UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA (CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL)

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA (CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL) DENIS YUKIO OTAKA DETECÇÃO MOLECULAR DE BOVINOS PORTADORES DE LEPTOSPIRAS NO RIO DE JANEIRO NITERÓI 2012

2 2 DENIS YUKIO OTAKA DETECÇÃO MOLECULAR DE BOVINOS PORTADORES DE LEPTOSPIRAS NO RIO DE JANEIRO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal Orientador: Prof. Dr. WALTER LILENBAUM NITERÓI 2012

3 3 DENIS YUKIO OTAKA DETECÇÃO MOLECULAR DE BOVINOS PORTADORES DE LEPTOSPIRAS NO RIO DE JANEIRO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal Aprovado em 16 de Fevereiro de BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Walter Lilenbaum Orientador UFF Niterói 2012

4 4 AGRADECIMENTOS A Deus pelo dom da vida. Aos meus pais, Luiz Carlos Hideo Otaka e Yukiko Otaka, pelos valores, ensinamentos, carinho e amor incondicional. Aos meus irmãos Daniel, Tatiana e Erik Otaka por serem também meus amigos e dos quais sinto muito orgulho. À minha esposa, Juliana Nabuco Pereira Otaka, amiga e companheira, incentivadora e parceira de sonhos e conquistas. À Família Nabuco Pereira (Regina, Caíque e Thiago) por me acolher e me fazer sentir em casa. Aos amigos (Bruno, Gabriel, Camila, Sabrina, Ana Paula, Ariel, William, Igor) que fiz no Laboratório de Bacteriologia Veterinária (UFF), pela ajuda, mas, sobretudo pelas companheirismo. Aos órgãos de fomento FAPERJ e CNPQ. A todos os proprietários e funcionários que permitiram e auxiliaram nas coletas das amostras. Ao meu orientador, Walter Lilenbaum, pela generosidade em compartilhar sua experiência e conhecimentos, fazendo com que essa jornada se tornasse mais fácil.

5 5 Há três métodos para se ganhar sabedoria: primeiro, por reflexão, que é o mais nobre; segundo, por imitação, que é o mais fácil; e terceiro, por experiência, que é o mais amargo. Confúcio

6 6 RESUMO Nos bovinos, as leptospiroses causam importantes perdas econômicas em decorrência de repetições de cio, infertilidade, mastites, abortamentos, natimortalidade, nascimento de bezerros fracos ou prematuros, mortes e decréscimo na produção de leite e de carne. O presente estudo teve por objetivo detectar por meio da PCR bovinos carreadores de Leptospira sp. em rebanhos no estado do Rio de Janeiro. Em uma primeira etapa foram testados sorologicamente rebanhos bovinos com problemas reprodutivos a fim de identificar aqueles acometidos por leptospirose. Na segunda etapa do experimento, amostras de urina de animais soronegativos e sororreativos provenientes de rebanhos com sororreatividade maior que 10% foram processadas pela PCR. Dentre os 1002 animais testados, 32,7% foram sororreativos e em oito dos nove rebanhos testados (88,9%) pelo menos um animal apresentou sororreatividade. O serovar predominante foi Hardjo. Das 139 amostras de urina testadas pela PCR, 28 (20,14%) foram positivas. A PCR demonstrou ser um método diagnóstico eficiente para detecção de animais carreadores dentro de rebanhos infectados, uma vez que em todos os rebanhos identificados como infectados pelo menos um animal foi PCR positivo. Embora a sorologia se mostre como um método diagnóstico aceitável para triagem da leptospirose em nível de rebanho, não demonstrou ser um método eficaz para detecção de carreadores em nível individual. Palavras-chaves: leptospirose, bovinos, Soro Aglutinação Microscópica (SAM), PCR

7 7 ABSTRACT Bovine leptospirosis causes economic losses due to reproductive failures (heat repetitions, infertility, mastitis, abortion, stillbirth, premature and weak calves, deaths and decrease in the production of milk and meat). The aim of this study was to detect by PCR bovine carriers of Leptospira sp. in herds in the state of Rio de Janeiro. In a first step, herds with reproductive problems were serologically tested in order to identify those affected by leptospirosis. Subsequently urine samples from seronegative and seroreactive animals from herds with seroreactivity higher than 10% were processed by PCR. Among the 1,002 animals tested, 32.7% were seroreactive and eight of the nine herds tested (88.9%) had at least one seroreactive animal. The predominant serovar was Hardjo. Of the 139 urine samples tested by PCR, 28 (20.14%) were positive. The PCR has proven to be an effective diagnostic method for detection of carrier animals in infected flocks, as in all herds identified as infected at least one animal was PCR positive. Although serology showed to be an acceptable tool to screen leptospirosis in a herd basis, it was not a good predictor for detecting the carriers in an individual basis. Keywords: leptospirosis, cattle, Microscopic Agglutination Test (MAT), PCR

8 8 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO, p FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA, p HISTÓRICO, p AGENTE ETIOLÓGICO, p LEPTOSPIROSE BOVINA, p DIAGNÓSTICO LABORATORIAL, p Métodos diretos, p Exame microscópico em campo escuro, p Cultura bacteriológica, p Reação em cadeia da polimerase (PCR), p Métodos indiretos, p ELISA, p Teste de Soroaglutinação microscópica (SAM), p CONTROLE, p OBJETIVOS, p OBJETIVO GERAL, p OBJETIVOS ESPECÍFICOS, p MATERIAL E MÉTODOS, p REBANHOS E ANIMAIS, p AVALIAÇÃO LABORATORIAL DE AMOSTRAS, p Sorologia, p Colheita de urina, p Bacterioscopia e Isolamento, p Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), p.33 5 RESULTADOS, p. 35

9 9 6 DISCUSSÃO, p CONCLUSÃO, p REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS, p.44 9 ANEXO, p.53

10 10 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Quadro 1 Serovares predominantes em estudos sorológicos para diagnóstico de leptospirose bovina realizados em diversos estados do Brasil na década de p. 17 Quadro 2 Soroprevalência e serovares predominantes em estudos sorológicos para detecção de aglutininas anti-leptospira em rebanhos bovinos de diversos estados brasileiros durante a década de p. 19 Quadro 3 Soroprevalência e serovares predominantes em estudos sorológicos para detecção de anticorpos anti-leptospira em rebanhos bovinos de diversos estados brasileiros durante a década de 1990 e p. 19 Quadro 4 Porcentagem de rebanhos positivos, número de animais estudados (N), soroprevalência e serovares predominantes no diagnóstico de leptospirose bovina em estados do Brasil, de 2006 a p. 20 Tabela 1 Municípios, raças e tipo de manejo de rebanhos bovinos testados pela SAM no estado do Rio de Janeiro, entre 2010 e p. 30 Quadro 5 Bateria de antígenos (serovares) utilizados no teste de Soroaglutinação Microscópica em rebanhos bovinos do estado do Rio de Janeiro. p. 32

