Estudo sorológico, bacteriológico e molecular da leptospirose em éguas envolvidas em programa de transferência de embriões

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1 1 UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA (CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL) ALINE EMERIM PINNA Estudo sorológico, bacteriológico e molecular da leptospirose em éguas envolvidas em programa de transferência de embriões NITERÓI 2011

2 2 ALINE EMERIM PINNA Estudo sorológico, bacteriológico e molecular da leptospirose em éguas envolvidas em programa de transferência de embriões Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor em Medicina Veterinária. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal. Orientador: Prof. Dr. Walter Lilenbaum Co-orientador: Prof. Dr. Felipe Zandonadi Brandão

3 3 NITERÓI 2011 ALINE EMERIM PINNA Estudo sorológico, bacteriológico e molecular da leptospirose em éguas envolvidas em programa de transferência de embriões Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor em Medicina Veterinária. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal. Aprovada em 17 de Junho de BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Walter Lilenbaum - Orientador

4 4 UFF Prof. Dr. Luis Altamiro Nogueira Garcia UFF Prof. Dr. Júlio Jacob UFRRJ Prof. Dr. Marco Antônio Alvarenga UneSP- Botucatú Prof. Dr. Sílvio Arruda Vasconcellos USP

5 5 Dedico às pessoas que mais amo neste mundo. A minha querida mãe, que nunca me deixou faltar apoio, carinho, amizade, atenção e participação nas decisões mais importantes da minha vida. Amo você! Aos meus queridos Ancelmo e Adriano, mais que pai e irmão, amigos que amo muito e sei que muito intercedem por mim junto a Deus! Aos meus sobrinhos Luíza e Arthur, que são as sementes de amor deixadas pelo meu querido irmão. meu lado. A minha querida tia Neide, tio Nádio, Manuella e Gabriel que estão sempre do Amo vocês!

6 6 AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer a todos aqueles que de maneira direta ou indireta contribuíram para a realização deste trabalho, e em especial: A Deus, pelo seu amor incondicional.

7 7 Ao Prof. Dr. Walter Lilenbaum, por todo apoio, incentivo, confiança ensinamentos. Minha eterna gratidão! e por tantos À equipe do Laboratório de Bacteriologia do Instituto Biomédico da Universidade Federal Fluminense, especialmente aos colegas Gabriel Martins, Camila Hamond, Bruno Penna, Renato Varges e Denis Otaka, pela acolhida e colaboração. Aos meus colegas veterinários responsáveis pelos plantéis estudados na presente tese, agradeço pela disponibilidade e presteza para comigo. Ao Setor de Reprodução Animal da Universidade Federal Fluminense, em particular aos professores Luis Altamiro Nogueira e Felipe Zandonadi Brandão pela colaboração e sugestões durante a realização deste trabalho. Ao Rafael Barros, pela amizade, respeito e compreensão. Aos amigos, pois sempre pude contar com vocês. À minha família, por tudo que representam para mim. PINNA, Aline Emerim. Estudo sorológico, bacteriológico e molecular da leptospirose em éguas envolvidas em programa de transferência de embriões Tese. Universidade Federal Fluminense RESUMO No Brasil, apesar do considerável plantel de cavalos, existem poucos estudos sobre a leptospirose em equinos. A ocorrência de falhas reprodutivas em programas de transferência de embrião (TE) é alta e ocorre por diversas causas. O presente estudo foi dividido em duas etapas. Em um primeiro momento, foram estudadas 688 éguas adultas, oriundas de 15 plantéis, envolvidas em programas de transferência de embriões nos estados do Rio de

8 8 Janeiro (n=9) e São Paulo (n=6). Nove plantéis com histórico de mortes embrionárias e abortamentos recentes formaram o Grupo A, enquanto seis plantéis sem histórico de alterações reprodutivas dignas de nota passaram a compor o grupo controle, ou Grupo B. Os animais do Grupo A foram ainda sub-divididos em dois grupos: grupo das doadoras de embrião e o grupo das receptoras de embrião. As doadoras apresentaram falha na taxa de recuperação embrionária de 16,2%. Já o grupo das receptoras apresentou morte embrionária precoce (20,7%), abortamentos (21,8%) e morte neonatal (5%), totalizando 47,6% de falhas reprodutivas. Já no Grupo B todas as éguas receptoras estavam prenhas no momento da coleta das amostras, e, portanto não foi observada a ocorrência de falhas reprodutivas. No que se refere ao Grupo A, dentre as 437 amostras testadas por soroaglutinação microscópica com antígenos vivos, 301 (68,9%) foram reativas (títulos 200). Neste grupo, em relação à distribuição por serovares, Bratislava foi o mais frequente, correspondendo a 195 amostras (64,8% das reativas). Reatividade perante o serovar Copenhageni também foi observada, em 106 amostras (35,2%). Já no Grupo B, das 251 amostras testadas, apenas 26 (10,4%) foram reativas. Neste grupo, Copenhageni foi o serovar mais frequente, em 16 amostras (61,5% das reativas). Reatividade perante o serovar Bratislava também foi observada em 10 amostras (38,5%). Em uma etapa seguinte, os plantéis em que os animais apresentaram falhas reprodutivas e que se mostraram sororeativos foram selecionados e, dos animais destes planteis, 61 amostras de urina foram colhidas para processamento bacteriológico e molecular. Ao exame direto em microscopia de campo escuro não se observou a presença de leptospiras em nenhuma das amostras examinadas. Também não foi possível isolar o microrganismo a partir de nenhuma das amostras testadas. Foram processadas para PCR um total de 29 amostras de urina, oriundas de dois plantéis (de números 5 e 8), com 15 e 14 amostras, respectivamente. Na PCR, no plantel de número 8 identificou-se DNA específico de Leptospira ssp. patogênica em 50% das amostras (7/14), enquanto no outro plantel (número 5) identificou-se tal DNA em 60% das amostras (9/15). Concluiu-se que a leptospirose representa uma importante enfermidade da esfera da reprodução, estando associada a ocorrência de morte embrionária precoce, abortamentos e morte perinatal nas receptoras, porém não nos índices de recuperação embrionário nas doadoras. Adicionalmente, o serovar Bratislava, mantido pelos equinos, mostrou-se predominante e mais frequentemente associado a falhas reprodutivas do que o serovar Copenhageni, embora este último também as determine. Por último, concluiu-se que a evidenciação de DNA bacteriano por PCR mostrou-se uma técnica de diagnóstico direto rápido e definitivo para a infecção por leptospiras em equinos. Palavras chave: Leptospirose, equinos, abortamentos, reprodução. PINNA, Aline Emerim. Serological study, bacteriological and molecular leptospirosis in mares involved in embryo transfer program Tese. Universidade Federal Fluminense ABSTRACT

