ANÁLISE FITOQUÍMICA E BIOLÓGICA DA FLOR DA CAEASALPINIA PULCHERRIMA (FABACEAE) VARIAÇÃO DE COR AMARELO

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1 ANÁLISE FITOQUÍMICA E BIOLÓGICA DA FLOR DA CAEASALPINIA PULCHERRIMA (FABACEAE) VARIAÇÃO DE COR AMARELO Paula Letícia de Melo Souza 1, Maísa Borges Costa 1, Luciana Machado Ramos 1. 1 Universidade Estadual de Goiás Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas (UnUCET), , Brasil maisabc@gmail.com Palavras-chave: Caesalpinia pulcherrima, barba-de-barata, Fabaceae. 1 Introdução Os produtos naturais estão presentes na História da humanidade desde tempos remotos, e o Brasil é marcado por esses recursos devido à comercialização de especiarias e à exploração do Pau-Brasil (Caeasalpinia echinata), por exemplo. A descoberta de substâncias tóxicas e medicamentosas, no decorrer do tempo, deve-se quase que integralmente ao perspicaz conhecimento do arsenal químico da natureza pelos povos primitivos e indígenas. Às mais distintas etnias são associadas o prosperar dos estudos de produtos naturais, de estruturas químicas e de propriedades biológicas, frente à intimidade e à observação desses povos (VIEGAS, 2006). Inicialmente, o desenvolvimento de fármacos a partir de produtos naturais de plantas era limitado ao isolamento e definição da estrutura de substâncias ativas e feito ao acaso (VIEGAS, 2006). Hoje, o foco da fitoquímica tradicional voltou-se para estudos que envolvam atividade biológica e/ou biossíntese de macromoléculas vegetais, por exemplo, bem como novas metodologias analíticas (PINTO, 2002). Grande parte dos compostos orgânicos naturais de origem vegetal são biologicamente ativos (PLETSCHI, 1998) e, inseridas nesse contexto, as plantas medicinais, apresentam potencial farmacológico, são atrativas, úteis terapeuticamente (CUNHA, 2005) e fornecem, ainda, substâncias enantiomericamente puras (MONTANARI, 2001). Além disso, elas podem fornecer metabólitos primários e secundários, que, após extração e transformação, pela Indústria Farmacêutica, em moléculas farmacologicamente viáveis, podem compor medicamentos (CUNHA, 2005). Apresentam, ainda, ações tranqüilizantes, analgésicas e antiinflamatórias, por exemplo, empregadas habitualmente na prevenção e/ou cura de doenças e como aromatizantes, flavorizantes ou antioxidantes (PLETSCHI, 1998). De forma geral, a natureza é a precursora da produção da maioria das substâncias orgânicas elucidadas e o reino vegetal é responsável pela grande parte da diversidade química conhecida e documentada (VIEGAS, 2006) e o mais recorrente no abastecimento das substâncias viáveis para o tratamento de doenças (MONTANARI, 2001). Por métodos laboratoriais, é praticamente inatingível a elaboração de metabólitos secundários e macromoléculas tão complexas quanto às naturais (VIEGAS, 2006). Além de ser a única fonte para a obtenção de certas drogas, a exemplo do taxol, essas substâncias são alternativas para a conquista de compostos que apresentam estrutura complexa e muitos centros quirais (PLETSCHI, 1998), capazes, apreciavelmente, de serem absorvidas e metabolizadas pelo organismo (PLETSCHI, 1998) já que a síntese química, nesse caso, é economicamente inviável (PLETSCHI, 1998). Outra aplicação de destaque da diversidade biológica é a obtenção de fitomedicamentos ou fitoterápicos. Esses medicamentos são provenientes da composição de extratos de uma ou mais plantas. Conforme a Organização Mundial da Saúde OMS, os fitomedicamentos são substâncias ativas encontradas em toda a planta, ou em parte dela, sob forma de extrato total ou processado (CALIXTO, 2006). 1