11 11 Tabela 2 Frequência de aglutininas anti-leptospira (SAM) e serovar predominante em nove rebanhos bovinos com falhas reprodutivas em municípios no estado do Rio de Janeiro, p. 36 Tabela 3 Diagnóstico direto (MCE e PCR) em amostras de urina de rebanhos bovinos do estado do Rio de Janeiro, p. 36 Tabela 4 Títulos observados na soroaglutinação microscópica (SAM) e detecção direta de Leptospira spp. em amostras de urina de bovinos por microscopia de campo escuro (MCE) e PCR do rebanho F no Município de Valença, p. 37 Tabela 5 Serovar e título sorológico (SAM) de bovinos PCR positivos (urina) em rebanhos bovinos do estado do Rio de Janeiro, p. 38 Tabela 6 Resultados sorológicos (SAM) para leptospirose em dez bovinos PRC positivos (urina) de três rebanhos no estado do Rio de Janeiro. p.39

12 12 1 INTRODUÇÃO A bovinocultura é um dos principais destaques do agronegócio brasileiro no cenário mundial. Embora seja o dono do segundo maior rebanho efetivo do mundo, com cerca de 200 milhões de cabeças, o Brasil possui o maior rebanho comercial e lidera o ranking de maior exportador mundial de carne bovina desde A reprodução animal constitui-se num dos fatores da maior importância que afeta diretamente a eficiência e a rentabilidade dos sistemas produtivos. A bovinocultura moderna é resultado de uma lenta evolução de técnicas de criação desenvolvidas ao longo de décadas e é dependente dos programas de manejo, sanidade, melhoramento genético e reprodução. Essa indústria é também cada vez mais dependente de tecnologia e as biotecnologias reprodutivas têm um grande impacto no seu desenvolvimento. O Brasil tem se destacado como um país que aplica comercialmente as diversas biotecnologias utilizadas na reprodução animal, o que tem provocado grande impacto na pecuária nacional. Apesar do desenvolvimento da bovinocultura brasileira devido em parte aos ganhos genéticos e produtivos alcançados pelo uso de biotecnologias reprodutivas, avanços acerca de programas de sanidade animal não caminham na mesma velocidade. Dentre os programas nacionais de sanidade animal bovina atualmente em curso, como o Programa Nacional de Erradicação e Prevenção da Febre Aftosa (PNEFA), o Programa Nacional de Controle da Raiva dos Herbívoros e outras Encefalopatias (PNCRH) e o Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (PNCEBT), apenas o último contempla o controle e erradicação de uma enfermidade da esfera reprodutiva, sendo negligenciadas dessa forma outras enfermidades tais como Rinotraqueíte Infecciosa Bovina (IBR), Diarréia Viral Bovina BVD, Campilobacteriose, Neosporose, Tricomoníase e Leptospirose.

13 13 Nos bovinos, as leptospiroses causam importantes perdas econômicas em decorrência de repetições de cio, infertilidade, mastites, abortos, natimortalidade, nascimento de bezerros fracos ou prematuros, mortes e decréscimo na produção de leite e de carne (ADLER; DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). Qualquer estirpe de leptospira tem potencial infectante, no entanto o que se observa é que, apenas um pequeno número de serovares é encontrado em uma determinada região e espécie (ELLIS, 1984). O serovar de Leptospira sp. mais frequentemente encontrado em bovinos é o Hardjo, do qual os bovinos são hospedeiros primários de manutenção (GUERRA, 2009). Duas estirpes do serovar Hardjo, sorologicamente idênticos, mas geneticamente distintos, são aceitos: Leptospira interrogans serovar Hardjo estirpe Hardjoprajitno e Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo estirpe Hardjobovis (BOLIN, 2005). No que se refere ao controle efetivo da leptospirose o contato direto e indireto com carreadores deve ser limitado, em um programa que inclua a combinação de identificação progressiva de carreadores e tratamento destes com antibiótico (LILENBAUM et al., 2009). As perdas econômicas causadas pela leptospirose bovina estão direta ou indiretamente ligadas às falhas reprodutivas como infertilidade e abortamento, bem como queda da produção de carne e leite, além de custos com despesas de assistência veterinária, vacinas e testes laboratoriais (FAINE et al., 2000). No Brasil, a doença em bovinos é endêmica e tem sido detectada em todos os estados (FÁVERO et al., 2001).

14 14 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 2.1 HISTÓRICO A história da leptospirose se confunde com a de outras icterícias infecciosas, principalmente a febre amarela, descritas desde os tempos de Hipócrates. Nos séculos XVIII e XIX, devido às limitações científicas e dificuldade de troca de informações, vários autores descreveram enfermidades ictéricas semelhantes e as denominaram com diferentes nomes como Typhus icterodes por ingleses e franceses e vomito prieto pelos espanhóis. Créditos são dados a Larrey como sendo o primeiro a descrever adequadamente, em 1812, a fievre jaune em tropas de Napoleão durante sua campanha no Egito. Naquela época foi considerada como apenas mais um caso de icterícia infecciosa, mas mais tarde soube-se que se tratava de leptospirose. Progressos significativos ocorreram neste mesmo século com o desenvolvimento da Anatomia Patológica como ciência. Griesinger, em 1851, realizou estudos clínicos e anatômicos no Egito e descreveu a bilious typhoid entidade ictérica semelhante, porém distinta da febre tifoide. No final do século XIX, a bilous typhoid foi cada vez mais reconhecida e estudada, até que acerca dos relatos realizados por MATHIEAU, em 1886, coube a WEIL, no mesmo ano, descrever de maneira minuciosa a forma clássica das leptospiroses, definindo-a como entidade distinta do vasto grupo das icterícias infecciosas. Essa descrição caracteriza o que hoje conhecemos como síndrome de Weil (FAINE et al., 2000). Em 1907, Stimson utilizou a recém-descrita técnica de Levaditi para coloração de espiroquetas em tecidos e demonstrou em cortes renais de um paciente humano descrito como tendo febre amarela a presença de organismos espiralados com terminação em gancho, o qual foi denominado Spirochoeta interrogans devido à

