NATAMICINA E BIOMAX D NO CONTROLE DO DESENVOLVIMENTO DE FUNGOS EM SALAME

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1 NATAMICINA E BIOMAX D NO CONTROLE DO DESENVOLVIMENTO DE FUNGOS EM SALAME L. Schittler 1, V. Lando 1, R. Pezenatto 1, A.P. Kempka 1, L. Bagatini 1, W.P. Silva 2 1-Departamento de Engenharia de Alimentos e Engenharia Química - Universidade do Estado de Santa Catarina- CEP: Pinhalzinho SC Brasil - Telefone: 55 (49) Fax: 5555 (49) e- mail: (liziane.schittler@udesc.br) 2- Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial, Universidade Federal de Pelotas CEP: Pelotas RS Brasil - Telefone: 55 (49) Fax: 00 (00) (wladimir@pq.cnpq.br) RESUMO Avaliou-se a atividade antifúngica da natamicina e do Biomax D em salame, bem como a influência da forma de aplicação, aspersão ou imersão, desses antimicrobianos no produto. Para isso, os envoltórios ou os salames foram submetidos a cinco tratamentos: T1: sem aplicação dos antimicrobianos; T2: aspersão de 2,5 ml de natamicina 0,1 % (p/v) por peça de salame; T3: aspersão de 2,5 ml de Biomax D 1,5 % (v/v) por peça de salame; T4: imersão do envoltório por 60 min em 0,1% (p/v) de natamicina; e T5: imersão do envoltório por 60 min em 1,5 % (v/v) de Biomax D. As contagens médias de bactérias ácido láticas e de bolores e leveduras durante o tempo de maturação, variaram entre 7,00 e 7,79 e 1,5 e 7,87 log UFC.g -1, respectivamente. Verificou-se que a natamicina apresentou atividade antifúngica quando o antimicrobiano foi aplicado por imersão dos envoltórios do salame. ABSTRACT The antifungal activity of natamicin and Biomax D in salami was evaluated as well as the influence of the application mode, sprinkling or immersion, of these antimicrobials in product. The wrap or salamis underwent five treatments: T1: no application of antimicrobials; T2: spraying 2.5 ml of natamycin 0,1% (w / v) per salami; T3: spraying 2.5 ml of Biomax D 1.5% (v / v) per salami; T4: wrap immersion for 60 min in natamicin 0.1% (w / v); and T5: wrap immersion for 60 min in Biomax D 1.5% (v / v). The mean counts of lactic acid bacteria and yeasts and molds during the ripening time ranged between 7.00 and 7.79, and 1.5 and 7.87 log CFU g -1, respectively. It was found that natamycin showed antifungal activity when the antimicrobial was applied by dipping the sausage wraps. PALAVRAS-CHAVE: antifúngicos; antimicrobianos; BAL; bolores; leveduras. KEYWORDS: antifungal; antimicrobials; LAB; mofo; yeasts. 1. INTRODUÇÃO O salame é um alimento tradicional em nosso país, principalmente na região sul, que foi colonizada por imigrantes alemães e italianos, e que trouxeram o hábito do consumo deste produto, bem como as técnicas de produção. Embora seja muito produzido por agroindústrias familiares, estas

2 enfrentam dificuldade em garantir a aparência adequada dos produtos durante o período de comercialização, principalmente pela presença de fungos na sua superfície. Os fungos (bolores e leveduras), são micro-organismos eucariontes, e sua proliferação na superfície dos salames é favorecida pelas condições ambientais e pela disponibilidade de matéria orgânica. O seu desenvolvimento durante o tempo de maturação é proveniente da contaminação natural do ar. A presença de bolores e leveduras na superfície do produto diminui a sua atratividade por parte dos consumidores, fazendo com que estes optem por produtos de outras marcas. Dessa forma, muitas agroindústrias acabam incluindo uma etapa de lavagem do salame, após o período de maturação, visando à retirada dos fungos. A inclusão desta nova etapa no processo de elaboração do produto eleva os custos de produção, bem como altera o seu prazo de entrega. Outra alternativa que vem sendo estudada é a utilização de substâncias antifúngicas, como a natamicina e o Biomax D, aplicados na superfície ou nos envoltórios do salame. A natamicina