Extração Supercrítica de Avocatinas: um antibiótico obtido do caroço de abacate

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1 Extração Supercrítica de Avocatinas: um antibiótico obtido do caroço de abacate Danilo G. P. Carneiro 1, Pedro L. M. Penedo 2, Regina C. A. Lago 3 & Gerson L. V. Coelho 4 1. Bolsista de Iniciação Científica, PIBIC/CNPq; 2. Departamento de Química, UBM, Centro Universitário de Barra Mansa, R. Adolfo Klotz, 444/103, Santa Rosa, Barra Mansa, RJ, , Brasil; 3. Embrapa-Alimentos, Av. das Américas 29501, Guaratiba, Rio de Janeiro, RJ, Brasil; 4. Lab. de Processos de Separação, DTQ/UFRRJ, Antiga Rio- São Paulo, Km 47, Seropédica, RJ, , Brasil. Fax: coelho@ufrrj.br. Palavras-chave: supercritical carbon dioxide, avocatin. Abstract Supercritical carbon dioxide was used to extract avocado essential oil and also the avocatins a new class of natural products, present in the stone of the avocado fruit. The antimicrobial activity of the avocations is well known. The experiments taken into account several parameters such as the properties of the stone (e.g., particle size, moisture content), operating conditions (e.g., pressure, temperature, extraction time, raw material/solvent ration) and the yield of the extracts. Previous experiments used the temperature of 50 o C, to avoid the decomposition of the extracts. An apparatus consisted of a 750ml vessel was used and samples of 130g of stone from avocado were taken. The sample was ground, sieved and classified in two particle size as <28 mesh and mesh. Was used stone from avocado ground and fresh (humidity about 60%) and dry at 50 o C during 24 hours. The pressure was settled at 55, 75, 85, and 120bar. The pressure at 105 bar showed the best for the avocatins compositions. Introdução A extração com fluidos supercríticos permite contornar problemas ocorridos nos processos tradicionais, como a presença de resíduos de solventes em produtos acabados, a necessidade de etapas de purificação em extrações que utilizam solventes pouco seletivos e a degradação de substâncias, causadas por condições drásticas de operação, como a utilização de elevadas temperaturas em processos de destilação. A seletividade oferecida pela extração utilizando fluidos supercríticos atrai a indústria farmacêutica, que vê a possibilidade de obtenção de compostos ativos com alto teor de pureza. Avocatinas são um grupo de substâncias com atividade antibiótica que demonstram boa eficiência na inibição do crescimento de vários microorganismos, inclusive de alguns patogênicos. A atividade antibiótica das avocatinas, assim como de alguns de seus derivados, foi testada. No extrato metanólico do caroço de abacate, ALVES et al. (1970) encontraram, além de outras, quatro avocatinas com anel furânico, duas das quais já haviam sido isoladas por KASHMAN et al. (1969). No extrato hexânico do caroço de abacate oito avocatinas furânicas foram identificadas por QUEIROZ et al. (1994). O extrato exibiu atividade antibiótica contra diversos microorganismos contaminantes de alimentos. FARINES et al. (1995) identificaram sete entre nove avocatinas presentes no óleo de frutos secos do abacate. QUEIROZ et al. (1998) compararam três métodos de extração de avocatinas furânicas: maceração em hexano, Soxhlet (éter de petróleo) e arraste a vapor (Clevenger modificado). Este último método ofereceu um extrato rico em avocatinas furânicas, porém com baixo rendimento. O extrato continha, ainda, monoterpenos e sesquiterpenos. Inúmeros trabalhos têm sido recentemente publicados sobre aplicação de fluido supercrítico na obtenção e fracionamento de óleos essenciais, produtos convencionalmente extraídos por arraste a vapor. O objetivo deste trabalho foi verificar a possibilidade de extrair avocatinas do caroço de abacate com dióxido de carbono supercrítico bem como o de estudar a seletividade do solvente face à mistura de monoterpenos, sesquiterpenos e avocatinas presentes no mesmo. Material e Métodos A unidade utilizada é de microextração contínua, com tomada de amostra da fase extrato do tipo on-line, acoplada com um cromatógrafo a gás de coluna capilar 273 v. 11, n. 2, p , 2001