15 15 sua morfologia semelhante a um ponto de interrogação. Mais tarde foi sugerido por Sellards que o paciente na verdade fora acometido pela doença de Weil e que durante a fase convalescente contraiu febre amarela. Essa preparação foi fotografada e reproduzida por Noguchi em 1928 sendo a primeira descrição de aglomerados de leptospiras no lúmen dos túbulos renais (FAINE et al., 2000). O primeiro isolamento de Leptospira sp. ocorreu em 1915 no Japão por Inada e Ito que detectaram espiroquetas e anticorpos específicos no sangue de mineradores japoneses com icterícia infecciosa (LEVETT, 2001). O mesmo grupo japonês descreveu o papel dos ratos como portadores do agente. Essa importante observação abriu caminho para o entendimento dos princípios epidemiológicos da transmissão por carreadores animais e controle, bem como futuras pesquisas em outras espécies animais como potenciais reservatórios. Foram necessários mais alguns anos antes que outros animais selvagens e domésticos fossem reconhecidos e as implicações zoonóticas das leptospiroses compreendidas (FAINE et al., 2000). A leptospirose bovina foi descrita pela primeira vez em 1935 por Michin e Azinow na Rússia em bezerros com infecção aguda e hemoglobinúria. Bernkopf em 1946 isolou o agente e estabeleceu a leptospirose como sendo o causador da enfermidade descrita na Palestina por Freund, Trainin e Malkin em bovinos adultos e homens (BERNKOPF et al., 1947). Jungherr em 1944 foi o primeiro a reconhecer a doença em bovinos nos Estados Unidos por meio da identificação do organismo em cortes histológicos de fígado e rim corados pelo método de Levaditi (SMITH; PERRY, 1952). Baker e Little (1948) isolaram e caracterizaram a Leptospira em bovinos na América do Norte e tiveram sucesso em transmitir esse agente em cobaios, coelhos, camundongos e ovos embrionados. Nessa mesma época Reinhard demonstrou que a leptospirose bovina estava amplamente distribuída nos Estados Unidos (FISH; GRINGER, 1957). Em 1957 o departamento de Agricultura dos EUA considerou a leptospirose como sendo a terceira mais importante doença responsável por prejuízos anuais na ordem de U$112 milhões. Nessa época a leptospirose já podia ser encontrada na maioria dos países produtores de bovinos (SYMINGTON, 1957). Na década de 50 e início dos anos 60, o serovar Pomona foi o mais frequente em estudos sorológicos e de isolamento em bovinos e suínos (AMATREDJO; CAMPBELL, 1975).

16 16 Estudos acerca da leptospirose bovina no Brasil têm relatos iniciais datados na década de 50, com destaque para Freitas et al. (1957), que realizaram o primeiro isolamento de Pomona do país a partir de órgãos de um feto abortado entre o quarto e quinto mês de gestação em uma granja leiteira de São Paulo. O segundo relato de isolamento de leptospiras na espécie bovina é de Santa Rosa et al. (1961a),sendo isolado o serovar Icterohaemorrhagiae a partir de um feto abortado entre o terceiro e quarto mês de gestação, no qual a vaca apresentou febre, icterícia e hemoglobinúria morrendo 15 dias depois. Estudos subsequentes identificaram sorologicamente rebanhos bovinos reativos predominantemente paras os serovares Pomona e Icterohaemorrhagiae em São Paulo (GUIDA; BARROS, 1958; GUIDA et al., 1959),em Campinas (SANTA ROSA et al., 1961b), e em Minas Gerais (BARBOSA,1962). Nesta época, estudos sorológicos apontaram novos serovares como importantes agentes da leptospirose bovina, principalmente serovares pertencentes ao sorogrupo Hebdomadis (Hebdomadis, Sejroe, Wolffi). O primeiro estudo da leptospirose bovina no estado do Rio de Janeiro só ocorreu em 1975 por Cordeiro et al. por meio de exame sorológico onde 84,37% das propriedades visitadas foram reagentes, com 19,97% de soro reatividade, e predominância de Wolffi, embora também tenham sido observadas reações para os serovares Tarassovi, Gryppotyphosa, Pomona, Bratislava e Copenhageni. Em 1980, Santa Rosa et al. descreveram o isolamento de dois novos serovares que acontecera em 1967 e 1970 denominadas Guaicurus e Goiano, respectivamente, ambas pertencentes ao sorogrupo Hebdomadis e a partir de rins provenientes de bovinos em matadouros. Nessa época alguns estudos sorológicos (Quadro 1) mostraram que serovares do sorogrupo Hebdomadis, principalmente Wolffi, eram prevalentes em rebanhos nacionais com problemas reprodutivos.

17 17 Quadro 1- Serovares predominantes em estudos sorológicos para diagnóstico de leptospirose bovina realizados em diversos estados do Brasil na década de ANO ESTADO SEROVAR AUTORES 1973 MG Hebdomadis REIS et al SP Wolffi TERUYA et al RJ Wolffi CORDEIRO et al RS Sejroe WILLIAMS et al BA Wolffi DÓRIA; SANTANA 1977 BA Wolffi CALDAS et al MG Wolffi MOREIRA et al. O primeiro isolamento do serovar Hardjo foi realizado por Roth e Galton (1960) na Louisiana, Estados Unidos da América (EUA), posteriormente por Robertson et al. (1964) no Canadá e em 1969 na Austrália por Sullivan e Stallman. Roth e Galton (1960), assim como Michna et al. (1974) sugeriram que esse organismo fora responsável por reações positivas para Sejroe previamente reportada em várias amostras de soro bovino. A partir da década de 1980, pesquisadores de todo o mundo passaram a dar maior ênfase à compreensão da epidemiologia do serovar Hardjo. White et al. em 1982, após isolarem amostras dos serovares Hardjo, Balcanica e Pomona de bovinos nos EUA, afirmaram que Com o aumento dos casos de infecções por Hardjo no gado, houve uma redução nas infecções por Pomona, talvez devido á disseminação a vacinação do gado com bacterinas de Pomona. e Desde 1960, quando Hardjo foi primeiramente isolada no gado, o interesse no sorogrupo Hebdomadis como causa de infecções bovinas voltou-se para o serovar Hardjo. Em 1981, Ellis et al. elucidaram a epidemiologia da Leptospira interrogans serovar Hardjo ao estudarem amostras renais de ratos, texugos e bovinos com problemas reprodutivos. Não conseguiram obter culturas a partir dos ratos e texugos, no entanto isolaram leptospiras a partir dos rins de 57 vacas testadas, confirmando a particular adaptação desta amostra à espécie bovina e o papel destes animais como hospedeiros e mantenedores da espiroqueta. Hathaway et al., em 1982, já afirmavam que a infecção do gado por Hardjo era reconhecida como

