UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA (CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL)

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1 1 UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA (CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL) GABRIEL MENDES DE SOUZA MARTINS LEPTOSPIROSE E SEU IMPACTO NA EFICIÊNCIA REPRODUTIVA EM PEQUENOS RUMINANTES NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO NITERÓI 2012

2 2 GABRIEL MENDES DE SOUZA MARTINS LEPTOSPIROSE E SEU IMPACTO NA EFICIÊNCIA REPRODUTIVA EM PEQUENOS RUMINANTES NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Medicina Veterinária. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal. Orientador: Prof. Dr. WALTER LILENBAUM Coorientador: Prof. Dr. FELIPE ZANDONADI BRANDÃO Niterói 2012

3 3 GABRIEL MENDES DE SOUZA MARTINS LEPTOSPIROSE E SEU IMPACTO NA EFICIÊNCIA REPRODUTIVA EM PEQUENOS RUMINANTES NO ESTADO DO RIO DE JANEIRO Aprovado em 16 de Fevereiro de Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Medicina Veterinária. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal. BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Walter Lilenbaum UFF Prof. Dr. Júlio Cesar Ferraz Jacob UFRRJ Profa. Dra. Melissa Hanzen Pinna UFBA Niterói 2012

4 4 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por toda orientação e proteção conferida durante todos esses anos de vida. Agradeço à minha mãe Tânia Dias Mendes, e meu pai Francisco de Assis de Souza Martins Junior por todo o incentivo, extremamente importante para minha escolha pela Medicina Veterinária e pelo apoio durante todo o decorrer do curso da vida. Não poderia deixar de agradecer às palavras de incentivo ditas por outros familiares, principalmente meus tios e tias, avó, primos, madrasta e meu irmão Pedro Henrique Brito Martins. Agradeço imensamente à minha companheira Beatriz Coronato Nunes, por todos os momentos de firmeza e conforto; não por dividir, mas por somar afagos, abraços e beijos incentivadores e renovadores; por fazer parte significativa da construção desta estrada, vulgarmente chamada de vida. Agradeço aos meus amigos do Laboratório de Bacteriologia Veterinária, local que me apresentou e me guiou para o caminho da arte da verdadeira ciência. Em especial, gostaria de agradecer ao grupo de leptospirose, equipe que tenho orgulho de pertencer e aprender diariamente. Isoladamente, com carinho agradeço aos meus grandes amigos e parceiros científicos Penna, B.; Hamond, C. e Otaka, D., por todo o apoio prestado e aprendizados transmitidos. Agradeço imensamente ao meu orientador Prof. Dr. Walter Lilenbaum por trilhar meus passos por meio da magia da ciência, sempre de forma focada e determinada; obrigado pelas oportunidades que me trouxeram (integralmente) até aqui. Agradeço enormemente ao meu coorientador Prof. Dr. Felipe Brandão e sua equipe pelo incentivo e auxílio na construção deste projeto. Adicionalmente, gostaria

5 5 de agradecer ao Dr. Marco Alberto Medeiros (FIOCRUZ) pela importante parceria no decorrer deste trabalho. Por fim, agradeço à Universidade Federal Fluminense e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte prestado. Agradeço também ao programa de pós-graduação em Medicina Veterinária (clínica e reprodução animal), em especial à coordenadora Profa. Dra. Ana Maria Reis Ferreira por toda assistência ao longo do curso. Os autores são gratos à FAPERJ pelo financiamento deste estudo (E-26/ /2008).

6 6 RESUMO A produção de pequenos ruminantes possui grande importância econômica, principalmente nos países em desenvolvimento. Entretanto a produtividade (leite e carne) permanece insatisfatória. Doenças infecciosas como a leptospirose contribuem para este cenário. Esta infecção em pequenos ruminantes pode determinar principalmente falhas reprodutivas causando importantes prejuízos econômicos. Este projeto objetivou a identificação da soroprevalência para leptospirose e distribuição de sorotipos em ovinos e caprinos do Estado do Rio de Janeiro, identificando falhas reprodutivas associadas à enfermidade, e a relação entre os diferentes níveis de tecnificação dos rebanhos com a ocorrência da sororreatividade. O presente estudo foi conduzido em duas etapas: i - Inquérito sorológico em número estatisticamente significativo de animais que determinou a ocorrência da doença em caprinos e ovinos do Estado do Rio de Janeiro, com associação da eficiência reprodutiva, e dos níveis de tecnificação dos rebanhos associados à ocorrência da infecção; ii - Os animais sororreativos no inquérito sorológico foram selecionados e amostras de urina foram colhidas para processamento bacteriológico e molecular. A soroprevalência média para leptospirose em pequenos ruminantes no presente estudo foi de 23,6%, sendo 37,6% em ovinos e 15,5% em caprinos. O sorotipo Hardjo foi o mais frequente no presente estudo. Nenhum cultivo de leptospiras foi obtido. Não obstante, 25,3% das amostras de urina apresentaram positividade na PCR, sendo 30,6% em rebanhos ovinos e 21,3% em caprinos. Sendo assim, a soroprevalência para leptospirose apresentou-se elevada, particularmente em ovinos, e todas as mesorregiões apresentaram rebanhos sororreativos. Falhas reprodutivas foram bastante frequentes, em especial em rebanhos sororreativos para Hardjo. Foi detectada a presença de DNA leptospírico em cinco rebanhos, comprovando a circulação do agente nos mesmos. Palavras-chave: 1. Leptospirose; 2. Pequenos ruminantes; 3. Diagnóstico; 4. Falhas reprodutivas.

7 7 ABSTRACT Small ruminants production has great economic importance, especially in developing countries. However the productivity of meat and milk remains suboptimal. Infectious diseases such as leptospirosis contribute to the scenario. Leptospirosis determines reproductive failures in small ruminants causing significant economic losses. This project aimed to investigate the seroprevalence of leptospirosis in sheep and goats, identifying the reproductive failures related to this infection. The preset study was conducted in two steps: i A serological survey was conducted in sheep and goats with a significant number of animals from state of Rio de Janeiro. ii Urine samples were collected from the seroreactive animals selected in the first step. These samples were processed by bacteriological and molecular methods. Seroprevalence of leptospirosis in small ruminants was 23.6%, with 37.6% of seroreactivity in sheep and 15.5% in goats. Serovar Hardjo was the most frequent in the present study. None leptospiral isolate was obtained. Nevertheless, 25.3% of urine samples were positive by PCR, 30.6% from sheep flocks and 21.3% from goats herds. Seroprevalence for leptospirosis was high, particularly in sheep. All regions showed seroreactive herds. High rates of reproductive failure were observed, especially in herds and flocks with predominance of Hardjo. DNA of leptospires was detected on five herds, confirming the agent circulation. Keywords: 1. Leptospirosis; 2. Small ruminants; 3. Diagnosis; 4. Reproductive failures.

8 8 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO, p.12 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA, p PANORAMA DA CAPRINO-OVINOCULTURA, p LEPTOSPIROSE, p LEPTOSPIROSE EM PEQUENOS RUMINANTES, p Epidemiologia, p Ocorrências no Brasil, p Sinais clínicos e lesões, p Diagnóstico, p Prevenção e controle, p Leptospira sp. - O ORGANISMO, p OBJETIVOS, p OBJETIVO GERAL, p OBJETIVOS ESPECÍFICOS, p MATERIAIS E MÉTODOS, p DESENHO DO ESTUDO, p ANIMAIS, p MÉTODOS EMPREGADOS, p Investigação Clínica (Problemas reprodutivos), p Investigação laboratorial, p Amostragem, p Procedimentos laboratoriais, p Sorologia, p Microscopia óptica de campo escuro, p. 38

9 Cultivo bacteriológico, p Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), p Investigação do nível de tecnificação, p Análise Estatística, p SURTO DE LEPTOSPIROSE, p RESULTADOS, p ANÁLISE DE UM SURTO DE LEPTOSPIROSE EM CAPRINOS, p DISCUSSÃO, p CONCLUSÃO, p OBRAS CITADAS, p ANEXOS, p. 68

10 10 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Quadro 1 Ocorrência de aglutininas anti-leptospira em caprinos e ovinos no Brasil de 1963 a 2011, diagnosticados pelo teste da soroaglutinação microscópica (SAM), p. 23. Tabela 1 Distribuição das 971 amostras de sangue de caprinos e ovinos provenientes de 19 rebanhos, presentes nas seis mesorregiões do Estado do Rio de Janeiro, , p. 33. Figura 1 Distribuição das 971 amostras de sangue colhidas de caprinos e ovinos de 19 rebanhos nas seis mesorregiões do Estado do Rio de Janeiro, segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), entre , p. 34. Quadro 2 Estirpes de Leptospira sp. empregadas como antígenos no teste da soroaglutinação microscópica (SAM) de ovinos e caprinos do Estado do Rio de Janeiro, p. 38. Tabela 2 Distribuição dos resultados sorológicos (SAM) para leptospirose por mesorregião e por espécie em 19 rebanhos de pequenos ruminantes estudados no Estado do Rio de Janeiro, , p. 43. Tabela 3 Distribuição da sororreatividade observada na SAM nas seis mesorregiões e duas espécies de pequenos ruminantes estudadas no Estado do Rio de Janeiro, , p. 44.

11 11 Figura 2 Distribuição da sororreatividade média observada na SAM nos rebanhos de caprinos (C) e ovinos (O) nas seis mesorregiões estudadas no Estado do Rio de Janeiro, , p. 44. Tabela 4 Dados de eficiência reprodutiva obtidos de quatro rebanhos de pequenos ruminantes no Estado do Rio de Janeiro, , p, 45. Tabela 5 Frequência das falhas reprodutivas associadas ao sorotipo predominante e índices de sororreatividade em 19 rebanhos de caprinos e ovinos estudados no Estado do Rio de Janeiro, , p. 46. Figura 3 Distribuição dos níveis de tecnificação dos 19 rebanhos de pequenos ruminantes estudados no Estado do Rio de Janeiro, , p. 47. Tabela 6 Distribuição da sororreatividade de caprinos e ovinos dos 19 rebanhos estudados nos três diferentes níveis de tecnificação avaliados no Estado do Rio de Janeiro, , p. 49. Tabela 7 Distribuição da positividade à PCR de amostras de urina de caprinos e ovinos em cinco rebanhos no Estado do Rio de Janeiro, , p. 49. Tabela 8 Resultados dos métodos diagnósticos e problemas reprodutivos identificados em agosto de 2009 e um ano mais tarde (após ampla intervenção) no surto de leptospirose em um rebanho caprino no Estado do Rio de Janeiro, p. 52.

