fmvz-unesp FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU Curso de Pós-Graduação em Zootecnia Nutrição e Produção Animal
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- João Guilherme Ferrão Vidal
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1 fmvz-unesp FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU Curso de Pós-Graduação em Zootecnia Nutrição e Produção Animal O emprego dos isótopos estáveis de carbono no controle da qualidade do mel Elvira Maria Romero Arauco Zootecnista Disciplina: Métodos de Avaliação da Qualidade de Carnes Prof. Roberto de Oliveira Roça Departamento de Gestão e Tecnologia Agroindustrial Fazenda Experimental Lageado, Caixa Postal, 237 F.C.A. - UNESP - Campus de Botucatu CEP BOTUCATU - SP robertoroca@fca.unesp.br
2 O emprego dos isótopos estáveis de carbono no controle da qualidade do mel O mel é um alimento apreciado por seu sabor característico e pelo seu considerável valor nutritivo. A sua matéria prima, monossacarídeos de moléculas simples, é o néctar das flores ou exsudados sacarídeos das partes vivas das plantas, que é coletado pelas abelhas melíferas, desidratando e armazenando em alvéolos nas suas colméias. O mel é conhecido pelo homem há milhares de anos, tem sido utilizado não somente na alimentação, mas também em rituais religiosos como elementos sagrados, assim como na medicina, devido a algumas características intrínsecas de sua composição. Entre os alimentos na dieta humana o mel tal vez seja o alvo mais freqüente das alterações ao longo da historia (Doner, 1991). Ã medida que novos tipos de adulterações foram ocorrendo, métodos analíticos foram se desenvolvendo com o intuito de identificar estas adulterações, tarefas cada vez mais difícil, dado à sofisticação cada vez maior observada nessa prática. Até 1974 as adulterações mais comuns resumiam-se à adição de açúcar comercial, ou açúcar invertido, sendo que a detecção da mesma podia ser feita pela quantificação de hidroximetilfulfural (HMF). O HMF é resultante da degradação da hexose, pode se encontrado no mel, mas em pequena quantidade. A sua presença em níveis aumentada pode ser resultado de três causas: a) superaquecimento do produto. b) estocagem prolongada. c) fraude por adição de açúcar comercial ou açúcar técnico invertido, rico em HMF. Nos dois primeiros casos, o aumento embora exista, é menor quando comparado ao resultado da fraude pela adição dos compostos anteriores citados. Portanto a detecção de HMF, feito qualitativamente ou quantitativamente, era até
3 1974, capaz de garantir a pureza do produto contra a principal fraude realizada até então (White e Doner, 1978). A partir daquele ano, um novo tipo de adulteração começou a ser realizada nos Estados Unidos, através da adição ao mel, de HFCS (High Fructose Corn Syrup). Produto com um custo de produção muito baixo, obtido a partir de um tratamento enzimático do xarope de milho, que possui glicose (50%) e frutose (42%) como principais elementos em sua composição. A sua adição ao mel não pode ser detectada pela pesquisa do HMF (White e Doner, 1978). Como resposta a esse novo tipo de adulteração, novos métodos analíticos que fossem capazes de detecta-la começaram a ser pesquisado. Apos algumas tentativas infrutíferos que incluíram a pesquisa de possíveis compostos próprios do HFCS e que só poderiam ser encontrados no mel, se o mesmo tivesse sido adulterado, iniciou-se um estudo viabilizando a utilização da análise da relação de isótopos estáveis de carbono como técnica analítica para detecção da adulteração (Doner e White; 1977). Essa técnica já havia sido anteriormente empregada para detectar baunilha sintética em extratos naturais, bem como a presença de sacarose em sucos de laranja. O emprego dos isótopos estáveis de carbono no controle da qualidade do mel. Estudos iniciais. Os experimentos iniciais com mel foram feitos por Doner, White e Ziegler, sendo que os primeiros resultados obtidos foram publicados em 1977 (Doner e White, 1977). Para a realização dos testes foram coletadas cerca de 500 amostras de mel com pureza certificada, originarias das safras de 1974 e Dessas, foram selecionadas 84, consideradas representativas do todo, ou seja, amostras provenientes de 34 estados, incluindo 37 diferentes tipos florais, de 17 famílias vegetais. O valor médio de todas as amostras foi 25,2 0 / 00, e o coeficiente de variação 3,7%. Essa variação era a menor até antão observada, considerando-se todos os constituintes do mel, bem como as propriedades físicas já estudadas. Por exemplo, levantamentos anteriores em 490 amostras de mel haviam mostrado que entre os constituintes a frutose era a que possuía o menor CV= 5,4%. Outros