2 (figura 1). A análise simultânea do material extraído elimina a necessidade de coleta dos extratos e posterior manuseio, possibilitando assim que todas as substâncias, inclusive as mais voláteis, sejam identificadas e quantificadas. Frutos de abacate adquiridos sem identificação, foi a primeira matériaprima a ser usada. Os caroços foram separados manualmente dos frutos e moídos em processador doméstico. O material moído foi classificado em peneiras. plásticos próprios para freezer e estocados.o caroço fresco submetido ao arraste com vapor d água, em balões contendo ca. de 2 kg de amostra, conduziram a 0,125g de óleo essencial, eqüivalendo a um rendimento de 0,003% (base úmida) ou 0,007 (base seca). Para comparação, procedeu-se à extração do mesmo material, em extrator tipo Butt, obtendo-se 0,29% de extrato etéreo (base úmida) ou 0,7% (base seca). O caroço seco, extraído nas mesmas condições, rendeu 0,57% de extrato etéreo, mostrando uma extração menos eficiente. Resultados e Discussão Figura 1: Diagrama esquemático da unidade contínua com tomada on-line. Onde: CA - compressor de ar comprimido, BP - bomba pneumática, UM - unidade de extração, VL - tomada de amostra líquida, VG - tomada de amostra gasosa, CG - cilindro de CO 2. O material foi secado em estufa à 50 o C, durante 24horas. Os experimentos preliminares foram conduzidos no extrator com capacidade de 750ml, sempre com 130g de amostra. A temperatura foi fixada em 50 o C. As extrações foram monitoradas por análise gás-cromatográfica (coluna sílica fundida SE- 54, 25m, o C, inj. 280 o C, det. 300 o C). A partir daí, os experimentos foram repetidos, com matériaprima adquirida da Ceasa, RJ (Distribuidora Nipo- Brasileira).O caroço separado da polpa foi moído em processador de laboratório, ensacado em sacos Verificou-se que, no material fresco, a granulometria de mesh comportou-se melhor do que a de <28 mesh. A pressão de 95bar mostrou maior seletividade para o grupo das avocatinas, ao contrário das anteriores quando predominava no extrato, sobretudo, os componentes monoterpênicos. No material seco, confirmou-se que a pressão de 95bar foi a mais seletiva, quando comparadas as de 55 e 75bar. Para as mesmas condições de pressão o desempenho do material seco foi superior. A água, portanto, presente em maior quantidade no caroço fresco, tem uma ação anti-solvente, isto é, prejudica a ação do CO2 supercrítico. O extrato foi analisado por CGL (cromatografia gás-líquido), em equipamento HP O cromatograma mostrou a presença de 0,77% de monoterpenos, 6,95% de sesquiterpenos e 92,12% de avocatinas furânicas. A umidade de caroço fresco, determinada por arraste com tolueno, foi de 58%. A secagem do caroço foi efetuada em estufa com ventilação, a 50 o C. Foram obtidos material com dois níves de umidade: 31,6% e 0,66%. Variou-se em seguida a faixa de pressão em intervalos menores de 10bar, ou seja, 85 e 105. Os resultados com pressão de 105bar, em termos de avocatinas furânicas, foram, até então, os melhores obtidos (Tabela 1). Nos experimentos de extração com CO2 supercrítico (CO2-SC) a relação massa de caroço/solvente variou de 1,76 a 0,

3 TABELA 1. Composição das frações obtidas nas extrações com CO2 SC de caroço de abacate moído. Extração Monoterpenos Tr até 28min Sesquiterpenos Tr 15-28min Avocatinas furânicas Tr 28-38min Outras substâncias Tr > 38min Área total, sem solvente 1 53,44 5,44 1,82 39,30 32, ,79 2,49 2,90 41,82 9, ,55 10,19 3,90 52,35 41, ,18 4,28 3,10 22,43 14, ,83 13,29 17,14 21,74 74,, ,66 12,22 38,08 22,03 65, ,89 0,75 6,07 4,29 14, ,59 13,71 3,12 7,58 20, ,57 22,95 23,24 4,23 5, ,19 1,08 2,86 0,87 13, ,32 5,28 8,83 6,57 9, ,66 10,09 49,33 5,92 10,73621 Para se analisar os efeitos da pressão, tempo e temperatura, na taxa de extração das avocatinas do caroço de abacate seco e fresco adotou-se um delineamento experimental do tipo fatorial completo com 2 e 3 níveis (Tabela 2). TABELA 2. Planejamento experimental, com 2 e 3 níveis, para seleção dos parâmetros de extração das avocatinas do caroço de abacate seco (umidade 0,66) e fresco (umidade 58%). Parâmetros Nível inferior (-) nível central (0) Nível superior (+) Pressão (bar) Tempo (min) Temperatura ( C) Apenas os parâmetros com significância superior a 95% (p<0,05) foram considerados relevantes. As Tabelas 3 e 4 mostram os resultados de extração de avocatinas do caroço seco e fresco, respectivamente, com CO2 supercrítico, cuja análise da variância e discussão detalhada é visto em PENEDO (2001). 275 v. 11, n. 2, p , 2001

4 TABELA 3. Resultados experimentais obtidos a partir do planejamento fatorial completo para avaliar os parâmetros de extração das avocatinas do caroço de abacate seco. Pressão (bar) Temperatura Tempo Monoterpenos Sesquiterpenos Avocatinas ( o C) (min) TABELA 4. Resultados experimentais obtidos a partir do planejamento fatorial completo para avaliar os parâmetros de extração das avocatinas do caroço de abacate fresco. Pressão (bar) Temperatura Tempo Monoterpenos Sesquiterpenos Avocatinas. ( C) (min)