12 12 1 INTRODUÇÃO Ovinos e caprinos são ubiquitários e apresentam grande importância para a subsistência, o sustento econômico e social da população humana, em especial nos países em desenvolvimento. Estas espécies são altamente adaptáveis a uma ampla gama de condições climáticas e geográficas, o que lhes confere o título de animais de produção com maior distribuição ao redor do mundo. O Brasil, devido às características edafoclimáticas e sociais, apresenta um cenário propício para expansão e o incremento da criação de caprinos e ovinos. Apesar do elevado efetivo de pequenos ruminantes e da forma acentuada como a caprino-ovinocultura vem se desenvolvendo no Brasil nos últimos anos, os níveis de produção e produtividade dos rebanhos nacionais são ainda bastante inferiores aos encontrados em outros países desenvolvidos (SIMPLÍCIO, 2011). Uma das razões para o baixo nível de produtividade dos rebanhos nacionais é o regime de manejo empregado nas explorações. Não obstante, o baixo desempenho reprodutivo vem sendo reportado como de fundamental importância na redução dos índices de produtividade de rebanhos. Infecções por agentes virais, bacterianos ou protozoários estão comumente associadas a falhas reprodutivas em pequenos ruminantes, sendo a leptospirose uma das enfermidades mais frequentes em rebanhos de pequenos ruminantes determinando importantes prejuízos econômicos (SUEPAUL et al., 2011). Nestas espécies a infecção leptospírica determina principalmente falhas reprodutivas, como infertilidade, abortamento, natimortalidade e nascimento de crias prematuras e fracas, com morte na primeira semana de vida, causando importantes prejuízos econômicos. Além disso, a diminuição na produção de leite e no ganho de peso dos animais também são relatados em caprinos e ovinos.

13 13 O controle da leptospirose nos animais domésticos envolve a aplicação de medidas como a identificação dos sorotipos circulantes, controle das fontes de infecção, cuidados no momento da aquisição de animais e a imunização sistemática dos susceptíveis com vacinas inativadas que contenham os sorotipos de leptospiras presentes na região (SUBHARAT et al., 2011). Destaca-se que o sucesso dos programas de vacinação depende de estudos epidemiológicos para o monitoramento dos sorotipos circulantes em uma população (WANG et al., 2007). A partir deste cenário, considerando-se a importância de ovinos e caprinos para o aprimoramento da pecuária, em especial no Estado do Rio de Janeiro, o presente estudo objetivou identificar a soroprevalência para leptospirose e distribuição de sorotipos em pequenos ruminantes no mesmo Estado, identificando falhas reprodutivas associadas à enfermidade, avaliando também a relação dos diferentes níveis de tecnificação dos rebanhos com a ocorrência da mesma. Adicionalmente, o presente estudo relata a ocorrência de um surto de leptospirose em um rebanho caprino, com elevado índice de falhas reprodutivas.

14 14 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 2.1 PANORAMA DA CAPRINO-OVINOCULTURA Pequenos ruminantes, isto é, ovinos e caprinos, são ubiquitários e apresentam grande importância para a subsistência, o sustento econômico e social da população humana, em especial nos países em desenvolvimento. Estas espécies são altamente adaptáveis a uma ampla gama de condições climáticas e geográficas, o que lhes confere o título de animais de produção com maior distribuição ao redor do mundo (PUGH; BAIRD, 2011). Apresentam um menor consumo de alimentos e baixas exigências de capital para criação, tornando-os ideais principalmente para pequenos produtores (KOSGEY; OKEYO, 2007). Além disso, apresentam curtos intervalos de geração, alta prolificidade, pequeno tamanho, e são capazes de utilizar uma grande variedade de alimentos, incluindo resíduos de culturas agrícolas (HOLST, 1999). Segundo a Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação ( Food and Agriculture Organization, FAO), em 2009 havia uma estimativa de 879,7 milhões de caprinos no mundo, sendo 64,2% distribuídos na Ásia, 28,8% na África, 4,6% nas Américas, 2,2% na Europa, e 0,2% na Oceania. Já para ovinos, no mesmo ano, havia a estimativa de 1,1 bilhões de animais ao redor do mundo, onde a maioria (41,9%) dos animais se localizava também na Ásia, 27,3% na África, 12,3% na Europa, 9,8% na Oceania e finalmente 8,7% nas Américas. Não obstante, aproximadamente 95,7% de todos os caprinos e 63,3% dos ovinos do mundo estão localizados em países em desenvolvimento, e representam mais de 70% da produção destas espécies (FAOSTAT, 2009). O Brasil, devido às características edafoclimáticas e sociais, apresenta um cenário propício para expansão e o incremento da criação de caprinos e ovinos. A

15 15 produção de insumos como carne, leite e peles ou lã de pequenos ruminantes representa um horizonte de crescimento praticamente sem precedentes em relação a outras formas de exploração do agronegócio brasileiro (CORDEIRO, 2006). De acordo com o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), em 2009, o país apresentava em torno de 9,2 milhões de caprinos, distribuídos em mais de 210 mil rebanhos. Deste efetivo, 48,1% estava localizado nos Estados da Bahia (30,2%) e Pernambuco (17,9%). No mesmo período, havia no território nacional aproximadamente 16,8 milhões de cabeças de ovinos, situados em cerca de 440 mil rebanhos, com destaque para o Estado do Rio Grande do Sul, que obtinha 23,5% do efetivo da espécie. Já no Estado do Rio de Janeiro, tanto o número de cabeças, como o efetivo de rebanhos de pequenos ruminantes apresenta números modestos quando comparados a outras regiões produtoras do país. Em 2009, existiam aproximadamente, 31,5 mil caprinos e 50 mil ovinos neste Estado, números que representavam 0,3% do total de animais do país, para ambas as espécies (IBGE, 2009). No entanto, apesar do baixo nível de produção, o Estado do Rio de Janeiro apresenta todas as condições para se desenvolver como grande produtor da caprino-ovinocultura, devido à presença de terrenos acidentados, pequenas propriedades, e mercado interno extremamente ávido por seus produtos e derivados, além de despontar como fornecedor de reprodutores de alto valor genético para outros estados (CORDEIRO, 1998). Uma enorme demanda de produtos pecuários está prevista para ocorrer no início do século 21. Este cenário é impulsionado quase que inteiramente pelo crescimento populacional, aumento da renda e à urbanização crescente nos países em desenvolvimento, representando uma enorme oportunidade para os produtores de animais, em particular de pequeno porte. A maior parcela do aumento desta demanda está prevista para regiões periurbanas, áreas que serão de especial interesse para os agricultores (POLLOTT; WILSON, 2009). Apesar do impulso econômico, vale ressaltar que a caprino-ovinocultura precisa ser explorada de modo a criar sistemas de produção mais sustentáveis, com incremento da produtividade, sem que seja necessário o aumento do número de animais nos rebanhos. O aumento na demanda por produtos de origem animal é comumente associado à elevação dos níveis de renda disponíveis e um crescente nível de sofisticação entre os consumidores. Em tal situação, a demanda dos consumidores por produtos de origem animal será cada vez mais baseada na qualidade dos produtos. Neste

16 16 contexto, a melhoria da sanidade dos rebanhos contribui de forma significativa para o aprimoramento da produtividade, uma vez que rebanhos sadios apresentam melhores níveis reprodutivos, produtos com maior valor de mercado (por exemplo, animais com maior peso ao abate), além de insumos com melhor nível de segurança alimentar (CORDEIRO, 2006). Caprinos e ovinos podem ser explorados para diversos fins, incluindo produção de carne, lã, leite, queijos, e peles. Utilizações especiais incluem o controle de plantas daninhas, experimentação animal, principalmente como modelos de digestão de ruminantes e doenças cardíacas, produção de anticorpos, além de animais geneticamente modificados (POLLOTT; WILSON, 2009). Embora esses animais estejam amplamente distribuídos em todo o mundo, o potencial de produção de ovinos e caprinos muitas vezes não é atingido, seja por decisões políticas e administrativas, ou pelo baixo acesso dos produtores à tecnologia e informação (BOYAZOGLU et al., 2005). Estes fatores podem determinar importantes prejuízos econômicos, fato refletido principalmente nos meios de vida rural e periurbano. É digno de nota que o incremento da sanidade dos rebanhos, aliado ao acesso a novas tecnologias e educação dos produtores são critérios eficazes para a ampliação da cadeia produtiva, seja neste, ou em quaisquer outros setores da produção animal (KOSGEY; OKEYO, 2007). Apesar do elevado efetivo de pequenos ruminantes e da forma acentuada como a caprino-ovinocultura vem se desenvolvendo no Brasil nos últimos anos, os níveis de produção e produtividade dos rebanhos nacionais são ainda bastante inferiores aos encontrados em outros países desenvolvidos (SIMPLÍCIO, 2011). No que tange a produção internacional de insumos de pequenos ruminantes, observamos que nosso país apresentava recentemente a 20ª posição no ranking de países produtores de leite caprino, com um nível de produção de 1,4x10 5 toneladas de leite por ano (ton/ano), número bem inferior ao de outros países em desenvolvimento como Índia (4,1x10 6 ton/ano 1ª colocada) e Somália (3,9x10 5 ton/ano 9ª colocada). Adicionalmente, a produção de carne ovina seguia o mesmo perfil, onde o Brasil se encontrava na 26ª posição no mundo, ficando atrás de países como África do Sul, Etiópia e Rússia (FAOSTAT, 2009). Uma das razões para o baixo nível de produtividade nacional está principalmente no regime de manejo empregado nas explorações. Pequenos ruminantes são predominantemente criados de forma extensiva e rudimentar, com