é um antibiótico de baixa toxicidade, não alergênico e que não desenvolve resistência, aprovado pela OMS (Organização Mundial da Saúde) e pela legislação brasileira, que vem sendo empregado em diversos países no controle de fungos em diferentes tipos de alimentos (Food Ingredients Brasil, 2010). O Biomax D não altera a cor, sabor e odor dos alimentos e tem sido utilizado no controle de bolores e leveduras na indústria de panificação, entretanto, também apresenta atividade antimicrobiana contra bactérias, como Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Streptococcus hemolyticus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Listeria monocytogenes (Prozin, 2013). Esse produto é comercializado no Brasil, e não necessita registro, por apresentar extratos de plantas em sua formulação, conforme preconiza a Resolução nº 23, de 15 de março de 2000, que dispõe sobre Procedimentos básicos registro e dispensa da obrigatoriedade de registro de produtos pertinentes à área de alimentos (Brasil, 2000). Devido ao exposto, este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antifúngica da natamicina e do Biomax D em salame, bem como a influência da forma de aplicação, aspersão ou imersão, desses antimicrobianos no produto. 2. MATERIAL E MÉTODOS Os antimicrobianos natamicina e o produto composto por extrato de pomelo e ácido ascórbico, comercializados como Natamicina DSM e Biomax D, respectivamente, foram fornecidos gentilmente pelas empresas Globalfood Sistemas, Ingredientes e Tecnologia para Alimentos Ltda, e Prozyn Indústria e Comércio Ltda, respectivamente. O envoltório natural foi adquirido no comércio local da cidade de Nova Erechim SC, Brasil. Os salames foram elaborados em uma agroindústria de Nova Erechim, utilizando-se carne suína, toucinho, nitrito, nitrato, sal, pimenta, alho, noz-moscada, açúcar, eritorbato de sódio, ácido eritórbico, maltodextrina e dextrose. A massa foi embutida em envoltório natural e cada peça apresentou, aproximadamente, 300g. A atividade antifúngica da natamicina e do Biomax D foi avaliada através de cinco tratamentos: Tratamento 1: salame sem aplicação dos antimicrobianos; Tratamento 2: aspersão de 2,5 ml de natamicina 0,1 % (p/v) em cada peça de salame; Tratamento 3: aspersão de 2,5 ml de Biomax D 1,5 % (v/v) em cada peça de salame; Tratamento 4: imersão do envoltório por 60 min em solução de 0,1% (p/v) de natamicina e, posteriormente, embutimento da massa; Tratamento 5: imersão do envoltório por 60 min em solução de 1,5 % (v/v) de Biomax D e, posteriormente, embutimento da massa. Após o embutimento, os salames foram pendurados em varas e submetidos à defumação em fumeiro durante 12 horas a temperaturas entre 55 e 60 C. Após a defumação, os salames permaneceram em sala de maturação com temperaturas entre 28 e 36 C por 14 dias. O experimento foi realizado em duplicata, com salames fabricados em datas diferentes.

3 As análises de contagem de bactérias ácido láticas (BAL) e de bolores e leveduras, bem como a análise de ph, foram realizadas logo após o preparo dos tratamentos (tempo zero), no sétimo e no décimo quarto dia de maturação. Para a contagem de BAL e de bolores e leveduras, foram transferidas, assepticamente, 25g de amostra de cada tratamento para sacos plásticos esterilizados tipo stomacher, e adicionou-se 225 ml de solução salina peptonada a 0,1%. Foram inoculados 0,1 ml das diluições apropriadas na superfície das placas de Petri contendo ágar Man, Rogosa and Sharpe (MRS/Oxoid) e ágar Batata Dextrose (AB/Merck), as quais foram incubadas a 36±1 C e 25±1 C por 48 h e 5 dias, respectivamente. As placas que apresentaram colônias foram contadas e o resultado foi expresso em log UFC.g -1. Para a análise de ph, as amostras foram preparadas e avaliadas conforme recomendações do fabricante do phmetro mpa210 Tecnopon. Os resultados das contagens de BAL e de bolores e leveduras, bem como de ph, foram submetidos a análise de variância (ANOVA), seguida do teste de Tukey, com nível de 95% de confiabilidade, utilizando-se o software livre Assistat 7.7beta. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Na Tabela 1 podem ser visualizadas as médias das contagens de BAL nos salames submetidos aos tratamentos com e sem os antimicrobianos natamicina e Biomax D, aplicados por aspersão ou imersão dos envoltórios, nos tempos zero (logo após o preparo), sétimo e 14 dia de maturação. A média das contagens de BAL durante os 14 dias de maturação variou entre 7,0 e 7,79 log UFC.g -1 (Tabela1). Resultados semelhantes foram relatados por Rantsiou e Cocolin (2006), que obtiveram contagens de BAL entre 7 e 8 log UFC.g -1 em salame fermentado, as quais mantiveram-se estáveis durante o período de maturação de 24 dias. De acordo com os resultados, podemos inferir que os antimicrobianos natamicina e Biomax D não influenciam negativamente na multiplicação das BAL durante o período de maturação do salame. Tabela 1. Médias das contagens (log 10 UFC.g -1 ) de bactérias ácido láticas em salames após os tratamentos com e sem os antimicrobianos natamicina e Biomax D aplicados por aspersão ou imersão dos envoltórios nos tempos zero (logo após o preparo), sétimo e 14 dia de maturação Tratamentos Tempo (dias) Sem aplicação de antimicrobianos 7,00 aab ±0,98 7,15 aab ±0,39 7,45 aa ±0,34 Aspersão de natamicina 0,1 % (p/v) no salame 7,11 ac ±0,12 7,21 abab ±0,02 7,46 ba ±0,05 Aspersão de Biomax D 1,5 % (v/v) no salame 7,31 abc ±0,12 7,22 aab ±0,03 7,13 aa ±0,02 Imersão do envoltório em natamicina 0,1 % (p/v) 7,61 aab ±0,00 7,35 ab ±0,49 7,55 aab ±0,49 Imersão do envoltório em Biomax D 1,5 % (v/v) 7,79 aa ±0,07 7,70 aa ±0,27 7,60 aa ±0,09 AB Letras maiúsculas diferentes nas colunas indicam diferença estatística pelo teste de Tukey (p<0,05) entre os tratamentos. ab Letras minúsculas diferentes nas linhas indicam diferença estatística pelo teste Tukey (p<0,05) entre o tempos de maturação. Letras iguais não diferem entre si significativamente. O salame é um produto fermentado, cuja fermentação pode ocorrer por bactérias naturalmente presentes na matéria-prima ou pode-se adicionar culturas iniciadoras, que além de proporcionarem

4 mudanças metabólicas e sensoriais no produto, também podem apresentar um efeito de preservação (Vásquez, 2009). O grupo de bactérias iniciadoras é formado pelas bactérias ácido láticas (BAL), as quais apresentam a capacidade de fermentar carboidratos presentes no meio com a produção de ácidos orgânicos, como o ácido láctico. O ácido láctico realça o sabor, a cor, a fatiabilidade e o aroma do produto cárneo fermentado (Terra, 2000), além de contribuir para o controle do desenvolvimento de micro-organismos patogênicos (McMullen e Stiles, 1996). Dessa forma, é de grande relevância avaliar se o antifúngico utilizado não interfere na multiplicação das BAL. Na Tabela 2, estão apresentadas as médias das contagens de bolores e leveduras nos salames submetidos aos tratamentos com e sem os antimicrobianos natamicina e Biomax D aplicados por aspersão ou imersão dos envoltórios, nos tempos zero (logo após o preparo), sétimo e 14 dia de maturação. As contagens de bolores e leveduras variaram entre 1,5 e 7,87 log UFC.g -1. Houve aumento na contagem de bolores e leveduras durante o período de maturação dos salames. Os salames tratados por aspersão da natamicina, por exemplo, apresentaram, no tempo zero, sétimo e 14 dia, contagens de 2,75, 6,25 e 7,21 log UFC.g -1 de bolores e leveduras, respectivamente (Tabela 2). Houve diferença significativa (p>0,05) entre as médias das contagens de bolores e leveduras no tempo zero, quando comparado ao sétimo e 14 dia de maturação dos salames em todos os tratamentos realizados. Resultados semelhantes foram relatados por Bustolin (2009) em salame tipo italiano tratado com natamicina por aspersão e imersão dos envoltórios, o qual observou um aumento na contagem de bolores e leveduras durante o tempo de maturação, que variou entre 1,65 e 8,16 log UFC.g -1 Tabela 2. Médias das contagens (log 10 UFC.g -1 ) de bolores e leveduras nos salames após os tratamentos com e sem os antimicrobianos natamicina e Biomax D aplicados por aspersão e imersão dos envoltórios nos tempos zero (logo após o preparo), sétimo e 14 dia de maturação Tempo (dias) Tratamentos Sem aplicação de antimicrobianos 2,58 ba ±1,17 7,28 aa ±2,33 7,33 aa ±1,07 Aspersão de natamicina 0,1 % (p/v) no salame 2,75 ca ±0,14 6,25 ba ±0,06 7,21 aa ±0,02 Aspersão de Biomax D 1,5 % (v/v) no salame 2,65 ca ±0,07 6,45 ba ±0,07 7,87 aa ±0,24 Imersão do envoltório em natamicina 0,1 % (p/v) 1,50 ba ±0,70 5,25 ab ±0,49 5,28 ab ±0,05 Imersão do envoltório em Biomax D 1,5 % (v/v) 2,15 ba ±0,21 6,57 aa ±0,21 6,80 aa ±0,00 AB Letras maiúsculas diferentes nas colunas indicam diferença estatística pelo teste de Tukey (p<0,05) entre os tratamentos. ab Letras minúsculas diferentes nas linhas indicam diferença estatística pelo teste Tukey (p<0,05) entre o tempos de maturação. Letras iguais não diferem entre si significativamente. As menores contagens de bolores e leveduras foram obtidas nos salames em que os envoltórios foram tratados com natamicina por imersão, apresentando 1,50, 5,25 e 5,28 log UFC.g -1 (Tabela 2), logo após o preparo do salame, no sétimo e no 14 dia de maturação, respectivamente. Houve diferença significativa (p>0,05) nas contagens de bolores e leveduras em relação aos demais tratamentos, no sétimo e 14 dia de maturação. Este resultado demonstra que a natamicina aplicada nos salames através da imersão dos envoltórios antes do embutimento foi o melhor tratamento para o controle do desenvolvimento de bolores e leveduras. Resultados inferiores foram relatados por Brustolin (2009), que observou que salames tratados com natamicina 1% (p/v) através da imersão dos envoltórios apresentaram contagem de bolores e leveduras de 2,47, 2,68 e 4,74 log UFC.g -1 nos tempos zero, sétimo e 14 dia de

5 maturação, respectivamente. Os valores superiores encontrados neste estudo podem ser explicados por ter sido utilizada pesagem de 25 g da amostra e diluição para a quantificação de bolores e leveduras, enquanto Brustolin (2009) utilizou swab para a coleta da amostra e quantificação dos bolores e leveduras. Verifica-se, na Tabela 2, que não houve diferença significativa (p>0,05) nas contagens de bolores e leveduras entre os tratamentos em que foram utilizados o antimicrobiano Biomax D e a amostra controle, sem aplicação de antimicrobianos. Desta forma, pode-se verificar que o Biomax D não apresenta atividade antifúngica em salame, quando aplicado por aspersão ou imersão na concentração de 1,5%. Destaca-se que a atividade antimicrobiana de uma substância pode ser influenciada pela forma de aplicação, o que foi evidenciado neste estudo. A natamicina 1% apresentou atividade antifúngica quando os envoltórios foram imersos por 60 min antes do embutimento da massa do salame. Já quando foi realizada a aspersão de 1% de natamicina na superfície dos envoltórios do salame, essa substância não apresentou atividade contra bolores e leveduras. Os valores de ph obtidos nos salames submetidos aos tratamentos com e sem os antimicrobianos, variaram entre 4,92 e 6,08, durante os 14 dias de maturação. Observou-se redução do ph nos salames no sétimo dia de maturação em relação ao tempo zero, logo após o preparo, em todos os tratamentos (Tabela 3). Já no 14 dia de maturação dos salames houve um aumento no valor do ph, quando comparado ao sétimo dia. Resultados semelhantes foram obtidos por Campagnol et al. (2007) e Brustolin (2009), que também observaram redução do ph no sétimo dia, bem como o