9 9 In Brazil, despite the large herd of horses, there are few studies on leptospirosis in those animals. The occurrence of reproductive failure in embryo transfer programs (ET) is high and occurs for different reasons. The present study was divided in two steps. At first, we studied 688 adult mares from 15 flocks, involved in embryo transfer programs in the states of Rio de Janeiro (n = 9) and São Paulo (n = 6). Nine herds with a history of embryonic deaths and abortions formed Group A, while six herds with no history of reproductive alterations were included as control group, or Group B. Animals in Group A were sub-divided into two groups: the embryo donors and embryo recipients. The donors had a rate of failure in embryo recovery of 16.2%. The group of recipients presented early embryonic death( 20.7%), abortions (21.8%) and neonatal death ( 5%) totaling 47.6 % of reproductive failure. In Group B all recipient mares were pregnant at the time of sample collection, and therefore reproductive failure was not observed. With regard to Group A, among the 437 samples tested by microscopic agglutination test, 301 (68.9%) were reactive (titers 200). In this group, in relation to the distribution of serovars, Bratislava was the most frequent, corresponding to 195 samples (64.8% of reactive). Reactivity to the serovar Copenhageni was also observed in 106 samples (35.2%). In Group B, of the 251 samples tested, only 26 (10.4%) were reactive. In this group, Copenhageni was the most frequent serovar in 16 samples (61.5% of reactive). Reactivity to the serovar Bratislava was also observed in 10 samples (38.5%). In a further step, the flocks in which the animals showed reproductive failure and that proved seroreactive were selected, and from thosee animals, 61 urine samples were collected for bacteriological and molecular processing. On direct examination at darkfield microscopy leptospires could not be observed. Additionally the microrganism was not isolated in any sample tested. PCR were processed for 29 urine samples from two flocks (numbers 5 and 8), with 15 and 14 samples, respectively. In PCR, specific DNA of pathogenic Leptospira spp.was observed in seven out of 14 samples from flock number 8, while in the other flock (number 5) that DNA was identified in 60% of the samples (9/15). We concluded that leptospirosis is an important disease of the reproductive sphere, being associated with early embryonic death, abortions, and perinatal death in recipients, but not in embryo recovery rates in donors. Additionally, serovar Bratislava, maintained by horses, was prevalent and frequently associated with reproductive failure than serovar Copenhageni, although the latter also determines. Finally, it was concluded that the demonstration of bacterial DNA by PCR showed a diagnostic technique for rapid direct and definitive Leptospira infection in horses. Key words: Leptospirosis, horses, abortion, reproduction.

10 10 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Antígenos utilizados para o diagnóstico sorológico da leptospirose por soroaglutinação microscópica em equinos Tabela 2: Avaliação reprodutiva de éguas envolvidas em programas de transferência de embrião (doadoras) oriundos de plantéis com histórico de falhas reprodutivas (Grupo A) Tabela 3: Avaliação reprodutiva de éguas envolvidas em programas de transferência de embrião (receptoras) oriundos de plantéis com histórico de falhas reprodutivas (Grupo A) Tabela 4: Avaliação sorológica (anticorpos anti-leptospira) de éguas envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com (Grupo A) e sem (Grupo B) histórico de falhas reprodutivas Tabela 5: Análise de associações entre sororeatividade (anticorpos anti-leptospira) de éguas envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de falhas reprodutivas e ocorrência de falha reprodutiva Tabela 6: Análise de associações entre sororeatividade (anticorpos anti-leptospira) de éguas (doadoras) envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de baixa recuperação embrionária (BRE) Tabela 7: Análise de associações entre sororeatividade (anticorpos anti-leptospira) de éguas (receptoras) envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de morte embrionária precoce (MEP) Tabela 8: Análise de associações entre sororeatividade (anticorpos anti-leptospira) de éguas (receptoras) envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de abortamento

11 11 Tabela 9: Análise de associações entre sororeatividade (anticorpos anti-leptospira) de éguas (receptoras) envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de morte perinatal Tabela 10: Análise de associações entre sorovariedade de éguas envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de falhas reprodutivas e ocorrência de falha reprodutiva Tabela 11: Análise de associações entre sorologia negativa e sorologia positiva para Bratislava de éguas envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de falhas reprodutivas e ocorrência de falha reprodutiva Tabela 12: Associações entre sororeatividade para Copenhageni de éguas envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de falhas reprodutivas e ocorrência de falha reprodutiva Tabela 13: Associações entre sorovariedade de éguas (doadoras) envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de baixa recuperação embrionária (BRE) Tabela 14: Associações entre sororeatividade para Bratislava de éguas (doadoras) envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de baixa recuperação embrionária (BRE) Tabela 15: Associações entre sororeatividade para Copenhageni de éguas (doadoras) envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de baixa recuperação embrionária (BRE) Tabela 16: Associações entre sorovariedade de éguas (receptoras) envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de morte embrionária precoce (MEP)

12 12 Tabela 17: Associações entre sororeatividade para Bratislava de éguas (receptoras) envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de morte embrionária precoce (MEP) Tabela 18: Associações entre sororeatividade para Copenhageni de éguas (receptoras) envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de morte embrionária precoce (MEP) Tabela 19: Associações entre sorovariedade de éguas (receptoras) envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de abortamento Tabela 20: Associações entre sororeatividade para Bratislava de éguas (receptoras) envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de abortamento Tabela 21: Associações entre sororeatividade para Copenhageni de éguas (receptoras) envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de abortamento Tabela 22: Associações entre sorovariedade de éguas (receptoras) envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de morte perinatal Tabela 23: Associações entre sororeatividade para Bratislava de éguas (receptoras) envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de morte perinatal Tabela 24: Associações entre sororeatividade para Copenhageni de éguas (receptoras) envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com histórico de morte perinatal

13 13 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1: Distribuição dos serovares de Leptospira interrogans em éguas envolvidas em programas de transferência de embrião oriundos de plantéis com (Grupo A) e sem (Grupo B) histórico de falhas reprodutivas...

