RENATO GUIMARÃES VARGES

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA CURSO DE DOUTORADO EM MEDICINA VETERINÁRIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL RENATO GUIMARÃES VARGES CORREÇÃO DE FATORES DE MANEJO COMO FERRAMENTA COMPLEMENTAR AO CONTROLE DA LEPTOSPIROSE EM UM REBANHO BOVINO NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, BRASIL NITERÓI 2009

2 RENATO GUIMARÃES VARGES CORREÇÃO DE FATORES DE MANEJO COMO FERRAMENTA COMPLEMENTAR AO CONTROLE DA LEPTOSPIROSE EM UM REBANHO BOVINO NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, BRASIL Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal. Orientador: Prof. Dr. WALTER LILENBAUM NITERÓI 2009

3 V297 Varges, Renato Guimarães Correção de fatores de manejo como ferramenta complementar ao controle da leptospirose em um rebanho bovino no estado do Rio de Janeiro/Renato Guimarães Varges; orientador Walter Lilenbaum f. Tese(Doutorado em Clínica e Reprodução Animal) Universidade Federal Fluminense, Orientador: Walter Lilenbaum 1. Doenças do bovino. 2. Leptospirose em animal. 3. Controle de doença transmissível. I. Título. CDD

4 RENATO GUIMARÃES VARGES CORREÇÃO DE FATORES DE MANEJO COMO FERRAMENTA COMPLEMENTAR AO CONTROLE DA LEPTOSPIROSE EM UM REBANHO BOVINO NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, BRASIL Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal. Aprovada em de de BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. WALTER LILENBAUM - Orientador Universidade Federal Fluminense Prof. Dr. GUILHERME NUNES DE SOUZA Empresa Brasileira de Pesquisa e Agropecuária Profª. DRA RACHEL FERREIRA Laboratório Nacional Agropecuário Profª DRA RITA LEAL PAIXÃO Universidade Federal Fluminense Prof. Dr. ALOYSIO DE MELLO FIGUEIREDO CERQUEIRA Universidade Federal Fluminense NITERÓI 2009

5 Aquele que perscruta os corações sabe o que deseja o Espírito, que intercede pelos seus santos, segundo Deus. Aliás, sabemos que todas as coisas concorrem para o bem daqueles que amam a Deus, daqueles que são eleitos segundo seus desígnios. Os que Ele distinguiu de antemão, também os predestinou para serem conformes à imagem de seu Filho. E aos que predestinou, também os chamou; a aos que chamou, também os justificou; e aos que justificou, também os glorificou. Que diremos depois disso? Se Deus é por nós, quem será contra nós? Aquele que não poupou seu próprio Filho, mas que por todos nós o entregou, como não nos dará também com Ele todas as coisas? Quem poderia acusar os escolhidos de Deus? É Deus quem os justifica. Quem os condenará?é Cristo ressuscitado que intercede por nós! Quem nos separará do amor de Cristo?A tribulação? A angústia? A perseguição? A fome? A nudez? O perigo?a espada? Em todas as coisas somos mais que vencedores em virtude Daquele que nos amou primeiro. (Romanos 8, 27-37)

6 Aqueles que mais amo. Em memória ao meu amado pai, que há exatamente um ano nos deixou. Papai que com sua incomparável simplicidade nunca me deixou faltar as coisas mais essenciais da vida: fé, amor, escuta, carinho, amizade, atenção e participação nas minhas decisões mais importantes. Que descanse eternamente na Paz Daquele que você tanto amou neste mundo! À Luciana, minha amada esposa, que com sua oferta diária de amor, sua presença cheia de fé e alegria tanto me inspira e anima. Eu te amo! À Teresa, que com sorriso incansável e delicadeza inspiradora me diverte e renova em meu coração a alegria de ser pai. Eu te amo! À mamãe, por todos os sacrifícios feitos e pelo exemplo de força e dedicação que sempre encontrei em você, seu espírito vencedor e empreendedor muito me estimula. À vovó, que incansavelmente se dedica ao ofício de amar com doçura, pureza e gratuidade. Sua vida é um exemplo! À Dani, mais que irmã, uma eterna amiga que amo muito, muito, muito profundamente! Ao meu amado vovô, pelas inúmeras lições de família, clínica e vida. Dedico tudo que faço a você, um exemplo de determinação, fibra, sacrifício e simplicidade. Você é o melhor veterinário do mundo! Finalmente, a duas pessoas que amo muito intensamente e não estão entre nós, minha bisavó Calixta, a quem já não posso mais beijar e sei que muito intercede por mim junto a Deus e a outra que ainda não posso beijar diretamente, mas beijo incansavelmente sobre a barriga da Luciana, sem ao menos saber qual será teu nome. Papai te ama!

7 AGRADECIMENTOS A Deus pela gratuidade e primazia de seu amor, Ao Prof. Dr. Walter Lilenbaum, por sua incansável labuta científica, pelas orientações científicas e pessoais, pelos ensinamentos, pela ajuda, pela compreensão, pela atenção, pela confiança...por tudo! À toda equipe de amigos do Laboratório de Bacteriologia Veterinária da UFF, Bruno Penna, Luciana Medeiros, Luciana Fonseca, Carla Dray, Gabriel Martins, Sabrina Thomé, Claudius Cabral (pela valiosa contribuição na formatação deste trabalho), Bernardo Figueiredo, Rodrigo Martins, Willian Renato da Silva Mendes Aline Pinna, Camila Hamond, Melissa Pinna (pelas contribuições na qualificação deste trabalho), Lais Falcão, Eliane Fernandes, Paulina e Valdeci, pelo maravilhoso e enriquecedor convívio. Vocês são fantásticos! Ao Paulo Marcio de Bragança Teixeira, proprietário da fazenda Santa Lúcia e ao Dr. Marcelo Fabricante, veterinário assistente, que tanto contribuíram com a colheita de dados deste estudo. À Prof. Drª Rita Leal Paixão e ao Prof Dr. Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira pelas valiosas contribuições dadas na etapa de qualificação deste trabalho e pela alegria de tê-los na banca de defesa desta tese. ii

8 À Prof Dra Rachel Ferreira e ao Prof Dr. Guilherme Nunes de Souza por prontamente aceitarem participar da banca de defesa desta tese, Aos meus queridos alunos, que tanto contribuem para minha paixão pela docência, À FAPERJ, CAPES e TECNORTE pelo apoio financeiro, À Prof.ª Ana Ferreira, nossa querida coordenadora do programa de Pós Graduação por todo apoio que me deu desde o início deste curso, À Profª Helena Lopes pelo incentivo e pelo apoio, Aos meus queridos irmãos da Comunidade Católica Shalom, pelos intensos momentos de fraternidade e alegria passamos. Deus os abençoe! À minha família, por tudo que representam para mim! A todos que de alguma forma ajudaram neste trabalho. ii