18 18 endêmica em vários países e que determinava mastites, abortamentos e nascimento de bezerros prematuros. Em 1984, Ellis analisou especificamente a prevalência, patogênese e controle das leptospiroses bovinas em países tropicais. Desta forma, o autor dividiu a ocorrência, de diferentes serovares de Leptospira em dois grupos: serovares adaptados e mantidos pelo gado bovino, como Hardjo, que independe de região e do índice pluviométrico, e os serovares causadores de infecções incidentais, determinadas por amostras mantidas por outras espécies domésticas ou silvestres. Investigações de Ellis et al. (1986a; 1986b) com a amostra Hardjo revelaram que este serovar pode colonizar diferentes estruturas do aparelho genital das fêmeas (ovários, ovidutos, útero e vagina) e dos machos (testículo, epidídimo e vesícula seminal) e com isto comprometer o desempenho reprodutivo destes animais. Inquéritos sorológicos realizados a partir de 1980 revelaram o predomínio do serovar Hardjo em bovinos em diversos países como Austrália (MILNER et al., 1980; KING, 1991); EUA (THIERMAN, 1983; MILLER et al., 1991); Alemanha (SCHOENBERG et al., 1987); Zimbabwe (FERESU, 1988); Argentina (STANCHI, 1989); México (SALMAN, 1990); Portugal (COLARES PEREIRA & ROCHA, 1991) e Canadá (RICHARDSON, 1995). No Brasil os inquéritos sorológicos realizados em bovinos até a década de 1980, acusavam predomínio de reações para a variante sorológica Wolffi como demonstrado nos Quadros 1 e 2.

19 19 Quadro 2- Soroprevalência e serovares predominantes em estudos sorológicos para detecção de aglutininas anti-leptospira em rebanhos bovinos de diversos estados brasileiros durante a década de ANO ESTADO SOROPREVALENCIA SEROVAR AUTOR 1980 MT 74,3% Hardjo MADRUGA et al BA 29,97% Wolffi DÓRIA et al RS 26,6% Pomona ABUCHAIM e DUTRA 1987 GO 20,57% Wolffi JARDIM et al MG 53,33% Wolffi ALMEIDA et al SP 18,98% Wolffi GIRIO e MATHIAS Investigações mais recentes (Quadro 3) demonstraram que, nos últimos anos, houve sensível elevação nos percentuais de animais sororreativos e predomínio de reações para a variante sorológica Hardjo. Quadro 3- Soroprevalência e serovares predominantes em estudos sorológicos para detecção de anticorpos anti-leptospira em rebanhos bovinos de diversos estados brasileiros durante a década de 1990 e ANO ESTADO PREVALÊNCIA SEROVAR AUTOR 1996 RJ 68% Hardjo LILENBAUM; SANTOS 1999 SP 45,56% Wolffi e Hardjo LANGONI et al AM NI Hardjo HOMEM et al RJ 46,9% Hardjo LILENBAUM; SOUZA 2004 SP 48,3% Hardjo DEL FAVA et al PE 57,7 Hardjo TENÓRIO et al MG NI Hardjo ARAÚJO et al. NI= Não Informado Um dos fatores responsáveis por essa mudança consiste no fato de que foi somente partir da década de 1980 que o serovar Hardjo foi incluído na bateria de antígenos para teste de soroaglutinção microscópica (SAM) no Brasil (LILENBAUM; Dos Santos 1995). Em 1994, Moreira relatou pela primeira vez em bovinos no Brasil,

20 20 o isolamento de uma amostra de Hardjo, e a denominou amostra Cantagalo. Com este fato o autor confirmou, definitivamente, a presença de Leptospira interrogans serovar Hardjo no rebanho nacional. Em 1999 Langoni et al. relatam o sucesso do isolamento de leptospiras a partir de 15 fetos bovinos abortados em 1996 em São Paulo. Os pesquisadores relataram ainda o isolamento de quatro amostras do serovar Hardjo, três de Pomona e oito de Wolffi. Isolamentos subsequentes na espécie bovina foram obtidos por Freitas et al. em 2004 no Paraná, a partir de amostras de urina obtidas por meio de punção direta de bexiga de animais de matadouro e por Zacarias et al. que em 2008 relataram o sucesso de duas culturas positivas obtidas em 2001, também no Paraná, a partir de amostras de urina coletadas por meio de punção direta da bexiga de bovinos de matadouros. Nessa última década a doença em bovinos, no Brasil, foi considerada endêmica e tem sido detectada em todos os estados (FÁVERO et al., 2001). Estudos mais recentes apresentados no Quadro 4 reforçam essa afirmativa. Quadro 4 - Porcentagem de rebanhos positivos, número de animais estudados (N), soroprevalência e serovares predominantes no diagnóstico de leptospirose bovina em estados do Brasil, de 2006 a ESTADO REBANHOS SEROVAR N PREVALÊNCIA POSITIVOS PREDOMINANTE AUTORES AM 95,3% ,8% Hardjo AGUIAR et al., 2006 PB 87,5% ,4% Hardjo LAGE et al., 2007 PI NI ,9% Hardjo MINEIRO et al., 2007 SP 71,3% ,4% Hardjo CASTRO et al., 2008 MS 96,5% ,8% Hardjo FIGUEIREDO et al., 2009 BA 77,93% ,42% Hardjo OLIVEIRA et al., 2009 ES NI ,4% Hardjo VIANA et al., 2010 PI NI 18 83,3% Hardjo MINEIRO et al., 2010 RJ 100% ,9% Hardjo MARTINS et al RJ 100% ,3% Hardjo MARTINS et al NI: Não Informado

21 AGENTE ETIOLÓGICO As leptospiras são bactérias pertencentes à ordem Spirochaetales, família Leptospiraceae, gênero Leptospira. Por meio da classificação sorológica, este gênero é dividido em duas espécies, Leptospira interrogans e L. biflexa; a primeira contém os serovares patogênicos, enquanto que a última compreende os serovares saprófitos (HERNÁNDEZ-RODRIGUEZ et al., 2010). Os serovares são definidos por aglutinação após adsorção cruzada com antígenos homólogos. Serovares antigenicamente relacionados são tradicionalmente agrupados em sorogrupos, e embora não tenham implicância taxonômica, tem utilidade no conhecimento epidemiológico (LEVETT, 2001). Em 1987, Yasuda et al. propuseram uma nova classificação baseada na hibridização por homologia do DNA, a qual agrupou as leptospiras em diversas espécies genômicas. Até o momento, foram identificadas 13 espécies patogênicas: L alexanderi, L. alstonii, L. borgpetersenii, L. inadaii, L. interrogans, L. fainei, L. kirshneri, L. licerasiae, L. noguchi, L. santarosai, L. terpstrae, L. weilii e L. wolffii com mais de 260 serovares e seis espécies saprófitas L. biflexa, L. meyeri, L. yanagawae, L. kmetyi, L. vanthielii, L. wolbachii com mais de 260 serovares (ADLER;DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). A nova classificação do gênero manteve os nomes das espécies L. interrogans e L. biflexa e para evitar confusão na nomenclatura denominou-se L. interrogans sensu lato e L. biflexa sensu lato quando se refere à nomenclatura sorológica, e L. interrogans sensu strictu e L. biflexa sensu strictu quando se refere às genomoespécies (ZUERNER; BOLIN, 1995). Um dos problemas da classificação genotípica é que um mesmo serovar pode representar mais de uma espécie genômica (BRENNER et al., 1999) conflitando com o sistema sorológico que tem servido a clínicos e epidemiologistas por muitos anos. As leptospiras são bactérias helicoidais, medindo de 6 a 20 μm de comprimento, aeróbias estritas, que apresentam uma ou as duas extremidades em forma de gancho e se movimentam por meio de flagelo contido na parede bacteriana. Podem ser de vida livre ou parasitas de homens e animais (GUERRA, 2009). São bactérias fastidiosas, com tempo de geração de seis a 16 horas, crescimento ótimo em ph 7,2-7,6 e temperatura de 28ºC a 30ºC. São pouco resistentes à luz solar direta, aos desinfetantes comuns e aos antissépticos. As