14 14 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Eletroforese em gel de agarose 2% dos fragmentos amplificados pela técnica da PCR a partir do DNA extraído da urina de éguas envolvidas em programas de TE.

15 15 LISTA DE ABREVIATURAS BRE Baixa Recuperação Embrionária DNA Ácido desoxirribonucléico EMJH Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris FR Falhas Reprodutivas MAT Soroaglutinação microscópica com antígenos vivos MEP Morte Embrionária Precoce

16 16 MN Morte Neonatal OIE Escritório internacional de Epizootias OMS Organização Mundial da Saúde PCR - Reação em Cadeia da Polimerase RE - Recuperação Embrionária TE Transferência de Embrião 1 INTRODUÇÃO A leptospirose é uma doença infecto-contagiosa que acomete os animais domésticos, silvestres e os seres humanos sendo, portanto, classificada como uma zoonose. Esta enfermidade vem assumindo grande importância, tanto nos países

17 17 em desenvolvimento quanto nos desenvolvidos, afetando a saúde animal, a economia de produção e a saúde pública. Causada pelas diversas sorovariedades da espiroqueta pertencente à Ordem Spirochaetales, Família Leptospiraceae, Gênero Leptospira e espécie L. interrogans (sensu lato), a doença pode ter evolução aguda ou crônica. O agente não se cora pelos métodos usuais, sendo visualizado em microscopia de campo escuro ou em microscópio óptico pelo método de impregnação pela prata. Seu cultivo é demorado e necessita de meios de cultura especiais, enriquecidos com soro de coelho ou albumina bovina. Por este motivo, a doença é freqüentemente diagnosticada por meio de evidências sorológicas. A ocorrência de leptospirose em equinos é variável em diferentes partes do mundo, podendo observar-se tanto de forma esporádica quanto endêmica. Os surtos ocorrem por exposição à água contaminada com urina ou tecidos provenientes de animais infectados. Existem vários ciclos epidemiológicos na leptospirose, que envolvem diferentes reservatórios e mecanismos de transmissão, mas as condições ambientais são sempre muito importantes para a ocorrência da doença. Cada sorovariedade tende a ser mantida por um hospedeiro específico e a prevalência do mesmo pode ser influenciada pela região envolvida. Em 1994, Ellis analisou a patogênese e controle da leptospirose em países tropicais e observou a ocorrência de diferentes sorovariedades de Leptospira, dividindo-os em dois grandes grupos: um grupo de amostras adaptadas e mantidas pelo próprio hospedeiro, que independe da região e do índice pluviométrico para se manter no hospedeiro, e o grupo das amostras mantidas por outras espécies domésticas ou silvestres, mais dependentes de influência ambiental e responsáveis pelas denominadas infecções incidentais. Além dos danos econômicos que a leptospirose pode determinar aos criadores de equinos, cabe ressaltar que esta é uma zoonose de reconhecida importância na saúde pública. O impacto da leptospirose sobre a saúde pública reflete-se no alto custo do tratamento nas pessoas acometidas e na alta letalidade, da ordem de 5 a 20%. No entanto, quanto à saúde animal, as conseqüências dessa infecção encontram-se particularmente na esfera econômica, tendo em vista as

18 18 perdas diretas, como os gastos com o tratamento e morte do animal e as indiretas, quando da queda da produtividade, aumento do intervalo de partos e queda de desempenho esportivo. Quanto às manifestações clínicas associadas a esta afecção, destacam-se problemas reprodutivos e oculares; porém, muitos eqüinos sororeativos não exibem sinais clínicos evidentes desta enfermidade. A introdução de novas técnicas na área da reprodução eqüina vem permitindo um maior aproveitamento do potencial genético e reprodutivo dos animais melhoradores ou de alta performance. A transferência de embrião (TE) tornou-se um mercado crescente dentro da indústria equina, gerando grandes investimentos por parte de criadores que desejam obter maior número de produtos de éguas selecionadas. Porém, perdas embrionárias e baixa taxa de recuperação embrionária ocorrem por diversas causas e assim determinam a queda nos resultados dos programas de TE. Neste contexto, o presente estudo visa contribuir para a identificação das sorovariedades circulantes em nosso meio, gerando avanços no conhecimento do agente infeccioso e de amostras locais, assim como de novas amostras a serem identificadas, permitindo o conhecimento de sua origem, bem como o aperfeiçoamento de métodos de diagnóstico adaptados as nossas condições, contribuindo desta forma para o conhecimento e controle da enfermidade em éguas envolvidas em programa de transferência de embriões. 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 AGENTE ETIOLÓGICO A palavra leptospira deriva do grego e traduz-se leptós - fino, pequeno,

19 19 delicado e speira, espiral. São bactérias helicoidais de 6 a 20 µm de comprimento e 0,1 µm de diâmetro (LEVETT, 2001), filamentosas, delgadas, podendo apresentar uma ou ambas as extremidades curvadas em formato de gancho (LEVETT, 2001; TORTORA, FUNKE e CASE, 2003). Nestas extremidades, as leptospiras, que são espiroquetas, possuem dois flagelos polares conhecidos como filamentos axiais ou flagelos periplasmáticos, que lhes garantem alta motilidade (FAINE et al., 2000; LEVETT, 2001; BARTHI et al., 2003). Assim, podem realizar movimentos de rotação e translação ao longo do seu eixo, em linha reta ou em círculos (FAINE et al., 2000; LEVETT, 2001; TORTORA, FUNKE e CASE, 2003). O lipopolissacarídeo que compõe a membrana externa das leptospiras se assemelha ao das bactérias Gram-negativas, porém possui menor atividade endotóxica (SHIMIZU et al., 1987). Estas espiroquetas não se coram pelos métodos usuais de coloração, sendo visualizadas apenas em microscopia de campo escuro ou em microscopia de campo claro de contraste de fase, ou ainda, em preparações impregnadas pela prata (FAINE et al., 2000). Condições aeróbicas são essenciais e determinam seu crescimento (LEVETT, 2001; TORTORA, FUNKE e CASE, 2003). Uma concentração ainda indefinida de CO 2 é indispensável para o início do crescimento acima citado. Desenvolvem-se em temperatura ótima de 28 a 30ºC e ph 7,2 a 7,6 (FAINE et al., 2000). Demandam meios especiais de cultivo, não crescendo na ausência de albumina (opta-se geralmente pela bovina a qual se acrescenta 1% ao meio) ou soro (sendo mais utilizado o de coelho na proporção de 10%) (FAINE et al., 2000; TORTORA, FUNKE e CASE, 2003), sendo que vitaminas B1, B12, fosfato, cálcio, magnésio, amônia e ferro são nutrientes essenciais para o seu desenvolvimento (FAINE et al., 2000; LEVETT, 2001). A sua principal fonte de energia são os ácidos graxos de cadeia longa (BASEMAN e COX, 1969). O meio de cultura mais utilizado para o seu cultivo é o meio líquido de Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH), que contém ácido oléico, soroalbumina bovina como detoxificante e tween 80 como fonte de carbono (ELLINGHAUSEN e MCCULLOUGH, 1965; JOHNSON e HARRIS, 1967). As leptospiras patogênicas possuem longo tempo de geração, variando de 8 a 18 horas. O crescimento em meio de cultura pode variar de dois a 30 dias (FAINE et al., 2000), podendo levar até 26 semanas em isolamentos primários (ELLIS et al., 1983).