9 RESUMO A leptospirose é uma doença infecto-contagiosa que acomete os bovinos determinando perdas reprodutivas. O presente estudo objetivou identificar fatores de manejo e ambientais associados à ocorrência da leptospirose em um rebanho bovino localizado no estado do Rio de Janeiro e avaliar a adoção de medidas complementares visando aperfeiçoar o protocolo atualmente preconizado para o controle desta enfermidade em bovinos mantidos em clima tropical. Estudou-se sorologicamente para leptospirose um rebanho com 432 bovinos, sendo 206 de aptidão leiteira e 226 de corte. Dentre estes, 94 animais (21,8%) apresentavam falhas reprodutivas, sendo 54 (57,4%) destes no gado leiteiro e 40 (42,6%) no gado de corte. No primeiro momento do estudo (maio de 2007), verificou-se soroprevalência de 46,2%, sendo reativos 49,5% dos animais de exploração leiteira e 36,3% dos de corte, com forte predominância do serovar Hardjo (88%). Aplicou-se o programa tradicional de controle da leptospirose, baseado em antibioticoterapia e vacinação. Após 13 meses (junho de 2008) o rebanho foi reavaliado em seus parâmetros reprodutivos e sorológicos, e observou-se redução na sororeatividade para 25% e nas falhas reprodutivas para 14,3%. Apesar do sucesso nos animais de corte, o gado leiteiro ainda apresentava níveis inaceitáveis de falhas reprodutivas e de sororeatividade. Determinou-se os fatores associados à infecção na propriedade e no manejo dos animais, como acesso a áreas alagadas e higiene na ordenha, que acometiam exclusivamente os animais leiteiros, que foram então corrigidos. Seis meses após tais correções (dezembro de 2008) os índices de sororeatividade foram reduzidos a 3% no gado leiteiro e zero nos de corte, enquanto as falhas reprodutivas foram reduzidas a 4,8% e 3,5%, respectivamente. Concluiu-se que o programa tradicionalmente recomendado para o controle da leptospirose é capaz de reduzir a soroprevalência do rebanho e os índices de falhas reprodutivas. No entanto, em rebanhos infectados pelo serovar Hardjo e mantidos sob condições tropicais, tal programa pode ser insuficiente para eliminar a doença do rebanho e manter as falhas reprodutivas em níveis aceitáveis. Desta forma, mudanças no manejo dos animais e na estrutura física da propriedade podem aperfeiçoar o controle da leptospirose, permitindo seu sucesso nestas regiões. Palavras chave: Leptospirose, Bovinos, Hardjo, Controle, trópicos.

10 ABSTRACT Leptospirosis is an infectious and contagious disease that affects cattle determining reproductive losses. This study aimed to identify management and environmental factors associated with the occurrence of leptospirosis in a cattle herd located in the state of Rio de Janeiro and evaluate the adoption of additional measures to improve the currently recommended protocol for controlling this disease in cattle kept in tropical climate. A 432 cattle herd (206 dairy and 226 beef) was serologically studied for leptospirosis. Among these, 94 animals (21.8%) had reproductive failure, being 54 (57.4%) dairy cattle and 40 (42.6%) beef cattle. In the first moment of the study (May 2007), there was seroprevalence of 46.2%, being reactive 49.5% of the dairy animals and 36.3% of the beef, with clear predominance of Hardjo serovar (88%). It was applied the traditional leptospirosis control program, based on antibiotics and vaccination. After 13 months (June 2008) the herd was reassessed on its reproductive and serological parameters, and it was observed a reduction in sororeatictivity to 25% and in reproductive failures to14.3%. Despite the success reached with the beef herd, the dairy cattle still had unacceptable levels of reproductive failure and sororeactivity. It was determined the factors associated with the infection in the property and in the animal s management, such as access to flooded areas and hygiene in the milking, which affects only the dairy cows, that were then corrected. Six months after such corrections (December 2008) the sororeactivity rates were reduced to 3% in dairy cattle and zero in the beef, while the reproductive failures have been reduced to 4.8% and 3.5% respectively. It was concluded that the program traditionally recommended for leptospirosis control is able to reduce the herd seroprevalence and the rate of reproductive failure. However, in herds infected with Hardjo serovar and kept under tropical conditions, this program may be insufficient to eliminate the disease from the herd and maintain acceptable levels in reproductive failures. Thus, changes in the management of animals and in the physical structure of the property can improve the control of leptospirosis, allowing their success in these regions. Key words: Leptospirosis, Bovine, Hardjo, Control, Tropics.

11 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Quadro 1 Lista de alguns serovares, sorogrupos, espécie e hospedeiro de manutenção de Leptospira sp. (Adaptado de Faine et al. 2000) f.19 Figura 01 Comparação da soroprevalência de anticorpos anti-leptospira no rebanho e quanto ao tipo de exploração dos animais no 1º e 2º momentos do estudo f.53 Figura 02 Comparação da ocorrência de transtornos reprodutivos do gado leiteiro entre o 1º e 2º momentos do estudo f.58 Figura 03 Comparação da ocorrência de transtornos reprodutivos do gado de corte entre o 1º e 2º momentos do estudo f.58 Figura 04 Animal na sala de ordenha da propriedade, onde pode-se observar a formação de poças de urina no chão f.60 Figura 05. Animais se banhando em alagadiços presentes na propriedade f.61 Figura 6. Figura 6. Comparação da soroprevalência de anticorpos anti-leptospira entre os animais de exploração leiteira e de corte nos três momentos do estudo f.63 Figura 7. Comparação do percentual de falhas reprodutivas nos animais de exploração leiteira e de corte nos três momentos do estudo f.64

12 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Amostras de leptospiras utilizadas como antígenos para o diagnóstico sorológico de leptospirose em bovinos f.44 Tabela 2. Soroprevalência de anticorpos anti-leptospira em animais de exploração leiteira e de corte no primeiro momento (maio 2007) do estudo de um rebanho bovino no estado do Rio de Janeiro f.49 Tabela 3. Distribuição de serovares de Leptospira no primeiro momento (maio 2007) do estudo de um rebanho bovino no estado do Rio de Janeiro f.50 Tabela 4. Soroprevalência de anticorpos anti-leptospira em animais de exploração leiteira e de corte no segundo momento (junho 2008) do estudo de um rebanho bovino no estado do Rio de Janeiro f.52 Tabela 5. Distribuição de serovares de Leptospira no segundo momento (junho 2008) do estudo de um rebanho bovino no estado do Rio de Janeiro f.54 Tabela 6. Comparação dos problemas reprodutivos observados no rebanho bovino estudado entre o 1º e 2º momentos do estudo f.57