22 22 espiroquetas patogênicas sobrevivem na água variando seu período conforme a temperatura, o ph, a salinidade e contaminação. Todas são sensíveis ao ph ácido ( 6,8), porém sobrevivem em ph alcalino (7,8-7,9).São visualizadas por microscopia de campo escuro ou contraste de fase e não são facilmente coradas (FAINE et al., 2000). A parede celular é composta por proteínas, lipídeos e lipopolissacarídeos, concentrando grande parte dos seus fatores de virulência (VINH et al., 1986). As variações dos carboidratos da cadeia lateral do lipopolissacarídeo (LPS) de membrana são responsáveis pela diversidade antigênica dos serovares (YANAGIHARA et al., 1984). A membrana externa das leptospiras possui um perfil relativamente complexo de proteínas, sendo que a lipoproteína de superfície Lipl32 é a mais abundante. Sendo expressa nas espécies patogênicas, tanto in vitro como in vivo, sua expressão não foi detectada nas espécies saprófitas (HAAKE et al., 2000). 2.3 LEPTOSPIROSE BOVINA Nos bovinos, as leptospiroses causam importantes perdas econômicas em decorrência de repetições de cio, infertilidade, mastites, abortos, natimortalidade, nascimento de bezerros fracos ou prematuros, mortes e decréscimo na produção de leite e de carne (ADLER; DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). Qualquer estirpe de leptospira tem potencial infectante, no entanto o que se observa é que apenas um pequeno número de serovares é encontrado em uma determinada região e espécie (ELLIS, 1984). O serovar de Leptospira sp. mais frequentemente encontrado em bovinos é o Hardjo, do qual os bovinos são hospedeiros primários de manutenção (GUERRA, 2009). Duas estirpes do serovar Hardjo, sorologicamente idênticos, mas geneticamente distintos, são aceitas: Leptospira interrogans serovar Hardjo estirpe Hardjoprajitno e Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo estirpe Hardjobovis (BOLIN, 2005). Uma vez na corrente sanguínea, as leptospiras se distribuem por todo o organismo do animal. A localização renal é a mais importante do ponto de vista epidemiológico, pois a urina passa a ser a principal via de eliminação dos

23 23 microrganismos. Os bovinos infectados usualmente eliminam o agente pela urina por tempo prolongado e intermitente, o que determina a contaminação de outros indivíduos e do ambiente (GUERRA, 2009). 2.4 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL A leptospirose bovina é de difícil diagnóstico clínico, uma vez que os sinais são inespecíficos e facilmente confundidos com outras doenças infecciosas abortivas (brucelose, neosporose, diarreia viral bovina, rinotraqueíte infecciosa bovina) e muitas vezes a infecção cursa de forma crônica e subclínica (HARTSKERRL et al., 2011). Em bovinos adultos, frequentemente o único sinal clínico observado é o abortamento ou o natimorto (GUERRA, 2009). Dessa forma, o diagnóstico não deve se basear somente em achados clínicos e um diagnóstico mais preciso exige testes laboratoriais (AGUDELO et al., 2006) Métodos diretos Exame microscópico em campo escuro O exame direto por meio de bacterioscopia em microscopia de campo escuro é tradicionalmente relacionado ao diagnóstico da leptospirose e à detecção da leptospirúria. No entanto, essa técnica apresenta sensibilidade e especificidade muito baixas, requerendo micro-organismos intactos e preferencialmente vivos e uma concentração aproximada de 10 4 leptospiras/ml para visualização. Além disso, a interpretação do exame é subjetiva e dependente da experiência do observador, já que estruturas como fibras têxteis e extrusões celulares podem ser confundidas com o agente. Sendo assim, não é considerado um teste definitivo, devendo ser confirmado por outros testes (HARTSKERRL et al., 2011).

24 Cultura bacteriológica O padrão ouro para se confirmar a infecção por leptospiras em um animal é o isolamento do agente em cultura pura, a partir de materiais clínicos como sangue, urina, fragmentos de órgãos ou de abortos. O meio de Ellinghausen, McCullough, Johnson e Harris (EMJH) é o meio de cultura mais utilizado para o crescimento de leptospiras. O crescimento das leptospiras é lento e as culturas devem ser mantidas por até 24 semanas antes de serem descartadas como negativas (FAINE et al., 2000). Apesar de apresentar alta especificidade(100%), é pouco utilizado devido à baixa sensibilidade (5-50%) e longo período necessário para o crescimento bacteriano (HARTSKERRL et al., 2011). Pode ser utilizado como método confirmatório, associada aos testes sorológicos. O isolamento das bactérias tem importância fundamental nas investigações epidemiológicas, sendo pré-requisito essencial para a identificação da cepa envolvida em surtos ou epidemias, ou mesmo circulante em determinada área geográfica (FAINE et al., 2000). Desta forma, o isolamento das leptospiras têm se mantido restrito a laboratórios especializados, não sendo utilizado como rotina para diagnóstico Reação em cadeia da polimerase (PCR) A PCR vem sendo utilizada de forma crescente para o diagnóstico precoce da leptospirose em várias espécies animais (LILENBAUM et al., 2009; HERNÁNDEZ- RODRÍGUEZ et al., 2011; PINNA et al., 2011). A técnica da PCR apresenta alta sensibilidade e especificidade, permitindo amplificar quantidades mínimas do DNA do microrganismo em diversos tipos de amostras biológicas tais como humor aquoso, urina, soro sanguíneo, líquor e tecidos (GUERRA, 2009). No entanto, apresenta limitações, como a incapacidade de identificar o serovar infectante. Enquanto isto não é significativo para o paciente individualmente, a identificação do serovar tem valor epidemiológico (LEVETT, 2001). A sensibilidade da PCR pode variar de acordo com a escolha dos pares de oligonucleotídeos iniciadores ("primers"), padronização dos reagentes empregados na técnica, seleção do material biológico, forma de conservação e tempo de estocagem da amostra, uma vez que o