20 20 As bactérias do gênero Leptospira sp são pouco resistentes, sendo rapidamente eliminadas pela desidratação e temperatura entre C. A resistência aos desinfetantes é bastante pequena. São inibidas em ph inferior a 6,8 ou superior a 8,0 e temperaturas inferiores a 10 C. No entanto, quando em condições favoráveis, sobrevivem na água e em cultura por longos períodos (FAINE et al., 2000). Solos, lama, coleções de água doce, rios (NELSON e COUTO, 2006), pântanos, órgãos e tecidos de animais vivos ou mortos são também citados como possíveis habitats para a espiroqueta. As espécies patogênicas podem sobreviver no ambiente, mas preferencialmente encontram-se no hospedeiro, onde se multiplicam (FAINE et al., 2000). As leptospiras saprófitas e patogênicas tendem naturalmente a formar agregados em coleções de água (TRUEBA et al., 2004; GANOZA et al., 2006) e são capazes de formar biofilmes in vitro (RISTOW et al., 2008). Agregados de leptospiras também são observados nos túbulos renais de ratos colonizados (ATHANAZIO et al., 2008) Taxonomia As leptospiras pertencem a Ordem Spirochaetales, a qual faz parte de um filo bacteriano único, Spirochaetes. A família Leptospiraceae compreende o gênero Leptospira sp, o qual é composto por bactérias saprófitas e patogênicas. A taxonomia e classificação das leptospiras são bastante complexas e vêm sofrendo diversas alterações ao longo dos últimos anos (PEROLAT et al., 1998; BRENNER et al., 1999; LEVETT et al., 2005). Até 1989 o gênero Leptospira sp era classificado de acordo com as características sorológicas, baseando-se na variabilidade do lipopolissacarídeo de parede, e de acordo com o fenótipo bacteriano; sendo dividido em dois grandes grupos, Leptospira biflexa sensu lato, contendo as leptospiras saprófitas ou ambientais e Leptospira interrogans sensu lato, contendo as leptospiras patogênicas (BARTHI et al., 2003). Diversos serovares foram identificados de acordo com a aglutinação sorológica que era observada (FAINE et al., 2000) e os que se relacionavam antigenicamente foram reunidos em sorogrupos, os quais não fazem parte da taxonomia, mas são indispensáveis à compreensão da epidemiologia e diagnóstico da doença. Sabe-se que existem mais de 250 serovares agrupados em 24

21 21 sorogrupos (LEVETT, 2001). A classificação fenotípica vem sendo substituída pela genotípica, baseada na hibridização DNA-DNA, a qual agrupou as leptospiras em diversas espécies genômicas, correspondendo então a grupos com DNA relacionado (LEVETT et al., 2005; MATTHIAS et al., 2008). Até o momento, foram identificadas 14 espécies e quatro genomoespecies (ainda não denominadas), com cepas contendo 70% ou mais de relação DNA-DNA (PEROLAT et al., 1998; BRENNER et al., 1999; LEVETT et al., 2005; MATTHIAS et al., 2008). Como a reclassificação do gênero manteve os nomes das espécies L. interrogans e L. biflexa, para evitar confusão na nomenclatura chama-se L. interrogans sensu lato e L. biflexa sensu lato quando se refere à antiga nomenclatura sorológica, e L. interrogans sensu strictu e L. biflexa sensu strictu quando se refere as genomoespécies (LEVETT, 2001). O maior problema da classificação genotípica é que muitas vezes um mesmo serovar pode representar mais de uma espécie genômica (BRENNER et al., 1999). A classificação molecular não é amplamente utilizada para a microbiologia clínica e a epidemiologia, sendo aceito referir-se às leptospiras pela classificação sorológica (BARTHI et al., 2003). 2.2 EPIDEMIOLOGIA A leptospirose é uma doença que acomete humanos e animais, tem distribuição mundial em áreas urbanas, silvestres e rurais e sua ocorrência está ligada a fatores ambientais e climáticos (FAINE et al., 2000; VASCONCELLOS, 2000; LEVETT, 2001; TORTORA, FUNKE e CASE, 2003; BATISTA, 2004), podendo manifestar-se em níveis endêmicos ou gerar surtos epidêmicos (VASCONCELLOS, 2000; BLAZIUS et al., 2005). Possui caráter sazonal descrito por diversos autores, estando diretamente relacionada a períodos chuvosos, quando há elevação do índice pluviométrico (JOUGLARD e BROD, 2000; BATISTA, 2004; BLAZIUS et al., 2005).