13 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO f REVISÃO DE LITERATURA f CARACTERÍSTICAS GERAIS DA LEPTOSPIROSE f Histórico f O agente f Epidemiologia da Leptospirose f A INFECÇÃO NOS BOVINOS f Ocorrência do serovar Hardjo f A enfermidade em bovinos f Patogenia f Profilaxia e Controle da leptospirose em bovinos f.33 3 OBJETIVOS f OBJETIVO GERAL f OBJETIVOS ESPECÍFICOS f MATERIAL E MÉTODOS f DESENHO DO ESTUDO f CARACTERIZAÇÃO DO REBANHO f ANÁLISE DA PROPRIEDADE E DO MANEJO DOS ANIMAIS f ANÁLISE DOS PARÂMETROS REPRODUTIVOS f ANÁLISE SOROLÓGICA f ANTIBIOTICOTERAPIA E VACINAÇÃO f ANÁLISE ESTATÍSTICA f RESULTADOS f ANÁLISE SOROLÓGICA f.48

14 5.2 ANÁLISE DOS PARÂMETROS REPRODUTIVOS f ANÁLISE DA PROPRIEDADE E MANEJO DOS ANIMAIS f ANÁLISE FINAL DO REBANHO f DISCUSSÃO f CONCLUSÕES f REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS f.73 ANEXOS f.84

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16 1 INTRODUÇÃO A leptospirose é uma doença infecciosa determinada pelos diferentes serovares da espiroqueta Leptospira sp. e pode acometer diversas espécies de animais, inclusive os bovinos. O microrganismo está presente na água, solo e reservatórios animais de zonas urbanas e rurais. Os animais infectados podem desenvolver o estado de portadores crônicos renais e tornarem-se reservatórios, eliminando leptospiras viáveis na urina por tempo variável. A leptospirose nos bovinos está amplamente distribuída em nosso meio, gerando grandes perdas econômicas para os produtores por estar diretamente ligada a problemas reprodutivos, tais como abortamentos, mumificação de fetos e ocorrência de natimortos, além de diminuição na produção de leite e no ganho de peso dos animais. Em 1984, Ellis analisou a patogênese e controle da leptospirose em bovinos em países de clima tropical e a dividiu etiologicamente em dois grandes grupos: uma doença determinada por serovares adaptados aos bovinos, como Hardjo, e outra determinada por serovares incidentais, mantidos por outras espécies domésticas ou silvestres que também atuam como reservatórios de Leptospira sp. para os rebanhos, principalmente em regiões de clima tropical. A transmissão e a manutenção da leptospirose em um rebanho bovino dependem de condições favoráveis para a sobrevivência do agente no meio, do número de portadores animais na população, do tempo em que esses animais permanecem como reservatórios de leptospiras e do grau de contato entre hospedeiros naturais e hospedeiros incidentais. Estas condições estão diretamente ligadas às características de manejo de cada rebanho e ao sistema de criação dos

17 15 animais, estando associados a variados fatores de risco relacionados à ocorrência da leptospirose. Alguns importantes fatores de risco associados à transmissão e manutenção da leptospirose em bovinos foram estudados por Lilenbaum e Santos (1996) e Lilenbaum e Souza (2003), tais como região geográfica, sistema de criação, medidas de manejo, assistência veterinária e grau de tecnificação da propriedade. Estes estudos revelaram que, independentemente da região geográfica estudada, em propriedades altamente tecnificadas predomina a infecção determinada por amostras adaptadas, visto que os mecanismos de transmissão de amostras incidentais seriam eliminados pela tecnificação. Já a leptospirose determinada por serovares incidentais está estreitamente relacionada à transmissão indireta, que ocorre quando um bovino entra em contato com leptospiras presentes no meio ambiente contaminado com urina de animais portadores. Por isso, o baixo índice de tecnificação das propriedades e as criações mistas de bovinos com outras espécies são fatores que favorecem a ocorrência deste tipo de infecção. Infecções determinadas por Hardjo apresentam características epidemiológicas bem definidas, pois sendo este serovar adaptado e mantido pelos bovinos, os próprios animais atuam como reservatórios permanentes do agente no rebanho, perpetuando a infecção no rebanho independentemente do contato direto ou indireto com outras espécies. Logo, este tipo de leptospirose é menos dependente do sistema de criação, da região geográfica e de fatores ambientais. O controle da leptospirose em bovinos está associado a diversos fatores ligados ao hospedeiro, ao agente e ao ambiente, que estarão sempre interferindo na ocorrência e no controle da enfermidade num rebanho. Protocolos de controle baseados em vacinação e antibioticoterapia foram descritos (MOREIRA, 1994), mas seus resultados são bastante variáveis, sendo muitas vezes desapontadores. A adoção de mudanças no sistema de manejo que, associadas à vacinação e antibioticoterapia, visem a minimizar os fatores de risco associados à transmissão da leptospirose em cada rebanho, podem contribuir para aumentar a taxa de sucesso nos programas de controle. Portanto, rebanhos bovinos com leptospirose devem ser minuciosamente avaliados a fim de se determinar qual o serovar envolvido na infecção, e se este é adaptado ou incidental. A partir de tais informações, considerando-se as particularidades de cada rebanho e de seu manejo, além de fatores ambientais,

18 16 deve-se estabelecer um programa de controle específico que atue minimizando os fatores de risco ligados à infecção, associando tais medidas complementares ás já consagradas antibioticoterapia e vacinação.

19 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1CARACTERÍSTICAS GERAIS DA LEPTOSPIROSE Histórico A leptospirose é uma doença infecto-contagiosa que acomete os animais domésticos, silvestres e os seres humanos sendo, portanto, classificada como uma zoonose. Esta enfermidade vem assumindo grande importância, tanto nos países em desenvolvimento quanto nos desenvolvidos, afetando a saúde animal, a economia de produção e a saúde pública (GENOVEZ et al. 2003). Em 1907, Stimson observou pela primeira vez as leptospiras em cortes histológicos de rins corados pela prata de um paciente com diagnóstico de febre amarela. As leptospiras formavam agregados nos rins e individualmente apresentavam forma de ponto de interrogação, sendo por isso denominadas como Spirochaeta interrogans. Vinte e um anos antes, em 1886, o médico alemão Adolf Weil descreveria pela primeira vez a leptospirose, como uma doença infecciosa que causa esplenomegalia, nefrite e icterícia ; e assim a forma grave da doença em humanos foi denominada Doença de Weil. O primeiro isolamento de leptospiras patogênicas foi feito por Inada e colaboradores, em 1916, no Japão, que tambémrealizaram estudos clássicos de infecção experimental, comprovando os Postulados de Koch, a proteção passiva em cobaios, distribuição da bactéria nos tecidos, características morfológicas das leptospiras, bem como o papel da ratazana como reservatório (FAINE et al., 2000).

