Cecil JE, Tavendale R, Watt P, et al. (2008) An obesity-associated FTO gene variant and increased energy intake in children. N. Engl. J. Med. 359, Qi Q, Downer MK, Kilpeläinen TO, et al. (2015) Dietary intake, FTO genetic variants and adiposity: a combined analysis of over 16,000 children and adolescents. Diabetes 64, Brunkwall L, Ericson U, Hellstrand S, et al. (2013) Genetic variation in the fat mass and obesity-associated gene (FTO) in association with food preferences in healthy adults. Food Nutr. Res. 57, den Hoed M, Westerterp-Plantenga MS, Bouwman FG, et al. (2009) Postprandial responses in hunger and satiety are associated with the rs single nucleotide polymorphism in FTO. Am. J. Clin. Nutr. 90,

128 RESULTADOS (Artigo 3) 31. Liu G, Zhu H, Lagou V, et al. (2010) FTO variant rs is associated with body mass index and waist circumference, but not with energy intake or physical activity in European-and African-American youth. BMC Med. Genet. 11, Hasselbalch AL, Ängquist L, Christiansen L, et al. (2010) A variant in the fat mass and obesity-associated gene (FTO) and variants near the melanocortin-4 receptor gene (MC4R) do not influence dietary intake. J. Nutr. 140, Morell P & Fiszman S (2017) Revisiting the role of protein-induced satiation and satiety. Food Hydrocoll. 68, Karra E, O Daly OG, Choudhury AI, et al. (2013) A link between FTO, ghrelin, and impaired brain food-cue responsivity. J. Clin. Invest. 123, Church C, Moir L, McMurray F, et al. (2010) Overexpression of Fto leads to increased food intake and results in obesity. Nat. Genet. 42, Farooqi IS, Keogh JM, Yeo GS, et al. (2003) Clinical spectrum of obesity and mutations in the melanocortin 4 receptor gene. N. Engl. J. Med. 348, Stutzmann F, Tan K, Vatin V, et al. (2008) Prevalence of melanocortin-4 receptor deficiency in Europeans and their age-dependent penetrance in multigenerational pedigrees. Diabetes 57, Qi L, Kraft P, Hunter DJ, et al. (2008) The common obesity variant near MC4R gene is associated with higher intakes of total energy and dietary fat, weight change and diabetes risk in women. Hum. Mol. Genet. 17, Park S, Daily JW, Zhang X, et al. (2016) Interactions with the MC4R rs variant, mental stress and energy intake and the risk of obesity in genome epidemiology study. Nutr. Metab. 13, Girardet C & Butler AA (2014) Neural melanocortin receptors in obesity and related metabolic disorders. Biochim. Biophys. Acta 1842, Zandoná MR, Rodrigues RO, Albiero G, et al. (2013) Polymorphisms in LEPR, PPARG and APM1 genes: associations with energy intake and metabolic traits in young children. Arq. Bras. Endocrinol. Metabol. 57, Brown BC, Ye CJ, Price AL, et al. (2016) Transethnic genetic-correlation estimates from summary statistics. Am. J. Hum. Genet. 99,

129 RESULTADOS (Artigo 3) Pregnant women invited to participate in the study: N=322 Pregnant women who agreed to participate: N = 299 (92.7%) 79 Excluded: 40 did not meet eligibility criteria [confirmed infectious (n=10) and parasitic (n=2) diseases or NCDs (n=2), >13 gestational weeks at enrollment (n=16) or abandoned prenatal care at the public health center (n=10)]; 4 twin pregnancies; 25 miscarriage; 5 stillbirth; 5 missing the baseline data Folow-up: N = 220 pregnant women 9 Losses to follow-up: 9 only information at baseline N = 211 pregnant women 62 did not have blood samples for genotyping N = 149 participants eligible for the final analysis 141 women had all the SNPs 1 woman had only FTO, MC4R and LEPR SNPs 2 women had only FTO, MC4R and LEP SNPs 2 women had only FTO, LEP and LEPR SNPs 1 woman had only MC4R, LEP and LEPR SNPs 1 woman had only LEP and LEPR SNPs 1 woman had only LEPR SNP FTO polymorphism (n=146) MC4R polymosphism (n=145) LEP polymorphism (n=147) LEPR polymorphism (n=147) Dietary data during pre-pregnancy (n=144) Dietary data during pre-pregnancy (n=143) Dietary data during pre-pregnancy (n=145) Dietary data during pre-pregnancy (n=145) Dietary data during pregnancy (n=139) Dietary data during pregnancy (n=138) Dietary data during pregnancy (n=139) Dietary data during pregnancy (n=139) Figure 1 Flowchart illustrating the recruitment and selection of the study sample Abbreviations: NCDs = non-communicable chronic diseases; FTO = fat mass and obesity-associated gene; MC4R = melanocortin-4 receptor gene; LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; SNPs = single nucleotide polymorphisms. 129

130 RESULTADOS (Artigo 3) Table 1. Maternal descriptive characteristics and dietary intake of the study sample Maternal characteristics Value study sample Sociodemographic and lifestyle (n=149) Median (IQR) n (%) Age (y) 27 (22 31) Education (y) 9 (7 11) Per-capita family income (R$) a ( ) Parity (number of parturitions) 0 57 (38.3) 1 92 (61.7) Early pregnancy alcohol consumption No 121 (81.2) Yes 28 (18.8) Early pregnancy smoking habit Nonsmoking 108 (72.5) Former smoker 31 (20.8) Current smoker 10 (6.7) LTPA before pregnancy a No 119 (81.0) Yes 28 (19.0) Self-reported skin color White 39 (26.2) Black 35 (23.5) Brown (mixed race) 75 (50.3) Pre-pregnancy BMI (kg/m²) status Underweight (<18.5) 5 (3.4) Normal weight ( ) 92 (61.7) Overweight ( ) 33 (22.2) Obesity ( 30.0) 19 (12.7) Daily dietary intake pre-pregnancy (n=147) b mean (95% CI) Total energy (kcal/day) 2394 (2263, 2524) % of energy from Carbohydrates 56.2 (55.2, 57.2) Protein 16.1 (15.6, 16.6) Fat 26.7 (25.9, 27.5) Ultra-processed foods 47.4 (45.4, 49.5) Daily dietary intake during pregnancy (n=141) c mean (95% CI) Total energy (kcal/day) 2401 (2275, 2526) % of energy from Carbohydrates 58.3 (57.4, 59.2) Protein 16.4 (15.8, 17.0) Fat 25.2 (24.4, 25.9) Ultra-processed foods 44.2 (41.9, 46.4) Abbreviations: R$ = real; LTPA = leisure-time physical activity; BMI = body mass index; IQR = interquartile range; CI = confidence interval. Notes: a Variables with missing information: three missing values for per-capita family income and two missing values for leisure time physical activity. b Difference of the total sample size: one missing for food frequency questionnaire and one exclusion because implausible total energy intake (>6000 kcal/day). c Difference of the total sample size: seven missing for food frequency questionnaire and one exclusion because implausible total energy intake (>6000 kcal/day). 130

131 RESULTADOS (Artigo 3) Table 2. Distribution of daily dietary intake before and during pregnancy and variation according to genotypes of the FTO-rs , MC4Rrs , LEP-rs and LEPR-rs gene polymorphisms, considering the dominant genetic model for all genes Gene Genotypes Pre-pregnancy Pregnancy Delta ( ) Mean (95% CI) p- p- value * Mean (95% CI) value * Mean (95% CI) Total energy (kcal/day) a FTO TT (n=47) 2311 (2088, 2557) (1904, 2297) (-494.9, -24.7) AT+AA (n=90) 2246 (2103, 2399) 2353 (2202, 2513) (-68.2, 293.6) MC4R TT (n=89) 2307 (2158, 2467) (2185, 2511) (-146.6, 226.3) CT+CC (n=47) 2236 (2028, 2465) 2113 (1943, 2297) (-385.8, 65.5) LEP GG (n=63) 2284 (2101, 2483) (2209, 2574) (-164.3, 314.3) GA+AA (n=74) 2268 (2106, 2442) 2176 (2014, 2351) (-265.0, 95.5) LEPR AA (n=35) 2214 (1992, 2460) (2124, 2593) (-148.5, 395.4) AG+GG (n=102) 2303 (2160, 2457) 2232 (2091, 2382) (-245.1, 95.5) % of energy from Carbohydrates FTO TT (n=47) 54.6 (52.7, 56.4) (56.7, 59.9) (1.4, 6.1) AT+AA (n=90) 57.0 (55.8, 58.2) 58.2 (57.2, 59.4) 1.2 (-0.2, 2.7) MC4R TT (n=89) 56.6 (55.3, 57.9) (57.0, 57.2) (0.0, 3.1) CT+CC (n=47) 55.6 (53.9, 57.2) 58.8 (57.2, 60.4) 3.2 (1.1, 5.3) LEP GG (n=63) 55.6 (54.0, 57.0) (57.7, 60.1) (1.5, 5.2) GA+AA (n=74) 56.6 (55.3, 58.0) 57.8 (56.4, 59.2) 1.2 (-0.5, 2.8) LEPR AA (n=35) 56.8 (54.8, 58.9) (55.6, 59.2) (-2.0, 3.1) AG+GG (n=102) 56.1 (55.2, 57.2) 58.6 (57.6, 59.7) 2.6 (1.2, 4.0) % of energy from Protein a FTO TT (n=47) 16.5 (15.7, 17.4) (15.7, 17.7) (-0.6, 1.3) AT+AA (n=90) 15.8 (15.2, 16.5) 15.8 (15.2, 16.5) 0.1 (-0.7, 0.9) MC4R TT (n=89) 16.1 (15.6, 16.8) (15.7, 17.1) (-0.4, 1.2) CT+CC (n=47) 15.9 (15.0, 16.9) 15.5 (14.6, 16.5) -0.2 (-1.2, 0.8) LEP GG (n=63) 16.0 (15.2, 16.8) (14.6, 16.2) (-1.4, 0.4) GA+AA (n=74) 16.1 (15.5, 16.7) 16.6 (15.8, 17.4) 0.8 (-0.0, 1.6) LEPR AA (n=35) 15.6 (14.7, 16.5) (15.1, 17.6) (-0.4, 2.3) AG+GG (n=102) 16.2 (15.6, 16.8) 16.0 (15.4, 16.7) -0.0 (-0.7, 0.7) p- value * 131