2 Com potencial fitoterápico, a Caesalpinia pulcherrima é um arbusto ornamental, lenhoso, ereto e espinhoso, da família Leguminosae (CAMARA, 2007). Aclimatado e difundido pelo Brasil, é conhecido popularmente como barba de barata, baio-de-estudante, orgulho de barbados, flor-do-paraíso, flamboyant-mirim e maravilha. Na índia, estudos farmacológicos revelaram que a espécie apresenta várias propriedades medicinais, das quais se destacam o uso no tratamento contra úlcera, tumores, dermatites, emenagoga, disenteria, diversas infecções, além da ação abortiva (PINTO, 2002). No Brasil, há poucas pesquisas científicas relacionadas com esta espécie. 3 Este trabalho teve por objetivo promover um estudo fitoquímico (CUNHA, 2005), da flor (variação de cor amarela) da C. pulcherrima, a partir de extratos e frações. Neste trabalho foram feitos diversos testes Fitoquímicos na tentativa de isolar novos metabólitos secundários diferentes dos relatados na literatura. Também foram realizados testes de letalidade com Artemias salinas a fim de estabelecer a toxicidade dos extratos. O ensaio de toxicidade sobre a Artemia salina é um dos ensaios que podem ser utilizados no monitoramento de extratos vegetais (ARAUJO, 2010), e foi desenvolvido para encontrar constituintes bioativos nos extratos das plantas. Esse ensaio também pode ajudar a mostrar a toxicidade de um extrato com atividade moluscicida contra peixes e pequenos crustáceos (MAGALHÃES, 2005). Os testes de toxicidade com Artemia são ensaios biológicos rápidos de baixo custo e são realizadso sem a necessidade de utilizar equipamentos sofisticados (LIEBERMANN, 1999). Estudos que envolvem compostos com alguma potencialidade biológica, são de fundamental importância que se realize ensaios de letalidade o qual permitirá avaliar sua toxicidade preliminar (DUSMANN, 2003). O ensaio com camarão marinho é uma ferramenta muito útil no isolamento de compostos bioativos em extratos de plantas (KRISHNARAJU, 2005). Ensaios de letalidade com Artemia salina definem valores da dose letal média (DL 50 ) em µg/ml de compostos ou extratos, sendo que dezenas de substâncias ativas conhecidas apresentam toxicidade ao realizar este teste (MEYER, 1982). A atividade é Considerada significativa quando a estimação do valor da DL 50 é menor que 1000 µg/ml (KRISHNARAJU, 2005). A atividade biológica preliminar dos extratos no TAS são classificadas conforme os seguintes critérios baseados nos níveis de DL 50 em Artemia salina: DL μg/ ml, altamente tóxicos; entre 80 μg/ ml e 250 μg/ ml, moderadamente tóxico; e DL μg/ ml, com baixa toxicidade ou não tóxico (KRISHNARAJU, 2005). 2 MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Materiais e reagentes utilizados * Materiais cromatográficos: Cromatofolhas de Alumínio de sílica gel 60 F254 MERCK, Sílica gel 60 ( Mesh) MERCK e Solventes P.A. * Equipamentos Evaporador rotativo (Quimis); Bomba à vácuo (Solab); Balança analítica (Gehaka); Estufa (Solotest); Banho-maria (Marconi aparelho para laboratório), Câmara escura UV (CIENLAB). 2.2 Material botânico As amostras da flor de Caesalpinia pulcherrima foram colhidas no pátio da Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas da Universidade Estadual de Goiás. A chave (número ) da planta foi realizada pela Agrônoma Juliana Machado Ramos Separação, Secagem e Moagem 2

3 Após a coleta, as flores foram secas em temperatura ambiente longe da incidência da luz solar. Com o material seco, o mesmo foi triturado com auxílio de um liquidificador doméstico. A extração foi realizada a frio via maceração evitando a formação de artefatos Obtenção dos extratos brutos Após maceração, os extratos foram obtidos a partir de extração não-contínua com solventes de diferentes polaridades, tais como etanol, clorofórmio e hexano, e, em seguida, rotaevaporados em balões previamente tarados. Obtiveram-se os Extratos Brutos Etanólicos (EBE), Extratos Brutos Hexânicos (EBHx) e Extratos Brutos Clorofórmicos (EBCl) das folhas e flores de C. pulcherrima Partição dos Extratos Brutos Etanólicos A partição é uma das metodologias que se baseiam no fracionamento de extratos com solventes de polaridade crescente (LEITE, 2001). O extrato etanólico foi particionado em extração líquido-líquido descontínua com Hexano, Diclorometano e Acetato de Etila, obtendo-se, assim, as Frações Hexânicas (F. Hx), Frações Diclorometânicas (F. DCM) e Frações de Acetato de Etila (F. AcOET) dos Extratos Brutos Etanólicos das folhas e flores de C. pulcherrima. 