20 18 A leptospirose humana é historicamente uma doença ocupacional. Na China, foi denominada icterícia dos plantadores de arroz. Em outras partes do mundo, como Austrália e Europa, esta foi denominada doença dos cortadores de cana, doença dos criadores de suínos e doença dos trabalhadores de esgoto. No Japão a doença era conhecida como febre outonal. Há relatos de leptospirose na França e Alemanha durante a Primeira Guerra Mundial. Nos anos de , diversas formas clínicas da leptospirose em humanos foram observadas. Nesta mesma época evidenciou-se também a importância da doença nos animais domésticos (LEVETT, 2001). Com o passar dos anos, diversas variantes de Leptospira sp. foram isoladas de pacientes humanos determinando variadas síndromes, que aos poucos foram sendo reconhecidas como diferentes manifestações clinicas da leptospirose. Além disso, muitas amostras foram identificadas em diferentes reservatórios animais. Os primeiros relatos publicados identificando novas amostras de Leptospira sp. e seus respectivos reservatórios animais foram de pesquisadores japoneses e alemães nas décadas de 20 e 30 (FAINE et al. 2000). Nesta mesma época a leptospirose foi caracterizada como uma enfermidade primariamente relacionada aos cães, causada pelos serovares Canicola e Icterohaemorrhagiae. No entanto, somente nas décadas de 30 e 40 a leptospirose foi reconhecida como uma doença de relativa importância na medicina veterinária, quando os primeiros relatos da enfermidade foram feitos em bovinos na Rússia, relacionando a doença à queda na produção dos animais (SEMSKOV, 1940). Em 1939, uma ampla relação de serovares e seus relativos hospedeiros foi publicada (Walch-Sorgdrager, 1939) e em 1958 Alston e Broom complementaram esta listagem acrescentando outros serovares. O conhecimento sobre a leptospirose em animais domésticos foi bastante enriquecido pelos relatos de Morse e colaboradores (1957) e Morter e colaboradores (1958). Na década de 80, Ellis e seus colaboradores (1981;1983;1984;1985;1986) demonstraram o papel da glândula mamária e do trato genital na transmissão da leptospirose e atestaram sua grande importância na medicina veterinária. Kmety e Dikken (1988) publicaram um documento com histórico cronológico e bibliográfico completo da identificação dos serovares de Leptospiras sp. O quadro 1 apresenta os principais sorogrupos e serovares de Leptospira sp. e seus respectivos hospedeiros de manutenção.

21 19 Quadro 1 Lista de alguns serovares, sorogrupos, espécie e hospedeiro de manutenção de Leptospira sp. (Adaptado de Faine et al. 2000) Serovar Sorogroupo Espécie Hospedeiro Hardjo (hardjobovis) Sejroe L. borgpetersenii Bovinos Hardjo (hardjoprajitno) Sejroe L. interrogans Bovinos Copenhageni Icterohaemorrhagiae L. interrogans Roedores Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae L. interrogans Ratazana Pomona Pomona L. interrogans Suínos Canicola Canicola L. interrogans Caninos

22 O agente A palavra leptospira deriva do grego e traduz-se leptós - fino, pequeno, delicado e speira, espiral. São bactérias helicoidais de 6 a 20 µm de comprimento e 0,1 µm de diâmetro (LEVETT, 2001), filamentosas, delgadas, podendo apresentar uma ou ambas as extremidades curvadas em formato de gancho (LEVETT, 2001; TORTORA, FUNKE e CASE, 2003). Nestas extremidades, as leptospiras, que são espiroquetas, possuem dois flagelos polares conhecidos como filamentos axiais ou flagelos periplasmáticos, que lhes garantem alta motilidade (FAINE et al., 2000; LEVETT, 2001; BARTHI et al., 2003). Assim, podem realizar movimentos de rotação e translação ao longo do seu eixo, em linha reta ou em círculos (TORTORA et al., 2003). O lipopolissacarídeo que compõe a membrana externa das leptospiras se assemelha com o das bactérias Gram-negativas, porém possui menor atividade endotóxica (SHIMIZU et al., 1987). Estas espiroquetas não se coram pelos métodos usuais de coloração, sendo visualizadas apenas em microscopia de campo escuro ou em microscopia de campo claro de contraste de fase, ou ainda, em preparações impregnadas pela prata (FAINE et al., 2000). Condições aeróbicas são essenciais e determinam seu crescimento (LEVETT, 2001; TORTORA et al., 2003). Vale salientar que uma concentração ainda indefinida de CO 2 é indispensável para o início do crescimento acima citado. Desenvolvem-se em temperatura ótima de 28 a 30ºC e ph 7,2 a 7,6 (FAINE et al., 2000). Demandam meios especiais de cultivo, não crescendo na ausência de albumina (opta-se geralmente pela bovina a qual se acrescenta 1% ao meio) ou soro (sendo mais utilizado o de coelho na proporção de 10%), sendo que vitaminas B1, B12, fosfato, cálcio, magnésio, amônia e ferro são nutrientes essenciais para o seu desenvolvimento (FAINE et al., 2000; LEVETT, 2001). A sua principal fonte de energia são os ácidos graxos de cadeia longa. O meio de cultura mais utilizado para o seu cultivo é o meio líquido de Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH), que contém ácido oléico, soroalbumina bovina como detoxificante e tween 80 como fonte de carbono (ELLINGHAUSEN e MCCULLOUGH, 1965; JOHNSON e HARRIS, 1967). As leptospiras patogênicas possuem longo tempo de geração, variando de 8 a 18 horas. O crescimento em meio de cultura pode variar de dois a 30 dias (FAINE