17 17 alta dependência da vegetação nativa, utilizando raças não especializadas, assistência técnica deficitária, baixo nível de organização e de gestão da unidade produtiva e, sobretudo com elevado nível de carência de controle sanitário efetivo (CORDEIRO, 2006). Não obstante, o baixo desempenho reprodutivo vem sendo reportado como de fundamental importância na redução dos índices de produtividade de rebanhos (MORAND-FEHR et al., 2004; INSKEEP; DAILEY, 2005). Este baixo desempenho é determinado por distúrbios na fisiologia da reprodução de fêmeas e machos, por intermédio da apresentação de sintomas como anestro, repetição de cio, absorção embrionária precoce, abortamento, retenção de placenta, retardo da puberdade e maturidade sexual. Esses distúrbios têm como consequência o aumento do intervalo entre partos, elevação do número de serviços por concepção, redução da vida útil de fêmeas e descarte precoce de reprodutores (BONDURANT, 2005; VALE; RIBEIRO, 2005). Desta forma, deficiências nutricionais, doenças infecciosas e manejo inadequado são considerados as principais causas dos baixos níveis reprodutivos, determinando consequentemente grandes prejuízos ao produtor (KOSGEY et al., 2006). Apesar do grande número e da importância dos pequenos ruminantes no mundo, programas de melhoramento genético, tecnológico e sanitário dos rebanhos são escassos (KOSGEY et al., 2006). Poucos estudos têm abordado as condições sanitárias dos rebanhos de caprinos e ovinos no Brasil, e principalmente o reflexo dessas condições nos níveis de produção e produtividade dos mesmos. Infecções por agentes virais, bacterianos ou protozoários estão comumente associadas a falhas reprodutivas em pequenos ruminantes (REINA et al., 2009; DEMPSTER et al., 2011; SUEPAUL et al., 2011), seja indiretamente, pelos efeitos sistêmicos (septicemias ou toxemias), ou diretamente, ao afetar o embrião ou contaminar seu ambiente. Daquelas, lentiviroses (artrite-encefalite caprina e maedivisna), toxoplasmose, neosporose, brucelose (Brucella abortus e B. ovis) e leptospirose são frequentemente reportadas nos rebanhos nacionais (POESTER et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2006; SILVA et al., 2009; CAMOSSI et al., 2011; SEIXAS et al., 2011), sendo esta última, descrita como a enfermidade infecciosa mais prevalente e potencialmente a principal infecção associada à baixa produtividade de pequenos ruminantes no Estado do Rio de Janeiro (LILENBAUM et al., 2007a).

18 LEPTOSPIROSE A leptospirose é uma doença sistêmica de seres humanos e animais determinada por bactérias do gênero Leptospira, caracterizada classicamente por febre, insuficiência renal e hepática, manifestações pulmonares e falhas reprodutivas. Os sinais clínicos são muito variáveis, principalmente nas leptospiroses animais, onde muitos casos são provavelmente inaparentes e associados a sorotipos adaptados ao hospedeiro, tais como, Canicola em cães, Bratislava em cavalos, Pomona em suínos e Hardjo em ruminantes (ELLIS et al., 1986; ANDRÉ- FONTAINE, 2006; GROOMS, 2006). Apesar disso, outros sorotipos podem estar envolvidos na apresentação mais grave da doença. Indivíduos podem se infectar indiretamente por meio do contato com água ou solo contaminados, ou por contato direto com urina, carcaças frescas ou órgãos contaminados. Em bovinos adultos os sinais mais frequentemente observados durante a infecção leptospírica são abortamento, repetição de cio e natimortalidade. Já em animais jovens a doença pode se desenvolver de forma mais grave, com apresentação da forma aguda da infecção, na qual, sinais como febre, icterícia, e hematúria estão presentes, com elevada taxa de mortalidade (GROOMS; BOLIN, 2005). Entre equinos infectados, abortamentos e natimortalidade podem ocorrer. Além disso, sinais não específicos como febre, também podem estar presentes durante a infecção leptospírica. Entretanto, o sinal clínico mais frequente da doença em cavalos é a uveíte recorrente (ROHRBACH et al., 2005). Recentemente, hemorragia pulmonar em decorrência de leptospirose foi descrita em equinos sororreativos para o sorotipo Copenhageni no Rio de Janeiro (HAMOND et al., 2011). Já em cães, os sinais da leptospirose podem variar de acordo com a idade, estado imunológico do animal, e do sorotipo infectante. Nas infecções agudas sinais precoces incluem febre e vômito. Desidratação, hemorragia pulmonar, síndrome hepato-renal e choque podem se desenvolver mais tardiamente. Em infecções subagudas, anorexia, sinais de depressão e afecções do trato respiratório, tais como rinite, podem ser evidentes. Em cães cronicamente infectados, a função renal pode diminuir, sendo acompanhada pela perda de peso, vômito, polidipsia e poliúria

19 19 (ANDRÉ-FONTAINE, 2006). Disfunção hepática pode resultar em icterícia, insuficiência hepática grave, com possibilidade de desenvolvimento de ascite e encefalopatia. Além disso, meningite e uveíte ocorrem raramente em cães com leptospirose (ADLER; DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). Mesmo em fase de recuperação da infecção, animais podem tornar-se portadores assintomáticos, carreando leptospiras nos túbulos renais por longos períodos, eliminando o micro-organismo no ambiente (LEVETT, 2001). Animais susceptíveis adquirem a infecção por contato direto ou indireto com urina ou tecidos de animais infectados. Outras espécies, como camundongos (Mus musculus e outras espécies do gênero Mus) e ratos (Rattus norvegicus e R. rattus) servem como reservatórios para sorotipos adaptados (Ballum, Icterohaemorrhagiae e Copenhageni) (MATTHIAS; LEVETT, 2002). Animais carreadores geralmente não apresentam sinais da doença, mas portam leptospiras em seus rins, tornando-se uma importante fonte de infecção para outros animais e humanos. O estado de portador renal é fundamental para a persistência e epidemiologia da leptospirose. Leptospiras colonizam as superfícies livres das células epiteliais dos túbulos proximais do rim (BREINER et al., 2009). Este micro-organismo pode persistir infectante por semanas a anos. Quando ocorre adaptabilidade entre o sorotipo e o hospedeiro, muitas vezes esta persistência se prolonga por toda a vida do animal, com excreção intermitente de leptospiras na urina. Na maioria das espécies animais, não existe associação entre os níveis de anticorpos e a concentração de leptospiras eliminadas na urina (LEVETT, 2001), e embora a presença de imunoglobulinas antileptospíricas já tenha sido descrita na urina, não apresentavam concentrações suficientes para inativação bacteriana. Leptospiras não sobrevivem em urina ácida, mas podem permanecer viáveis quando esta é alcalina. Consequentemente, herbívoros e outros animais cuja dieta produz urina com este perfil são relativamente mais importantes como disseminadores do agente do que animais de urina ácida (HARTSKEERL et al., 2011). A leptospirose em humanos é caracterizada por uma grande variedade de sintomas e um curso bifásico da doença. A primeira fase corresponde à multiplicação e disseminação do micro-organismo de forma sistêmica. Já a segunda fase é caracterizada pelo desenvolvimento de anticorpos circulantes e detecção de leptospiras na urina, com período de incubação normalmente de uma a duas semanas (variação de 2 a 30 dias) (LEVETT, 2001). A maioria das infecções em

20 20 seres humanos possivelmente são subclínicas ou tão brandas que dificultam seu diagnóstico. Dentre os casos clínicos, sinais iniciais semelhantes à gripe (síndrome gripal) ocorrem durante a primeira fase da infecção e incluem febre, cefaleias, calafrios, mialgias, e, ocasionalmente, erupção cutânea maculopapular e derrame conjuntival (HARTSKEERL, 2006). Na segunda fase, os sinais da leptospirose são mais órgão-específicos, e a doença pode ser classificada nas formas ictérica e anictérica. A forma mais branda da doença (anictérica) é diagnosticada em aproximadamente 90% dos pacientes (ADLER; DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). Em pessoas com leptospirose anictérica, meningite asséptica é o sintoma mais comum e é caracterizada por fortes dores de cabeça e rigidez de nuca; sendo esta síndrome mais frequente em pacientes mais jovens. Uveíte pode ocorrer durante esta fase, ou pode se manifestar semanas a anos após o início da doença (LEVETT, 2001). A forma mais grave, ictérica (também chamada de síndrome de Weil), tem um curso bifásico menos pronunciado. Depois o início dos sinais inespecíficos, a segunda fase é caracterizada por icterícia, disfunção renal, disfunção pulmonar, ou manifestações hemorrágicas. Pacientes não tratados, que apresentem este tipo de manifestação, têm maior taxa de mortalidade do que aqueles com a forma anictérica da doença. A complicação mais grave da forma ictérica é o desenvolvimento de oligúria e, posteriormente anúria, hemorragia pulmonar e insuficiência renal, sendo esta última a causa mais comum de morte (HARTSKEERL et al., 2011). A transmissão do micro-organismo entre humanos já foi relatada, mas é rara e de baixa importância epidemiológica, visto que humanos infectados e convalescentes geralmente não excretam leptospiras por longos períodos na urina, e hábitos elementares de higiene são suficientes para a prevenção da infecção por sangue e urina contaminados (BAL et al., 1994). Reinfecção pelo mesmo sorotipo ocorre em menor número que por sorotipos diferentes, principalmente em seres humanos. Infecções decorrentes de acidentes laboratoriais raramente têm sido relatadas (EVANGELISTA; COBURN, 2010).