132 RESULTADOS (Artigo 3) Gene Genotypes Pre-pregnancy Pregnancy Delta ( ) Mean (95% CI) p- p- value * Mean (95% CI) value * Mean (95% CI) % of energy from Fat FTO TT (n=47) 27.6 (25.9, 29.3) (23.3, 25.9) (-5.0, -0.9) AT+AA (n=90) 26.1 (25.2, 27.0) 25.4 (24.5, 26.3) -0.7 (-1.8, 0.3) MC4R TT (n=89) 26.0 (25.0, 27.1) (24.1, 25.9) (-2.3, 0.2) CT+CC (n=47) 27.6 (26.1, 29.0) 25.1 (23.9, 26.4) -2.4 (-4.1, -0.8) LEP GG (n=63) 27.2 (25.8, 28.5) (24.2, 26.3) (-3.3, -0.5) GA+AA (n=74) 26.2 (25.1, 27.4) 25.0 (23.9, 26.1) -1.2 (-2.6, 0.2) LEPR AA (n=35) 26.8 (25.0, 28.7) (24.4, 27.2) (-2.9, 0.9) AG+GG (n=102) 26.5 (25.6, 27.5) 24.9 (24.0, 25.7) -1.7 (-2.9, 0.5) % of energy from Ultra-processed foods FTO TT (n=47) 47.0 (43.6, 50.4) (36.9, 44.3) (-10.2, -2.6) AT+AA (n=90) 46.7 (44.1, 49.3) 45.6 (47.7, 48.5) -1.1 (-3.9, 1.7) MC4R TT (n=89) 45.5 (42.9, 48.2) (39.8, 45.8) (-5.7, 0.3) CT+CC (n=47) 49.2 (46.0, 52.5) 45.4 (42.0, 48.8) -3.8 (-7.4, -0.2) LEP GG (n=63) 46.8 (43.8, 49.9) (41.5, 47.9) (-5.4, 1.2) GA+AA (n=74) 47.1 (44.2, 50.0) 42.8 (39.5, 46.1) -4.3 (-7.5, -1.1) LEPR AA (n=35) 49.4 (45.0, 53.8) (38.7, 48.5) (-11.1, -0.4) AG+GG (n=102) 46.2 (43.9, 48.5) 44.1 (41.4, 46.7) -2.1 (-4.6, 0.4) Abbreviations: FTO = fat mass and obesity-associated gene; MC4R = melanocortin-4 receptor gene; LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; CI = confidence interval. Notes: a During pre-pregnancy and pregnancy log transformed values were used, but estimates provided in the table were back-transformed and data are presented as geometric mean (95%CI). Delta ( ) refers to the difference between values during pregnancy and pre-pregnancy performed with the untransformed variable, to compare differences between groups of the genotypes. * p-value refers to Student s t-test with the assumption of dominant genetic model. p- value * 132

133 RESULTADOS (Artigo 3) Table 3. Linear regression models between FTO-rs , MC4R-rs , LEP-rs and LEPR-rs gene polymorphisms and daily dietary intake before and during pregnancy, considering the dominant * genetic model for all genes Outcomes Gene Pre-pregnancy Pregnancy Crude Adjusted Crude Adjusted β (95% CI) p- β (95% CI) p- p- β (95% CI) p- β (95% CI) value value value value FTO (-0.065, 0.037) (-0.031, 0.071) (0.006, 0.105) (0.003, 0.106) MC4R (-0.065, 0.034) (-0.074, 0.024) (-0.088, 0.011) (-0.091, 0.010) LEP (-0.046, 0.050) (-0.029, 0.065) (-0.084, 0.011) (-0.081, 0.017) LEPR (-0.057, 0.050) (-0.060, 0.042) (-0.072, 0.037) (-0.078, 0.035) (log)total energy a (kcal/day) % of energy from Carbohydrates FTO 2.5 (0.4, 4.5) (0.5, 4.8) (-1.8, 1.9) (-1.8, 2.2) MC4R -0.4 (-2.5, 1.7) (-2.4, 1.9) (-1.2, 2.6) (-1.1, 2.8) LEP 1.0 (-0.9, 3.0) (-0.9, 3.2) (-2.9, 0.8) (-2.5, 1.3) LEPR -0.5 (-2.7, 1.7) (-2.7, 1.8) (-0.8, 3.3) (-0.6, 3.6) (log) Protein a FTO (-0.047, 0.008) (-0.066, ) (-0.057, 0.008) (-0.074, ) MC4R (-0.37, 0.018) (-0.038, 0.018) (-0.058, 0.006) (-0.061, 0.003) LEP (-0.021, 0.032) (-0.030, 0.024) (-0.001, 0.061) (-0.008, 0.053) LEPR (-0.006, 0.052) (-0.006, 0.051) (-0.045, 0.026) (-0.050, 0.020) Fat FTO -1.4 (-3.2, 0.3) (-2.7, 1.0) (-0.7, 2.3) (-0.3, 2.8) MC4R 1.2 (-0.5, 2.9) (-0.9, 2.7) (-1.4, 1.7) (-1.4, 1.7) LEP -0.9 (-2.6, 0.7) (-2.4, 1.1) (-1.7, 1.3) (-1.9, 1.2) LEPR -0.7 (-2.5, 1.2) (-2.4, 1.3) (-2.6, 0.7) (-2.6, 0.8) Ultra-processed foods FTO -0.8 (-4.3, 4.1) (-2.3, 6.3) (0.5, 10.1) (1.4, 11.1) MC4R 3.5 (-0.6, 7.6) (-0.4, 8.0) (-1.8, 7.8) (-0.9, 8.6) LEP -0.5 (-4.6, 3.6) (-3.0, 5.3) (-6.2, 3.0) (-6.1, 3.1) LEPR -4.2 (-8.6, 0.3) (-8.0, 0.6) (-4.6, 6.0) (-4.6, 6.0) Abbreviations: FTO = fat mass and obesity-associated gene; MC4R = melanocortin-4 receptor gene; LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; β = linear regression coefficient; CI = confidence interval. Notes: a Log transformed values were used. * Dominant genetic model (FTO = TT vs. AT + AA; MC4R = TT vs. CT + CC; LEP = GG vs. GA + AA; LEPR = AA vs. AG + GG). Models were adjusted for maternal age, self-reported skin color, parity, gestational age, per capita income and pre-pregnancy body mass index. 133

134 RESULTADOS (Artigo 3) Table 4. Longitudinal analysis between FTO-rs , MC4R-rs , LEP-rs and LEPR-rs gene polymorphisms and daily dietary intake, according to genotypes. SNPs/ Genotypes (log) Total energy (kcal) a, % of energy from β (95% CI) p- value Carbohydrates (log) Protein a Fat Ultra-processed foods β p- (95% CI) β value p- (95% CI) β value p- (95% CI) β value p- (95% CI) value FTO-rs AT vs. TT (-0.018, 0.065) (-0.2, 2.9) (-0.048, 0.003) (-1.5, 1.2) (-1.9, 6.1) AT+AA vs. TT (-0.008, 0.070) (-0.3, 2.7) (-0.050, ) (-1.2, 1.3) (-1.2, 6.4) MC4R-rs CT vs. TT (-0.073, 0.009) (-1.6, 1.5) (-0.038, 0.013) (-0.7, 1.9) (0.5, 8.3) CT+CC vs. TT (-0.073, 0.006) (-1.5, 1.6) (-0.042, 0.008) (-0.6, 2.0) (0.4, 8.0) LEP-rs GA vs. GG (-0.051, 0.029) (-1.0, 2.0) (-0.017, 0.033) (-2.4, 0.3) (-5.5, 2.1) GA+AA vs. GG (-0.052, 0.024) (-1.4, 1.5) (-0.011, 0.036) (-1.9, 0.7) (-4.0, 3.3) LEPR-rs AG vs. AA (-0.050, 0.042) (-0.9, 2.5) (-0.020, 0.037) (-2.5, 0.4) (-6.8, 1.9) AG+GG vs. AA (-0.048, 0.037) (-1.2, 2.1) (-0.018, 0.036) (-2.1, 0.6) (-5.9, 2.2) Abbreviations: SNPs = single nucleotide polymorphisms; FTO = fat mass and obesity-associated gene; MC4R = melanocortin-4 receptor gene; LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; CI =confidence interval. Notes: a Log transformed values were used. Models were adjusted for gestational age (wk), maternal age, self-reported skin color, parity, per capita income and pre-pregnancy body mass index. β= Linear mixed-effect regression coefficient; p-value refers to the maximum likelihood estimator. 134

135 RESULTADOS (Artigo 3) Supplementary Table 1. Genotype distribution and allele frequencies of the FTO-rs , MC4R-rs , LEP-rs and LEPR-rs gene polymorphisms SNPs Study sample n (%) p-value (HW) FTO-rs (n=146) TT 47 (32.2) AT 75 (51.4) AA 24 (16.4) T-allele 169 (58.0) A-allele 123 (42.0) MC4R-rs (n=145) TT 94 (64.8) CT 47 (32.4) CC 4 (2.8) T-allele 235 (81.0) C-allele 55 (19.0) LEP-rs (n=147) GG 70 (47.6) GA 62 (42.2) AA 15 (10.2) G-allele 202 (69.0) A-allele 92 (31.0) LEPR-rs (n=147) AA 39 (26.5) AG 68 (46.3) GG 40 (27.2) A-allele 146 (50.0) G-allele 148 (50.0) Abbreviations: SNPs = single nucleotide polymorphisms; FTO = fat mass and obesity-associated gene; MC4R = melanocortin-4 receptor gene; LEP = leptin; LEPR = leptin receptor; HW = Hardy Weinberg equilibrium. Note: Hardy Weinberg equilibrium test, p-value refers to Pearson χ 2 tests. (FTO = TT, Wild type; AT, heterozygote; and AA, homozygote for risk allele); (MC4R = TT, Wild type; CT, heterozygote; and CC, homozygote for risk allele); (LEP = GG, Wild type; GA, heterozygote; and AA, homozygote for risk allele); (LEPR = AA, Wild type; AG, heterozygote; and GG, homozygote for risk allele). 135

136 CONCLUSÕES 8. CONCLUSÕES A presente tese apresentou três artigos científicos como principais produtos. As principais conclusões foram: Gene FTO (rs ) O SNP do gene do FTO-rs foi significativamente associado ao o excesso de peso pré-gestacional; no entanto, mulheres portadoras do genótipo AA ganharam menos peso ao longo da gestação quando comparadas a mulheres com os genótipos AT e TT. No presente estudo não foram encontradas associações deste polimorfismo com o GPG e a retenção de peso pós-parto. Contudo, foram encontradas associações significativas com a percentagem mais elevada de energia derivada dos carboidratos no período pré-gestacional, e também a percentagem mais elevada de energia total e a percentagem de energia derivada de alimentos ultraprocessados durante a gestação. Adicionalmente, este polimorfismo foi associado negativamente ao percentual de energia proveniente das proteínas nos períodos prégestacional e gestacional. Gene MC4R (rs ) O polimorfismo no gene MC4R-rs (alelo C) não foi associado ao excesso de peso pré-gestacional, o GPG e a retenção de peso pós-parto. Porém, foi associado à percentagem mais elevada de energia derivada de alimentos ultraprocessados ao longo do período gestacional, em comparação com aquelas portadoras do genótipo TT. Gene LEP (rs ) Este polimorfismo não foi associado estatisticamente ao risco de excesso de peso prégestacional, concentração plasmática de leptina durante a gestação ou com os parâmetros de consumo alimentar nos períodos pré-gestacional e gestacional. As mulheres portadoras de genótipo AA do gene LEP-rs apresentaram menor peso corporal ao longo da gestação em comparação com as portadoras dos genótipos GG ou GA+GG; mas o alelo A mostrou-se significativamente associado ao maior risco de GPG excessivo. 136