23 21 et al., 2000), podendo levar até 26 semanas em isolamentos primários (ELLIS et al., 1983). As bactérias do gênero Leptospira sp são pouco resistentes, sendo rapidamente eliminadas pela desidratação e temperatura entre C. A resistência aos desinfetantes é bastante pequena. São inibidas em ph inferior a 6,8 ou superior a 8,0 e temperaturas inferiores a 10 C. No entanto, quando em condições favoráveis, sobrevivem na água e em cultura por longos períodos (TRUEBA et al., 2004). Solos, lama, coleções de água doce, rios (NELSON e COUTO, 2006), pântanos, órgãos e tecidos de animais vivos ou mortos são também citados como possíveis habitats para a espiroqueta. As espécies patogênicas podem sobreviver no ambiente, mas preferencialmente encontram-se no hospedeiro, onde se multiplicam (FAINE et al., 2000). As leptospiras saprófitas e patogênicas tendem naturalmente a formar agregados em coleções de água (TRUEBA et al., 2004; GANOZA et al., 2006) e são capazes de formar biofilmes in vitro (RISTOW et al., 2008). Agregados de leptospiras também são observados nos túbulos renais de ratos colonizados (ATHANAZIO et al., 2008). As leptospiras pertencem a Ordem Spirochaetales, a qual faz parte de um filo bacteriano único, Spirochaetes. A família Leptospiraceae compreende o gênero Leptospira sp, o qual é composto por bactérias saprófitas e patogênicas. A taxonomia e classificação das leptospiras são bastante complexas e vêm sofrendo diversas alterações ao longo dos últimos anos (PEROLAT et al., 1998; BRENNER et al., 1999; LEVETT et al., 2001). Até 1989 o gênero Leptospira sp era classificado de acordo com a sorologia, baseando-se na variabilidade do lipopolissacarídeo de parede, e de acordo com o fenótipo bacteriano; sendo dividido em dois grandes grupos, Leptospira biflexa sensu lato, contendo as leptospiras saprófitas ou ambientais e Leptospira interrogans sensu lato, contendo as leptospiras patogênicas (BHARTI et al., 2003). Diversos serovares foram identificados de acordo com a aglutinação sorológica que era observada (FAINE et al., 2000) e os que se relacionavam antigenicamente foram reunidos em sorogrupos, os quais não fazem parte da taxonomia, mas são indispensáveis à compreensão da epidemiologia e diagnóstico da doença. Sabe-se que existem mais de 250 serovares agrupados em 24 sorogrupos (LEVETT, 2001).

24 22 A classificação fenotípica vem sendo substituída pela genotípica, baseada na hibridização DNA-DNA, a qual agrupou as leptospiras em diversas espécies genômicas, correspondendo então a grupos com DNA relacionado (LEVETT et al., 2001; MATTHIAS et al., 2008). Até o momento, foram identificadas 14 espécies e quatro genomospecies (ainda não denominadas), com cepas contendo 70% ou mais de relação DNA-DNA (PEROLAT et al., 1998; BRENNER et al., 1999; LEVETT et al., 2005; MATTHIAS et al., 2008). Como a reclassificação do gênero manteve os nomes das espécies L. interrogans e L. biflexa, para evitar confusão na nomenclatura chama-se L. interrogans sensu lato e L. biflexa sensu lato quando se refere à antiga nomenclatura sorológica, e L. interrogans sensu strictu e L. biflexa sensu strictu quando se refere às genomoespécies (LEVETT, 2001). O maior problema da classificação genotípica é que muitas vezes um mesmo serovar pode representar mais de uma espécie genômica (BRENNER et al., 1999). A classificação molecular permanece confusa para a microbiologia clínica e a epidemiologia, sendo ainda aceito referir-se às leptospiras pela classificação sorológica antiga (BHARTI et al., 2003) Epidemiologia da Leptospirose A leptospirose é uma doença que acomete humanos e animais, tem distribuição mundial em áreas urbanas, silvestres e rurais e sua ocorrência está ligada a fatores ambientais e climáticos (VASCONCELLOS, 2000), podendo manifestar-se em níveis endêmicos ou gerar surtos epidêmicos (BLAZIUS et al., 2005). Possui caráter sazonal descrito por diversos autores, estando diretamente relacionada a períodos chuvosos, quando há elevação do índice pluviométrico (JOUGLARD e BROD, 2000; BLAZIUS et al., 2005). Os roedores são os principais reservatórios do agente, notadamente do serovar Icterohaemorrhagiae, e a ratazana de esgoto (Rattus norvegicus) tem papel fundamental na transmissão da doença no meio urbano (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2003). Há uma grande diversidade de reservatórios ou hospedeiros de manutenção de leptospiras, compreendendo animais silvestres e domésticos. Cada serovar tende a ser mantido por um hospedeiro animal específico,

25 23 sendo então este serovar considerado adaptado à determinada espécie animal (ELLIS, 1984; FAINE et al., 2000). Os reservatórios animais são cronicamente infectados nos rins pelos diferentes serovares de Leptospira sp. (ATHANAZIO et al., 2008). Assim, a transmissão da leptospirose ocorre pela eliminação de leptospiras na urina com a posterior contaminação da água e solo, sendo esse o principal veículo de transmissão da doença (JOUGLARD e BROD, 2000; MCBRIDE et al., 2005); ou ainda, as leptospiras podem persistir no trato genital, sendo desta forma eliminadas pelo sêmen e secreções vaginais e, portanto transmitidas pela cópula ou inseminação artificial (FAINE et al., 2000). Acredita-se que as leptospiras sejam eliminadas em altas concentrações na urina de ratos, visto que recente estudo demonstrou que ratos experimentalmente infectados eliminam até 10 7 bactérias/ml de urina (NALLY et al., 2005). No Rio de Janeiro, já foi demonstrado que cerca de 30% das ratazanas de vida livre são portadoras de leptospiras, predominantemente do sorogrupo Icterohaemorrhagiae (LILENBAUM et al., 1993). O estado de portador renal dos hospedeiros de manutenção é um elemento chave na transmissão da leptospirose. As leptospiras naturalmente tendem a formar agregados na água, o que pode estar relacionado à sua manutenção no meio ambiente (TRUEBA et al., 2004). As vias de transmissão clássicas da leptospirose são através do contato com a pele lesada e mucosa. O conhecimento dos serovares e seus hospedeiros de manutenção são essenciais para a compreensão da epidemiologia da doença em uma dada região (LEVETT, 2001). Os animais que sobrevivem à fase aguda da leptospirose podem desenvolver a condição de portadores convalescentes onde as leptospiras instalam-se e multiplicam-se nos túbulos renais e são eliminados para o meio ambiente por períodos variáveis. Imunoglobulinas específicas são normalmente achadas na urina (FAINE et al., 2000). A enfermidade nos animais domésticos apresenta diversas manifestações clínicas, dependendo da espécie animal, do serovar infectante envolvido e do ambiente. Serovares adaptados tendem a causar doença crônica e por vezes subclínica nos hospedeiros de manutenção; enquanto que serovares não adaptados tendem a causar doença aguda e grave. Nos bovinos, por exemplo, doença determinada por serovares não adaptados, como Grippotyphosa ou Pomona, em geral apresentam caráter agudo, com manifestações clínicas aparentes