22 22 Os roedores são os principais reservatórios do agente, em especial do serovar Icterohaemorrhagiae, onde a ratazana de esgoto (Rattus norvegicus) tem papel fundamental na transmissão da doença no meio urbano (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2003). Há uma grande diversidade de reservatórios ou hospedeiros de manutenção de leptospiras, compreendendo animais silvestres e domésticos, como caninos, bovinos, suínos, caprinos, eqüinos e ovinos. Cada serovar tende a ser mantido por um hospedeiro animal específico, sendo então este serovar considerado adaptado à determinada espécie animal (FAINE et al., 2000). Nos reservatórios animais, estas infectam cronicamente os rins por diferentes serovares de Leptospira (LEVETT, 2001; ATHANAZIO et al., 2008). Assim, a transmissão da leptospirose ocorre pela eliminação de leptospiras na urina, havendo a contaminação da água e solo, constituindo assim o principal veículo de transmissão da doença (JOUGLARD e BROD, 2000; MCBRIDE et al., 2005). As leptospiras podem persistir no trato genital, sendo desta forma eliminadas pelo sêmen e secreções vaginais e, portanto transmitidas pela cópula ou inseminação artificial (FAINE et al., 2000). Acredita-se que as leptospiras sejam eliminadas em altas concentrações na urina de ratos, visto que foi demonstrado que ratos experimentalmente infectados eliminam até 10 7 bactérias/ml de urina (NALLY et al., 2005). O estado de portador renal dos hospedeiros de manutenção é um elemento chave na transmissão da leptospirose. As leptospiras naturalmente tendem a formar agregados na água, o que pode estar relacionado à sua manutenção no meio ambiente (TRUEBA et al., 2004). As vias de infecção clássicas da leptospirose são através do contato da bactéria com a pele lesada e mucosa. O conhecimento dos serovares e seus hospedeiros de manutenção são essenciais para a compreensão da epidemiologia da doença em uma dada região (LEVETT, 2001). Os animais que sobrevivem à fase aguda da leptospirose podem desenvolver a condição de portadores convalescentes, onde as leptospiras instalam-se e multiplicam-se nos túbulos renais e são eliminados para o meio ambiente por períodos variáveis. Imunoglobulinas específicas são normalmente achadas na urina (FAINE et al., 2000).

23 23 A enfermidade nos animais domésticos apresenta diversas manifestações clínicas, dependendo da espécie animal, do serovar infectante e do ambiente envolvido. Serovares adaptados tendem a causar doença crônica e por vezes subclínica nos hospedeiros de manutenção; enquanto que serovares não adaptados causam doença aguda e grave. Os eqüinos, além dos distúrbios reprodutivos, apresentam uveíte recorrente causada pela presença de leptospiras ou anticorpos específicos nas câmaras oculares, e que pode evoluir para a cegueira (HARTSKEERL et al., 2004; LÉON et al., 2006). 2.3 A LEPTOSPIROSE EM EQUINOS O primeiro caso de leptospirose em eqüinos foi publicado na Rússia em Na América do Norte tem sido reportada desde 1952 com casos de abortamento, ocorrência de natimortos, disfunção renal, disfunção hepática e oftalmia periódica. Desde então, casos similares foram reportados no mundo todo (LEES e GALE,1994). A leptospirose em equinos é uma importante enfermidade da esfera da reprodução, uma vez que determina o nascimento de crias fracas, natimortalidade ou mortalidade neonatal e abortamento (comumente no sexto mês de gestação), como seqüela comum após invasão sistêmica. O abortamento sem prévia doença clínica também é comum (LILENBAUM, 1998; RADOSTITS et al., 2002). Os equinos podem apresentar infecção subclínica e usualmente tem um curso brando, já nas infecções agudas e subagudas apresentam um distúrbio sistêmico transitório, com sinais de hipóxia, depressão e relutância em se mover (RADOSTITS et al., 2002). Os sorotipos Kennewicki e Pomona são os mais comumente reportados como agentes causadores de abortamentos, embora Bratislava, Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa, Hardjo e Canicola também tenham sido descritos. Estes ocorrem em idades gestacionais que variam entre 140 e 250 dias de gestação. Em alguns locais a leptospira pode ser considerada como a principal causadora de abortamento, onde as infecções fetoplacentárias são responsáveis por um terço dos natimortos e da morte perinatal que, em 75% dos casos, ocorrem em virtude de infecção bacteriana (RADOSTITS et al., 2002). A infecção por leptospiras tem sido confirmada como uma enfermidade da esfera da reprodução, causando abortamentos e natimortalidade em eqüinos

24 24 (DONAHUE et al., 1991; VASCONCELLOS, 2000). O abortamento relacionado a leptospirose é conseqüência da leptospiremia fetal, pela passagem das leptospiras através da placenta. Quando a infecção é por uma sorovariedade mantida pelos eqüinos, geralmente o abortamento ocorre no terço final da gestação e quando a sorovariedade envolvida é incidental, este pode ocorrer a qualquer momento da gestação (VASCONCELLOS, 2000). No Brasil, apesar do considerável plantel de cavalos, existem poucos estudos sobre a leptospirose em equinos. Evidências da infecção, caracterizadas pela identificação de aglutininas específicas anti-leptospiras em equinos, têm sido relatadas há mais de 50 anos (CORREA et al., 1955), com relatos esporádicos em diversos estados, como Minas Gerais (CORDEIRO et al., 1974), Rio Grande do Sul (PESCADOR et al., 2004) e no Rio de Janeiro (LILENBAUM, 1998; RAMOS et al., 2006). A maior parte dos estudos sorológicos realizados em equinos no Brasil registra a predominância de sororeatividade para Icterohaemorrhagiae, Pomona e Grippotyphosa, enquanto sororeatividade para Bratislava é mais raramente relatada (VASCONCELLOS, 2000; FAVERO et al., 2002; LANGONI et al., 2004; PINNA et al., 2007). Pouco tem sido descrito na literatura sobre o isolamento de leptospiras e seu papel na etiologia da doença em equinos. O diagnóstico definitivo da leptospirose é difícil e a maior parte dos laboratórios não buscam seu isolamento, pois a cultura do agente é difícil, pela sua fragilidade e longo período de incubação (DONAHUE et al., 1991). Ellis et al. (1983), durante um surto de abortamento em éguas, verificaram a infecção por leptospira em nove fetos. Foram examinados 22 fetos pelo método de imunofluorescência e cultura. Os sorogrupos isolados foram Australis, Pomona, Hebdomadis e Icterohaemorrhagiae. Yasuda et al. (1986) relataram o isolamento da Leptospira biflexa sorotipo Ranarum, pertencente ao grupo de leptospiras saprófitas, de um aborto equino. Hodgin et al. (1989), identificaram a leptospirose como causa de quatro abortamentos e uma morte neonatal em Louisiana, EUA. O diagnóstico foi baseado na visualização das leptospiras dos tecidos provenientes do rim, fígado e placenta.