25 25 DNA pode facilmente sofrer degradação. Técnicas moleculares podem detectar concentrações na ordem de 10 bactérias por ml (STODDARD et al., 2009). O método consiste na amplificação exponencial in vitro de regiões específicas de DNA em um curto espaço de tempo. Cada ciclo consiste de três fases: 1) desnaturação das fitas de DNA; 2) anelamento dos oligonucleotídeos iniciadores específicos ao DNA molde; 3) síntese do DNA específico utilizando a enzima Taq DNA polimerase. As moléculas amplificadas pela técnica da PCR são facilmente detectadas e identificadas pela eletroforese. Embora a PCR seja um teste ainda dispendioso para o diagnóstico da leptospirose, é um teste preciso, rápido e confiável (HERNÁNDEZ-RODRÍGUEZ et al., 2011) Métodos indiretos ELISA O ELISA utiliza um antígeno leptospírico revestindo as placas de microaglutinação e o soro é colocado em contato com o antígeno, seguindo-se a respectiva incubação e lavagem. A reação inicial antígeno-anticorpo é evidenciada pela utilização de um conjugado marcado com uma enzima e respectivo substrato cromogênico. A intensidade da reação colorimétrica é proporcional à quantidade de anticorpo presente no soro. O ELISA tem como maior vantagem a possibilidade de detectar especificamente anticorpos da classe IgM ou IgG, o que permite inferir há quanto tempo ocorreu a infecção. A utilização de diferentes técnicas na produção de antígenos pelos diferentes pesquisadores fez com que houvesse pouca reprodutibilidade dos resultados (BOMFIM; KO, 2005). Outra desvantagem é que não é capaz de identificar o serovar infectante (GUERRA, 2009) Teste de Soroaglutinação microscópica (SAM) O teste de soroaglutinação microscópica com antígenos vivos é o teste mais utilizado por pesquisadores de todo o mundo para diagnóstico das leptospiroses bovinas, sendo recomendado pela World Health Organization (WHO, 2003) e pela

26 26 OIE (2008). Baseia-se na reação de aglutinação entre os anticorpos presentes no soro do paciente e o antígeno O do LPS de membrana das leptospiras. É realizado pela adição do soro suspeito em diluições crescentes às culturas de diversos serovares de Leptospira sp., utilizando-se sempre as amostras mais comuns na região e procurando incluir ao menos um representante de cada sorogrupo (FAINE et al., 2000; LEVETT, 2001). Sua realização é laboriosa e requer equipamento e pessoal especializado para a manutenção de uma painel de antígenos vivos e leitura do exame (HARTSKEERL et al., 2011), limitando sua realização para centros de pesquisa ou ensino e laboratórios especializados em leptospirose. Embora existam controvérsias quanto á sua capacidade de definir o serovar infectante, já que existem as reações cruzadas entre serovares pertencentes a um mesmo sorogrupo, para fins epidemiológicos considera-se que o serovar com maiores títulos representaria o mais provável serovar infectante no rebanho (GUERRA, 2009). É uma técnica imprecisa devido à subjetividade da interpretação dos resultados e a ausência de um valor preciso de ponto de corte. Os valores de sensibilidade da SAM variam de 40 a 89,2% e a especificidade entre 85,7 e 100% (HERNADÉZ- RODRIGUÉZ et al., 2011). 2.5 CONTROLE O contato direto e indireto com a urina de animais que eliminam o agente é a base para a infecção. Prevenção e controle devem, portanto, focar na redução de fontes infecciosas e na prevenção da penetração de leptospiras em hospedeiros acidentais (GUERRA, 2009). A sua disseminação na criação é caracterizada principalmente pela existência de animais portadores assintomáticos que eliminam o micro-organismo por períodos variáveis pela urina, mantendo a doença endêmica na propriedade (ELLIS et al., 1981). A infecção dos túbulos renais e a excreção de leptospiras na urina de animais carreadores é o ponto chave na transmissão do agente entre animais. Para um controle efetivo o contato direto e indireto com carreadores deve ser limitado, em um programa incluindo a combinação de identificação progressiva de carreadores e tratamento destes com antibiótico (LILENBAUM et al., 2009).

27 27 Sabe-se que proteção vacinal é serovar específica e que as vacinas existentes no mercado consistem de um painel limitado de serovares. Adicionalmente, a proteção imunológica se mantém por um curto período de tempo, o que faz com que vacinações de reforço em intervalos regulares sejam necessárias para a manutenção de títulos de anticorpos (HARTSKEERL et al., 2011). No Brasil as vacinas disponíveis para bovinos apresentam-se de forma polivalente numa composição que varia entre a combinação dos serovares Hardjo, Wolffi, Canicola, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Tarassovi, Pomona, Bataviae, Copenhageni, Pyrogenes e Bratislava, associadas ou não a outras enfermidades (IBR, BVD) (ITV, 2007). A prevenção da leptospirose sem vacinação é muito difícil (ADLER; DE LA PEÑA MOCTEZUMA, 2010). No entanto, quando se tenta fazer o controle de animais positivos para leptospirose apenas com vacinação corre-se o risco de haver o aumento do número de animais atingidos, uma vez que a vacinação não elimina o estágio de portador, por isso recomenda-se o uso de antibiótico em animais infectados (GIRIO et al., 2005). A estreptomicina foi um dos primeiros antibióticos a ser utilizado para a terapia da leptospirose e é considerada, até hoje, uma das melhores opções de tratamento (GIRIO et al., 2005). A dose terapêutica padrão é de 25 mg por kg (MARTINS et al., 2010). O tratamento com antibióticos de todos os animais de um rebanho pode ser economicamente difícil, e efeitos colaterais das drogas utilizadas podem ocorrer, limitando o uso da antibioticoterapia em larga escala. Dessa forma uma identificação acurada dos carreadores é necessária para determinar quais animais devem ser tratados (LILENBAUM et al., 2009).

