MÉTODOS DE MULTI-DOCKING GENERALIZADO

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1 MÉTODOS DE MULTI-DOCKING GENERALIZADO Aluno: Gabriel Coutinho de Paula Orientador: Bruno Araujo Cautiero Horta Introdução Metodologias computacionais de docking receptor-ligante são ferramentas de grande importância no planejamento inteligente de novas drogas. Docking pode ser definido como um problema chave-fechadura, que possui a finalidade de prever os modos de interação entre duas moléculas conhecendo apenas suas estruturas tridimensionais isoladas (e.g. uma estrutura tridimensional de uma proteína do Protein Data Bank e um potencial fármaco). A metodologia possui dois objetivos principais: predição de conformação, e afinidade de ligação. Um método docking deve ser capaz de prever corretamente a conformação do ligante (a geometria experimental das moléculas), e as interações físico-químicas associadas. Utilizando essas informações, o método deve ser capaz de distinguir moléculas ligantes das não ligantes, ranqueando-as de acordo com suas afinidades [Guedes et al, 2014]. A principal aplicação de métodos docking atualmente jaz na industria farmacêutica, para planejamento de fármacos em abordagens do tipo virtual screening. Nessa, pretende-se buscar em uma database os melhores ligantes (i.e. de maior afinidade) para um determinado alvo molecular (e.g. sítio ativo de uma proteína causadora de um efeito indesejado). Esses ligantes, denominados lead compounds, possuem potencial farmacêutico, uma vez que podem inibir a ação da proteína sobre análise [Souza et al, 2013]. Para aplicações em virtual screening, portanto, é necessário um método veloz, uma vez que varre-se uma database com centenas de milhares de potenciais ligantes. Portanto, o método precisa retornar com acurácia os modos e afinidade de ligação de maneira rápida. Deve-se ressaltar que métodos docking não estão restritos a atracamento proteína-inibidor [Dominguez et al, 2003]. Um método docking necessita de dois componentes principais: Um algoritmo de busca e uma função de avaliação de energia (i.e. scoring function). A habilidade de lidar com a flexibilidade intrínseca do sistema e descrever corretamente a energia de interação entre receptor-ligante é critica. Além disso, é necessário a estrutura tridimensional do receptor (e.g. uma proteína do Protein Data Bank), e da estrutura do ligante [Vakser, 1993]. Algoritmo de Busca No docking, um algoritmo de busca são empregados para explorar a superfície de energia livre, com a finalidade de encontrar as melhores conformações de ligantes. Há uma serie de desafios relacionados com tal ferramenta. Se a termodinâmica do sistema (i.e. efeitos entálpicos e entrópicos) for corretamente modelada pela função de energia, o mínimo global da superfície de energia corresponder-se-á com a conformação receptor-ligante experimental. Porém, tais efeitos são de elevada complexidade, e métodos docking utilizam aproximações grosseiras. Portanto, não pode-se garantir que o mínimo global encontrado pelo algoritmo de busca corresponderá com o experimental. Existem diferentes abordagens diferentes com respeito à flexibilidade do receptorligante:

2 A proteína é considerada rígida, e apenas os graus de liberdade rotacionais e translacionais do ligante são explorados; A proteína é considerada rígida, e todos os graus de liberdade do ligante são explorados (i.e. rotacional, translacional e conformacional); A proteína é considerada parcialmente ou totalmente flexível, e todos os graus de liberdade do ligante são explorados (i.e. rotacional, translacional e conformacional). A maioria dos algoritmos consideram a proteína rígida, explorando inteiramente os graus de liberdade do ligante. Amostragem de Ligantes Algoritmos de busca são classificados em três principais grupos, de acordo com a metodologia aplicada para explorar a flexibilidade de ligantes: sistemáticos, determinísticos e estocásticos [Brooijmans et al, 2003]. A abordagem sistemática é a única as três que garante convergência para o mínimo global. Ela explora todos os graus de liberdade do ligante de maneira exaustiva, pintando a superfície de energia. O principal problema relacionado com métodos sistemáticos é que o custo computacional cresce de modo explosivo com a adição de graus de liberdade no sistema. Para ligantes maiores (i.e. com muitos graus de liberdade), essa abordagem torna-se proibitiva. Para aplicações que dependem de métodos ligeiros, essa abordagem nem sempre é ótima. A abordagem determinística utiliza métodos de minimização de