21 LEPTOSPIROSE EM PEQUENOS RUMINANTES Epidemiologia Inquéritos sorológicos realizados em diversos países constataram que a infecção de caprinos e ovinos por Leptospira sp. é frequente e está associada, na maioria dos casos, ao sorotipo Hardjo, principal estirpe causadora da doença em bovinos (CICERONI et al., 2000; HERRMANN et al., 2004). A transmissão deste sorotipo ocorre independentemente de fatores ambientais e sazonais; assim como criações consorciadas ovino/bovinos exercem pouca influência na transmissão desta estirpe, tornando seu controle mais difícil (ELLIS, 1994; LILENBAUM et al., 2008b). Adicionalmente, no Rio de Janeiro, DNA leptospírico foi detectado pela Reação em Cadeia da Polimerase ( Polymerase Chain Reaction, PCR) em amostras de sêmen e fluido vaginal de caprinos e ovinos, evidenciando a potencial transmissão venérea da leptospirose em pequenos ruminantes (LILENBAUM et al., 2008a). Alguns autores consideram pequenos ruminantes como hospedeiros acidentais de leptospiras, infectando-se apenas por sorotipos incidentais, carreados por outras espécies domésticas e silvestres (ELLIS, 1994, CERRI et al., 1996). Por outro lado, diversos estudos demonstraram que infecções por este micro-organismo em caprinos e ovinos são comuns, podendo estas espécies atuar, assim como os bovinos, como hospedeiras de manutenção para o sorotipo Hardjo (COUSINS; ROBERTSON, 1986; COUSINS et al., 1989; LILENBAUM et al., 2009). No Brasil, pouco tem sido relatado a respeito do isolamento de estirpes de leptospiras e seu papel na etiologia da leptospirose em pequenos ruminantes. Azevedo et al. (2004) relataram o isolamento de leptospiras a partir de rins de ovinos sem sinais clínicos da infecção na região nordeste do país, no entanto, as espécies isoladas não foram identificadas. Mais recentemente, um grupo obteve o isolamento de L. noguchii em ovelhas no Estado do Rio Grande do Sul, e apontou que ovinos poderiam atuar como hospedeiros de manutenção do sorogrupo Autumnalis, infectando outras espécies animais e também humanos (SILVA et al., 2007). Não obstante, Lilenbaum et al. (2007b) obtiveram o isolamento de duas cepas de Leptospira em um rebanho caprino no Estado do Rio de Janeiro. No entanto, apesar da não identificação das espécies, a identificação presuntiva, baseada em métodos

22 22 sorológicos sugeriu que aqueles isolados pertencessem ao sorogrupo Grippotyphosa. A ocorrência de infecções por diferentes sorotipos de Leptospira sp. em pequenos ruminantes é comum na maioria dos países, sendo mais frequente em rebanhos que utilizam sistemas de manejo intensivo; ou extensivo com criação consorciada de bovinos, nas quais caprinos e ovinos adquirem a infecção preferencialmente pelo contato direto com urina ou água contaminadas (DOS SANTOS et al., 2012). A transmissão do micro-organismo também pode ocorrer diretamente entre pequenos ruminantes por meio do contato direto ou indireto com urina, fluidos e placenta contaminados; além de transmissão venérea (ELLIS, 1994; LILENBAUM et al., 2008a). Adicionalmente, a alimentação de cordeiros com leite ou colostro de vacas infectadas pode atuar como via de transmissão da bactéria, sendo o quadro clínico normalmente caracterizado por anemia, febre, depressão e dificuldade respiratória seguida de morte (SIMPSON; DONE, 1989). Pequenos ruminantes podem atuar como portadores de leptospiras e eliminar a bactéria na urina por longos períodos (LILENBAUM et al., 2009). Essa eliminação constitui um potencial problema zoonótico, principalmente para indivíduos que apresentam contato direto com animais e suas secreções e excreções, como tratadores, produtores e trabalhadores de matadouros ou frigoríficos (DORJEE et al., 2011). Em um estudo realizado na Nova Zelândia, verificou-se sororreatividade em funcionários em matadouros de ovinos, o que foi associado à presença de leptospiras viáveis nos rins e na urina dos animais abatidos (DORJEE et al., 2008). Não obstante, estudo similar conduzido na cidade de Patos, Estado da Paraíba, evidenciou o risco de infecção leptospírica em trabalhadores de um matadouro de pequenos ruminantes (AZEVEDO et al., 2004). Além disso, abortos podem estar altamente contaminados com o agente, sendo aquele um importante risco para os tratadores dos rebanhos (LEVETT, 2001) Ocorrências no Brasil A presença de aglutininas anti-leptospira em pequenos ruminantes foi relatada pela primeira vez no Brasil em ovinos por Santa Rosa e Pestana de Castro

23 23 (1963) no Estado de São Paulo. Neste relato houve 34% de sororreatividade dos animais, com títulos variando de 200 até 1600, sendo Canicola, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Sejroe, Grippotyphosa, Bataviae e Australis os sorotipos identificados. Posteriormente, diversos inquéritos sorológicos foram realizados em diferentes estados brasileiros (Quadro 1). Quadro 1- Ocorrência de aglutininas anti-leptospira em caprinos e ovinos no Brasil de 1963 a 2011, diagnosticados pelo teste da soroaglutinação microscópica (SAM). Autores Estado Ano Espécie Número de Amostras Sorotipos mais estudada amostras reativas (%) frequentes SANTA ROSA; Canicola, Pomona, PESTANA DE CASTRO SP 1963 Ovinos ,0 Icterohaemorrhagiae e Sejroe Canicola, SANTA ROSA et SP 1969/70 Ovinos ,7 Icterohaemorrhagiae, al. Pomona e Sejroe CALDAS et al. BA 1983 Caprinos/Ovinos 896/1130 9,7/15,4 Autumnalis, Butembo, Castellonis e Pomona VIEGAS et al. BA 1994 Caprinos/Ovinos 130/219 43,3/89,5 Javanica, Castellonis, Autumnalis, Bataviae LANGONI et al. SP 1995 Ovinos ,9 Icterohaemorrhagiae, Hardjo e Bratislava SOUZA et al. RJ 2001 Caprinos ,1 Hardjo e Wolffi SCHMIDT et al. RS 2002 Caprinos 354 3,4 Icterohaemorrhagiae, Pomona e Hardjo FAVERO et al. SP 2002 Caprinos/Ovinos 1941/284 4,2/0,7 Icterohaemorrhagiae, Icterohaemorrhagiae e Grippotyphosa HERRMANN et Hardjo, Sentot, RS 2004 Ovinos ,3 al. Fortbragg e Wolffi LILENBAUM et al. RJ 2007a Caprinos ,1 Hardjo e Wolffi LILENBAUM et al. RJ 2008a Caprinos/Ovinos 248/292 20,9/13,7 Hardjo e Shermani SEIXAS et al. DF 2011 Ovinos 157 3,0 Hardjo DOS SANTOS et Autumnalis, Tarassovi MG 2012 Caprinos ,3 al. e Pyrogenes

24 Sinais clínicos e lesões A maioria das infecções leptospíricas em pequenos ruminantes são subclínicas. Formas clínicas da doença são observadas principalmente em animais jovens, que apresentam sintomatologia aguda e normalmente grave, caracterizada por icterícia, lesão renal, meningite e, em alguns casos, morte; e fêmeas lactantes ou prenhas, as quais apresentam agalaxia e falhas reprodutivas (ELLIS, 1994). Apesar de alguns pesquisadores apontarem uma possível resistência dos pequenos ruminantes à doença (LEON-VIZCAINO et al., 1987), outros relataram surtos de leptospirose, com elevado nível de mortalidade. Perda de apetite, irritabilidade, eriçamento de pelos e diarreia também podem ocorrer em infecção agudas, normalmente três a dez dias após a exposição ao agente. A maioria dos casos de leptospirose aguda em pequenos ruminantes tem sido associada a sorotipos incidentais, como Pomona, Ballum, Grippotyphosa e Icterohaemorrhagiae (HARTLEY, 1952; DAVIDSON; HIRSH, 1980; VERMUNT et al., 1994). Ovelhas e cabras sororreativas podem apresentar problemas reprodutivos; como infertilidade; abortamento; natimortalidade; e nascimento de crias prematuras e fracas, com morte na primeira semana de vida. Na maioria dos casos, os abortamentos estão associados às infecções pelo sorotipo Hardjo e em menor número, à Pomona, Ballum e Bratislava. Síndrome da queda do leite, semelhante a que ocorre em bovinos, também pode ser observada em fêmeas lactantes (RIET- CORREA et al., 2007). Os principais achados sintomatológicos em abortos provenientes de infecção leptospírica são icterícia, ampla hemorragia e anemia, com exsudato sanguinolento. Como em outros animais, os rins aumentam e apresentam petéquias e pontos brancos na superfície, aliados a atrofia glomerular e aglomerados proteicos tubulares. Abortos podem também apresentar manguitos perivasculares, hemorragias cerebelares e vacuolização das superfícies das células endometriais (DORJEE et al., 2009).