2.3 Identificações dos Metabólitos Secundários de C. pulcherrima A prospecção fitoquímica foi realizada para a identificação dos metabólitos secundários presentes nos extratos e frações das flores da C. pulcherrima, baseado no Manual para Análise Fitoquímica de Extratos Vegetais (Barbosa, 2004). Foram realizados os seguintes testes: saponina espumídica; ácidos orgânicos; açúcares redutores; polissacarídeos; proteínas e aminoácidos; fenóis e taninos; flavonoides; alcaloides; catequinas; sesquiterpenoslactonas e outras lactonas; esteróides e triterpenóides. 2.4 Cromatografia em Placa Preparativa Os extratos brutos e frações que apresentaram boa separação dos componentes, ou seja, Fatores de Retenção (Rf) relativamente distantes foram submetidos à Cromatografia Preparativa, com eluente determinado pelos testes em Cromatografia em Camada Delgada. As amostras submetidas à cromatografia preparativa foram: O EBH e as frações hexânicas, acetato de etila. As placas foram preparadas com aplicação da suspensão de sílica para placas preparativas MACHEREY- NAGEL e água destilada em placas de vidro de dimensões 20 cm x 20 cm. Após aplicação, as placas foram ativadas em estufa a 100 C por 1 hora. Pesaram-se 200 mg de cada amostra, que, em seguida, foram aplicadas nas Placas Preparativas com ajuda de capilar e eluídas em cuba contida do eluente já definido por CCD. Após eluição, as placas foram reveladas em Câmara UV com comprimento de onda igual a 254 nm, raspada conforme revelação e lavada com o respectivo eluente. As frações obtidas, com Rfs calculados, foram pesadas, submetidas à Cromatografia em Camada Delgada e reunidas conforme a proximidade do fator de retenção. 3. Resultados e discussões 3.1 Classe de metabólitos secundários identificados Após realizado os testes descritos acima foram identificados metabólitos secundários para os extratos brutos e frações. Para os extratos brutos (EBH e EBCl) e frações da flor (FrH, FrDCM, FrAcOEt, FrBut), foram observadas apenas a presença de esteróides. 3

4 3.2 Cromatografia em Camada Delgada das Frações Obtidas da Cromatografia em Placas Preparativas Através da realização da CCD foi possível observar as frações com eluição semelhante para que fossem reunidas. Logo, todos os produtos obtidos das frações em que se realizou a cromatografia em placas preparativas foram reunidos, pois apresentaram eluição semelhante. Todas as frações foram pesadas para que fosse analisado com quais frações seria feito o bioensaio com Artemia salina e seus Rf s foram calculados. 3.2 Avaliação citotóxica A análise de toxicidade dos extratos frente à Artemia salina demonstrou, após o tempo de 24 horas de incubação, a sobrevivência de todos os microcrustáceos no branco, e a mortalidade da A. salina em alguns extratos, confirmando o potencial biológico dos mesmos. Os dados de DL 50 foram obtidos a partir do cálculo estatístico PROBITO. Os extratos brutos da flor da C. pulcherrima foram preparados via dissolução em solução salina de ph variando entre 8,4 e 8,6. Entretanto, extratos foram pouco solúveis, motivo pelo qual foi adicionado o solvente DMSO, a fim de auxiliar na solubilização destes extratos. Os dados de DL 50 evidenciaram que os extratos brutos hexânico e clorofórmico, e todas as frações da partição do EBE não apresentaram atividade frente à Artemia salina. 