energia e dinâmica molecular. Essas munem-se de ferramentas como o gradiente (i.e. direção de maior crescimento de uma superfície) e a movimentação do sistema ao longo do tempo, respectivamente. Portanto, garantem sempre convergência para um mínimo de energia. Porem, não pode-se garantir que tal mínimo corresponde ao mínimo global da superfície de energia. Esses métodos são estritamente dependentes das condições iniciais do sistema, freqüentemente ficando presos em mínimos locais com barreiras de energia altas. A última abordagem trata-se de métodos heurísticos na exploração da superfície de energia livre. Métodos estocásticos variam todos os graus de liberdade do ligante (translacional, rotacional e conformacional) aleatoriamente a cada etapa, gerando uma grande diversidade de soluções. Essas são avaliadas de acordo a um critério probabilístico, para decidir se serão rejeitadas ou não. Exemplos dessa abordagem são Monte Carlo e Algoritmo Evolucionário [Jones et al, 1997]. A principal desvantagem dessa abordagem é que a convergência ao mínimo global não é garantida, necessitando de múltiplas execuções independentes do algoritmo para maximizar a probabilidade de encontrar um resultado ótimo. Algoritmos genéticos são métodos de otimização baseados na evolução biológica de uma dada população, por meio de seleção natural para obter soluções otimais para um dado problema. Utiliza distribuição aleatória para gerar uma população de solução inicial, evolui esta aplicando operadores genéticos em certos indivíduos e selecionando-os de acordo com uma função de aptidão. A grande vantagem desta classe de métodos é a facilidade dele de escapar de mínimos locais, e a possibilidade de encontrar múltiplas soluções de baixa energia. Essa abordagem não possui dependência da conformação inicial (uma vez que múltiplas conformações são geradas aleatoriamente), e não oferece um custo computacional explosivo para ligantes com muitos graus de liberdade. Portanto, para sistemas complexos com disponibilidade de tempo limitada, e para aplicações cujos resultados devem ser similares ao real, a escolha de métodos estocásticos é justa. A inclusão de flexibilidade no receptor (i.e. proteína) continua um desafio para docking. Proteínas em solução sofrem variações conformacionais ao atracarem a um ligante, devido ao ajuste induzido pelo encaixe. Diferenças sutis na geometria de uma proteína podem

3 afetar significativamente o perfil do sítio ativo desta, resultando em uma predição de configuração e afinidade de ligação pouco precisas [Totrov et al, 2008]. Função de Avaliação Ao longo da execução do docking, algoritmos de busca investigam um número excessivo de conformação de ligantes (usualmente milhões). As funções de scoring são usadas para avaliar a qualidade desses modos, direcionando a busca para conformações de ligante relevantes. Uma função de avaliação deve ser capaz de distinguir as diferentes configurações explorada pelo algoritmo de busca da experimentalmente observada (i.e. prever a geometria do ligante). Também deve classificar quais ligantes, em suas conformações especificas, são ativos e inativos. E, finalmente, prever as afinidades de ligação entre o receptor e o ligante, ranqueando diferentes moléculas de acordo com suas afinidades. Métodos de docking atuais exibem bons resultados na predição de conformação do ligante quando a flexibilidade do receptor (i.e. proteína) é irrelevante. Porém, a detecção de ligantes ativos dentre uma miríade de falsos ligantes, e a estimação com acurácia da afinidade de ligação são desafios sem solução definitiva, mesmo quando o receptor é inflexível [Yuriev et al, 2013]. Diversas abordagens com diferentes níveis de complexidade foram desenvolvidos para prever a energia livre de ligação. Porém, os mais precisos normalmente herdam altos custos computacionais, que os inviabilizam para aplicações em virtual screening. Uma das abordagens para aumentar a acurácia de tais predições é a utilização de funções de avaliação especificas, que possuem resultados melhores para certas classes de sistema. Funções de scoring podem ser divididas em três classes diferentes: campo de força, empírica e knowledge-based [Wang et al, 2003]. Funções de campo de forca são derivadas de campo de forca clássico, e consistem do somatório de diferentes termos de energia. Esse tipo de função considera a energia de interação do complexo receptor-ligante, e a energia interna do ligante (dos termos ligados e não ligados). O principal problema dessa classe é a forte repulsão atômica em pequenas