26 24 (LILENBAUM e SANTOS, 1995). No entanto, em casos de infecção determinadas por Hardjo, é mais comum observar-se doença crônica e subclínica associada a problemas reprodutivos. A ocorrência de leptospirose é variável em diferentes partes do mundo, podendo observar-se tanto de forma esporádica quanto endêmica. Os surtos ocorrem por exposição à água contaminada com urina ou tecidos provenientes de animais infectados (FAVERO et al. 2002). Existem vários ciclos epidemiológicos na leptospirose, que envolvem diferentes reservatórios e mecanismos de transmissão, mas as condições ambientais são sempre muito importantes para a ocorrência da doença (ANDRÉ-FONTAINE E GARNIÉRE, 1990). 2.2 A INFECÇÃO NOS BOVINOS A leptospirose em bovinos é uma zoonose relatada mundialmente como importante causa de prejuízos econômicos por comprometer os níveis de produção e produtividade dos rebanhos afetados (FAVERO et al., 2001) Os primeiros trabalhos sobre leptospirose em bovinos no Brasil surgiram no final da década de 1950, a partir dos relatos pioneiros de Freitas e colaboradores (1957), que pela primeira vez identificaram no país a existência da infecção pelo serovar Pomona, em um feto abortado em São Paulo. Nos anos 70, um número consideravelmente maior de pesquisadores interessou-se pelo estudo das leptospiroses em bovinos. Assim, além de São Paulo, houve relatos da enfermidade em bovinos de Minas Gerais (REIS et al., 1973; MOREIRA et al., 1979), Rio de Janeiro (CORDEIRO et al., 1975), Rio Grande do Sul (WILLIAMS et al., 1975; OLIVEIRA, 1977; VAZ & OLIVEIRA, 1977) e na Bahia (DÓRIA & SANTANA, 1976; CALDAS et al., 1977). Até então, na maior parte dos relatos, observava-se a predominância do serovar Pomona, seguido por Wolffi e Sejroe. No entanto, na época, o serovar Hardjo não era incluído nas baterias de diagnóstico. A técnica de soroaglutinação com antígenos vivos já era, então, amplamente aceita e utilizada nestes estudos.

27 Ocorrência do serovar Hardjo O serovar Hardjo passou a ser mais valorizado a partir de seu primeiro isolamento a partir de bovinos nos Estados Unidos (ROTH e GALTON, 1960). Na América Latina o primeiro isolamento foi obtido na Argentina (MYERS & JELAMBI, 1975). No início da década de 80, diversos pesquisadores passaram a se dedicar ao estudo das leptospiroses em bovinos, em especial à compreensão da epidemiologia que envolve o serovar Hardjo nesta espécie. Nesta época, Oliveira e colaboradores (1980) relataram altos títulos reagentes para Hardjo em bovinos no Rio Grande do Sul. Estes mesmos autores obtiveram pela primeira vez no Brasil o isolamento de leptospiras do sorogrupo Hebdomadis sorogrupo a que pertencia o serovar hardjo na ocasião - a partir do sangue de um animal, que, no entanto, não chegou à classificação final do serovar. A transmissão de Hardjo entre bovinos foi mais bem elucidada por Ellis e colaboradores (1981) que obtiveram seu isolamento a partir dos rins de 57 vacas, o que confirmou a adaptação desta amostra à espécie bovina e o papel desta como mantenedora renal do espiroqueta. A partir de tal fato, pesquisadores de outras regiões passaram a incluir amostras de Hardjo em suas baterias de sorodiagnóstico. A partir de achados sorológicos, Abuchaim e Dutra (1985), constataram a grande importância deste serovar em animais da bacia leiteira de Porto Alegre, paralelamente à Pomona e Sejroe. Na Bahia (DÓRIA et al., 1980), no Mato Grosso (MADRUGA et al., 1980) e em Minas Gerais, foi observada alta ocorrência de Hardjo (RIBEIRO et al., 1988). Posteriormente, o isolamento de Hardjo no trato genital de vacas não-prenhas mostrou que a persistência extra-renal da espiroqueta poderia ser importante para a manutenção do estado de portador, sugerindo a transmissão venérea da enfermidade entre bovinos, visto que também houve isolamento do trato genital de touro naturalmente infectados (ELLIS et al. 1986). A partir destes relatos, dois estudos realizados em São Paulo por GIRIO e MATHIAS (1989) e, posteriormente, GIRIO e colaboradores (1990) estudaram a influência das leptospiroses e do serovar Hardjo sobre a eficiência reprodutiva de vacas leiteiras. Em 1993, Moreira e colaboradores estudaram um surto de leptospirose em Minas Gerais e descreveram a ocorrência de abortamentos, mastites e morte fetal com predominância de Hardjo e Wolffi no sorodiagnóstico. No mesmo ano,

28 26 Lilenbaum e colaboradores (1993) relataram a importância do sorogrupo Sejroe, incluindo o serovar Hardjo, como agentes da leptospirose em bovinos do Rio de Janeiro. Em um estudo mais amplo no Rio de Janeiro, Lilenbaum e colaboradores (1995) examinaram 405 amostras de vacas com problemas reprodutivos, e observaram 68,4% de reações positivas, com predominância de Hardjo (21%), seguido de Wolffi (13,8%). No mesmo ano, Lilenbaum e Santos analisaram o papel do serovar Hardjo nas leptospiroses em bovinos, que foi encontrado em 80,9% das propriedades testadas, o que atestou sua ampla disseminação no rebanho bovino deste estado. No período de 1984 a 1997 Favero e colaboradores (2001) compilaram dados sorológicos para determinar os serovares mais prevalentes em 21 estados do Brasil. Os resultados demonstraram 84,1% dos rebanhos com pelo menos um animal sororeativo, tendo pelo menos um rebanho positivo por estado. Neste estudo, o estado do Mato Grosso do Sul apresentou animais sororeativos em 100% dos rebanhos testados. Houve grande predominância de Hardjo (51,5%) frente aos outros serovares testados. Em 2001, Homem e colaboradores realizaram inquérito sorológico em rebanhos da região amazônica e encontraram 61,2% de sororeatividade para Hardjo, confirmando sorologicamente a presença deste serovar na região norte do país. Araújo e colaboradores (2005) realizaram novo inquérito em Minas Gerais e encontraram como serovares mais freqüentes: Hardjo, amostra Norma, Hardjo amostra hardjoprajitno, Hardjo amostra hardjobovis e Wolffi. Segundo os autores, estes resultados mostraram a grande relevância de Hardjo como problema prioritário nas leptospiroses em bovinos no estado de Minas Gerais. No ano de 2007, Mineiro e colaboradores no estado do Piauí e Figueiredo no estado do Mato Grosso também relataram a predominância de Hardjo em bovinos, encontrando 39,5 e 65,6% de sororeatividade respectivamente. Em amplo estudo realizado em todo o estado de São Paulo por Castro (2007), foi constatado que a infecção por Leptospira sp. estava presente em 49,4% das propriedades estudadas, sendo o serovar Hardjo (46%) o predominante. Além disso, o estudo também demonstrou que a distribuição deste serovar é praticamente homogênea em todas as regiões do estado de São Paulo.