4. Conclusões A prospecção fitoquímica realizada com o extrato bruto Hexânico, Clorofórmico e Etanólico da flor da Caesalpinia pulcherrima, revelou a presença apenas de esteróides. Porém, a aplicação de técnicas de identificação pode ser empregada afim de que a estruturas desses compostos sejam elucidadas. No experimento referente à citotoxicidade das flores de C. pulcherrima frente à letalidade contra Artemia salina, observou-se a ausência de atividade citotóxica, pois o valor de DL 50 foi superior a 1000 μg/ml. Diante desses resultados, observa-se a importância e a necessidade de ser realizado um estudo aprofundado da espécie C. pulcherrima, visando avaliar outras atividades, isolar e elucidar os possíveis compostos presentes na planta. 5. Referências ARAÚJO, M. G. F.; et al. Estudo fitoquímico preliminar e bioensaio toxicológico frente a larvas de Artemia salina Leach. de extrato obtido de frutos de Solanum lycocarpum A. St.-Hill (Solanaceae). Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, v.31, n.2, pp , CALIXTO, J. B. Biodiversidade como Fonte de Medicamentos. Ciência e Cultura. vol 55, n 3, São Paulo, julho/setembro, CAMARA, C. de A. Caracterização, germinação e conservação de sementes de visgueiro (Parkia pendula (Wild.) Benth. ex Walpers e de maravilha (Caesalpinia pulcherrima (L.) Sw.). Dissertação de Mestrado em Agronomia: Produção Vegetal Universidade Federal de Alagoas. Centro de Ciência Agrárias, Rio Largo, CUNHA, A. P.; ROQUE, O. R. Farmacognosia e Fitoquímica. Fundação Calouste Gulbenkian. A. Coelho Dias, S. A., novembro,

5 DÜSMAN, L. T.; Síntese, estudos conformacionais e avaliação da atividade biológica frente trypanosoma crusi e artemia salina de tetraidro-β-carbonilas-3-carbometóxi e 3-amido-1- benzossubstituídas; Universidade Estadual de Maringá Centro de Ciências Exatas Departamento de Química Programa de Pós - graduação em Química HOSTETTMANN, K. ; QUEIROS, E. F.; VIEIRA, P. C.; Princípios ativos de plantas superiores. São Carlos: EduFSCar, p. (Série de texto da Escola de Verão em Química, Vol. IV). KRISHNARAJU, A. V.; RAO, T. V. N.; SUNDARARAJU, D.; VANISREE, M.; TSAY, H. S.; SUBBARAJU, G. V.; Assessment of bioactivity of indian medicinal plants using brine shrimp (artemia salina) lethality assay; International Journal of Applied Science and Engineering. p. 125 a 134, KUMAR, D.; SINGH, J.; BAGHOTIA, A.; KUMAR, S.; Anticonvulsant effect of the ethanol extract of Caesalpinia pulcherrima (l.) sw., fabaceae, leaves. Brazilian Journal of Pharmacognosy 20(5), p , Out./Nov LEITE, J. P. V.; Fitoterapia: base cientifica e tecnológicas. São Paulo: Editora Atheneu, p. 328, LIEBERMAN, M.; A brine shrimp bioassay for measuring toxicity and remediation of chemical; Journal of Chemical Education. vol. 76, p a 1691, MAGALHÃES, A. F.; RUIZ, A. L. T. G.; et al. Avaliação da atividade tóxica em Artemia salina e Biomphalaria glabrata de extratos de quatro espécies do gênero Eleocharis (Cyperaceae). Revista Brasileira de Farmacognosia, v.15, p , MEYER, B. N.; FERRIGNI, N. R.; PUTNAM, J. E., et. al.; Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituents ; Planta Medica, vol. 45, p. 31 a MONTANARI, C.A.; BOLZANI, V.S. Planejamento Racional de Fármacos baseado em Produtos Naturais. Química Nova, Vol. 24, p , PEREIRA, A. de C.; CASTRO, D. L. de. Prospecção fitoquímica e potencial citotóxico de Unxia kubitzkii H.Rob. (Asteraceae-Heliantheae). Revista Brasileira de Biociências, v.5, p , PINTO, A. C.; SILVA, D. H. S.; BOLZANI, V. S.; LOPES, P. N.; EPIFANIO, R. A.; Produtos naturais: atualidade, desafios e perspectiva. Química Nova; vol. 25, Supl. 1, 45-61, 2002, p , PLETSCHI, M. Compostos Naturais Biologicamente Ativos. Biotecnologia: Ciência e Desenvolvimento, 4: 12 15, Brasília DF, VIEGAS, C. Jr.; BOLZANI, V. S.; BARREIRO, E. J.; Os produtos naturais e a química medicinal moderna. Química Nova; vol. 29, Nº 2, p , São Paulo Mar./ Apr WOLDEMICHAEL, G. M.; SINGH, M. P.; MAIESE, W. M.; TIMMERMANN, B. N.; Constituents of antibacterial extract of Caesalpinia paraguariensis burk. Z. Naturforsch. 58c, p ,