25 Diagnóstico Em razão da inespecificidade da sintomatologia clínica e inexistência de lesões características, exames laboratoriais são essenciais para se realizar um diagnóstico preciso. Diagnóstico laboratorial para leptospirose pode ser indireto, por meio de sorologia; ou direto, com a utilização de microscopia óptica, isolamento do agente ou detecção de DNA em tecidos e fluidos corporais dos animais (GROOMS; BOLIN, 2005). Dentre os diversos testes já padronizados para o diagnóstico laboratorial da leptospirose, o teste da soroaglutinação microscópica (SAM) é, sem dúvida, o mais utilizado por pesquisadores de todo o mundo, sendo também o teste recomendado pela Organização Mundial da Saúde Animal ( World Organisation for Animal Health, OIE). O teste imunoenzimático ( Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay, ELISA) indireto tem sido utilizado principalmente em regiões onde a doença ocorre por um grupo reduzido de sorotipos. Esta técnica apresenta melhor sensibilidade e especificidade que a SAM, e apresenta capacidade de distinção entre uma infecção crônica e aguda por meio da detecção de imunoglobulinas específicas das classes IgM, e IgG. Porém, este teste é normalmente gênero-específico, não sendo hábil para detectar o sorotipo circulante, limitando assim sua utilização para estudos epidemiológicos. Além disso, a utilização do ELISA como método exclusivo de diagnóstico, substituindo a SAM, não é recomendado (ADLER; DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). O diagnóstico por métodos diretos pode ser realizado por microscopia de campo escuro, imunofluorescência direta, cultura bacteriana ou PCR. Imunofluorescência direta pode ser utilizada para identificar leptospiras em tecidos (fígado, pulmões, rins ou placenta) ou sedimentos urinários. É um teste rápido, podendo ser utilizado em amostras congeladas. O conjugado disponível comercialmente não é sorotipo-específico e torna necessária a realização do exame sorológico (SAM) para identificar o sorogrupo infectante. Cultura bacteriana é considerada o padrão-ouro no diagnóstico da leptospirose. Apesar disso, este método apresenta grandes limitações, como a baixa sensibilidade devido ao elevado nível de contaminação das amostras, o crescimento fastidioso do micro-organismo e o dispêndio da técnica (GROOMS; BOLIN, 2005). Métodos moleculares, como a PCR, vêm sendo cada vez mais utilizados na rotina do diagnóstico da leptospirose

26 26 animal (PINNA et al., 2011). Esta metodologia apresenta elevada sensibilidade e especificidade, podendo detectar até dez leptospiras por mililitro de urina. Apesar disso, necessita de grande aparato tecnológico e profissionais treinados para realização do teste (STODDARD et al., 2009). Em pequenos ruminantes a PCR tem sido uma ferramenta de grande importância para identificação de animais carreadores, bem como no controle da enfermidade (LILENBAUM et al., 2008a) Prevenção e controle O controle da leptospirose nos animais domésticos envolve a aplicação de medidas como a identificação e eliminação das fontes de infecção, cuidados no momento da aquisição de animais e a imunização sistemática dos susceptíveis com vacinas inativadas que contenham os sorotipos de leptospiras presentes na região (SUBHARAT et al., 2011). Em pequenos ruminantes, a utilização combinada da SAM como teste de triagem, e posterior análise da urina por meio da PCR foi considerada adequada para a identificação de portadores renais, indivíduos responsáveis pela disseminação da doença nos rebanhos (LILENBAUM et al., 2009). No momento da aquisição de animais, é importante verificar a procedência dos mesmos, adquirindo animais de propriedades com comprovada eficiência reprodutiva e bons índices sanitários. Além disso, deve-se levar em consideração a realização do exame sorológico para diagnóstico da infecção do rebanho (HARTSKEERL et al., 2011). A vacinação desempenha um importante papel no controle da leptospirose, podendo reduzir significativamente a ocorrência de animais doentes no rebanho. Apesar disso, as vacinas atualmente disponíveis (bacterinas), não impedem a infecção dos animais, não evitando assim o estado de portador renal. Desta forma, animais vacinados podem constituir fontes de infecção para outros animais e humanos, sendo necessário o tratamento (antibioticoterapia) dos portadores para o efetivo controle da leptospirose nos rebanhos (MARTINS et al., 2010). A identificação da variante sorológica de Leptospira circulante é muito importante, uma vez que a imunidade adquirida pós-infecção é sorotipo-específica. Logo, a vacinação protege somente contra sorotipos homólogos ou antigenicamente semelhantes aos da solução vacinal, não havendo imunidade cruzada (LEVETT, 2001). O uso

27 27 sistemático de bacterinas específicas contra os sorotipos mais frequentes nas regiões tem sido reportado como uma medida eficiente no controle da leptospirose em animais. Já no que se refere à antibioticoterapia, a estreptomicina, um dos primeiros antibióticos utilizados na terapia da doença, é considerada ainda hoje uma das melhores opções de tratamento e eliminação do estado de portador renal em animais infectados, pois apresenta fácil dispersão no tecido renal e boa eficiência contra leptospiras (GERRITSEN et al., 1994). Destaca-se que o sucesso dos programas de vacinação depende de estudos epidemiológicos para o monitoramento dos sorotipos circulantes em uma população (WANG et al., 2007). No Brasil, a maioria das vacinas disponíveis no mercado é voltada para a infecção em bovinos, suínos e caninos; ficando os pequenos ruminantes dependentes da utilização de vacinas direcionadas para outras espécies, sem haver, contudo, uma avaliação da eficiência das mesmas em caprinos e ovinos. 2.4 Leptospira sp - O ORGANISMO Leptospirose é uma doença zoonótica bacteriana com uma distribuição mundial determinada por espiroquetas do gênero Leptospira, família Leptospiraceae, ordem Spirochaetales. Leptospiras apresentam aproximadamente 0,1 μm de diâmetro por 6-20 μm de comprimento, e incluem tanto espécies saprófitas quanto patogênicas (SIMPSON; WHITE, 1964). Na reunião de 2007 da Subcomissão sobre Taxonomia de Leptospiraceae realizada em Quito, no Equador, foram incluídas mais quatro novas espécies ao gênero, totalizando 13 espécies de Leptospira patogênicas: L. alexanderi, L. alstonii (antiga genomospécie 1), L. borgpetersenii, L. inadai, L. interrogans, L. fainei, L. kirschneri, L. licerasiae, L. noguchii, L. santarosai, L. terpstrae (antiga genomospécie 3), L. weilii, L. wolffii, com mais de 260 sorotipos. Espécies saprófitas de Leptospira incluem L. biflexa, L. meyeri, L. yanagawae (antiga genomospécie 5), L. kmetyi, L. vanthielii (antiga genomospécie 4) e L. wolbachii, que contêm mais de 60 sorotipos. Além disso, especula-se que novas espécies existam. Por outro lado, a classificação de sorotipos de Leptospira é baseada na expressão dos epítopos de superfície expostos em um mosaico de antígenos lipopolissacarídeos (LPS), enquanto a especificidade dos epítopos depende da

28 28 composição e orientação de seus açúcares (ADLER; DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). Leptospiras têm extremidades curvas, e foram denominadas primariamente de Spirochaeta interrogans (STIMSON, 1907), justamente devido à sua semelhança com pontos de interrogação. Dois flagelos periplasmáticos com inserções polares estão localizados no espaço periplasmático e são responsáveis pela motilidade; as proteínas FlaA e FlaB constituem a bainha e núcleo flagelar, respectivamente. Adicionalmente, Leptospira com mutante flab apresenta deficiência de endoflagelo e são imóveis (PICARDEAU et al., 2001). Estas bactérias apresentam uma estrutura típica de dupla membrana, na qual a membrana citoplasmática e peptidoglicanos da parede celular estão intimamente associadas e são recobertos por uma membrana externa (CULLEN et al., 2004). Inserido na membrana externa, o LPS constitui o principal antígeno da Leptospira. Este é estruturalmente e imunologicamente semelhante ao LPS de microorganismos Gram-negativos. No entanto, aquele apresenta menor nível de toxicidade para células. Além de LPS, proteínas estruturais e funcionais fazem parte da membrana externa leptospírica. Uma grande dimensão de proteínas, tais como lipoproteínas, estão em abundância na superfície da célula bacteriana. Proteínas integrais de membrana, como a porina OmpL1 e do sistema de secreção tipo dois (SST2) secretina GspD, também estão localizadas na membrana externa da Leptospira e têm se mostrado antigênicas (SHANG et al., 1995; REYES et al., 2005). Leptospiras são bactérias aeróbias obrigatórias, com temperatura ótima de crescimento de C. Crescem em meios de cultura simples, mas enriquecidos com vitaminas B1 e B12, ácidos graxos de cadeia longa e sais de amônio. Estes ácidos graxos são utilizados como única fonte de carbono e são metabolizados por meio da β-oxidação (STALHEIM; WILSON, 1964). Não obstante, crescimento de micro-organismo em meios contendo soro ou albumina, e proteína livre em meio sintético tem sido descrito. Adicionalmente, vários meios líquidos enriquecidos com soro de coelho foram descritos por renomados pesquisadores da área como Noguchi, e Stuart (NOGUCHI, 1918; STUART, 1946). Atualmente, o meio de cultivo mais utilizado é baseado em ácido oleico, albumina sérica bovina, polissorbato (Tween), e é conhecido como EMJH, uma menção aos nomes de seus criadores (ELLINGHAUSEN; MCCULLOUGH, 1965; JOHNSON; HARRIS, 1967). Algumas cepas requerem adição de piruvato ou soro de coelho para o isolamento primário,

29 29 enquanto o crescimento de contaminantes em amostras clínicas pode ser inibido pela adição de 5-fluorouracil, gentamicina, ácido nalidíxico ou rifampicina aos cultivos (JOHNSON; ROGERS, 1964; ADLER et al., 1986). O crescimento das leptospiras é, na maioria das vezes, lento durante o isolamento primário. Em decorrência dos baixos índices de crescimento, os cultivos devem ser mantidos por semanas antes de serem descartados. Ágar pode ser adicionado em baixas concentrações (0,1-0,2%), criando meios semissólidos onde o crescimento atinge uma densidade máxima em uma zona discreta logo abaixo da superfície do meio, que se torna cada vez mais turva ao longo da incubação. Este crescimento está diretamente relacionado com a tensão de oxigênio ideal e é conhecido como anel ou disco de Dinger. Culturas puras de leptospiras são mantidas por meio de repetidos subcultivos ou pelo armazenamento em meio semissólido contendo hemoglobina (ADLER; DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). Armazenamento de longo prazo em nitrogênio líquido também produz bons resultados e é o método preferido de armazenamento para manutenção da virulência bacteriana (ROSSETTI; AUTERI, 2008). Existem apenas seis publicações a respeito do sequenciamento do genoma leptospírico, as quais indicam que, dependendo da espécie, o tamanho do genoma completo varia entre 3,9 e 4,6 megabases (Mb) (KO et al., 2009). O conteúdo G/C está entre 35% e 41% e, em algumas espécies, há evidência de rearranjo genômico significativo e plasticidade. O genoma leptospírico na maioria das espécies é composto de dois cromossomos, um de grande porte (cerca de 4,4 Mb) e outro relativamente pequeno, com cerca de 350 kilobases (Kb) (ZUERNER, 1991). Leptospira biflexa (micro-organismo não patogênico) possui um terceiro replicon, de aproximadamente 74 Kb, que contém genes de manutenção celular (ADLER; DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). Genômica comparativa tem indicado que L. biflexa e as espécies patogénicas L. borgpetersenii e L. interrogans compartilham um núcleo de genes (PICARDEAU et al., 2008). Curiosamente, o genoma de L. borgpetersenii contém aproximadamente 10 vezes mais pseudogenes do que L. interrogans e L. biflexa (XUE et al., 2009). Isto é consistente com a observação de que L. borgpetersenii seja um micro-organismo de baixa sobrevivência em ambientes externos e pode estar em evolução para um ciclo de transmissão direto hospedeiro-hospedeiro (BULACH et al, 2006; ADLER; DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010).