137 CONCLUSÕES LEPR (rs ) Não foi encontrada nenhuma associação estatisticamente significante deste polimorfismo ao peso pré-gestacional excessivo, GPG excessivo, concentração plasmática de leptina ao longo da gestação e parâmetros de consumo alimentar antes e durante a gestação. 137

138 CONSIDERAÇÕES FINAIS 9. CONSIDERAÇÕES FINAIS À medida que a prevalência de obesidade continua a aumentar em todo o mundo, cresce a necessidade de maior compreensão dos mecanismos desta doença para que se possa promover a sua prevenção, minimizar os impactos à saúde e reduzir a carga econômica. Com este propósito, pesquisadores estão investigando maneiras pelas quais a genética pode estar causando impacto nesta epidemia. Alguns avanços foram alcançados, porém ainda existem lacunas e muitos estudos ainda precisam ser realizados na busca por evidências mais consistentes. A genética vinculada ao processo gestacional é uma área de relevância a ser explorada, pois a obesidade materna está relacionada a vários mecanismos de risco de complicações gestacional para a mãe e o feto. Apesar desta importancia, ainda é escasso ou inexistente o conhecimento sobre como os genes contribuem para as mudanças de peso ao longo da gestação. A presente tese apresentou resultados sobre as associações dos SNPs dos genes relacionados à obesidade com as mudanças de peso corporal e consumo alimentar em mulheres gestantes. Os genes FTO-rs , MC4R-rs e LEPR-rs são altamente expressos no cérebro, particularmente no hipotalamo, enfatizando sua importância nos mecanismos relacionados ao sistema nervoso central para o controle da obesidade. É reconhecido que o apetite e o comportamento alimentar sofrem influência genética e há indícios de que o componente genético atue sobre o gasto energético, notadamente sobre a taxa metabólica basal. Contudo, diversos são os desafios da via biológica da obesidade comum e muitos questionamentos ainda precisam ser mais bem explorados. Os fatores relacionados aos padrões alimentares e à prática de atividade física são considerados fatores ambientais de risco da obesidade. A saúde materna e o consumo alimentar, antes e durante o período gestacional, são importantes fatores para o desenvolvimento adequado da gestação. Entre os genes estudados, o FTO-rs e o MC4R-rs foram associados aos parâmetros de consumo alimentar, além de o gene FTO-rs também ter sido associado ao excesso do peso pré-gestacional. O gene LEPrs foi associado ao risco de GPG excessivo. Assim, os resultados deste estudo agregam novos conhecimentos à literatura científica e podem contribuir para o direcionamento de novas pesquisas sobre evidências genéticas e desfechos gestacionais. Com o avanço no conhecimento do genoma humano e o desenvolvimento de tecnologias abrangentes, provavelmente será possível abordar simultaneamente as 138

139 CONSIDERAÇÕES FINAIS características genéticas e ambientais e contribuir para o desenvolvimento de medidas que objetivem a redução da prevalência da obesidade e suas comorbidades. Nesta perspectiva, são necessários novos estudos longitudinais para avaliar as associações entre os polimorfismos genéticos e parâmetros relacionados ao peso e ao consumo alimentar antes, durante e após a gestação. Os resultados da presente tese são inovadores, pois avaliam a influência genética sobre as mudanças do peso corporal e do consumo alimentar na gestação com técnicas estatísticas longitudinais ajustadas para o efeito de outras potenciais variáveis confundidoras. A compreensão e a interligação dos fatores que exercem influência na gestação e nos seus desfechos adversos são de suma importância para propor mudanças nos hábitos modificáveis e estabelecer medidas de prevenção do excesso de peso na gestação. 139

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153 APÊNDICES 11. APÊNDICES 153

154 APÊNDICE A Do-files Tabelas Artigo 1 APÊNDICE A Do-files Tabelas Artigo 1 **************************************************************************************************** Table 1 Maternal characteristics according to the FTO (rs ) and the MC4R (rs ) gene polymorphisms **************************************************************************************************** Amostra Total tabstat idade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, stat (med p25 p75 n) tab new_cor_referida_cat if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 tabstat anos_escolaridade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, stat (med p25 p75 n) tab new_sitconj_cat if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 tab new_fumo_cat2 if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 tab faz_ativ_lazer_antes if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 tab paridade1 if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 tab sexo_bebe if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 tabstat kcaltotal1tr if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 & kcaltotal1tr<5000, stat (med p25 p75 n) sum peso_pre_relatado estaturamedia imcreferido if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 sum peso_atual if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 sum peso_atual if amostra_genetica==7 & trimestre==2 & status_peso_prereferido==1 sum peso_atual if amostra_genetica==7 & trimestre==4 & status_peso_prereferido==1 sum retenção_peso_referido if amostra_genetica==7 & trimestre==4 & status_peso_prereferido==1 Recessive model FTO (TT/AT vs AA tabstat idade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, stat (med p25 p75 n) by (polifto_2cat) ranksum idade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, by (polifto_2cat) tab polifto_2cat new_cor_referida_cat if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 tabstat anos_escolaridade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, stat (med p25 p75 n) by (polifto_2cat) ranksum anos_escolaridade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, by (polifto_2cat) tab polifto_2cat new_sitconj_cat if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row exact chi2 tab polifto_2cat new_fumo_cat2 if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 exact tab polifto_2cat faz_ativ_lazer_antes if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 exact tab polifto_2cat paridade1 if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 exact tab polifto_2cat sexo_bebe if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 tabstat kcaltotal1tr if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 & kcaltotal1tr<5000, stat (med p25 p75 n) by (polifto_2cat) ranksum kcaltotal1tr if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 & kcaltotal1tr<5000, by (polifto_2cat) ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(polifto_2cat) ttest estaturamedia if trimestre==1 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(polifto_2cat) ttest imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(polifto_2cat) ttest peso_atual if trimestre==1 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(polifto_2cat) ttest peso_atual if trimestre==2 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(polifto_2cat) ttest peso_atual if trimestre==4 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(polifto_2cat) ttest retenção_peso_referido if trimestre==4 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(polifto_2cat) Additive model FTO (TT vs AT vs AA) tabstat idade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, stat (med p25 p75 n) by (polifto) kwallis idade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, by (polifto) tab polifto new_cor_referida_cat if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 tabstat anos_escolaridade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, stat (med p25 p75 n) by (polifto) kwallis anos_escolaridade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, by (polifto) tab polifto new_sitconj_cat if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row exact chi2 tab polifto new_fumo_cat2 if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 exact tab polifto faz_ativ_lazer_antes if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 exact tab polifto paridade1 if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 exact tab polifto sexo_bebe if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 tabstat kcaltotal1tr if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 & kcaltotal1tr<5000, stat (med p25 p75 n) by (polifto) kwallis kcaltotal1tr if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 & kcaltotal1tr<5000, by (polifto) by polifto:sum peso_pre_relatado if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 anova peso_pre_relatado polifto if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 pwmean peso_pre_relatado, over(polifto) effects sort mcompare(tukey) by polifto: sum estaturamedia if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 anova estaturamedia polifto if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 pwmean estaturamedia, over(polifto) effects sort mcompare(tukey) by polifto: sum imcreferido if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 anova imcreferido polifto if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 154

155 APÊNDICE A Do-files Tabelas Artigo 1 pwmean imcreferido, over(polifto) effects sort mcompare(tukey) by polifto: sum peso_atual if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 anova peso_atual polifto if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 pwmean peso_atual, over(polifto) effects sort mcompare(tukey) by polifto: sum peso_atual if amostra_genetica==7 & trimestre==2 & status_peso_prereferido==1 anova peso_atual polifto if amostra_genetica==7 & trimestre==2 & status_peso_prereferido==1 pwmean peso_atual, over(polifto) effects sort mcompare(tukey) by polifto: sum peso_atual if amostra_genetica==7 & trimestre==4 & status_peso_prereferido==1 anova peso_atual polifto if amostra_genetica==7 & trimestre==4 & status_peso_prereferido==1 pwmean peso_atual, over(polifto) effects sort mcompare(tukey) by polifto: sum retenção_peso_referido if amostra_genetica==7 & trimestre==4 & status_peso_prereferido==1 anova retenção_peso_referido polifto if amostra_genetica==7 & trimestre==4 & status_peso_prereferido==1 pwmean retenção_peso_referido, over(polifto) effects sort mcompare(tukey) Dominant model MC4R (TT vs CT/CC) tabstat idade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, stat (med p25 p75 n) by (polimc4r2) ranksum idade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, by (polimc4r2) tab polimc4r2 new_cor_referida_cat if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 tabstat anos_escolaridade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, stat (med p25 p75 n) by (polimc4r2) ranksum anos_escolaridade if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, by (polimc4r2) tab polimc4r2 new_sitconj_cat if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row exact chi2 tab polimc4r2 new_fumo_cat2 if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 exact tab polimc4r2 faz_ativ_lazer_antes if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 exact tab polimc4r2 paridade1 if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 exact tab polimc4r2 sexo_bebe if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1, row chi2 tabstat kcaltotal1tr if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 & kcaltotal1tr<5000, stat (med p25 p75 n) by (polimc4r2) ranksum kcaltotal1tr if amostra_genetica==7 & trimestre==1 & status_peso_prereferido==1 & kcaltotal1tr<5000, by (polimc4r2) ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(polimc4r2) ttest estaturamedia if trimestre==1 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(polimc4r2) ttest imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(polimc4r2) ttest peso_atual if trimestre==1 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(polimc4r2) ttest peso_atual if trimestre==2 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(polimc4r2) ttest peso_atual if trimestre==4 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(polimc4r2) ttest retenção_peso_referido if trimestre==4 & amostra_genetica==7 & status_peso_prereferido==1, by(polimc4r2) **************************************************************************************************** Table 2 Associations of adiposity risk alleles (FTO and MC4R) with body weight changes before, during pregnancy and early postpartum **************************************************************************************************** *******************************************regressão linear múltipla************************************** FTO - GWG in 1st trimester (g/wk) regress gan_peso_sem_1per i.polifto_2cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress gan_peso_sem_1per i.polifto_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat sg1seg i.paridade1 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress gan_peso_sem_1per i.polifto_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat sg1seg i.paridade1 imcreferido imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 FTO - GWG in 2nd trimester (g/wk) regress gan_peso_sem_2per i.polifto_2cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress gan_peso_sem_2per i.polifto_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 sg2seg if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress gan_peso_sem_2per i.polifto_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 sg2seg imcreferido imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 FTO - GWG in 3rd trimester (g/wk) regress gan_peso_sem_3per i.polifto_2cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress gan_peso_sem_3per i.polifto_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 sg3seg if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress gan_peso_sem_3per i.polifto_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 sg3seg imcreferido imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 FTO - Total GWG, (kg) regress ganhopesogest_ref i.polifto_2cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress ganhopesogest_ref i.polifto_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat sg4seg i.paridade1 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 155