aumento do valor de ph no 14 dia de maturação do salame. Tabela 3. Médias dos valores de ph nos salames submetidos aos tratamentos com e sem os antimicrobianos natamicina e Biomax D aplicados por aspersão ou imersão dos envoltórios nos tempos zero (logo após o preparo), sétimo e 14 dia de maturação Tempo (dias) Tratamentos Salame sem aplicação de antimicrobianos 6,08 aab ±0,47 5,37 aa ±0,86 5,51 aa ±0,68 Aspersão de natamicina 0,1 % (p/v) no salame 5,75 aa ±0,07 5,73 ba ±0,01 5,62 ba ±0,03 Aspersão de Biomax D 1,5 % (v/v) no salame 6,25 aab ±0,02 5,47 ba ±0,18 5,94 aba ±0,01 Imersão do envoltório em natamicina 0,1 % (p/v) 5,75 ab ±0,07 5,02 ba ±0,00 5,15 ba ±0,09 Imersão do envoltório em Biomax D 1,5 % (v/v) 5,71 ab ±0,02 4,92 ba ±0,01 5,20 ca ±0,01 AB Letras maiúsculas diferentes nas colunas indicam diferença estatística pelo teste de Tukey (p<0,05) entre os tratamentos. ab Letras minúsculas diferentes nas linhas indicam diferença estatística pelo teste Tukey (p<0,05) entre o tempos de maturação. Letras iguais não diferem entre si significativamente. A redução de ph, pode ser explicada pela multiplicação de BAL no produto e, consequentemente, produção de ácido láctico (Terra, 2004). Já o aumento de ph no 14º dia de maturação se deve a ação de enzimas proteolíticas sobre a carne produzindo amônia e, consequentemente, aumentando o ph (Campagnol et al., 2007). 4. CONCLUSÕES

6 O Biomax D, na concentração de 1,5%, não apresenta atividade antifúngica quando aplicado por aspersão do produto ou por imersão dos envoltórios de salame. A natamicina apresenta atividade antimicrobiana contra bolores e leveduras em salame na concentração de 1% quando aplicada por imersão dos envoltórios. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Brasil, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. (2000). Resolução nº 23, de 15 de março de 2000 ementa: Dispõe sobre: O Manual de Procedimentos Básicos para Registro e Dispensa da Obrigatoriedade de Registro de Produtos Pertinentes à Área de Alimentos publicação. Diário Oficial da União,16/03/2000. Anexo 1 e 2, p.23. Brasil, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. (2000) Instrução Normativa Nº. 22. Regulamento de Padrão de Identidade e Qualidade de Salames; Brasília.Brustolin, J. C. (2009). Uso de Natamicina no controle do desenvolvimento de fungos em salame tipo italiano (Dissertação de mestrado). Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria. Campagnol, P. C. B., Fries, L. L. M., Terra, N.N., Santos, B. A., Furtado, A. S. (2007). Salame laborado com Lactobacillus plantarum fermentado em meio de cultura de plasma suíno. Food Science and Technology, 27(4), Celles, R. M. (2009). Parahidroxifenilsalicilamida e Natamicina no controle de fungos na Superfície De Salames Tipo Milano (Dissertação de mestrado). Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis. Food Ingredients Brasil. (2010). Agentes Antimicrobianos Químicos e Naturais. 15, Disponível em Hanušová, K., Dobiáš, J., Klaudis, K.(2009). Effect of Packaging Films Releasing Antimicrobial Agents on Stability of Food Products. Czech Journal of Food Sciences. 27, Mcmullen, L.M., Stiles, M.E.(1996). Potencial for use of bacteriocin producing lactic acid bacteria in the preservation of meats. Journal of Food Protection.59(supple), Prozyn (2013) - Biomax D: Substituição Natural aos Conservantes; Guia do fabricante. Rantsiou, K., Cocolin, L.(2006). New developments in the study of the microbiota of naturally fermented sausages as determined by molecular methods: A review. International Journal of Food Microbiology,108(2), Suarez, M. H., Vasquez, M. S. M., Zapata, B. S. (2009). Use of antimicrobian substances produced by acid lactic bacterias on meat conservation. Revista chilena de nutrición, 36(1), Terra, N. N. (2000). Apontamentos de Tecnologias de Carnes. São Leopoldo: Unisinos.