distâncias, derivada da aproximação clássica intrínseca ao campo de força. Funções empíricas foram criadas para reproduzir a afinidade de ligação experimental com alta precisão. Essas são baseadas na correlação entre a energia livre de ligação e um somatório ponderado de variáveis independentes. Os coeficientes são obtidos através da análise de afinidades de ligação conhecidas. Funções knowledge-based são baseadas na análise estatística da interação entre pares de átomo do complexo receptor-ligante. Cada par de átomo é atribuído um pseudo-potencial, que é utilizado para descrever a geometria de preferência entre o par. Essa estratégia é limitada pela numero e diversidade de estruturas experimentais utilizadas. É importante ressaltar que não existe uma função de avaliação universal, que pode ser aplicada com acurácia em qualquer caso. A maneira correta de abordar o problema é aplicar a função que melhor descreve o sistema sobre investigação. Tal função é construída e parametrizada de forma a otimizar o resultado para uma dada família de complexos. Concluindo, embora a predição de configuração receptor-ligante para casos de receptores nativamente inflexíveis é satisfatória, a estimação da afinidade de ligação ainda é um desafio. Como dito anteriormente, a maioria dos métodos docking consideram a proteína como um receptor rígido. Devido a importância da flexibilidade da proteína para o atracamento receptor-ligante, infere-se que métodos que são capazes de considerá-la, com acurácia, flexível poderão estimar com mais precisão a conformação e a afinidade de ligação de um complexo. Essas considerações aumentam o custo computacional do docking.

4 Virtual Screening Entidades engajadas no descobrimento de novas possíveis drogas (e.g. firmas farmacêuticas) estão a procura de metodologias docking mais rápidas, mais eficientes e mais precisas. A abordagem de virtual screening tornou-se uma importante ferramenta na procura de lead compounds (potenciais fármacos). É utilizada para varrer uma extensa database de moléculas, determinando aquelas que são ligantes ativos para um determinado alvo molecular (e.g. sítio ativo de uma proteína). Embora virtual screening é uma técnica amplamente utilizada, o método escolhido deve ser validado para aumentar a confiança do resultado [Friesner et al, 2004]. É necessário avaliar se o algoritmo de busca e a função de avaliação são capazes de reproduzir resultados experimentais. A habilidade do método de diferenciar moléculas ligantes de não ligantes também deve ser verificado. Essa validação é de grande importância, pois reduz o numero de moléculas inativas a serem encaminhadas para a etapa experimental, que é mais cara e demanda mais tempo. Os compostos selecionados são então submetidos a etapa experimental, e.g. síntese (para compostos teóricos ou não disponíveis para compra), testes in vitro, e testes in vivo. Métodos de Otimização Métodos mais sofisticados podem ser necessários na solução de desafios existente em metodologias docking atuais. Porém, tais abordagens podem aumentar o custo computacional significativamente, inviabilizando o método para aplicações em virtual screening. Para diminuir o tempo de execução de métodos mais sofisticados, pode-se empregar diferentes tipos de otimização. Uma otimização comum em métodos docking é a utilização de um Grid tridimensional [Meng et al, 1992]. Esta abordagem troca precisão por menor custo computacional, diminuindo substancialmente o tempo de execução da função de avaliação nas múltiplas iterações do algoritmo. Antes de iniciar o processo do docking, gera-se uma rede (Grid) tridimensional centrada no alvo molecular em investigação, que discretiza o espaço. Calculase, previamente, o potencial de energia do receptor para cada ponto do Grid, atribuindo-os correspondentemente. Após esse cálculo, não mais é necessário calcular a energia de interação entre os termos não ligados do complexo receptor-ligante, uma vez que já se possui o valor da energia de interação para cada ponto do espaço discreto. A aproximação dessa abordagem jaz na consideração do espaço como discreto, aproximando a coordenada geométrica para o ponto mais próximo do Grid. Durante a execução de um método docking, múltiplas iterações são feitas sobre a energia de interação (scoring), poupando múltiplos ciclos de processamento. Uma outra abordagem é o uso de computação de alto desempenho, que otimiza o tempo de execução de um algoritmo através da aceleração por hardware [Houstis et al, 1997]. Isso pode ser feito através da distribuição