156 APÊNDICE A Do-files Tabelas Artigo 1 regress ganhopesogest_ref i.polifto_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat sg4seg i.paridade1 imcreferido imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 FTO - PPWR, (g/wk) regress retenção_peso_referido_corr i.polifto_2cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress retenção_peso_referido_corr i.polifto_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.paridade1 i.new_cor_referida_cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress retenção_peso_referido_corr i.polifto_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.paridade1 i.new_cor_referida_cat ganhopesogest_ref if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 MC4R2 - GWG in 1st trimester (g/wk) regress gan_peso_sem_1per i.polimc4r2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress gan_peso_sem_1per i.polimc4r2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat sg1seg i.paridade1 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress gan_peso_sem_1per i.polimc4r2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat sg1seg i.paridade1 imcreferido imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 MC4R2 - GWG in 2nd trimester (g/wk) regress gan_peso_sem_2per i.polimc4r2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress gan_peso_sem_2per i.polimc4r2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 sg2seg if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress gan_peso_sem_2per i.polimc4r2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 sg2seg imcreferido imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 MC4R2 - GWG in 3rd trimester (g/wk) regress gan_peso_sem_3per i.polimc4r2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress gan_peso_sem_3per i.polimc4r2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 sg3seg if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress gan_peso_sem_3per i.polimc4r2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 sg3seg imcreferido imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 MC4R2 - Total GWG, (kg) regress ganhopesogest_ref i.polimc4r2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress ganhopesogest_ref i.polimc4r2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat sg4seg i.paridade1 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress ganhopesogest_ref i.polimc4r2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat sg4seg i.paridade1 imcreferido imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 MC4R - PPWR, (g/wk) regress retenção_peso_referido_corr i.polimc4r2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress retenção_peso_referido_corr i.polimc4r2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.paridade1 i.new_cor_referida_cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 regress retenção_peso_referido_corr i.polimc4r2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.paridade1 i.new_cor_referida_cat ganhopesogest_ref if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1 **********************************************regressão de Poisson************************************** FTO - RR pre-pregnancy BMI - overweight (BMI >=25 kg/m 2 poisson catimcrefer_new0 i.polifto_2cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson catimcrefer_new0 i.polifto_2cat i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat idade anos_escolaridade i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson catimcrefer_new0 i.polifto_2cat i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat idade anos_escolaridade i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1 estaturamedia if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) FTO - RR total GWG by IOM category - insufficiente poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.polifto_2cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.polifto_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.polifto_2cat i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 imcreferido imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) FTO - RR total GWG by IOM category - excessive poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.polimc4r2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.polimc4r2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.polimc4r2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 imcreferido imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) FTO - RR postpartum BMI overweight (BMI >=25 kg/m 2 ) poisson new_imc_catposparto0 i.polifto_2cat if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson new_imc_catposparto0 i.polifto_2cat i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat idade anos_escolaridade i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) 156

157 APÊNDICE A Do-files Tabelas Artigo 1 poisson new_imc_catposparto0 i.polifto_2cat i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat idade anos_escolaridade i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1 imcreferido imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) MC4R - RR pre-pregnancy BMI - overweight (BMI >=25 kg/m 2 ) poisson catimcrefer_new0 i.polimc4r2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson catimcrefer_new0 i.polimc4r2 i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat idade anos_escolaridade i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson catimcrefer_new0 i.polimc4r2 i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat idade anos_escolaridade i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1 estaturamedia if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) MC4R - RR total GWG by IOM category - insufficiente poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.polimc4r2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.polimc4r2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.polimc4r2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 imcreferido imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) MC4R - RR total GWG by IOM category - excessive poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.polimc4r2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.polimc4r2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.polimc4r2 i.sexo_bebe i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade1 imcreferido imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) MC4R - RR postpartum BMI overweight (BMI >=25 kg/m 2 ) poisson new_imc_catposparto0 i.polimc4r2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson new_imc_catposparto0 i.polimc4r2 i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat idade anos_escolaridade i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) poisson new_imc_catposparto0 i.polimc4r2 i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat idade anos_escolaridade i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1 imcreferido imcreferido2 if amostra_genetica==7 & seguimento==1 & status_peso_prereferido==1, irr vce(robust) **************************************************************************************************** **Table 3 - Longitudinal analysis between FTO (rs ), MC4R (rs ) and trajectory of body weight during pregnancy **************************************************************************************************** FTO - Trajectory of maternal weight (TT or AT vs. AA) xi: xtmixed peso_atual i.polifto_2cat sg_padrao sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1, id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed peso_atual i.polifto_2cat sg_padrao anos_escolaridade i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat i.sexo_bebe idade i.faz_ativ_lazer_antes estaturamedia i.paridade1 sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1, id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed peso_atual i.polifto_2cat sg_padrao anos_escolaridade i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat i.sexo_bebe idade i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1 imcreferido imcreferido2 sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1, id: sg_padrao, covariance(uns) variance FTO - Trajectory of maternal weight (FTO#gestational age) xi: xtmixed peso_atual polifto_2cat##c.sg_padrao sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1, id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed peso_atual polifto_2cat##c.sg_padrao anos_escolaridade i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat i.sexo_bebe idade i.faz_ativ_lazer_antes estaturamedia i.paridade1 sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1, id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed peso_atual polifto_2cat##c.sg_padrao anos_escolaridade i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat i.sexo_bebe idade i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1 imcreferido imcreferido2 sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1, id: sg_padrao, covariance(uns) variance MC4R - Trajectory of maternal weight (TT vs. CT or CC) xi: xtmixed peso_atual i.polimc4r2 sg_padrao sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1, id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed peso_atual i.polimc4r2 sg_padrao anos_escolaridade i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat i.sexo_bebe idade i.faz_ativ_lazer_antes estaturamedia i.paridade1 sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1, id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed peso_atual i.polimc4r2 sg_padrao anos_escolaridade i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat i.sexo_bebe idade i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1 imcreferido imcreferido2 sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1, id: sg_padrao, covariance(uns) variance Aggregate score (FTO/MC4R)0=(TT/TT) or (AAorAT/TT or CCorCT/TT) 1=(AAorAT/CCorCT) xi: xtmixed peso_atual i.fto2mc4r2mod_news_r sg_padrao sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1, id: sg_padrao, covariance(uns) variance 157

158 APÊNDICE A Do-files Tabelas Artigo 1 xi: xtmixed peso_atual i.fto2mc4r2mod_news_r sg_padrao anos_escolaridade i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat i.sexo_bebe idade i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1 estaturamedia sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1, id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed peso_atual i.fto2mc4r2mod_news_r sg_padrao anos_escolaridade i.new_fumo_cat2 i.new_cor_referida_cat i.sexo_bebe idade i.faz_ativ_lazer_antes i.paridade1 imcreferido imcreferido2 sg_padrao2 if amostra_genetica==7 & seguimento~=5 & status_peso_prereferido==1, id: sg_padrao, covariance(uns) variance 158

159 APÊNDICE B Do-files Tabelas Artigo 2 APÊNDICE B Do-files Tabelas Artigo 2 **************************************************************************************************** Table 1. Maternal characteristic of the study population stratifying for pre-pregnancy BMI categories. **************************************************************************************************** Study population tabstat idade if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, stat (med p25 p75 n) tab new_cor_referida_cat if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 tabstat anos_escolaridade if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, stat (med p25 p75 n) tab new_fumo_cat2 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 tabstat kcaltotal1tr if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, stat (med p25 p75 n) tab faz_ativ_lazer_antes if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 tab paridade3 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 ********************************************* sum peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 sum ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 tab cat_gan_peso_ref_iom if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 ci logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 ci logleptina_trial if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1 ci logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 Underweight or normal weight (BMI < 25 kg/m2) vs Overweight/obese (BMI = >25kg/m2) tabstat idade if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, stat (med p25 p75 n) by (catimcrefer_new) ranksum idade if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (catimcrefer_new) tab catimcrefer_new new_cor_referida_cat if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, row chi2 exact tabstat anos_escolaridade if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, stat (med p25 p75 n) by (catimcrefer_new) ranksum anos_escolaridade if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (catimcrefer_new) tab catimcrefer_new new_fumo_cat2 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, row chi2 exact tabstat kcaltotal1tr if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, stat (med p25 p75 n) by (catimcrefer_new) ranksum kcaltotal1tr if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (catimcrefer_new) tab catimcrefer_new faz_ativ_lazer_antes if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, row chi2 exact tab catimcrefer_new paridade3 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, row chi2 exact ********************************************* ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (catimcrefer_new) ttest ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, by (catimcrefer_new) tab catimcrefer_new cat_gan_peso_ref_iom if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, row chi2 exact ttest logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (catimcrefer_new) ttest logleptina_trial if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1, by (catimcrefer_new) ttest logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, by (catimcrefer_new) **************************************************************************************************** Table 2. Genotype and allele frequencies of the LEP-rs and of the LEPR-rs polymorphisms of the study population stratifying for pre-pregnancy BMI **************************************************************************************************** LEP - Study population tab lep_rs if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 genhwi , label (GG GA AA) LEP - Underweight or normal weight (BMI < 25 kg/m2) vs Overweight/obese (BMI = >25kg/m2) tab catimcrefer_new snplep_rs if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, row chi2 exact genhwi , label (GG GA AA) genhwi , label (GG GA AA) LEPR - Study population tab rlep_rs if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 genhwi , label (AA AG GG) LEPR - Underweight or normal weight (BMI < 25 kg/m2) vs Overweight/obese (BMI = >25kg/m2) tab catimcrefer_new snprlep_rs if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, row chi2 exact genhwi , label (AA AG GG) genhwi , label (AA AG GG) **************************************************************************************************** Table 3. Distribution of the pre-pregnancy body weight and BMI, total GWG and plasma leptin concentrations according to genotypes of the LEP-rs and of the LEPR-rs **************************************************************************************************** LEP - Pre-pregnancy body weight (kg) - (GG vs GA vs AA) oneway peso_pre_relatado snplep_rs if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate LEP - Pre-pregnancy body weight (kg) - (GA vs GG) ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs ~=2, by (gen_rs ) LEP - Pre-pregnancy body weight (kg) - (AA vs GG) ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs ~=1, by (gen_rs ) 159