29 27 Observa-se, portanto, que o panorama da leptospirose nos rebanhos bovinos nacionais segue o padrão encontrado em todo o mundo, com grande predominância do serovar Hardjo nas diferentes regiões do Brasil A enfermidade em bovinos Uma vez introduzido em um rebanho, o serovar Hardjo estabelece níveis variáveis de infecção, podendo persistir por longos períodos (ELLIS, 1994). Os bovinos infectados usualmente eliminam o agente pela urina por tempo prolongado, o que determina a contaminação de outros indivíduos e do ambiente. Desta forma, a leptospirose em bovinos deve ser encarada como doença coletiva, e não apenas como moléstia individual, que freqüentemente passa despercebida pelas dificuldades de diagnóstico verificadas a campo. Nos bovinos, as leptospiroses causam consideráveis perdas econômicas em decorrência das diversas manifestações de infertilidade, tais como repetições de cio, aumento do número de serviços por concepção, aumento do intervalo entre partos, mastites, abortamentos, natimortalidade, bezerros prematuros, nascimento de bezerros fracos e decréscimo na produção de leite e de carne (ARAÚJO et al, 2005). O abortamento, embora não seja o achado mais comum da enfermidade, frequentemente é o único sinal clínico observado (AMATREDJO & CAMPBELL, 1975). Em 1984, Ellis analisou a patogênese e controle da leptospirose bovina em países tropicais e a dividiu etiologicamente em dois grandes grupos: uma doença determinada por serovares adaptados ao gado bovino (Hardjo), e outra determinada por serovares incidentais, mantidos por outras espécies domésticas ou silvestres, mais dependentes da influência de fatores ambientais, tais como clima e índices pluviométricos. Infecções determinadas por Hardjo, um serovar adaptado e mantido pelos próprios bovinos, tem um caráter epidemiológico bem definido, pois sua transmissão é menos dependente da região geográfica ou de fatores climáticos e mais ligados a

30 28 fatores de risco como o manejo inadequado do rebanho e o grau de tecnificação da fazenda. O papel de Hardjo como a principal amostra patogênica para bovinos é aceito mundialmente (FAINE et al., 2000) e no Brasil inquéritos sorológicos feitos em Minas Gerais (MOREIRA et al., 1979; RIBEIRO et al., 1988; RIBEIRO et al., 2000), no Mato Grosso (MADRUGA et al., 1980), no Rio de Janeiro (LILENBAUM et al., 1995), em São Paulo (VASCONCELLOS et al., 1997; LANGONI et al., 2000), em Pernambuco (OLIVEIRA et al., 2001) e na região amazônica (AGUIAR et al., 2006) encontraram elevada freqüência de bovinos reagentes para este serovar. Teoricamente, qualquer serovar de Leptospira pode infectar um animal, no entanto o que se observa é que apenas um pequeno número de serovares é encontrado em uma determinada região e espécie (ELLIS, 1984). No caso de Hardjo, considera-se que a transmissão direta de bovino para bovino é o mecanismo mais importante para sua manutenção no rebanho (FAINE et al, 2000), o que explica sua alta prevalência em propriedades tecnificadas e com sistema intensivo de produção leiteira. No que diz respeito a outros serovares encontrados em nosso meio, tais como Bratislava e Pomona, estas caracterizam as chamadas infecções incidentais, e são atribuídas ao contato direto ou indireto do bovino com a urina de outras espécies, principalmente suínos. Sua ocorrência é fortemente influenciada por outras variáveis como índice pluviométrico, região geográfica e sistema de produção adotado na propriedade. No Brasil, foi demonstrado que a ocorrência de infecções incidentais está diretamente ligada ao manejo adotado na propriedade; quanto menos tecnificada a criação, maior as chances de infecções deste grupo (LILENBAUM e SANTOS, 1995) Patogenia A dinâmica da patogenia da leptospirose é complexa e multifatorial. A motilidade e morfologia das leptospiras favorecem a sua penetração através do contato direto da pele lesada ou mucosas íntegras com a urina ou órgãos de animais

31 29 portadores de leptospiras. As vias transplacentária e mamária também devem ser consideradas na transmissão da leptospirose. A via venérea, pela monta natural realizada entre animais infectados, também é considerada uma importante via de transmissão direta da leptospirose (FAINE et al., 2000). A possibilidade de transmissão da leptospirose pelo sêmen industrializado é minimizada, desde que sejam seguidos os critérios relativos à saúde do touro e da manipulação do ejaculado exigidos pelo Escritório Internacional de Epizootias (OIE) (HEINEMANN et al., 1999). Após a infecção segue-se uma rápida disseminação da bactéria na corrente sanguínea do hospedeiro, ocorrendo multiplicação ou leptospiremia com duração média de três a 10 dias. Este período compreende a primeira fase da doença, onde não resposta imune detectável e com sintomatologia branda e inespecífica. Após esta fase, ocorre o desenvolvimento de anticorpos específicos pelo sistema imune e as leptospiras irão migrar para seus órgãos alvo, principalmente, fígado, pulmões e musculatura esquelética e trato genital feminino, locais onde se desenvolverá toda sintomatologia clássica da leptospirose (ELLIS, 1984). Acredita-se que a explicação para a escolha de tais órgãos se deva ao aporte sanguíneo ser limitado nestas regiões o que leva a uma menor eficiência das imunoglobulinas nestes locais (FAINE et al., 2000). Segundo GUYTON (1981), o fluxo sanguíneo renal na cortical corresponde a 20% do débito cardíaco, enquanto na região medular externa e interna é de 9% e 1% respectivamente, corroborando com os achados de ATHANAZIO et al. (2008) que sugerem que as leptospiras encontrem nos rins um escape do sistema imune. A localização renal é a mais importante do ponto de vista epidemiológico (FAINE et al., 2000), pois a urina passa a ser a principal via de eliminação dos microrganismos. A leptospirúria é intermitente e pode persistir por meses ou anos e os animais tornam-se fontes de infecção junto ao rebanho. Os rins colonizados por leptospiras apresentam nefrite túbulo-intersticial, com a presença de focos inflamatórios, necrose tubular e hemorragias. As leptospiras são encontradas em grande número nos túbulos contorcidos proximais, glomérulos e interstício (BARNETT et al., 1999; NALLY et al., 2004; YANG et al., 2006), no citoplasma de macrófagos e em depósitos formados a partir de células degeneradas (MORRISON e WRIGHT, 1976). A lesão tecidual primordial da leptospirose parece ser a lesão endotelial, levando à vasculite e às hemorragias nos tecidos (LEVETT, 2001). Hemorragias,