25 25 Já Sebastian et al. (2005) descreveram um caso de inflamação do cordão umbilical associado à infecção por leptospira da placenta de potro prematuro da raça Thoroughbred. Os autores sugeriram que a primeira parte da placenta a ser afetada seria o cordão umbilical, e que se identifique a infecção por leptospiras a partir dele. Dhaliwal et al. (1997), em estudo para verificar o efeito da infecção por Leptospira interrogans serovar Hardjo na concentração de progesterona em novilhas, sugeriram que a infecção talvez tenha efeito direto na fertilização e/ou morte embrionária precoce. Eles verificaram que as novilhas infectadas apresentaram menor concentração de progesterona, que as novilhas não infectadas. A infecção por leptospira em equinos tem sido associada à uveítes recorrentes, febre, icterícia e mais frequentemente, abortamentos e outras desordens reprodutivas (ELLIS et al., 1983, VEMULAPALLI et al., 2005). Estudos sorológicos indicam que a infecção subclínica é muito comum em equinos, chegando a 70% dos casos (HODGIN et al., 1989). Ellis et al.(1983) em um estudo realizado na Irlanda do Norte, sugeriram que Bratislava talvez tenha se adaptado aos equinos, devido a grande prevalência de anticorpos contra Bratislava e o isolamento deste serovar dos rins de sete de 91 equinos adultos. Porém, os sintomas clínicos determinados pela infecção por esta sorovariedade ainda não estão esclarecidos. A sorovariedade Bratislava já foi descrita no Rio de Janeiro, mas sua correlação com casos clínicos ainda requer maiores estudos (LILENBAUM, 1998; PINNA et al., 2007). Na Irlanda, Egan e Yearsley (1986), ao examinarem 530 amostras de sangue de equinos de várias regiões do país, verificaram que os serovares predominantes foram Bratislava, Copenhageni e Pyrogenes. Segundo Kitson-piggot e Prescott (1987), o serovar Bratislava foi o mais prevalente durante um estudo sorológico realizado em Ontário, Canadá. Ainda no mesmo país, Lees et al. (1994), encontraram títulos de Icterohaemorrhagiae, Bratislava, Copenhageni e Autumnalis como as mais comuns. Na Argentina, Bordoy (1985) realizou um estudo sorológico em três províncias; de 561 eqüinos examinados, 321 (57,22%) foram reagentes, sendo que os serovares mais freqüentes foram Bratislava, Pomona, Tarassovi e Icterohaemorrhagiae.

26 26 Donahue et al. (1991), verificaram em Kentucky, EUA, durante a estação de monta de 1989, que a infecção por leptospira pôde ser demonstrada em 15 de 594 casos de abortamentos e natimortalidade. Isolou-se leptospiras a partir de dois casos, e identificou-se a sorovariedade Kennewicki. Um posterior estudo na mesma região avaliou a prevalência de abortamentos induzidos pela leptospira no período de três estações de monta ( ). Durante os três anos, 74 (3,3%) de abortamentos, foram causados pela leptospirose. Leptospiras foram isoladas de 45 (60,8%) dos 74 casos (DONAHUE et al., 1995). No Brasil, o primeiro trabalho sobre a infecção por leptospiras em equinos foi realizado por Corrêa et al., (1955). Os autores realizaram um inquérito sorológico em 118 equinos no estado de São Paulo e confirmaram a ocorrência de anticorpos específicos em cavalos no Brasil. Como resultado, registraram uma taxa de 16,9% de sororeatividade pela técnica de soroaglutinação microscópica com predominância dos serovares Australis, seguido de Icterohaemorrhagiae e Sejröe. Santa Rosa et al. (1968) pesquisaram soros de equinos abatidos em matadouro e equinos de corrida nas proximidades de São Paulo pela técnica de soroaglutinação microscópica. Foi considerado o título inicial de 200 como significativo para uma reação positiva. Dos 419 soros obtidos de equinos de matadouro, 37,9% tiveram reações positivas, sendo os serovares Pomona e Canicola os mais freqüentes, enquanto que em animais de corrida, dos 217 soros pesquisados, 6,9% estavam positivos, sendo Pomona (2,8%) e Icterohaemorrhagiae (2,3%) os mais encontrados. Foi ainda descrita correlação de Pomona e Icterohaemorrhagiae com a oftalmia periódica. Cordeiro et al. (1974) pesquisaram soros de 404 equinos de vários grupos, dentre eles, animais de sela e puro sangue inglês do Jockey Clube, nos municípios de Belo Horizonte, Vianópolis e Barbacena. Os autores consideraram positivas as reações com títulos iguais ou maiores que 100. Verificaram a ocorrência de 14,8% de animais reagentes, sendo Pomona o serovar mais encontrado em cavalos de sela (26,1%) e Bataviae em cavalos de corrida (26,9%). Giorgi et al. (1981) realizaram um inquérito sorológico da leptospirose em equinos puro-sangue de carreira na cidade de São Paulo. Foram encontradas 75 (4,5%) reações positivas com títulos iguais ou maiores que 200 pela da prova de

27 27 aglutinação microscópica, e os serovares mais freqüentes foram Icterohaemorrhagiae (41,3%) e Javanica (30,7%). Além disso, os autores conseguiram isolar pela primeira vez no Brasil o agente Leptospira interrogans, serovar Icterohaemorrhagiae de rins de um feto abortado. Pinheiro et al. (1985) pesquisaram amostras de soros de equinos e muares procedentes de Goiás, Minas Gerais, Mato Grosso do Sul, Paraná e São Paulo, utilizando prova de aglutinação microscópica. Foi encontrada uma freqüência de 10,5% de animais reagentes com títulos iguais ou superiores a 200. Os serovares predominantes foram Pomona, Javanica e Canicola. Abuchaim (1991) examinou soros de 420 equinos provenientes de nove municípios do Rio Grande do Sul por meio da prova de aglutinação microscópica. Constatou que 37,4% dos soros apresentaram títulos iguais ou maiores que 100. Os serovares mais encontrados foram Icterohaemorrhagiae e Pomona. Além disso, observou que 55,6% dos animais testados estavam clinicamente sadios, podendo ser importante fonte de contaminação para o homem e para outros animais. Pellegrin et al. (1994) realizaram sorologia em 150 equinos provenientes de dez fazendas localizadas no Pantanal. Todos os rebanhos foram considerados positivos e 139 (92,6%) dos soros testados reagiram com títulos iguais ou maiores que 100 para detecção de aglutininas anti-leptospiras. Os serovares mais observados foram Icterohaemorrhagiae e Hardjo. Segundo os autores, a evidência da infecção por Hardjo nos equinos pode acontecer por contato direto ou indireto com bovinos, visto serem estes os hospedeiros de manutenção deste sorotipo. Lilenbaum (1998) avaliou achados sorológicos em 547 éguas de seis rebanhos do Rio de Janeiro, durante o período de Encontrou 235 reações positivas com títulos iguais ou maiores que 100. Os serovares predominantes foram Icterohaemorrhagiae (43,4%), Bratislava (27,2%), Pomona (14,4%) e Hardjo (4,26%). O autor atribuiu a alta predominância de éguas positivas para Icterohaemorrhagiae à presença de roedores, pois esses são portadores sadios da doença e são, portanto fonte de contaminação dos equinos. Langoni et al. (2004) analisaram amostras de soros de equinos dos estados São Paulo, Goiás e Mato Grosso do Sul, desse total 754 (54%) estavam