28 28 3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL Detectar por meio de método molecular (PCR) bovinos carreadores de Leptospira sp. em rebanhos com problemas reprodutivos no estado do Rio de Janeiro. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Testar sorologicamente rebanhos bovinos a fim de identificar aqueles acometidos por leptospirose Identificar a ocorrência de sororretividade para leptospirose e os serovares prevalentes em rebanhos bovinos do estado do Rio de Janeiro Isolar o agente etiológico a partir de urina de animais sororreativos e soronegativos. Analisar por método molecular (PCR) amostras de urina de animais sororreativos e soronegativos. Correlacionar os achados bacteriológicos, moleculares e sorológicos entre si.

29 29 4 MATERIAL E MÉTODOS Esse projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal Fluminense em 14 de Julho de 2011 sob o protocolo n o 100, estando de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório. 4.1 REBANHOS E ANIMAIS Como critério de inclusão foram selecionados rebanhos com histórico de falhas reprodutivas (repetição de cio, abortamentos, nascimento de bezerros fracos), negativos para o exame de brucelose e sem vacinação contra leptospirose há pelo menos um ano, localizados em diversas regiões do estado do Rio de Janeiro. Assim, foram estudados nove rebanhos voltados para produção de leite nos municípios de Resende, Valença e Cachoeiras de Macacu e um total de 1002 animais com idade superior a 24 meses, incluindo animais das raças Jersey, Gir, Girolando e animais Sem Raça Definida (SRD), sob manejo extensivo, semi-intensivo ou intensivo como apresentado na Tabela 1.

30 30 Tabela 1- Municípios, raças e tipo de manejo de rebanhos bovinos testados pela SAM no estado do Rio de Janeiro, entre 2010 e Rebanho Município Raças Tipo de Manejo A Cachoeiras De Macacu SRD Extensivo B Resende Girolando Semi-intensivo C Resende SRD Extensivo D Resende SRD Extensivo E Resende SRD Extensivo F Valença Gir e Girolando Semi-intensivo G Resende SRD Semi-intensivo H Cachoeiras De Macacu Gir e Girolando Semi-intensivo I Cachoeiras De Macacu Jersey Intensivo O estudo foi desenvolvido em duas etapas. Em uma primeira etapa foram testados sorologicamente rebanhos bovinos com problemas reprodutivos a fim de identificar aqueles acometidos por leptospirose. Na segunda etapa do experimento, rebanhos com soro reatividade maior que 10% tiveram animais selecionados para coleta de amostras de urina, dentre os sororreativos e, em alguns rebanhos, também animais soronegativos, para realização de microscopia de campo escuro, cultura bacteriológica e PCR. 4.2 AVALIAÇÃO LABORATORIAL DE AMOSTRAS Sorologia As amostras sanguíneas foram coletadas por meio de punção venosa em tubos plásticos de coleta de sangue à vácuo com capacidade de 10 ml sem anticoagulante (Vacutainer,Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey, EUA) posteriormente identificados e transportados em caixa isotérmica, sob refrigeração, até o laboratório, onde foram centrifugadas para obtenção do soro. A SAM foi realizada de acordo com o procedimento padrão (WHO, 2003). Brevemente, os antígenos vivos utilizados estão apresentados no Quadro 5 e foram mantidos em meio líquido EMJH de acordo com os protocolos recomendados pela OIE (2008). Cepas de referência (serovares) foram cultivadas em EMJH por 5-10 dias numa temperatura de 30 C em estufa D.B.O. (ELETROLAB, São Paulo, SP) até o

31 31 crescimento na densidade de 1-2 x 10 8 leptospiras por mililitro. As culturas foram examinadas microscopicamente para assegurar que estavam livres de autoaglutinação e contaminação; e subculturas eram realizadas semanalmente. Para cada reação foram utilizados soros-padrão positivo e negativo, além disso, foi utilizado um controle negativo, empregando-se solução salina tamponada (NaCl 0,9%) às reações. Cada amostra de soro foi inicialmente diluída a 1:50 em solução salina tamponada. Após esta etapa, uma alíquota desta diluição contendo 50 μl foi adicionada em microplacas de vinil de fundo plano contendo 96 poços (Costar, Corning, NY, EUA), logo após, foi acrescentado o mesmo volume de cada antígeno correspondente nos poços obedecendo à marcação das placas, obtendo-se uma diluição final de 1:100. Cada amostra sorológica foi testada frente à bateria antigênica com 24 sorotipos. As microplacas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37 C por 90 minutos. Cada amostra foi observada em microscopia de campo escuro e classificada de acordo com os procedimentos descritos a seguir. Apenas laboratoristas experientes participaram da avaliação de sororreatividade. Os procedimentos operacionais para manutenção dos antígenos e a avaliação da aglutinação estão descritos nos procedimentos operacionais padrão do laboratório de realização do presente estudo. As leituras foram realizadas em microscópico óptico (Zeiss, Standort Göttingen, Vertrieb, Alemanha), com condensador seco de campo escuro, em magnificação máxima de 200 vezes, observando-se a formação de aglutinações. Amostras sorológicas foram triadas na diluição de 1:100 e, aquelas que apresentavam nível de aglutinação igual ou superior a 50% eram então, novamente diluídas numa razão geométrica de dois (1:200; 1:400 e 1:800). O título sorológico foi representado para recíproca da maior diluição que apresentou resultado positivo. Adicionalmente, o último nível de diluição das amostras foi 1:800, logo, amostras que apresentaram reatividade nesta diluição foram classificadas como 800.

32 32 Quadro 5- Bateria de antígenos (serovares) utilizados no teste de Soroaglutinação Microscópica em rebanhos bovinos do estado do Rio de Janeiro. Serovar Sorogrupo Amostra referência Espécie Australis Australis Ballico L. interrogans Bratislava Australis Jez Bratislava L. interrogans Copenhageni Icterohaemorrhagiae M 20 L. interrogans Guaricurus Sejroe Bov. G L. santarosai Hardjo Sejroe Hardjoprajitno L. interrogans Hebdomadis Hebdomadis Hebdomadis L. interrogans Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae RGA L. interrogans Pomona Pomona Pomona L. interrogans Dentro de um rebanho, o serovar predominante foi aquele que apresentou o maior número de animais sororreativos, e em nível individual o serovar considerado infectante foi aquele que apresentou o maior título Colheita de urina As amostras de urina foram coletadas mediante prévia higienização da genitália externa (água e secagem com papel toalha) e administração intravenosa de Furosemida 0,5mg/Kg, desprezando-se os primeiros jatos da micção e coletando-se aproximadamente 40mL de urina em tubo cônico estéril descartável de 50mL(BD,Franklin Lakes,EUA). Alíquotas das amostras foram imediatamente diluídas a 1:10 em meio estoque e transportadas até o laboratório em até quatro horas. Alíquotas de urina (1,0 ml) também foram acondicionadas em microtubos plásticos (Eppendorf, São Paulo, SP) de 1,5 ml e mantidas refrigeradas até o laboratório onde foram armazenadas a -15ºC até o momento do processamento da PCR.