32 30 anemia hemolítica, hemoglobinemia, hemoglobinúria e icterícia são achados decorrentes da hemólise e lesão endotelial (DAHER et al., 2002; WAGENAAR et al., 2007). A trombocitopenia é comumente observada nas formas graves da leptospirose, podendo ocorrer em decorrência de hemorragias, citotoxicidade e agregação plaquetária (NICODEMO et al., 1989; GREENE, 2004; YANG et al., 2006; WAGENAAR et al., 2007). A obstrução tubular originada a partir do edema intersticial e menor perfusão renal resulta em diminuição progressiva da filtração pelo glomérulo. O infiltrado celular observado nestes casos está associado à produção local de anticorpos e, secundariamente, à fagocitose (MORRISON e WRIGHT, 1976). O quadro de insuficiência renal provoca azotemia, aumento de creatinina, oligúria ou anúria, alterações do sedimento urinário, proteinúria, glicosúria, natriurese e caliurese (KO et al., 1999; DAHER et al., 2002; NALLY et al., 2004). A presença de leptospiras no fígado leva ao dano hepatocelular, provocando lesões hepáticas típicas tais como perda da arquitetura tecidual, focos de necrose hepatocitária, focos de inflamação, presença de células de Kupffer aumentadas e eventualmente presença de células apoptóticas (MERIEN et al., 1998; NALLY et al., 2004, YANG et al., 2006). As leptospiras localizam-se em sinusóides e canalículos biliares, levando à colestase e provocando um aumento de bilirrubina sérica, contribuindo para o quadro de icterícia (da SILVA et al., 2002). Observa-se ainda aumento das transaminases hepáticas, gama glutamil transferase e fosfatase alcalina (da SILVA et al., 2002; PEREIRA et al., 2005). O dano pulmonar principal na leptospirose ocorre devido à intensa hemorragia intra-alveolar (NALLY et al., 2004; PEREIRA et al., 2005; YANG et al., 2006), levando à insuficiência respiratória (GOUVEIA et al., 2008). Raras leptospiras são visualizadas nos pulmões (NALLY et al., 2004; YANG et al., 2006), sugerindo outro mecanismo de patogenia neste órgão que não a ação direta do microrganismo. A presença de imunocomplexos em membranas alveolares de cobaios sugere um processo auto-imune como etiologia da hemorragia pulmonar observada na leptospirose (NALLY et al., 2004). Em casos graves os pulmões apresentam grandes sufusões. Já no coração observa-se pericardite e petéquias no epicárdio e endocárdio (BALDWIN e AYKINS, 1987). A resposta imune contra leptospiras parece ser estimulada por componentes da membrana externa, como lipopolissacarídeos (LPS), proteínas e lipoproteínas. A resposta adquirida se desenvolve a partir da segunda semana de infecção e é

33 31 específica para o serovar infectante. A especificidade é conferida pelo LPS, que é altamente imunogênico (LEVETT, 2001). Os anticorpos específicos opsonizam as leptospiras, as quais são fagocitadas por macrófagos (MERIEN et al., 1997). WANG et al. (1984) observaram resistência de leptospiras à fagocitose por neutrófilos. Já SEBASTIAN (1994) verificou que na leptospirose a intensidade das lesões teciduais está intimamente relacionada à estirpe do serovar e a adaptabilidade do hospedeiro. A localização das leptospiras no trato reprodutivo das vacas resulta em infecção uterina, que pode persistir em vacas vazias por até 97 dias e nas prenhas por até 142 dias. A infecção uterina resulta em leptospirose congênita que pode determinar abortamento em qualquer momento da gestação (FAINE et al. 2000). Durante a fase de leptospiremia há morte fetal, com ou sem regeneração placentária, seguida de eliminação fetal entre 24 e 48 horas após a infecção (RADOSTITS et al., 2000). Após e expulsão do feto pode haver persistência das leptospiras nas tubas uterinas por até 22 dias após o parto, bem como a eliminação do microrganismo por descargas vaginais ou através dos anexos fetais (ELLIS, 1984). Fetos bovinos infectados no terço final da gestação que não são abortados podem desenvolver resposta imune humoral detectável (ELLIS, 1984). Na infecção pelo serovar Hardjo, além dos rins, o trato genital superior parece ser um importante sítio de localização das leptospiras. Particularmente na infecção de bovinos pelo serovar Hardjo a via venérea é bastante importante para a disseminação do agente no rebanho e no ambiente (CASTRO, 2006). O isolamento do serovar Hardjo do trato genital de touros naturalmente infectados sugere tal importância, pois a introdução do microrganismo por via intrauterina estabelece a infecção de fêmeas, que passam a excretá-lo pela urina por até 54 semanas (FAINE et al., 2000). Este microrganismo, assim como os serovares Pomona e Hebdomadis, também foi demonstrado em glândulas acessórias e em testículos de touros e no sêmen, inclusive com a presença de aglutininas anti-leptospira no plasma seminal (ELLIS, 1994). Nas fêmeas bovinas, a infecção por Hardjo parece ter efeito direto sobre a fertilização interferindo com a função do corpo lúteo, pela diminuição dos níveis de progesterona (DHALIWAL et al., 1996). Hardjo também tem sido relatado persistindo na glândula mamária de bovinos (THIERMANN, 1984). Estas infecções não são, normalmente, tão severas quanto àquelas determinadas por serovares não adaptados aos bovinos, que determinam surtos de abortamento no rebanho (DHALIWAL et al., 1996).