de cálculos por diferentes núcleos de um processador, explorando a paralelização do algoritmo. Uma outra abordagem mune-se de placas gráficas (GPU Graphical Processor Unit) para diminuir o tempo de execução, uma vez que estas possuem alto potencial de processamento para cálculos vetoriais e matriciais. Uma vantagem desses métodos é a disponibilidade de equipamentos. Processadores modernos dispõem de arquiteturas multinucleadas, e placas gráficas oferecem processamento veloz e de baixo custo. Otimizações por aceleração por hardware já é utilizada em diversos sistemas de modelagem molecular. Objetivos O principal objetivo do presente projeto é desenvolver uma ferramenta computacional para executar o processo de docking de uma ou múltiplas moléculas de uma forma

5 generalizada, permitindo a aplicação em sistemas diversos de importância tecnológica, principalmente, em nanotecnologia. Essa abordagem permite o estudo das interações moleculares em sistemas complexos, como nanotubos, dendrímeros, proteínas, vesículas e sistemas porosos (e.g. zeólitas). Desenvolvimento A ferramenta de Multi-Docking Generalizado será implementada sobre o programa DockThor [Almeida, 2011]. Este foi desenvolvido no LNCC (Laboratório Nacional de Computação Científica), e o desenvolvimento do atual projeto é feito em conjunto com a equipe que criou o DockThor. O programa está implementado em C++, com algumas rotinas em Fortran. Atualmente, o programa realiza o docking convencional, utilizando um algoritmo genético como função de busca e o campo de força MMFF94 como função de avaliação, com uma abordagem de docking em Grid. O DockThor considera a proteína como uma entidade rígida, e o ligante completamente flexível. A solução (configuração geométrica e posição espacial do ligante) é armazenada em um vetor de números reais, denominado cromossomo. O cromossomo possui três entradas referentes a posição do ligante no espaço (coordenadas cartesianas), quatro entradas referentes aos graus de liberdade rotacionais do corpo rígido da molécula do ligante (armazenados em um quatérnion), e um número variável de entradas relacionadas aos graus de liberdade rotacionais das ligações químicas internas do ligante (armazenadas como um ângulo para cada ligação rotacionável de um ligante). A execução do programa começa com a geração da população inicial de soluções (armazenadas em cromossomos), dividida em etapas. Primeiro, ocorre uma distribuição estocástica, que respeita restrições fornecidas pelo usuário. Depois, evolui-se essa população com 30% das iterações totais do programa. Desse novo conjunto, escolhe-se quatro indivíduos para serem líderes, com a restrição de serem boas soluções e diferentes (RMSD < 2.0 angströms). Finalmente, esses quatro indivíduos são utilizados para gerar a população inicial, utilizando uma distribuição de Cauchy. Essa geração garante maior diversidade, favorecendo a criação de nichos e a convergência da busca. Ao longo da execução do algoritmo, são utilizados operadores genéticos para gerar novos indivíduos, aplicados sobre os cromossomos. O DockThor mune-se de três operadores crossover e dois de mutação. Para melhorar o desempenho do algoritmo, ao longo da execução ocorre uma adaptação dos operadores, de modo que aqueles que obtiveram um maior sucesso possuem maior chance de serem aplicados em iterações futuras. O algoritmo de busca mune-se de uma Seleção por Torneio Restrito para realizar a evolução da população de soluções. Essa seleção utiliza um método de crowding para formação e preservação de nichos, através de substituição por similaridade de indivíduos. O critério de similaridade é definido pela distância euclidiana, medindo-a através do o RMSD. Devido a elevação do custo computacional ao empregar uma metodologia Multi- Docking, aplicar-se-á diferentes métodos de otimização para reduzir o tempo de execução. Dentre esses, encontra-se a Computação de Alto Desempenho, que otimiza o tempo de execução através da aceleração por hardware, explorando o uso de paralelização, e o uso de outros algoritmos de busca evolucionários mais otimizados. A metodologia abordará primeiro o docking de múltiplos ligantes em diferentes cavidades da proteína. Para isso, utilizar-se-á um algoritmo identificador de sítio ativo em uma proteína [Laurie et al, 2006], realizando o docking sobre a melhor cavidade identificada. Depois, aplicar-se-á novamente o identificador de sitio ativo sobre a nova estrutura da proteína-ligante (obtida na etapa anterior), realizando o docking sobre a próxima cavidade encontrada.