5 De acordo com a análise de efeitos pode-se concluir, em relação ao caroço seco, que a taxa de extração das avocatinas tem um perfil parabólico em relação à pressão. Isto significa que: o valor da taxa de extração apresenta uma região de valores máximos na pressão correspondente a 100 bar; a taxa de extração é suavemente crescente quando se aumenta os valores das variáveis tempo e temperatura. Pode-se concluir a partir dos dados experimentais que: das avocatinas do caroço seco foram em média 266 e 143%, quando se variou a pressão de 50 para 100bar respectivamente nas temperaturas de 50 e 80 o C; das avocatinas do caroço seco foram em média 98, 53 e 30% quando se variou a temperatura de 50 para 80 o C, respectivamente, nas pressões de 50, 100 e 150bar; O aumento percentual máximo na taxa de extração das avocatinas do caroço seco, em relação ao tempo de extração, foi observado quando se passou de 15 para 45 minutos (cerca de 27%), na temperatura de 50 o C e pressão de 50bar. De acordo com a análise de efeitos pode-se concluir, em relação ao caroço fresco, que a taxa de extração das avocatinas tem um perfil parabólico em relação à pressão. Isto significa que: o valor da taxa de extração apresenta uma região de valores máximos na pressão correspondente a 100 bar; a taxa de extração é ligeiramente crescente quando se aumenta os valores das variáveis tempo e temperatura. Pode-se concluir a partir dos dados experimentais que: das avocatinas do caroço fresco foram em média 273 e 147%, quando se variou a pressão de 50 para 100 bar respectivamente nas temperaturas de 50 e 80 o C; das avocatinas do caroço fresco foram em média 52, 3 e 5% quando se variou a temperatura de 50 para 80 o C, respectivamente, nas pressões de 50, 100 e 150 bar; O aumento percentual máximo na taxa de extração das avocatinas do caroço fresco, em relação ao tempo, foi observado quando se passou de 45 para 75 minutos (cerca de 73%), na temperatura de 50 o C e pressão de 50 bar. As Figuras 2 e 3 apresentam, sob a forma de barras, os resultados obtidos para extração de monoterpenos e sesquiterpenos, nas condições experimentais indicadas para se obter a taxa máxima de extração de avocatinas do caroço de abacate seco e fresco, respectivamente. Na Figura 4 é comparada a taxa de extração de avocatinas para o caroço seco e fresco de abacate, podendo-se observar que a taxa de extração das avocatinas do caroço fresco foi menos sensível à variação na temperatura do que a do caroço seco. 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 MONO SESQUI AVOCATINAS 50 ºC 80 ºC Figura 2. Resultados obtidos da extração do caroço de abacate seco (p=100 bar). 277 v. 11, n. 2, p , 2001

6 45,00 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 Figura 3. Resultados obtidos da extração do caroço de abacate fresco (p=100 bar). 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 MONO SESQUI AVOCATINAS fresco seco 50 ºC 80 ºC 50 ºC 80 ºC Figura 4. Comparação entre a taxa de extração de avocatinas para o caroço seco e fresco de abacate (p=100 bar). Conclusões Este trabalho alcançou seu objetivo. As avocatinas do caroço do abacate foram extraídas utilizando dióxido de carbono supercrítico, que é um processo alternativo e de grande interesse industrial. Neste caso específico, o interesse maior é da indústria farmacêutica pelo fato das avocatinas furânicas possuírem alta atividade antibiótica, inclusive em bactérias patogênicas ao ser humano. De acordo com experimentos realizados, foi possível determinar as condições ótimas de fracionamento. Obtivemos melhores resultados quando realizamos experimentos nas condições de 100 bar de pressão e 80ºC de temperatura e com caroço de abacate seco. O rendimento alcançado ficou em torno de 54% do produto desejado. Agradecimentos e Auxílio Financeiro Agradecimentos ao PIBIC/CNPq pela bolsa de iniciação científica, as equipes do Laboratório de Processos de Separação do DTQ/IT e do CTAA/ Embrapa que possibilitaram a execução deste trabalho. Referências Bibliográficas ALVES, M.; COXON, D.T.; FALSHAW, C.P.; ODTFREDSEN, W.O.; OLLIS, W.D. The avocatins a new class of natural products. An. Acad. Bras. Cienc., 42 (supl.), 45-48, FARINES, M.; SOULIER, J.; RANCUREL, A.; MONTADOUIN, M.G.; LEBORGNE, L. Influence of avocado oil processing on the nature of some unsaponifiable constituents. J. Am. Oil Chem. Soc., 72, 4, , KASHMAN, Y.; NÉEMAN, I.; LIFSHITZ, A. Six new c17-olefinic and acetylenic oxygenated compounds from avocado pear. Israel J. Chem., 7, , PENEDO, P.L.M. Dissertação de Dr. Sc., UFRRJ, (submetida), QUEIROZ, A.P. DE A.; MARÇANO, M.M.; LAGO, R.C.C.; PINTO, A.C. Atividade antibiótica do caroço de abacate (var. hass). Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 14, 149, QUEIROZ, A.P. DE A.; TORQUILHO, D.F.; LAGO, R.C.A. Comparação entre três métodos de extração de avocatinas do caroço do abacate (Persea americana Mill.). Reunião anual da sociedade brasileira de química, 2, 139,