160 APÊNDICE B Do-files Tabelas Artigo 2 LEP - Pre-pregnancy body weight (kg) - (AA vs GA+GG) ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (re_gen_rs ) LEP - Pre-pregnancy body weight (kg) - (GA+AA vs GG) ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs ) ********************************************* LEP - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (GG vs GA vs AA) oneway imcreferido snplep_rs if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate LEP - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (GA vs GG) ttest imcreferido if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs ~=2, by (gen_rs ) LEP - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (AA vs GG) ttest imcreferido if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs ~=1, by (gen_rs ) LEP - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (AA vs GA+GG) ttest imcreferido if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (re_gen_rs ) LEP - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (GA+AA vs GG) ttest imcreferido if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs ) ********************************************* LEP - Total GWG (kg) - (GG vs GA vs AA) oneway ganhopesogest_ref snplep_rs if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate LEP - Total GWG (kg) - (GA vs GG) ttest ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs ~=2, by (gen_rs ) LEP - Total GWG (kg) - (AA vs GG) ttest ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs ~=1, by (gen_rs ) LEP - Total GWG (kg) - (AA vs GA+GG) ttest ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (re_gen_rs ) LEP - Total GWG (kg) - (GA+AA vs GG) ttest ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs ) ********************************************* LEP - Leptina (ng/dl) First trimester - (GG vs GA vs AA) oneway logleptina_trial snplep_rs if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate LEP - Leptina (ng/dl) First trimester - (GA vs GG) ttest logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs ~=2, by (gen_rs ) LEP - Leptina (ng/dl) First trimester - (AA vs GG) ttest logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs ~=1, by (gen_rs ) LEP - Leptina (ng/dl) First trimester - (AA vs GA+GG) ttest logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (re_gen_rs ) LEP - Leptina (ng/dl) First trimester) - (GA+AA vs GG) ttest logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs ) ********************************************* LEP - Leptina (ng/dl) Second trimester - (GG vs GA vs AA) oneway logleptina_trial snplep_rs if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate LEP - Leptina (ng/dl) Second trimester - (GA vs GG) ttest logleptina_trial if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs ~=2, by (gen_rs ) LEP - Leptina (ng/dl) Second trimester - (AA vs GG) ttest logleptina_trial if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs ~=1, by (gen_rs ) LEP - Leptina (ng/dl) Second trimester - (AA vs GA+GG) ttest logleptina_trial if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1, by (re_gen_rs ) LEP - Leptina (ng/dl) Second trimester) - (GA+AA vs GG) ttest logleptina_trial if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs ) ********************************************* LEP - Leptina (ng/dl) Third trimester - (GG vs GA vs AA) oneway logleptina_trial snplep_rs if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, tabulate LEP - Leptina (ng/dl) Third trimester - (GA vs GG) ttest logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs ~=2 & coorte_ou_ensaio3==1, by (gen_rs ) LEP - Leptina (ng/dl) Third trimester - (AA vs GG) ttest logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs ~=1 & coorte_ou_ensaio3==1, by (gen_rs ) LEP - Leptina (ng/dl) Third trimester - (AA vs GA+GG) ttest logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, by (re_gen_rs ) LEP - Leptina (ng/dl) Third trimester) - (GA+AA vs GG) ttest logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, by (gen_rs ) ********************************************* ********************************************* LEPR - Pre-pregnancy body weight (kg) - (AA vs AG vs GG) oneway peso_pre_relatado snprlep_rs if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate LEPR - Pre-pregnancy body weight (kg) - (AG vs AA) ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs ~=2, by (gen_rs ) LEPR - Pre-pregnancy body weight (kg) - (GG vs AA) ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs ~=1, by (gen_rs ) LEPR - Pre-pregnancy body weight (kg) - (GG vs AG+AA) ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (re_gen_rs ) LEPR - Pre-pregnancy body weight (kg) - (AG+GG vs AA) ttest peso_pre_relatado if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs ) ********************************************* LEPR - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (AA vs AG vs GG) oneway imcreferido snprlep_rs if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate 160

161 APÊNDICE B Do-files Tabelas Artigo 2 LEPR - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (AG vs AA) ttest imcreferido if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs ~=2, by (gen_rs ) LEPR - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (GG vs AA) ttest imcreferido if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs ~=1, by (gen_rs ) LEPR - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (GG vs AG+AA) ttest imcreferido if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (re_gen_rs ) LEPR - Pre-pregnancy BMI (kg/m2) - (AG+GG vs AA) ttest imcreferido if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs ) ********************************************* LEPR - Total GWG (kg) - (AA vs AG vs GG) oneway ganhopesogest_ref snprlep_rs if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate LEPR - Total GWG (kg) - (AG vs AA) ttest ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs ~=2, by (gen_rs ) LEPR - Total GWG (kg) - (GG vs AA) ttest ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs ~=1, by (gen_rs ) LEPR - Total GWG (kg) - (GG vs AG+AA) ttest ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (re_gen_rs ) LEPR - Total GWG (kg) - (AG+GG vs AA) ttest ganhopesogest_ref if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs ) ********************************************* LEPR - Leptina (ng/dl) First trimester - (AA vs AG vs GG) oneway logleptina_trial snprlep_rs if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate LEPR - Leptina (ng/dl) First trimester - (AG vs AA) ttest logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs ~=2, by (gen_rs ) LEPR - Leptina (ng/dl) First trimester - (GG vs AA) ttest logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs ~=1, by (gen_rs ) LEPR - Leptina (ng/dl) First trimester - (GG vs AG+AA) ttest logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (re_gen_rs ) LEPR - Leptina (ng/dl) First trimester) - (AG+GG vs AA) ttest logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs ) ********************************************* LEPR - Leptina (ng/dl) Second trimester - (AA vs AG vs GG) oneway logleptina_trial snprlep_rs if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1, tabulate LEPR - Leptina (ng/dl) Second trimester - (AG vs AA) ttest logleptina_trial if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs ~=2, by (gen_rs ) LEPR - Leptina (ng/dl) Second trimester - (GG vs AA) ttest logleptina_trial if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs ~=1, by (gen_rs ) LEPR - Leptina (ng/dl) Second trimester - (GG vs AG+AA) ttest logleptina_trial if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1, by (re_gen_rs ) LEPR - Leptina (ng/dl) Second trimester) - (AG+GG vs AA) ttest logleptina_trial if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1, by (gen_rs ) ********************************************* LEPR - Leptina (ng/dl) Third trimester - (AA vs AG vs GG) oneway logleptina_trial snprlep_rs if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, tabulate LEPR - Leptina (ng/dl) Third trimester - (AG vs AA) ttest logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs ~=2 & coorte_ou_ensaio3==1, by (gen_rs ) LEPR - Leptina (ng/dl) Third trimester - (GG vs AA) ttest logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs ~=1 & coorte_ou_ensaio3==1, by (gen_rs ) LEPR - Leptina (ng/dl) Third trimester - (GG vs AG+AA) ttest logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, by (re_gen_rs ) LEPR - Leptina (ng/dl) Third trimester) - (AG+GG vs AA) ttest logleptina_trial if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, by (gen_rs ) **************************************************************************************************** Table 4. Associations of the LEP-rs and LEPR-rs polymorphisms with pre-pregnancy BMI, GWG and leptin concentrations. **************************************************************************************************** LEP-rs (GA vs GG)- Pre-pregnancy BMI (kg/m2)- Overweight/obese (>=25)- RR (95% CI) poisson catimcrefer_new0 i.snplep_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 anos_escolaridade kcaltotal1tr /// if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs ~=2, irr vce(robust) LEP-rs (AA vs GG)-Pre-pregnancy BMI (kg/m2)- Overweight/obese (>=25)- RR (95% CI) poisson catimcrefer_new0 i.snplep_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 anos_escolaridade kcaltotal1tr /// if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs ~=1, irr vce(robust) LEP-rs (AA vs GA+GG)-Pre-pregnancy BMI (kg/m2)- Overweight/obese (>=25)- RR (95% CI) poisson catimcrefer_new0 i.re_gen_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 anos_escolaridade kcaltotal1tr /// if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, irr vce(robust) LEP-rs (GA+AA vs GG)-Pre-pregnancy BMI (kg/m2)- Overweight/obese (>=25)- RR (95% CI) poisson catimcrefer_new0 i.gen_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 anos_escolaridade kcaltotal1tr /// 161

162 APÊNDICE B Do-files Tabelas Artigo 2 if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, irr vce(robust) ********************** LEP-rs (GA vs GG)-Total GWG by IOM category - Insufficient - RR (95% CI) poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.snplep_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg /// if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 & snplep_rs ~=2, irr vce(robust) LEP-rs (AA vs GG)-Total GWG by IOM category - Insufficient - RR (95% CI) poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.snplep_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg /// if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 & snplep_rs ~=1, irr vce(robust) LEP-rs (AA vs GA+GG)-Total GWG by IOM category - Insufficient - RR (95% CI poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.re_gen_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg /// if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, irr vce(robust) LEP-rs (GA+AA vs GG)-Total GWG by IOM category - Insufficient - RR (95% CI poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.gen_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg /// logleptina_trial if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, irr vce(robust) ********************** LEP-rs (GA vs GG)-Total GWG by IOM category - Excessive - RR (95% CI) poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.snplep_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg /// if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 & snplep_rs ~=2, irr vce(robust) LEP-rs (AA vs GG)-Total GWG by IOM category - Excessive - RR (95% CI) poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.snplep_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg /// if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 & snplep_rs ~=1, irr vce(robust) LEP-rs (AA vs GA+GG)-Total GWG by IOM category - Excessive - RR (95% CI poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.re_gen_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg /// if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, irr vce(robust) LEP-rs (GA+AA vs GG)-Total GWG by IOM category - Excessive - RR (95% CI poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.gen_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg /// if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, irr vce(robust) ********************** LEP-rs (GA vs GG)-(log) Leptin by First trimester regress logleptina_trial i.snplep_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==1 & snplep_rs ~=2 & comp_dados_geneticos_2==1 LEP-rs (AA vs GG)-(log) Leptin by First trimester regress logleptina_trial i.snplep_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==1 & snplep_rs ~=1 & comp_dados_geneticos_2==1 LEP-rs (AA vs GA+GG)-(log) Leptin by First trimester regress logleptina_trial i.re_gen_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 LEP-rs (GA+AA vs GG)-(log) Leptin by First trimester regress logleptina_trial i.gen_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 ********************** LEP-rs (GA vs GG)-(log) Leptin by Second trimester regress logleptina_trial i.snplep_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==2 & snplep_rs ~=2 & comp_dados_geneticos_2==1 LEP-rs (AA vs GG)-(log) Leptin by Second trimester regress logleptina_trial i.snplep_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==2 & snplep_rs ~=1 & comp_dados_geneticos_2==1 LEP-rs (AA vs GA+GG)-(log) Leptin by Second trimester regress logleptina_trial i.re_gen_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1 LEP-rs (GA+AA vs GG)-(log) Leptin by Second trimester regress logleptina_trial i.gen_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1 ********************** LEP-rs (GA vs GG)-(log) Leptin by Third trimester regress logleptina_trial i.snplep_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==3 & snplep_rs ~=2 & comp_dados_geneticos_2==1 LEP-rs (AA vs GG)-(log) Leptin by Third trimester regress logleptina_trial i.snplep_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==3 & snplep_rs ~=1 & comp_dados_geneticos_2==1 LEP-rs (AA vs GA+GG)-(log) Leptin by Third trimester regress logleptina_trial i.re_gen_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 LEP-rs (GA+AA vs GG)-(log) Leptin by Third trimester regress logleptina_trial i.gen_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 ********************** ********************** 162