30 30 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL Identificar a soroprevalência para leptospirose e distribuição de sorotipos em ovinos e caprinos do Estado do Rio de Janeiro, identificando falhas reprodutivas associadas à enfermidade, bem como avaliar a relação dos diferentes níveis de tecnificação dos rebanhos com a ocorrência da mesma. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS I. Conhecer a soroprevalência da leptospirose nos rebanhos do Estado do Rio de Janeiro e mapear as mesorregiões de maior prevalência para a enfermidade; II. Avaliar a relação dos diferentes níveis de tecnificação dos rebanhos com a sororreatividade e presença de problemas reprodutivos; III. Aplicar métodos tradicionais e avançados de diagnóstico desta moléstia em ovinos e caprinos.

31 31 4 MATERIAIS E MÉTODOS O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal Fluminense sob o número 59/ DESENHO DO ESTUDO O projeto foi desenvolvido em duas etapas: Em um primeiro momento, um inquérito sorológico foi realizado em número significativo de animais em cada mesorregião do Estado do Rio de Janeiro, que determinou a ocorrência de sororreatividade em caprinos e ovinos. Paralelamente, houve análise da associação da sororreatividade com parâmetros reprodutivos, e os diferentes níveis de tecnificação observados nos rebanhos. Na etapa seguinte, alguns reprodutores de rebanhos com transtornos reprodutivos e que tinham se mostrado sororreativos ao inquérito sorológico foram selecionados por conveniência para comporem um grupo de trabalho. Destes animais foram colhidas amostras de urina para cultura bacteriológica, microscopia de campo escuro e PCR. 4.2 ANIMAIS O Estado do Rio de Janeiro apresenta aproximadamente caprinos e ovinos, distribuídos em 430 e rebanhos, respectivamente (IBGE, 2009). A amostragem assumiu uma prevalência média estimada de acordo com estudos anteriores na mesma região, de 20,9% para caprinos e 13,7% para ovinos

32 32 com uma margem de erro de 5% e nível de confiança de 95% (LILENBAUM et al., 2009), e calculada com o auxílio do software Epi Info (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, Estados Unidos da América [EUA]). A amostragem mínima calculada para atingir o nível de representatividade no Estado do Rio de Janeiro foi de 251 amostras de caprinos e 182 para ovinos. O Estado do Rio de Janeiro é dividido em seis mesorregiões (IBGE, 2009), sendo estas: baixadas litorâneas, centro fluminense, metropolitana do Rio de Janeiro, noroeste fluminense, norte fluminense e sul fluminense. Em cada uma das mesorregiões foram colhidas amostras em número representativo, de acordo com a população de cada espécie por área estudada. Os rebanhos foram selecionados aleatoriamente dentro de cada uma das seis mesorregiões e somente aqueles com pelo menos 20 animais foram selecionados para o estudo, o qual foi realizado entre abril de 2009 e março de 2011, após consentimento dos proprietários. Ao longo das colheitas, foi respeitada a relação de um macho para 20 fêmeas dentre as amostras colhidas. Nenhum dos rebanhos relatou histórico de surtos ou perdas econômicas elevadas relacionadas à leptospirose. O diagnóstico para brucelose (Brucella abortus e B. ovis) e artrite-encefalite caprina (AEC) foi realizado simultaneamente nas amostras colhidas, a fim de descartar rebanhos que apresentassem sororreatividade para outras enfermidades infecciosas da esfera reprodutiva. Para B. abortus foram utilizados o teste do antígeno acidificado tamponado como método de triagem e a prova do 2- mercaptoetanol como teste confirmatório; e para o diagnóstico de B. ovis foi empregado o teste da imunodifusão em gel de agarose, segundo OIE (2008). Já para AEC, foi realizada a técnica da imunodifusão em gel de agarose para detecção de anticorpos anti-aec, também segundo OIE (2008). Se o rebanho apresentasse ao menos um animal reativo para alguma das bruceloses, o plantel era excluído do estudo. De cada rebanho, aproximadamente 20% dos animais adultos foram amostrados. Para os caprinos (C), um total de 606 amostras foi testado, representando sete rebanhos, enquanto que para ovinos (O), 365 amostras foram testadas, representando 12 rebanhos, o que totalizou 971 amostras representadas por 19 rebanhos ao redor do Estado. Com relação à amostragem por mesorregião, 85 amostras foram colhidas nas baixadas litorâneas (38 C; 47 O), 79 no centro fluminense (54 C; 25 O), 194 na metropolitana do Rio de Janeiro (125 C; 69 O), 216

33 no noroeste fluminense (201 C; 15 O), 357 no norte fluminense (158 C; 199 O) e 40 no sul fluminense (30 C; 10 O), conforme demonstrado na Tabela 1 e Figura Tabela 1 - Distribuição das 971 amostras de sangue de caprinos e ovinos provenientes de 19 rebanhos, presentes nas seis mesorregiões do Estado do Rio de Janeiro, Mesorregião Rebanho Espécie Animais testados 1 Caprinos 125 Metropolitana do Rio de Janeiro 2 Ovinos 39 3 Ovinos 30 Subtotal A Ovinos 25 Centro fluminense 5 Caprinos 46 6 Caprinos 8 Subtotal B Caprinos Ovinos 17 9 Ovinos 42 Norte fluminense 10 Ovinos Ovinos Ovinos Ovinos 29 Subtotal C Noroeste fluminense 14 Caprinos Ovinos 15 Subtotal D Baixadas litorâneas 16 Ovinos Caprinos 38 Subtotal E Sul fluminense 18 Caprinos Ovinos 10 Subtotal F Total

34 34 Figura 1 - Distribuição das 971 amostras de sangue colhidas de caprinos e ovinos de 19 rebanhos nas seis mesorregiões do Estado do Rio de Janeiro, segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), entre MÉTODOS EMPREGADOS Investigação Clínica (Problemas reprodutivos) Nos machos foi realizado exame andrológico completo (PUGH; BAIRD, 2011). O exame inicialmente consistiu na colheita de informações referentes ao histórico reprodutivo do animal. Em seguida foi avaliada a genitália externa, onde por meio da inspeção e palpação foram avaliados quanto à consistência, sensibilidade e calor os testículos, epidídimos, pênis e prepúcio. Posteriormente, os testículos foram mensurados e foi determinada a circunferência escrotal. Os animais que apresentaram alteração nos testículos ou nos epidídimos no exame externo foram, quando possível, examinados por meio de ultrassonografia (Aloka SSD-500V,

35 35 Wallingford, CT, EUA) onde foi avaliada a homogeneidade do parênquima testicular, permitindo observar a presença de degeneração testicular, fibrose ou de estruturas císticas. Nas fêmeas, o exame ginecológico consistiu na realização da anamnese, onde foram colhidas informações a respeito do intervalo entre estros, ocorrência de repetição de cio, ocorrência de abortamentos, natimortos e crias fracas. Em seguida foi realizado o exame das genitálias externa e interna. O exame da genitália interna foi realizado por meio da vaginoscopia e da ultrassonografia (Aloka SSD-500V, Wallingford, CT, EUA). Na vaginoscopia foi avaliada a presença de alterações na vagina e no fundo de saco vaginal (PUGH; BAIRD, 2011). Por meio da ultrassonografia avaliamos a presença de alterações uterinas, como endometrites ou piometrites. Todas as informações colhidas no exame andrológico e ginecológico foram registradas em fichas individuais para análise e comparações no software SPSS Statistics Base (IBM Corporation, Armonk, NY, EUA) Investigação laboratorial Amostragem Para a primeira etapa do projeto (inquérito sorológico), o sangue foi colhido dos animais selecionados, por meio da punção da veia jugular, após antissepsia local, com solução de álcool iodado a 2%, utilizando agulhas descartáveis de dimensão 25x0,8 mm e tubos plásticos de 10 mililitros (ml) sem anticoagulante à vácuo (Vacutainer, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey, EUA). O sangue foi identificado, mantido em refrigeração (4 ºC) e transportado para o laboratório. As amostras foram centrifugadas (1000 g por 10 minutos [min]) e o soro foi extraído, identificado e armazenado em duplicata em microtubos de 1,5 ml a -20 C até seu processamento. As amostras de urina foram colhidas após a administração intravenosa de furosemida (MSD, São Paulo, SP, Brasil) na dosagem de 0,5 miligramas por quilo (mg/kg). Colheu-se o segundo jato da micção, objetivando a redução da contaminação por outros micro-organismos na cultura bacteriológica. A urina foi