6 Referências 1 Brooijmans N., Kuntz I.D., MOLECULAR RECOGNITION AND DOCKING ALGORITHMS. Annu Rev Biophys Biomol Struct : p Dominguez, C., Boelens, R., and Bonvin, A.M.J.J., HADDOCK: A PROTEIN- PROTEIN DOCKING APPROACH BASED ON BIOCHEMICAL OR BIOPHYSICAL INFORMATION. J. AM. CHEM. SOC., : p Friesner, A.R., Banks, L.J., Murphy, B.R., Halgren, A.T., Klicic, J.J., Mainz, T.D., Repasky, P.M., Knoll, H.E., Shelley, M., Perry,K.J., Shaw, E.D., Francis, P., and Shenkin, S.P., GLIDE: A NEW APPROACH FOR RAPID, ACCURATE DOCKING AND SCORING. 1. METHOD AND ASSESSMENT OF DOCKING ACCURACY. J. Med. Chem., : p Guedes, I.A., Magalhães, C.S., and Dardenne, L.E., RECEPTOR LIGAND MOLECULAR DOCKING. Biophys Rev, : p Houstis, C., et al., EXECUTION OF COMPUTE-INTENSIVE APPLICATIONS INTO PARALLEL MACHINES. Information Sciences, (1-2): p Jones, G., Willett, P., Glen, C.R., Leach, R.A., and Taylor, R., DEVELOPMENT AND VALIDATION OF A GENETIC ALGORITHM FOR FLEXIBLE DOCKING. J. Mol. Biol., : p Meng, C.E, Shoichet K.B. and Kuntz D.I, AUTOMATED DOCKING WITH GRID-BASED ENERGY EVALUATION. Journal of Computational Chemistry, (4): p Sousa, S.F., A.J.M. Ribeiro, J.T.S. Coimbra, R.P.P. Neves, S.A. Martins, N.S.H.N. Moorthy, P.A. Fernandes and M.J. Ramos, PROTEIN-LIGAND DOCKING IN THE NEW MILLENNIUM A RETROSPECTIVE OF 10 YEARS IN THE FIELD. Current Medicinal Chemistry, Totrov, M., and Abagyan, R., FLEXIBLE LIGAND DOCKING TO MULTIPLE RECEPTOR CONFORMATIONS: A PRACTICAL ALTERNATIVE. Curr Opin Struct Biol., (2): p Vakser I.A., PROTEIN DOCKING FOR LOW-RESOLUTION STRUCTURES. Protein Eng., (4): p Wang, R., Lu, Y., Wang, S., COMPARATIVE EVALUATION OF 11 SCORING FUNCTIONS FOR MOLECULAR DOCKING. J Med Chem, : p Yuriev, E., Ramsland, P.A., LATEST DEVELOPMENTS IN MOLECULAR DOCKING: IN REVIEW. J Mol Recognit, : p Almeida, D. M., DOCKTHOR: IMPLEMENTAÇÃO, APRIMORAMENTO E VALIDAÇÃO DE UM PROGRAMA DE ATRACAMENTO RECEPTOR- LIGANTE. Petropolis, RJ. Laboratório Nacional de Computação Científica, Laurie, A.T.R., and Jackson, R.M., METHODS FOR THE PREDICTION OF PROTEIN-LIGAND BINDING SITES FOR STRUCTURE-BASED DRUG DESIGN AND VIRTUAL LIGAND SCREENING. Current Protein and Peptide Science, : p