163 APÊNDICE B Do-files Tabelas Artigo 2 LEPR-rs (AG vs AA)- Pre-pregnancy BMI (kg/m2)- Overweight/obese (>=25)- RR (95% CI) poisson catimcrefer_new0 i.snprlep_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 anos_escolaridade kcaltotal1tr if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs ~=2, irr vce(robust) LEPR-rs (GG vs AA)-Pre-pregnancy BMI (kg/m2)- Overweight/obese (>=25)- RR (95% CI) poisson catimcrefer_new0 i.snprlep_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 anos_escolaridade kcaltotal1tr if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs ~=1, irr vce(robust) LEPR-rs (GG vs AG+AA)-Pre-pregnancy BMI (kg/m2)- Overweight/obese (>=25)- RR (95% CI) poisson catimcrefer_new0 i.re_gen_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 anos_escolaridade kcaltotal1tr if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, irr vce(robust) LEPR-rs (AG+GG vs AA)-Pre-pregnancy BMI (kg/m2)- Overweight/obese (>=25)- RR (95% CI) poisson catimcrefer_new0 i.gen_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 anos_escolaridade kcaltotal1tr if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1, irr vce(robust) ********************** LEPR-rs (AG vs AA)-Total GWG by IOM category - Insufficient - RR (95% CI) poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.snprlep_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 & snprlep_rs ~=2, irr vce(robust) LEPR-rs (GG vs AA)-Total GWG by IOM category - Insufficient - RR (95% CI) poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.snprlep_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 & snprlep_rs ~=1, irr vce(robust) LEPR-rs (GG vs AG+AA)-Total GWG by IOM category - Insufficient - RR (95% CI) poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.re_gen_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, irr vce(robust) LEPR-rs (AG+GG vs AA)-Total GWG by IOM category - Insufficient - RR (95% CI) poisson cat_gan_peso_ref_iom2 i.gen_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, irr vce(robust) ********************** LEPR-rs (AG vs AA)-Total GWG by IOM category - Excessive - RR (95% CI) poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.snprlep_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 & snprlep_rs ~=2, irr vce(robust) LEPR-rs (GG vs AA)-Total GWG by IOM category - Excessive - RR (95% CI) poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.snprlep_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 & snprlep_rs ~=1, irr vce(robust) LEPR-rs (GG vs AG+AA)-Total GWG by IOM category - Excessive - RR (95% CI) poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.re_gen_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, irr vce(robust) LEPR-rs (AG+GG vs AA)-Total GWG by IOM category - Excessive - RR (95% CI) poisson cat_gan_peso_ref_iom1 i.gen_rs i.faz_ativ_lazer_antes idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 i.new_fumo_cat2 logleptina_trial imcreferido sg4seg if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1, irr vce(robust) ********************** LEPR-rs (AG vs AA)-(log) Leptin by First trimester regress logleptina_trial i.snprlep_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==1 & snprlep_rs ~=2 & comp_dados_geneticos_2==1 LEPR-rs (GG vs AA)-(log) Leptin by First trimester regress logleptina_trial i.snprlep_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==1 & snprlep_rs ~=1 & comp_dados_geneticos_2==1 LEPR-rs (GG vs AG+AA)-(log) Leptin by First trimester regress logleptina_trial i.re_gen_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 LEPR-rs (AG+GG vs AA)-(log) Leptin by First trimester regress logleptina_trial i.gen_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==1 & comp_dados_geneticos_2==1 ********************** LEPR-rs (AG vs AA)-(log) Leptin by Second trimester regress logleptina_trial i.snprlep_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==2 & snprlep_rs ~=2 & comp_dados_geneticos_2==1 LEPR-rs (GG vs AA)-(log) Leptin by Second trimester regress logleptina_trial i.snprlep_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==2 & snprlep_rs ~=1 & comp_dados_geneticos_2==1 LEPR-rs (GG vs AG+AA)-(log) Leptin by Second trimester regress logleptina_trial i.re_gen_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1 LEPR-rs (AG+GG vs AA)-(log) Leptin by Second trimester regress logleptina_trial i.gen_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==2 & comp_dados_geneticos_2==1 ********************** LEPR-rs (AG vs AA)-(log) Leptin by Third trimester regress logleptina_trial i.snprlep_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==3 & snprlep_rs ~=2 & comp_dados_geneticos_2==1 LEPR-rs (GG vs AA)-(log) Leptin by Third trimester regress logleptina_trial i.snprlep_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==3 & snprlep_rs ~=1 & comp_dados_geneticos_2==1 LEPR-rs (GG vs AG+AA)-(log) Leptin by Third trimester 163

164 APÊNDICE B Do-files Tabelas Artigo 2 regress logleptina_trial i.re_gen_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 LEPR-rs (AG+GG vs AA)-(log) Leptin by Third trimester regress logleptina_trial i.gen_rs sg_padrao idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre==3 & comp_dados_geneticos_2==1 **************************************************************************************************** Table 5. Longitudinal analysis between LEP-rs and LEPR-rs gene polymorphisms and maternal body weight and leptin concentration throughout pregnancy **************************************************************************************************** LEP-rs (log) Leptin ß(95% CI) Co-dominant-(GA vs. GG) xi: xtmixed logleptina_trial i.snplep_rs sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre>=1 & trimestre<=3 & snplep_rs ~=2 & comp_dados_geneticos_2==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance Co-dominant-(AA vs. GG) xi: xtmixed logleptina_trial i.snplep_rs sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atualif trimestre>=1 & trimestre<=3 & snplep_rs ~=1 & comp_dados_geneticos_2==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance Recessive-(AA vs. GA+GG) xi: xtmixed logleptina_trial i.re_gen_rs sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre>=1 & trimestre<=3 & comp_dados_geneticos_2==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance Dominant-(GA+AA vs. GG) ********************** LEP-rs Maternal weight (kg)ß (95% CI) Co-dominant-(GA vs. GG) xi: xtmixed peso_atual i.snplep_rs sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 i.paridade3 anos_escolaridade estaturamedia if trimestre<=4 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs ~=2 & coorte_ou_ensaio3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance Co-dominant-(AA vs. GG) xi: xtmixed peso_atual i.snplep_rs sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 i.paridade3 anos_escolaridade estaturamedia if trimestre<=4 & comp_dados_geneticos_2==1 & snplep_rs ~=1 & coorte_ou_ensaio3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance Recessive-(AA vs. GA+GG) xi: xtmixed peso_atual i.re_gen_rs sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 i.paridade3 anos_escolaridade estaturamedia if trimestre<=4 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance Dominant-(GA+AA vs. GG) xi: xtmixed peso_atual i.gen_rs sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 i.paridade3 anos_escolaridade estaturamedia if trimestre<=4 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************** ********************** LEPR-rs (log) Leptin ß(95% CI) Co-dominant-(AG vs. AA) xi: xtmixed logleptina_trial i.snprlep_rs sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre>=1 & trimestre<=3 & snprlep_rs ~=2 & comp_dados_geneticos_2==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance Co-dominant-(GG vs. AA) xi: xtmixed logleptina_trial i.snprlep_rs sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre>=1 & trimestre<=3 & snprlep_rs ~=1 & comp_dados_geneticos_2==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance Recessive-(GG vs. AG+AA) xi: xtmixed logleptina_trial i.re_gen_rs sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre>=1 & trimestre<=3 & comp_dados_geneticos_2==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance Dominant-(AG+GG vs. AA) xi: xtmixed logleptina_trial i.gen_rs sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 peso_atual if trimestre>=1 & trimestre<=3 & comp_dados_geneticos_2==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************** LEPR-rs Maternal weight (kg)ß (95% CI) Co-dominant-(AG vs. AA) xi: xtmixed peso_atual i.snprlep_rs sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 i.paridade3 anos_escolaridade estaturamedia if trimestre<=4 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs ~=2 & coorte_ou_ensaio3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance Co-dominant-(GG vs. AA) xi: xtmixed peso_atual i.snprlep_rs sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 i.paridade3 anos_escolaridade estaturamedia if trimestre<=4 & comp_dados_geneticos_2==1 & snprlep_rs ~=1 & coorte_ou_ensaio3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance Recessive-(GG vs. AG+AA) xi: xtmixed peso_atual i.re_gen_rs sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 i.paridade3 anos_escolaridade estaturamedia if trimestre<=4 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance Dominant-(AG+GG vs. AA) 164

165 APÊNDICE B Do-files Tabelas Artigo 2 xi: xtmixed peso_atual i.gen_rs sg_padrao sg_padrao2 idade i.faz_ativ_lazer_antes i.new_cor_referida_cat i.new_fumo_cat2 i.paridade3 anos_escolaridade estaturamedia if trimestre<=4 & comp_dados_geneticos_2==1 & coorte_ou_ensaio3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance 165