36 36 colhida em tubos estéreis cônicos (50 ml) e semeada imediatamente após a colheita em tubos estéreis cônicos (15 ml) contendo meio estoque (tampão fosfato acrescido de 10% de EMJH) na proporção 1:1 e transportadas para o laboratório em temperatura ambiente para procedimento bacteriológico. Adicionalmente, alíquotas de 1 ml de urina foram armazenadas em microtubos e transportadas para o laboratório refrigeradas (4 ºC) para realização da PCR (LILENBAUM et al., 2009) Procedimentos laboratoriais Sorologia A SAM foi realizada de acordo com WHO (2003). Brevemente, os antígenos vivos utilizados estão apresentados no Quadro 2 e foram mantidos em meio líquido (EMJH) de acordo com os protocolos recomendados pela OIE (2008). As cepas de referência foram cultivadas em EMJH por 5-10 dias a 30 C em estufa D.B.O. (Eletrolab, São Paulo, SP) até o crescimento na densidade de 1-2 x 10 8 leptospiras por mililitro. As culturas foram examinas microscopicamente para assegurar que estavam livres de autoaglutinação e contaminação; e subculturas eram realizadas semanalmente para manutenção dos cultivos. Para cada reação foram utilizados soros-padrão positivo e negativo, além disso, foi utilizado um controle negativo, empregando-se solução salina tamponada (NaCl 0,9%) às reações. Cada amostra de soro foi inicialmente diluída a 1:50 em solução salina tamponada. Após esta etapa, uma alíquota desta diluição contendo 50 microlitros (μl) foi adicionada em microplacas de vinil de fundo plano contendo 96 poços (Costar, Corning, NY, EUA), logo após, foi acrescentado o mesmo volume de cada antígeno correspondente nos poços, obedecendo à marcação das placas, obtendo-se uma diluição final de 1:100. Cada amostra sorológica foi testada frente à bateria antigênica compreendida por 24 sorotipos. As microplacas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37 C por 90 min. Cada amostra foi observada em microscopia de campo escuro e classificada de acordo com os procedimentos descritos abaixo, conforme Lilenbaum et al. (2008a). Apenas laboratoristas experientes participaram da avaliação de sororreatividade. Os procedimentos operacionais para manutenção dos antígenos e a avaliação da

37 37 aglutinação estão descritos nos procedimentos operacionais padrão do laboratório de realização do presente estudo. As leituras foram realizadas em microscópico óptico (Zeiss, Standort Göttingen, Vertrieb, Alemanha), com condensador seco de campo escuro, em magnificação máxima de 200 vezes, observando-se a formação de aglutinações. As amostras sorológicas foram inicialmente analisadas na diluição de 1:100 e, aquelas que apresentavam nível de aglutinação igual ou superior a 50% eram então, novamente diluídas numa razão geométrica de dois (1:200; 1:400 e 1:800). O título sorológico foi representado para recíproca da maior diluição que apresentou resultado positivo. Adicionalmente, o último nível de diluição das amostras foi 1:800, logo, amostras que apresentaram reatividade nesta diluição foram classificadas como 800. O maior título alcançado foi utilizado para identificar o sorotipo infectante. Os animais foram considerados positivos quando apresentaram títulos 200. Na ocorrência de sororreatividade para mais de um sorotipo, a estirpe com maior frequência no rebanho era considerada a infectante.

38 38 Quadro 2 - Estirpes de Leptospira sp. empregadas como antígenos no teste da soroaglutinação microscópica (SAM) de ovinos e caprinos do Estado do Rio de Janeiro. Espécie Sorotipo Sorogrupo Amostra de referência L. biflexa Patoc Semaranga Patoc I (ATCC 23582) L. borgpetersenii Ballum Ballum Mus 127 L. borgpetersenii Castellonis Ballum Castellon 3 L. borgpetersenii Javanica Javanica Veldrat Batavia 46 L. borgpetersenii Mini Mini Sari L. borgpetersenii Tarassovi Tarassovi Perepelicin L. borgpetersenii Whitcombi Celledoni Whitcomb L. interrogans Australis Australis Ballico L. interrogans Autumnalis Autumnalis Akiyami A L. interrogans Bataviae Bataviae Van Tienen L. interrogans Bratislava Australis Jez Bratislava L. interrogans Canicola Canicola Hond Utrecht IV L. interrogans Copenhageni Icterohaemorrhagiae M 20 L. interrogans Hardjo Sejroe Hardjoprajitno L. interrogans Hebdomadis Hebdomadis Hebdomadis L. interrogans Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae RGA L. interrogans Pomona Pomona Pomona L. interrogans Pyrogenes Pyrogenes Salinem L. interrogans Wolffi Sejroe 3705 L. kirschneri Butembo Autumnalis Butembo L. kirschneri Cynopteri Cynopteri 3522 C L. kirschneri Grippotyphosa Grippotyphosa Moskva V L. noguchii Panama Panama CZ 214 K L. santarosai Guaricurus Sejroe Bov. G L. santarosai Shermani Shermani 1342 K Microscopia óptica de campo escuro Para visualização direta do agente nas amostras de urina recém-colhidas foi utilizada a técnica de microscopia óptica de campo escuro. As amostras provenientes dos tubos estéreis cônicos (50 ml) foram transferidas para microtubos

39 39 (1,5 ml) por meio de pipetas estéreis, no volume de 1 ml. Após este momento, 10 µl de cada microtubo foram transferidos para lâminas de vidro lisas (26 x 76 mm) por meio de micropipetas e ponteira estéreis, sobrepostas por lamínulas de vidro (18 x 18 mm) e imediatamente visualizadas em microscópio de campo escuro (Zeiss, Standort Göttingen, Vertrieb, Alemanha) em magnificação máxima de 200 vezes. Foram observados 20 campos microscópicos por amostra, e a visualização de apenas uma estrutura bacteriana, compatível com a morfologia de células leptospíricas permitia considerar a amostra positiva, ou seja, com a presença de leptospiras (AGUDELO-FLÓREZ et al., 2008) Cultivo bacteriológico As amostras de urina foram semeadas para cultura bacteriológica, utilizandose a técnica de diluição seriada, com diluições de 10-2 e 10-3 do cultivo original, em meio semissólido Fletcher (Difco, Detroit, MI, EUA), que também continha 300 mg/l de 5-fluorouracil (Pharmacia, Kalamazoo, MI, EUA) e 20 mg/l de ácido nalidíxico (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido), e incubados por 24 horas a 28 o C. Após este período, os tubos foram semeados no mesmo meio semissólido, porém sem antibióticos, incubados na mesma temperatura e examinados (microscopia de campo escuro) uma vez por semana, durante 20 semanas (LILENBAUM et al., 2008a) Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) O DNA das amostras de urina foi extraído pelo Wizard SV Genomic DNA Purification System (Promega, Madison, EUA) de acordo com recomendações do fabricante. No ensaio da PCR para a detecção do gene LipL32 (presente apenas em leptospiras patogênicas) foram empregados os primers LipL32-45F (5 -AAG CAT TAC CGC TTG TGG TG-3 ) e LipL32-286R (5 -GAA CTC CCA TTT CAG CGA TT- 3 ), projetados por Stoddard et al. (2009). Utilizou-se um volume de 25 µl de solução contendo: 300 µm de cada desoxinucleotídeo (Invitrogen, Carlsbad, EUA), 75 milimolar (mm) de TrisHCl, 50 mm de KCl, 20 mm de (NH 4 ) 2 SO 4, 2,4 mm de MgCl 2, 0,6 micromolar (µm) de cada primer (Integrated DNA Technologies, Coralville,

40 40 EUA), 1 Unidade (U) Taq DNA polimerase (Biotools B&M Labs, Valle de Tobalina, Espanha) e 3,5 µl de DNA molde. Para cada conjunto de amostras, água ultrapura (UltraPure DEPC-treated Water, Invitrogen, Van Allen Way Carlsbad, CA, EUA) foi utilizada como controle negativo, enquanto 10 fentogramas (fg) de DNA extraído de Leptospira interrogans sorotipo Copenhageni cepa Fiocruz L1-130 foi usado como controle positivo. Todas as reações ocorreram no termociclador Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, EUA). Após uma desnaturação inicial a 95 C por 5 min, o perfil da PCR foi definido da seguinte forma: 30 segundos (s) de desnaturação a 94 C, 30 s de anelamento do primer a 53 C e 1 min de extensão do primer a 72 C, com um total de 35 ciclos, com uma extensão final a 72 C durante 5min. O volume total de reação de cada amostra foi analisado por eletroforese em gel de agarose (1,5%) dissolvido em TAE 1X tampão (40 mm Tris-acetado, 1 mm EDTA). Após a reação de PCR a amostra foi preparada para eletroforese com adição de 5 µl de tampão de corrida ( Loading buffer : 0,1% azul de bromofenol, glicerol e água destilada) em 25µl da reação. A seguir as amostras e o padrão de peso molecular 1 Kb DNA Ladder (Invitrogen, Carlsbad, EUA) foram aplicados em gel de agarose e submetidos à eletroforese com 5 V/cm 2 (110 V por 45 minutos) em uma cuba horizontal (Biorad Ampla Mini-Sub Célula GT, Hercules, CA, EUA) com tampão TAE 1x (40 mm Tris-acetado e 1 mm EDTA). Em seguida, os géis foram incubados em uma solução de brometo de etídio (0,5 µg/ml), e analisadas em transiluminador de luz ultravioleta (LTB - 21x26 HE, Loccus Biotecnologia, São Paulo) para análise dos resultados Investigação do nível de tecnificação Nos 19 rebanhos estudados foi aplicado um questionário epidemiológico que serviu de parâmetro para a análise dos diferentes níveis de tecnificação associados à sororreatividade e problemas reprodutivos (Anexo 1). Neste questionário foram analisados fatores como: sistema de criação (predominantemente extensivo ou intensivo); aplicação de controle rotineiro para leptospirose (diagnóstico, vacinação e tratamento); utilização de biotecnologias da reprodução animal, como inseminação artificial, ou monta natural; aplicação de estação de monta; utilização de aparelho de