28 28 positivos para um ou mais serovares com títulos iguais ou maiores que 100. Os serovares mais encontrados foram Icterohaemorrhagiae (37,0%), Castellonis (16,9%), Djasiman (6,1%), Copenhageni (4,5 %) e Hardjo (4,3%). Oliveira e Pires Neto (2004) realizaram um estudo no Rio Grande do Sul sobre o diagnóstico e a ocorrência da infecção por leptospiras em várias espécies, dentre elas a eqüina. Realizaram exames sorológicos, no período de 2000 a 2002 em 992 equinos, destes 727 (73,3%) foram positivos com títulos iguais ou superiores de 100, com predominância de Bratislava e Copenhageni. Em um estudo realizado por Linhares et al. (2005) na microrregião de Goiânia, entre os 16 serovares pesquisados, apenas cinco foram detectados, sendo que, dos 82 soros positivos, 68,4% reagiram para Icterohaemorrhagiae, 13,4% para Pomona, 8,5% para Wolffi, 6,1% para Hardjo e 3,6% para Canicola. A alta prevalência encontrada foi justificada pelos autores pelo manejo higiênico-sanitário deficiente. Pinna et al. (2007) avaliaram um rebanho com 148 éguas que apresentavam um nível elevado de abortamento (12%), morte embrionária (10%) e óbitos neonatais (8%). Foi realizado o teste de soroaglutinação microscópica (MAT) onde 87,8% foram sororeativos ao serovar Bratilslava, 7,3% ao serovar Icterohaemorrhagiae e 4,9% ao serovar Australis. Os animais sororeativos foram tratados com dihidroestreptomicina e vacinados. Após um ano, sororeatividade e ocorrência de abortamentos, morte embrionária e neonatal declinou. 2.4 PATOGENIA A patogenia da leptospirose é complexa e multifatorial. Equinos podem adquirir a doença pelo contato com a urina de roedores, cães, porcos, vacas e outros animais de fazenda. Evidências indicam que equinos podem excretar leptospiras viáveis na urina por 14 semanas ou mais. Uma vez na corrente sanguínea, as leptospiras se distribuem por todo o organismo do animal. A localização renal é a mais importante do ponto de vista epidemiológico, pois a urina passa a ser a principal via de eliminação dos microrganismos. A leptospirúria pode persistir por meses ou anos e os animais tornam-se fontes de infecção junto ao rebanho. Desta forma, a leptospirose deve ser encarada como doença coletiva, e

29 29 não apenas como moléstia individual, que frequentemente passa despercebida pelas dificuldades de diagnóstico verificadas a campo. A motilidade e morfologia das leptospiras favorecem a sua penetração através da pele lesada e mucosas íntegras. Após a infecção segue-se uma rápida disseminação da bactéria na corrente sanguínea do hospedeiro, ocorrendo multiplicação ou leptospiremia com duração média de três a 10 dias. Este período compreende a primeira fase da doença, não imune e com sintomatologia branda e inespecífica. Após esta fase, ocorre o desenvolvimento de anticorpos específicos pelo sistema imune e as leptospiras irão se concentrar nos órgãos alvo, como rins, fígado, pulmões e musculatura esquelética, provocando a sintomatologia clássica (FAINE et al., 2000). Uma vez a infecção instalada, pode haver a evolução para doença aguda em hospedeiros sensíveis, bem como o desenvolvimento de imunidade protetora e eliminação do microrganismo, ou desenvolvimento do estado de portador crônico (FAINE et al., 2000). Nos ratos, reservatórios de Icterohemorrhagiae, as leptospiras disseminam-se por todos os tecidos durante a primeira semana de infecção e depois são apenas encontradas nos rins (ATHANAZIO et al., 2008). Nos animais de produção acometidos, as leptospiras têm sido evidenciadas tanto na urina como no sêmen e em secreções vaginais, o que confirma não só a colonização dos túbulos renais como também dos órgãos da reprodução e das suas glândulas anexas (ELLIS, 1994; LILENBAUM et al., 2009). Sebastian (1994) verificou que na leptospirose a intensidade das lesões teciduais está intimamente relacionada à estirpe do serovar e a adaptabilidade do hospedeiro. Posteriormente, o mesmo grupo (SEBASTIAN et al., 2005) identificou a Leptospira como uma importante causa de abortamento infeccioso e natimortalidade em equinos. De acordo com Pescador et al. (2004), a placentite caracteriza-se por trombose, vasculite e infiltração de celular inflamatórias no estroma juntamente com hiperplasia adenomatosa cística e necrose de epitélio. 2.5 A ENFERMIDADE A leptospirose nos animais domésticos apresenta diversas manifestações clínicas, dependendo da espécie animal, do serovar infectante e do ambiente envolvidos. Serovares adaptados tendem a causar doença crônica e por vezes subclínica nos hospedeiros de manutenção, enquanto serovares não adaptados