33 Bacterioscopia e Isolamento O exame direto por meio de bacterioscopia em microscopia de campos escuro foi realizado, em até 4 horas após a coleta das amostras, no Laboratório de Bacteriologia Veterinária do Instituto Biomédico da Universidade Federal Fluminense, na tentativa de observação do agente. Para o isolamento foi utilizado o protocolo de diluição seriada (FAINE et al. 200) onde a partir de cada amostra de urina foi semeado em séries de diluições na razão de 1:10, 1:100 e 1:1000 em três tubos sequenciais contendo 4,5 ml de meio de cultura estoque. A partir dessas diluições de meio estoque foram feitos repiques de 0,5 ml em três tubos sequências (1:10, 1:100, 1:1000) contendo 4,5 ml de meio EMJH e o mesmo procedimento foi repetido para meio Fletcher (Anexo 1). Os tubos foram mantidos a 30 C em estufa D.B.O. (ELETROlab ) e analisados em microscopia de campo escuro semanalmente por até 24 semanas. As amostras suspeitas foram repicadas em subcultivos e observadas da mesma forma. Em locais onde a estrutura física permitiu o processamento bacteriológico, o exame direto e o protocolo de diluição seriada foram realizados na própria fazenda, minimizando dessa forma possibilidades de degradação do agente em virtude do tempo de transporte Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Para a realização da PCR foram empregados iniciadores específicos do gene LipL32 descritos por Stoddard et al. (2009), LipL32_45F 5 AAG CAT TAC CGC TTG TGG TG 3 e o LipL32_286R 5 GAA CTC CCA TTT CAG CGA TT 3, os quais geram um fragmento de 242pb. O método foi realizado de acordo com Hamond et al. (2011). Foi utilizado um volume de 25 µl de solução contendo: 300 µm de cada desoxinucleotídeo (Invitrogen, Carlsbad, EUA), 75 mm de TrisHCl,50 mm de KCl,20mM de (NH4) 2 SO4, 2,4mM de MgCl2, 0,6 µm de cada primer (Integrated DNA Technologies, Coral ville, EUA), 1 unidade de Taq DNA polimerase (Biotools B&M Labs, SA,Valle de Tobalina, Espanha), controle interno (20fg) que gera um fragmento 754pb e 3,0µL de DNA extraído da amostra clínica.

34 34 Para cada conjunto de amostras, água ultrapura (UltraPure DEPCtreatedWater, Invitrogen, Van Allen Way Carlsbad, CA, USA) foi utilizada como controle negativo, enquanto 10fg de DNA extraído de Leptospira interrogans serovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130 foi utilizado como controle positivo.todas as (AppliedBiosystems, Foster City, EUA). Protocolo da reação da PCR: Um ciclo de desnaturação inicial a 95 C por cinco minutos e 35 ciclos com 30 segundos de desnaturação a 94 C, 30 segundos de anelamento do primer a 53 C e um minuto de extensão do primer a 72 C e um ciclo de extensão final a 72 C durante cinco minutos. O volume total de reação de cada amostra foi analisado por eletroforese em gel de agarose (1,5%) dissolvido em TAE 1X tampão (40mM Tris-acetado, 1mM EDTA). Após a reação de PCR a amostra foi preparada para eletroforese com a adição de 5µl de tampão de corrida (Loadingbuffer: 0,1% Azul de bromofenol, glicerol e água destilada q.s.p) em 25µl da reação. A seguir as amostras e o padrão de peso molecular 1Kb DNA Ladder (Invitrogen) foram aplicados em gel de agarose e submetidos a eletroforese com 5v/cm² (110v por 45 minutos) em uma cuba horizontal (Biorad Ampla Mini-Sub Célula GT) com tampão TAE 1x (40mM Trisacetado e 1mM EDTA). Em seguida, os géis foram incubados em uma solução de brometo de etídio 0,5µg/ml, e analisadas em transiluminador de luz ultravioleta (LTB - 21x26 HE, Loccus Biotecnologia, São Paulo, Brasil) e fotografadas no foto documentador (L-Pix HE, Loccus Biotecnologia, São Paulo, Brasil) para posterior análise dos resultados.

35 35 5 RESULTADOS Os principais problemas reprodutivos relatados pelos proprietários foram repetições de cio (aumento de intervalo entre partos) e abortamentos esporádicos. Em função do regime extensivo ou semi-intensivo observado na maioria dos rebanhos, e a ausência de dados confiáveis por parte dos proprietários, os dados exatos referentes a ocorrência de tais problemas não foram obtidos. Dentre os 1002 animais testados, 328 (32,7%) apresentaram títulos de anticorpos 100, e em oito dos nove rebanhos testados (88,9%) pelo menos um animal apresentou sororreatividade. Os percentuais de animais reagentes por rebanho variou entre 5,8% e 54,8%. Hardjo foi o serovar predominante em sete das oito propriedades que apresentaram alguma sororreatividade, totalizando 90,2% dos animais reativos para esse serovar; reatividade menos expressiva foi observada para outros serovares, como Icterohaemorrhagiae (3,1%), Bratislava (2,7%) e Pomona (2,1%). Os serovares Copenhageni, Guaicurus e Hebdomadis foram reativos em menos de 1% e os outros serovares incluídos na bateria de antígenos não tiveram reação observada (Tabela 2).

36 36 Tabela 2- Frequência de aglutininas anti-leptospira (SAM) e serovar predominante em nove rebanhos bovinos no estado do Rio de Janeiro, Rebanho Animais Testados Sororreatividade (%) Serovar Predominante A 25 44,0% Hardjo B ,1% Hardjo C 31 54,8% Hardjo D 50 14,0% Hardjo E 52 5,7% Hardjo F ,0% Hardjo G 15 0,0% - H 36 50,0% Hardjo I 32 6,2% Icterohaemorrhagiae TOTAL ,7% Um total de 139 amostras de urina foi coletado para cultura bacteriológica e PCR. Das 139 amostras de urina testadas pela PCR, 28 (20,14%) foram positivas (Tabela 3). Tabela 3 - Diagnóstico direto (MCE e PCR) em amostras de urina de rebanhos bovinos do estado do Rio de Janeiro, REBANHO AMOSTRAS MCEpos* PCR pos MCEpos + e PCRpos** A B C D F H TOTAL *(MCEpos) Microscopia de Campo Escuro positiva;** Positivo no Exame direto e na PCR Vinte e quatro amostras (17,3%), todas pertencentes a um mesmo rebanho (F, município de Valença) foram positivas no exame direto (Tabela 4), embora nenhum cultivo tenha apresentado crescimento.