41 41 ultrassonografia para o diagnóstico de gestação; utilização de raças especializadas; especialização da produção (produção exclusiva ou não de subprodutos) e mecanização da produção (para rebanhos leiteiros); para formação de três categorias: alta, média e baixa de tecnificação. Os fatores incluídos para formação dos três grupos foram selecionados de acordo com publicações relacionadas aos fatores de risco e proteção para leptospirose em pequenos ruminantes, tais como utilização de piquetes suspensos, mecanização da produção, utilização de biotecnologias da reprodução, nível de sanidade dos rebanhos e controle específico para leptospirose (LILENBAUM; SANTOS, 1996; SOUZA et al., 2001; LILENBAUM et al., 2008b; DOS SANTOS et al., 2012) Análise Estatística Dados referentes aos problemas reprodutivos e resultados laboratoriais, principalmente os relacionados às análises sorológicas, juntamente com informações dos questionários epidemiológicos, foram utilizados na montagem das bases de dados, que posteriormente foram analisadas utilizando-se o software SPSS Statistics Base (IBM Corporation, Armonk, NY, EUA). Análise estatística foi aplicada utilizando-se o teste do Qui-quadrado (χ 2 ) de Pearson (com correção de Yates para tabela 2x2) ou teste exato de Fisher, de acordo com o número de amostras testadas, com um nível de significância de 5%, testes realizados também no SPSS. Adicionalmente, para aferir a força de associação entre as variáveis foi utilizada a relação de risco ( Odds Ratio - OR), com um intervalo de confiança (IC) de 95% (THRUSFIELD, 2007). 4.4 SURTO DE LEPTOSPIROSE Adicionalmente, durante a realização do inquérito sorológico foi identificado e estudado um rebanho de caprinos com suspeita para leptospirose. Para o diagnóstico dos animais foram empregados, nas amostras de soro obtidas, a SAM; e para amostras de urina, PCR e cultura bacteriológica, como previamente descritos. Os resultados são relatados abaixo, no item 5.1.

42 42 5 RESULTADOS Das 971 amostras de soro examinadas pela SAM, 229 apresentaram sororreatividade, ou seja, título igual ou superior a 200. A taxa de prevalência (TP) da leptospirose em pequenos ruminantes no Estado do Rio de Janeiro durante o período do estudo foi, então, determinada em 23,6% (21,0-26,4%), com uma margem de erro (ME) de 2,7%. Dos 606 caprinos estudados, 94 apresentaram positividade ao teste sorológico (TP 15,5%; IC 12,8-18,6%; ME 2,9%), já em ovinos, dos 365 animais estudados, 135 foram positivos (TP 37,6%; IC 32,2-42,0%; ME 4,9). Pode-se notar que, dos 19 rebanhos estudados, apenas um não apresentou animais sororreativos. Das seis mesorregiões estudadas, a metropolitana foi a que apresentou o maior índice de sororreatividade (36,1%), seguida das mesorregiões norte fluminense (27,2%); centro fluminense (24,1%); baixadas litorâneas (14,1%); noroeste fluminense (12,9%); e sul fluminense (7,5%), conforme Tabelas 2 e 3, e Figura 2. As mesorregiões metropolitana e norte fluminense apresentaram diferença de sororreatividade quando comparadas com outras localidades (P<0,05), mas não entre si. Adicionalmente, a mesorregião sul fluminense apresentou o menor índice de sororreatividade (P<0,01).

43 43 Tabela 2 - Distribuição dos resultados sorológicos (SAM) para leptospirose por mesorregião e por espécie em 19 rebanhos de pequenos ruminantes estudados no Estado do Rio de Janeiro, Mesorregião Rebanho Espécie Animais testados Animais sororreativos Positivos % 1 Caprinos ,8 Metropolitana do Rio de Janeiro 2 Ovinos ,3 3 Ovinos ,0 Subtotal A ,1 4 Ovinos ,0 Centro fluminense 5 Caprinos ,9 6 Caprinos ,0 Subtotal B ,1 7 Caprinos ,4 8 Ovinos ,8 9 Ovinos ,9 Norte fluminense 10 Ovinos ,7 11 Ovinos ,5 12 Ovinos ,0 13 Ovinos ,4 Subtotal C ,2 Noroeste fluminense 14 Caprinos ,9 15 Ovinos ,0 Subtotal D ,9 Baixadas litorâneas 16 Ovinos ,4 17 Caprinos ,7 Subtotal E ,1 Sul fluminense 18 Caprinos ,7 19 Ovinos ,0 Subtotal F ,5 Total ,6

44 44 Tabela 3 - Distribuição da sororreatividade observada nas seis mesorregiões e duas espécies de pequenos ruminantes estudadas no Estado do Rio de Janeiro, Mesorregião Animais sororreativos / Animais testados (%) Caprinos Ovinos Total Metropolitana do Rio de Janeiro 41/125 (32,8) 29/69 (42,0) 70/194 (36,1) Centro fluminense 7/54 (13,0) 12/25 (48,0) 19/79 (24,1) Norte fluminense 7/158 (4,4) 90/199 (45,2) 97/357 (27,2) Noroeste fluminense 28/201 (13,9) 0/15 (0,0) 28/216 (12,9) Baixadas litorâneas 9/38 (23,7) 3/47 (6,4) 12/85 (14,1) Sul fluminense 2/30 (6,7) 1/10 (10,0) 3/40 (7,5) Figura 2 - Distribuição da sororreatividade média observada na SAM nos rebanhos de caprinos (C) e ovinos (O) nas seis mesorregiões estudadas no Estado do Rio de Janeiro,

45 45 Títulos de 200 foram observados com maior frequência (P<0,01), representando 150 (65,7%) amostras sororreativas, seguido de 59 (25,7%) e 20 (8,6%), para títulos de 400 e maiores ou iguais a 800, respectivamente. O sorotipo Hardjo foi o mais prevalente, representando 144 (62,9%) amostras reativas, sendo 37 (25,7%) amostras de caprinos e 107 (74,3%) de ovinos, em 10 (52,6%) rebanhos estudados. Icterohaemorrhagiae foi o segundo sorotipo mais frequente, apresentando 60 (26,2%) amostras sororreativas, 57 caprinos (95,0%) e três ovinos (5,0%). Sorotipos Grippotyphosa e Pomona foram detectados apenas em ovinos, sendo 21 (9,2%) e quatro (1,7%) o número de amostras sororreativas para cada um destes sorotipos, respectivamente. Apenas quatro rebanhos apresentavam todos os dados de eficiência reprodutiva, os quais foram descritos na Tabela 4. Nenhum animal apresentou quaisquer sintomas relacionados ao trato reprodutivo além de abortamento, repetição de cio, natimortalidade e nascimento de crias fracas (Tabela 5). Destacase que rebanhos que apresentavam níveis de abortamento maiores ou iguais a 10%, apresentavam maior taxa de sororreatividade para Hardjo (P<0,01), e 40,7 vezes (OR; IC 1,8-917,2) mais chance de serem sororreativos para Hardjo do que para quaisquer outros sorotipos encontrados no presente estudo. Tabela 4 Dados de eficiência reprodutiva obtidos de quatro rebanhos de pequenos ruminantes no Estado do Rio de Janeiro, Rebanho Eficiência reprodutiva bruta* Média de idade dos animais (anos) Nº de primíparas Média de coberturas por prenhez** 1 0,7 4,7 12 2,2 6 0,3 3,3 1 2,0 13 0,8 7,6 7 1,7 14 0,3 4,0 22 4,6 * Foi considerada como a razão entre o número de filhotes desmamados por ano sobre o número de coberturas de cada matriz. ** Pode-se considerar também a utilização de sêmen.

46 46 Tabela 5 - Frequência das falhas reprodutivas associadas ao sorotipo predominante e índices de sororreatividade em 19 rebanhos de caprinos e ovinos estudados no Estado do Rio de Janeiro, Porcentagem de falhas reprodutivas Sorotipo Percentual de Nascimento Rebanho Repetição predominante sororreatividade Abortamento Natimortalidade de crias de cio fracas 1 Icterohaemorrhagiae 32, Hardjo 51, Grippotyphosa 30, Hardjo 48, Hardjo 10, Hardjo 25, Icterohaemorrhagiae 4, Icterohaemorrhagiae 11, Hardjo 42, Pomona 26, Hardjo 12, Hardjo 65, Grippotyphosa 41, Hardjo 13, , Hardjo 6, Icterohaemorrhagiae 23, Hardjo 6, Icterohaemorrhagiae 10, Os resultados da avaliação do nível de tecnificação de cada rebanho nas seis mesorregiões estudadas estão descritos na Figura 3. Na comparação das espécies dos rebanhos com o nível de tecnificação, observamos que 75% dos rebanhos com alto nível de tecnificação eram da espécie caprina, perfil inverso dos rebanhos com nível médio e baixo de tecnificação, nos quais apresentaram 70% e 80% de rebanhos da espécie ovina, respectivamente, conforme descrito na Tabela 6. O nível de sororreatividade dos rebanhos com alto nível de tecnificação foi de 22,9%, variando de 21,3% em caprinos (C) e 41,1% em ovinos (O). Já nos rebanhos com níveis médio e baixo de tecnificação, a sororreatividade média foi de 32,4% (14,0% -

47 47 C; 44,0% - O;) e 14,5% (4,4% - C; 27,4% - O), respectivamente. Não houve diferença entre a taxa de sororreatividade e o tipo de tecnificação do rebanho (P<0,05). Foi observado que os planteis de número 1, 6, 14 (rebanhos caprinos) e 13 (rebanho ovino), os quais apresentavam alto nível de tecnificação, tinham também elevados índices de falhas reprodutivas, principalmente repetição de cio, situação observada com menor frequência nos rebanhos com níveis inferiores de tecnificação, mesmo quando as taxas de sororreatividade eram elevadas nestes últimos (por exemplo, rebanho de número 2). Adicionalmente, foi observado que todos os três rebanhos caprinos com alto nível de tecnificação apresentavam índices de repetição de cio maiores ou iguais a 30%, taxa distinta (P<0,05) quando comparada a rebanhos com outros níveis de tecnificação. Além disso, não houve associação significativa entre o sorotipo infectante dos rebanhos com o nível de tecnificação dos mesmos. Figura 3 Distribuição dos níveis de tecnificação dos 19 rebanhos de pequenos ruminantes estudados no Estado do Rio de Janeiro,