166 APÊNDICE C Do-files Tabelas Artigo 3 APÊNDICE C Do-files Tabelas Artigo 3 **************************************************************************************************** Table 1 Maternal descriptive characteristics and dietary intake of the study sample **************************************************************************************************** Sociodemographic and lifestyle tabstat idade if trimestre==1 & artigo_3==1, stat (med p25 p75 n) tabstat anos_escolaridade if trimestre==1 & artigo_3==1, stat (med p25 p75 n) tabstat renda_percapta if trimestre==1 & artigo_3==1, stat (med p25 p75 n) tab paridade3 if trimestre==1 & artigo_3==1 tab consome_alcool if trimestre==1 & artigo_3==1 tab new_fumo_cat1 if trimestre==1 & artigo_3==1 tab faz_ativ_lazer_antes if trimestre==1 & artigo_3==1 tab new_cor_referida_cat_3 if trimestre==1 & artigo_3==1 tab catimcrefer if trimestre==1 & artigo_3==1 Daily dietary intake during pre-pregnancy ci logkcaltotalnutr if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ci perkcalcarbtotal if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ci logperkcalprottotal if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ci perkcalliptotal if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ci perprocessadkcalnutrt if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 Daily dietary intake during pregnancy ci logkcaltotalnutr if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ci perkcalcarbtotal if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ci logperkcalprottotal if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ci perkcalliptotal if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ci perprocessadkcalnutrt if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 **************************************************************************************************** Table 2 - Distribution of daily dietary intake during pre-pregnancy and pregnancy and variation according to genotypes of the FTO (rs ), MC4R (rs ), LEP (rs ) and LEPR (rs ) genes polymorphisms, considering the dominant genetic model for all genes **************************************************************************************************** During Pre-pregnancy ********** FTO ttest logkcaltotalnutr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliftodom) ttest perkcalcarbtotal_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliftodom) ttest logperkcalprottotal if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliftodom) ttest perkcalliptotal_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliftodom) ttest perprocessadkcalnutrt_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliftodom) ********** MC4R2 ttest logkcaltotalnutr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(polimc4r2) ttest perkcalcarbtotal_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(polimc4r2) ttest logperkcalprottotal if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(polimc4r2) ttest perkcalliptotal_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(polimc4r2) ttest perprocessadkcalnutrt_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(polimc4r2) ********** LEP ttest logkcaltotalnutr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) ttest perkcalcarbtotal_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) ttest logperkcalprottotal if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) ttest perkcalliptotal_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) ttest perprocessadkcalnutrt_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) ********** LEPR ttest logkcaltotalnutr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) ttest perkcalcarbtotal_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) ttest logperkcalprottotal if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) ttest perkcalliptotal_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) ttest perprocessadkcalnutrt_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) 166

167 APÊNDICE C Do-files Tabelas Artigo 3 During pregnancy ********** FTO ttest logkcaltotalnutr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliftodom) ttest perkcalcarbtotal_3tr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliftodom) ttest logperkcalprottotal if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliftodom) ttest perkcalliptotal_3tr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliftodom) ttest perprocessadkcalnutrt_3tr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(poliftodom) ********** MC4R ttest logkcaltotalnutr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(polimc4r2) ttest perkcalcarbtotal_3tr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(polimc4r2) ttest logperkcalprottotal if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(polimc4r2) ttest perkcalliptotal_3tr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(polimc4r2) ttest perprocessadkcalnutrt_3tr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(polimc4r2) ********** LEP ttest logkcaltotalnutr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) ttest perkcalcarbtotal_3tr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) ttest logperkcalprottotal if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) ttest perkcalliptotal_3tr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) ttest perprocessadkcalnutrt_3tr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) ********** LEPR ttest logkcaltotalnutr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) ttest perkcalcarbtotal_3tr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) ttest logperkcalprottotal if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) ttest perkcalliptotal_3tr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) ttest perprocessadkcalnutrt_3tr if trimestre==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by(gen_rs ) Delta ********** FTO ttest difkcaltotalnutr_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (poliftodom) ttest difperkcalcarbtotal_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (poliftodom) ttest difperkcalprottotal_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (poliftodom) ttest difperkcalliptotal_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (poliftodom) ttest difperprocessadkcalnutrt_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (poliftodom) ********** MC4R2 ttest difkcaltotalnutr_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (polimc4r2) ttest difperkcalcarbtotal_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (polimc4r2) ttest difperkcalprottotal_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (polimc4r2) ttest difperkcalliptotal_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (polimc4r2) ttest difperprocessadkcalnutrt_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (polimc4r2) ********** LEP ttest difkcaltotalnutr_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs ) ttest difperkcalcarbtotal_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs ) ttest difperkcalprottotal_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs ) ttest difperkcalliptotal_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs ) ttest difperprocessadkcalnutrt_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs ) ********** LEPR ttest difkcaltotalnutr_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs ) ttest difperkcalcarbtotal_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs ) ttest difperkcalprottotal_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs ) ttest difperkcalliptotal_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs ) ttest difperprocessadkcalnutrt_3_1tr if trimestre==1 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 & amostra_genetica_3==3, by (gen_rs ) **************************************************************************************************** Table 3 - Linear regression models between FTO (rs ), MC4R (rs ), LEP (rs ) and LEPR (rs ) gene polymorphisms and daily dietary intake during pre-pregnancy and pregnancy, considering the dominant* genetic model for all genes. **************************************************************************************************** During Pre-pregnancy ********** FTO regress logkcaltotalnutr i.poliftodom if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress logkcaltotalnutr i.poliftodom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 167

168 APÊNDICE C Do-files Tabelas Artigo 3 ************************* regress perkcalcarbtotal i.poliftodom if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalcarbtotal i.poliftodom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress logperkcalprottotal i.poliftodom if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress logperkcalprottotal i.poliftodom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perkcalliptotal i.poliftodom if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalliptotal i.poliftodom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perprocessadkcalnutrt i.poliftodom if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress perprocessadkcalnutrt i.poliftodom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ********** MC4R regress logkcaltotalnutr i.polimc4r2 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress logkcaltotalnutr i.polimc4r2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perkcalcarbtotal i.polimc4r2 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalcarbtotal i.polimc4r2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress logperkcalprottotal i.polimc4r2 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress logperkcalprottotal i.polimc4r2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perkcalliptotal i.polimc4r2 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalliptotal i.polimc4r2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perprocessadkcalnutrt i.polimc4r2 if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress perprocessadkcalnutrt i.polimc4r2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ********** LEP regress logkcaltotalnutr i.gen_rs if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress logkcaltotalnutr i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perkcalcarbtotal i.gen_rs if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalcarbtotal i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress logperkcalprottotal i.gen_rs if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress logperkcalprottotal i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perkcalliptotal i.gen_rs if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalliptotal i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perprocessadkcalnutrt i.gen_rs if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress perprocessadkcalnutrt i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ********** LEPR regress logkcaltotalnutr i.gen_rs if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress logkcaltotalnutr i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perkcalcarbtotal i.gen_rs if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalcarbtotal i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress logperkcalprottotal i.gen_rs if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress logperkcalprottotal i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ************************* 168

169 APÊNDICE C Do-files Tabelas Artigo 3 regress perkcalliptotal i.gen_rs if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalliptotal i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perprocessadkcalnutrt i.gen_rs if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 regress perprocessadkcalnutrt i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==1 & amostra_genetica_3==3 During Pre-pregnancy ********** FTO regress logkcaltotalnutr i.poliftodom if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress logkcaltotalnutr i.poliftodom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perkcalcarbtotal i.poliftodom if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalcarbtotal i.poliftodom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress logperkcalprottotal i.poliftodom if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress logperkcalprottotal i.poliftodom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perkcalliptotal i.poliftodom if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalliptotal i.poliftodom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perprocessadkcalnutrt i.poliftodom if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress perprocessadkcalnutrt i.poliftodom idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ********** MC4R regress logkcaltotalnutr i.polimc4r2 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress logkcaltotalnutr i.polimc4r2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perkcalcarbtotal i.polimc4r2 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalcarbtotal i.polimc4r2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress logperkcalprottotal i.polimc4r2 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress logperkcalprottotal i.polimc4r2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perkcalliptotal i.polimc4r2 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalliptotal i.polimc4r2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perprocessadkcalnutrt i.polimc4r2 if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress perprocessadkcalnutrt i.polimc4r2 idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ********** LEP regress logkcaltotalnutr i.gen_rs if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress logkcaltotalnutr i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perkcalcarbtotal i.gen_rs if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalcarbtotal i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress logperkcalprottotal i.gen_rs if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress logperkcalprottotal i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perkcalliptotal i.gen_rs if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalliptotal i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perprocessadkcalnutrt i.gen_rs if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress perprocessadkcalnutrt i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 169

170 APÊNDICE C Do-files Tabelas Artigo 3 ********** LEPR regress logkcaltotalnutr i.gen_rs if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress logkcaltotalnutr i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perkcalcarbtotal i.gen_rs if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalcarbtotal i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress logperkcalprottotal i.gen_rs if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress logperkcalprottotal i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perkcalliptotal i.gen_rs if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress perkcalliptotal i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 ************************* regress perprocessadkcalnutrt i.gen_rs if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 regress perprocessadkcalnutrt i.gen_rs idade i.new_cor_referida_cat_3 i.paridade3 sg1seg renda_percapta imcreferido if trimestre==3 & amostra_genetica_3==3 **************************************************************************************************** Table 4 - Longitudinal analysis between FTO, MC4R, LEP and LEPR gene polymorphisms and daily dietary intake, according to genotypes. **************************************************************************************************** FTO ********************************************** AT vs. TT ********************************************** xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.polifto sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.polifto sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.polifto sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.polifto sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed logperkcalprottotal i.polifto sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed logperkcalprottotal i.polifto sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perkcalliptotal i.polifto sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalliptotal i.polifto sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.polifto sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.polifto sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** AT+AA vs. TT ********************************************** xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.poliftodom sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.poliftodom sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.poliftodom sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.poliftodom sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed logperkcalprottotal i.poliftodom sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed logperkcalprottotal i.poliftodom sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// 170

171 APÊNDICE C Do-files Tabelas Artigo 3 if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perkcalliptotal i.poliftodom sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalliptotal i.poliftodom sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.poliftodom sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.poliftodom sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance MC4R ********************************************** CT vs. TT ********************************************** xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.polimc4r sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.polimc4r sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.polimc4r sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.polimc4r sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed logperkcalprottotal i.polimc4r sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed logperkcalprottotal i.polimc4r sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perkcalliptotal i.polimc4r sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalliptotal i.polimc4r sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.polimc4r sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.polimc4r sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** CT+CC vs. TT ********************************************** xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.polimc4r2 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.polimc4r2 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.polimc4r2 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.polimc4r2 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed logperkcalprottotal i.polimc4r2 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed logperkcalprottotal i.polimc4r2 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perkcalliptotal i.polimc4r2 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalliptotal i.polimc4r2 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.polimc4r2 sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.polimc4r2 sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance LEP ********************************************** GA vs. GG ********************************************** xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.snplep_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.snplep_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// 171

172 APÊNDICE C Do-files Tabelas Artigo 3 if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.snplep_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.snplep_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed logperkcalprottotal i.snplep_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed logperkcalprottotal i.snplep_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perkcalliptotal i.snplep_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalliptotal i.snplep_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.snplep_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.snplep_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ******************************************** GA+AA vs. GG ******************************************** xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.gen_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.gen_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.gen_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.gen_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed logperkcalprottotal i.gen_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed logperkcalprottotal i.gen_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perkcalliptotal i.gen_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalliptotal i.gen_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.gen_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.gen_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance LEPR ********************************************** AG vs. AA ********************************************** xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.snprlep_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.snprlep_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.snprlep_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.snprlep_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed logperkcalprottotal i.snprlep_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed logperkcalprottotal i.snprlep_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perkcalliptotal i.snprlep_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalliptotal i.snprlep_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.snprlep_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance 172