30 30 causam doença aguda e grave. Os eqüinos, além dos distúrbios reprodutivos, apresentam uveíte recorrente (também conhecida como oftalmia periódica; cegueira da lua) causada pela presença de leptospiras ou anticorpos específicos nas câmaras oculares, e que pode evoluir para a cegueira (HARTSKEERL et al., 2004; BRAGA et al., 2010). De acordo com SAMAILLE (2001), a leptospirose eqüina pode ainda causar queda do desempenho esportivo. A presença do agente no interior do globo ocular causa uveíte, com envolvimento da úvea posterior (íris, corpo ciliar e coróide), córnea, retina e nervo óptico (HUNTER e HERR, 1994). Os sinais clínicos característicos são lacrimejamento aumentado, blefarospasmo, fotofobia em graus variados, miose e catarata em casos mais avançados (GELLAT, 2003). A infecção é considerada como importante causa de nascimento de crias fracas, natimortalidade ou mortalidade neonatal e abortamento (comumente no sexto mês de gestação), como seqüela comum após invasão sistêmica. O abortamento sem prévia doença clínica também é comum (RADOSTITS et al., 2002). Segundo Hong et al. (1993) e Hunter e Herr (1994) observam-se também a ocorrência de febre, icterícia e morte por nefrite intersticial. No estudo realizado por Williams (1968) que induziu a infecção com Pomona em equinos, observou-se febre durante três dias que ocorreu de três a 10 dias após exposição, inapetência, leve depressão, inconstantes graus de icterícia e leucocitose com neutrofilia. Na Argentina, Parma et al. (1985) inocularam nove eqüinos adultos com uma suspensão de uma mistura de leptospiras dos serovares Pomona, Tarassovi, Icterohaemorrhagiae, Wolffi e Hardjo. Oito animais apresentaram anticorpos contra os cinco sorotipos inoculados. A única alteração clínica observada foi opacidade da córnea na terceira semana pós-inoculação. Já Van den Ingh et al. (1989) observaram desconforto respiratório grave, depressão e febre em doze potros de quatro a 12 semanas de idade. Outros sinais incluíam icterícia em um potro, marcha instável em outro potro e diarréia em dois potros. A doença foi rapidamente fatal e em todos os potros foi encontrada pneumonia hemorrágica na necrópsia. Foi isolado a partir do sangue Leptospira interrogans serovar Iora (do sorogrupo Australis) em um dos potros.

31 PROFILAXIA, CONTROLE E TRATAMENTO A profilaxia e controle da leptospirose em equinos dependem primariamente de um método de diagnóstico em que se procure identificar na propriedade qual a sorovariedade predominante e quais os mecanismos de transmissão envolvidos. No caso de infecções incidentais determinadas por sorovariedades que não são mantidas pelos equinos, deve-se identificar de que forma o rebanho está sendo exposto aos reservatórios naturais destas variedades, como suínos, ratos e animais silvestres. Somente por meio de medidas de higiene e da tecnificação da criação pode-se controlar a leptospirose no plantel. No entanto, quando a infecção for determinada por amostras mantidas pelos equinos, seu controle se torna mais complexo, uma vez que a principal forma de transmissão neste rebanho está entre os próprios equinos. O controle da infecção leptospírica pode ser realizado de duas formas principais: aquele que objetiva a completa erradicação do agente no plantel, baseada na progressiva identificação e tratamento de portadores; e aquela que se propõe a controlar seus efeitos sobre os animais, baseada na vacinação dos animais e uso esporádico de antibióticos (FAINE et al., 2000). Em ambas as situações, variáveis ambientais características de países tropicais muitas vezes não são devidamente levadas em conta. Poucos são os programas de controle de leptospirose que enfatizam a adoção do controle ambiental associado a tradicional combinação de vacinação e antibioticoterapia. No entanto, sabe-se que manejo e ambiente influenciam na transmissão da infecção em diversas espécies, tais como em suínos (BOQVIST et al., 2002; RAMOS e LILENBAUM, 2002), bovinos (ALONSO-ANDICOBERRY et al., 2001; LILENBAUM e SOUZA, 2003) e caprinos (LILENBAUM et al., 2008). Em todos estes estudos, apesar de conduzidos com diferentes espécies e consequentemente com outros serovares de leptospiras, observou-se que tais fatores interferem de forma marcante na distribuição da infecção leptospírica entre os rebanhos e mesmo entre os animais do mesmo rebanho. De acordo com Vasconcellos (2000), do ponto de vista preventivo uma das medidas a serem tomadas é a utilização racional de antibióticos que bloqueiem a

32 32 eliminação de leptospiras através da urina, sêmen e secreção vaginal. A estreptomicina aplicada por via parenteral, usualmente na concentração de 25 mg/kg de peso vivo, têm sido a medicação de escolha. Radostits (2002) ainda menciona a possibilidade de tratar animais infectados por serovar de manutenção com diidroestreptomicina G (25 mg/kg), durante um, três ou cinco dias. Os esquemas de tratamento precisam ser revistos, incluindo a hipótese de emprego integrado de tratamento e imunização (VASCONCELLOS, 2000). A imunidade na leptospirose eqüina é baseada na resposta humoral. As vacinas são importantes na redução da transmissão e manutenção da leptospirose (HEATH e JOHNSON, 1994) e as atualmente utilizadas são serovar-específicas. Assim, a vacinação contra um determinado serovar nem sempre fornece proteção cruzada contra outros serovares, mas pode interferir na reação de aglutinação microscópica (HAGIWARA, 2003). São compostas de bacterinas (bactérias inteiras inativadas quimicamente) e induzem a imunidade pela opsonização das bactérias, resultando na apresentação de antígenos de membrana - lipopolissacarídeos e proteínas da membrana externa. Elas reduzem a gravidade da doença e a sua prevalência, mas não impedem o desenvolvimento de estado de portador crônico nos animais, porque nem sempre previnem a instalação das leptospiras no tecido renal (GREENE, 2004). Não há um completo entendimento sobre o mecanismo de imunidade protetora das vacinas. O LPS parece conferir uma parte da imunidade humoral protetora (FAINE et al., 2000; LEVETT, 2001), havendo também a participação da resposta celular (NAIMAN et al., 2001). Acredita-se, no entanto, que a vacina não é capaz de prevenir a leptospirúria (BOLIN e ALT, 2001), assim como não é capaz de proteger em casos de grande exposição à bactéria (ANDRÉ-FONTAINE et al., 2003). Um dos desafios da pesquisa atual em leptospirose é identificar frações ou subunidades bacterianas conservados, que confiram imunidade protetora de longa duração e imunidade cruzada contra diversos serovares de leptospiras. Proteínas de membrana externa ou Omps e lipoproteínas têm sido consideradas candidatos interessantes para o desenvolvimento de novas vacinas (BRANGER et al., 2001; GAMBERINI et al., 2005; YANG et al., 2006; SEIXAS et al., 2007; SILVA et al., 2007).