173 APÊNDICE C Do-files Tabelas Artigo 3 xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.snprlep_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** AG+GG vs. AA ********************************************** xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.gen_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed logkcaltotalnutr i.gen_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.gen_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalcarbtotal i.gen_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed logperkcalprottotal i.gen_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed logperkcalprottotal i.gen_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perkcalliptotal i.gen_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perkcalliptotal i.gen_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance ********************************************** xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.gen_rs sg_padrao if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance xi: xtmixed perprocessadkcalnutrt i.gen_rs sg_padrao idade i.new_cor_referida_cat i.paridade3 renda_percapta imcreferido /// if amostra_genetica_3==3 & regdiet1_3tri==1 & artigo_3==1 id: sg_padrao, covariance(uns) variance 173

174 ANEXOS 12. ANEXOS 174

175 ANEXO 1 Aprovação do Comitê de Ética 175

176 ANEXO 2 TCLE TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA PARTICIPAR DA PESQUISA Estado nutricional e saúde mental na gestação e no pós-parto: Estudo prospectivo com ensaio clínico randomizado Você está sendo convidada a fazer parte de uma pesquisa que tem por objetivo entender melhor a relação entre a alimentação e a ocorrência de problemas como a ansiedade e o estresse durante a gestação e após o parto. Neste estudo, também avaliaremos se o ômega-3 (um composto natural presente em vários alimentos, como peixes e alguns vegetais) protege as gestantes de tais problemas. Você não é obrigada a participar e, mesmo aceitando fazer parte do estudo, poderá desistir e retirar o seu consentimento a qualquer momento. Sua recusa em participar do estudo não trará nenhum prejuízo em sua relação com o pesquisador, com o seu médico ou com a maternidade; ou seja, você poderá seguir normalmente com o seu atendimento nesta unidade de saúde. Como irei participar? Você fará uma avaliação completa e detalhada sobre sua saúde. No total, você terá 4 consultas com nossa equipe: 4 durante o pré-natal (com até 13 semanas, na 24ª e 34ª semanas) e uma de 30 a 45 dias após o nascimento de seu filho. Todas estas consultas serão preferencialmente marcadas em dias em que você já tenha que vir ao hospital. O tempo aproximado destas consultas é de minutos. Durante as consultas, você irá responder a perguntas e preencher questionários para obtermos informações como: sua identificação (endereço e telefone), dados demográficos (nome, estado civil, idade), situação social e econômica, história obstétrica, uso de álcool, fumo e outras drogas, violência familiar, estresse e ansiedade, atividade física e como você se alimenta. Em todas as 4 consultas iremos também avaliar seu peso e altura e coletar amostras de sangue para avaliarmos o açúcar, gorduras, colesterol e níveis de hormônios. Além disso, em cada consulta, deixaremos com você dois aparelhos por um período de 24 horas (1 dia): um chamado de frequencímetro polar que mede a freqüência cardíaca (batimentos do coração) e o outro pedômetro que conta o número de passos que você dará durante este dia. No dia seguinte, um pesquisador do projeto irá até a sua casa recolher esses equipamentos, não sendo necessário, portanto, que você retorne ao hospital apenas para devolvê-los. A partir da 18ª semana de gestação, um grupo de mulheres que estiverem participando do estudo serão convidadas a integrar uma parte diferente do estudo e serão orientadas a fazer uso de um suplemento na forma de cápsulas, contendo ômega-3. Se você fizer parte deste grupo, você deverá fazer uso de 5-6 cápsulas por dia junto das refeições (almoço), todos os dias até 30 dias após o parto. Você não precisará comprar ou pagar por este suplemento, ou seja, você vai recebê-lo de graça. É importante você saber que esta suplementação é composta unicamente de óleo de peixes marinhos, porém sem qualquer sabor ou cheiro característico de peixe. Além do óleo, o outro ingrediente presente é uma pequena quantidade de vitamina E. O uso desta suplementação durante a gestação não traz nenhum risco ou efeito colateral para a sua saúde e a do bebê. No entanto, já foram relatados a ocorrência passageira de diarréia, regurgitação e refluxo. Consumir o óleo na forma de cápsula torna apenas mais prático. 176

177 ANEXO 2 TCLE Todas as informações que você fornecer serão mantidas em segredo e utilizadas apenas para a pesquisa. Nenhuma outra pessoa ou profissional terá acesso a suas informações, somente os pesquisadores que trabalham para esta pesquisa. Quando divulgarmos os resultados deste trabalho, seu nome em momento algum irá aparecer, bem como qualquer outra informação fornecida, ou resultado de exame de sangue. Portanto, não há riscos em participar desta pesquisa, apenas a necessidade de coletar sangue e o tempo que você irá gastar com as avaliações durante as consultas. Por ocasião da coleta de sangue, você poderá observar a formação pequeno hematoma na região do braço onde ocorreu a picada da agulha. Sempre usaremos materiais descartáveis. Quais as vantagens? Ao participar deste estudo, você terá a oportunidade de realizar uma avaliação mais completa e detalhada da sua saúde. O acompanhamento de seus hábitos durante a gestação, como o seu ganho de peso e sua alimentação, são medidas importantes para garantir a saúde do seu bebê ao nascer. Este acompanhamento também é importante para que você tenha uma vida mais saudável, prevenindo problemas futuros como a obesidade, ansiedade e depressão. Você terá acesso a todos os seus resultados se assim desejar. Este termo de consentimento é um documento importante e você irá receber uma cópia na qual consta o telefone e o endereço do pesquisador principal, podendo tirar suas dúvidas sobre o projeto e sua participação, agora ou a qualquer momento. Meu consentimento: Minha participação é de livre e espontânea vontade, ou seja, não fui pressionada por ninguém para participar desta pesquisa. Tenho liberdade para continuar ou recusar, em qualquer momento, a participar da pesquisa. O meu atendimento e de meu (minha) filho(a), nesta unidade não será, em momento algum, afetado pela minha recusa. Desta forma, concordo em participar deste estudo estando totalmente esclarecida dos objetivos, riscos e benefícios desta pesquisa, uma vez que tive em mãos este documento e a oportunidade de lê-lo antes de assinar. data Nome e assinatura do pesquisador Nome do sujeito da pesquisa Telefones: data Assinatura do sujeito da pesquisa Contato do coordenador da pesquisa: Professor Dr. Gilberto Kac Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ Telefones: / kacetal@gmail.com Juliana dos Santos Vaz Nutricionista, doutoranda UFRJ Telefones: juliana.vaz@gmail.com Secretaria Municipal de Saúde e Defesa Civil / Comitê de Ética em Pesquisa Rua Afonso Cavalcanti, 455 Bloco 1 - Sala cepsms@rio.rj.gov.br 177

178 ANEXO 3 Protocolo de extração do DNA PROTOCOLO EXTRAÇÃO DE DNA COM FENOL-CLOROFÓRMIO 1. Descongelar o sangue a temperatura ambiente. 2. Homogeneizar suavemente. LISE DE MEMBRANAS CELULAR E NUCLEAR (SDS =solubiliza as membranas e proteinase K =degrada proteínas) 3. Transferir 2 ml do sangue para um tubo Falcon 15 ml e adicionar igual volume de tampão K 2X (para ficar com uma concentração final de 1X). 4. Adicionar 100 µl de proteinase K (20 mg/dl) e homogeneizar suavemente. 5. Incubar a 37 C overnight. 6. Observar a aparência do tubo (fácil movimento do conteúdo do tubo). EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS E OUTROS (fenol = atrai os fragmentos de proteínas e lipídios). 7. Adicionar 4 ml de fenol-clorofórmio e agitar suavemente por 1 min. 8. Centrifugar a rpm por 20 min na centrifuga clínica. Separação de fases superior (aquosa) e inferior (fenol). 9. Retirar a fase aquosa para outro tubo falcon 15 ml. Passar para o ítem 13. Se não aparecer uma fase aquosa, transferir todo o volume (8 ml) para um tubo falcon 50 ml e adicionar igual volume (8 ml) de tampão K. Homogeneizar suavemente, transferir para tubo corex e centrifugar novamente à rpm por 5 min. 10. Transferir a fase aquosa para um tubo falcon 50 ml. 11. Adicionar ao tubo corex, 4 ml de tampão K, homogeneizar suavemente e centrifugar a rpm por 5 min, para lavar a interface. 12. Retirar novamente a fase aquosa e juntar à outra fase aquosa retirada (volume total ± 20 ml). 13. Colocar igual volume de clorofórmio e agitar suavemente. 14. Centrifugar a rpm por 5 min na centrifuga clínica. 15. Retirar a fase aquosa para outro tubo corex (falcon 50 ml (± 10 ml)). PRECIPITAÇÃO DO DNA 16. Adicionar 200 ul NaCl 4 M para uma concentração final de 0,2 M e homogeneizar suavemente. 178

179 ANEXO 3 Protocolo de extração do DNA 17. Adicionar 2 volumes de etanol absoluto e homogeneizar suavemente. Verificar a presença de fibras (se presente seguir para item 20. Caso não verifique fibra, continuar com itens 18 e 19). 18. Colocar a -20 C por 1 hora, no mínimo. 19. Centrifugar em tubos corex a rpm por 15 mim e a 4 C (marcar a posição dos tubos na centrifuga, para posterior visualização do pellet). Verificar se o sobrenadante ficou com uma coloração escura e se o pellet está claro. LAVAGEM DO DNA 20. Desprezar o sobrenadante. Lavar o pellet com etanol 70% e desprezar o sobrenadante, secar o pellet por inversão em papel toalha e colocar a 55 C por 10 min. O pellet deve estar aderido à parede do tubo, mas bem espalhado e não concentrado num ponto. RESSUSPENSÃO DO DNA 21. Ressuspender no máximo com 500 µl de TE-4 do seguinte modo: adicionar 100 µl de TE- 4 em cada tubo corex, lavando bem a parede onde estiver espalhado o pellet. Transferir as soluções para um tubo 1,5 ml, mas não descartar os tubos corex. Adicionar 100 µl a um tubo corex e repetir o procedimento anterior, lavando a parede. Transferir o volume para o outro tubo corex e repetir o procedimento de lavagem. Retirar o volume do lavado e transferir para o tubo de 1,5 ml, perfazendo o volume total de 500 µl. 22. Ler a DO (após pellet/fibra estar totalmente dissolvido) para quantificar o DNA. 23. Guardar a -20 C. 179

180 ANEXO 4 Artigo 1 publicado na Periódico Nutrition 180