4 constituintes menores estavam variando de 25 a 75%. Por tanto a aparente homogeneidade dos dados relativos à composição isotópica era um bom indicativo para que as pesquisas utilizaram a nova técnica e tivessem continuidade. O passo seguinte foi à realização de um estudo colaborativo (White e Doner, 1978) envolvendo 7 laboratórios norte-americanos que analisaram amostras de mel, amostras de HFCS, e amostras constituídas de misturas de ambos os compostos. Três experimentos foram conduzidos no estudo com o intuito de estabelecer a aplicabilidade do novo procedimento: Experimento a: Determinou-se a faixa de variabilidade dos valores de δ 13 C de méis americanos e importados, bem como de amostras de HFCS, já que não havia informação na literatura. Os valores das composições isotópica das 119 amostras de mel e de 4 amostras de HFCS mostraram que o valor médio de δ 13 C= - 25,4 0 / 00. Experimento b: Pesquisou-se a existência de uma relação entre valores de δ 13 C e a composição das misturas de méis e HFCS. Três misturas de mel e HFCS de composição conhecida foram preparadas; a partir desses resultados pode-se estabelecer que o valor de δ 13 C das amostras provenientes das misturas de HFCS e mel é a soma da contribuição de cada uns dos compostos. Experimento c: Amostra de composição conhecida e predeterminada foi submetida ao estudo colaborativo. Cinco amostras foram enviadas aos 7 laboratórios envolvidos no estudo colaborativo. Das amostras, somente a amostra E era de mel puro, sendo que as demais (A-D) eram mistura contendo 50,83% (A); 25,91%(B); 60,50% (C) e 34,13%(D) de mel respectivamente. Devem ser ainda ressaltados dois pontos: o colaborador 1 analisou as mesmas amostras em duas datas diferentes, a segunda 5 meses após a primeira, e o colaborador 6 analisou as amostras 5 meses após os demais. Com base em todos os resultados obtidos nos três experimentos, o método proposto foi aceito pela AOAC (Association of Official Analytical Chemists), em first action.
5 O problema dos méis cítricos e outras questões Aprovado o método em 1978, o mesmo começo a ser utilizado para o controle de a qualidade do mel nos Estados Unidos, mas em 1980 White, demonstrou que amostras com valores δ 13 C entre 23,4 e / 00 deveriam ser submetidas a um teste adicional para que sua pureza fosse confirmada, já que havia se observado que amostras dentro dessa faixa poderiam estar adulteradas com até 20% com fonte C4, dependendo do valor de δ 13 C da amostra de mel puro o a qual havia sido realizada a adulteração(white, 1989). Outro problema também detectado com a nova técnica referia-se aos méis provenientes de plantas cítricas. Amostras de tais produtos apresentaram um valor de 0 / 00 δ 13 C menos negativos que a média encontrada para os demais. Levantouse então a hipótese de que as colméias produtoras pudessem ter sido alimentadas artificialmente com soluções preparadas a partir de xarope de cana ou HFCS. Deve-se salientar que essa prática é comum e muitas vezes necessárias para que as colméias possam estar prontas quando início do fluxo do néctar, que nas plantas cítricas ocorre prematuramente em relação à demais. Sendo assim poderse-ia esperar que os primeiros méis produzidos no início do fluxo pudessem estar contaminados pelo produto resultante do processo de alimentação artificial das abelhas, o que poderia explicar a diferença observada nos valores de δ 0 / C. Outra hipótese a ser testada era a de que tais méis possuíam um valor de δ 0 / C menos negativos devido à presença de adulterantes, já que quando submetidos a provas complementares, os resultados foram negativos para presença de adulterantes (White e Robinson, 1983). Para avaliar essa última possibilidade foram colhidas amostras de mel de plantas cítricas, bem como do néctar a partir do qual as abelhas haviam elaborado o produto (White e Robinson, 1983). Diferença nos valores de δ 0 / C entre o mel e o néctar seriam indicativas de adulteração do produto. Ao contrario, resultados iguais confirmariam a hipótese de que méis de frutas cítricas realmente apresentam um δ 0 / C menos negativos. Alem da questão dos méis cítricos, pontos relativos à nova metodologia começaram a ser discutidos:
6 a) méis provenientes de Acácia spp também mostraram possuir valores de δ 0 / C menos negativos que a grande maioria. b) Resultados de néctar de plantas CAM revelaram que os mesmos possuíam valores de δ 0 / C na faixa de 13,1 a 14,4 0 / 00, o que permitia sugerir que os méis dessas fontes também teriam uma composição isotópica diferenciada, com valores maiores inclusive que os cítricos. c) A ampla faixa de valores considerada normal para méis puros ( - 23,5 0 / 00 ) permitia, por exemplo, que a adição de 12,5 % de HFCS a um mel com δ 0 / C de 25,7 0 / 00, dessa origem a um produto dentro da faixa de normalidade (- 23,7 0 / 00 ), permitindo considerar pura uma amostra adulterada. d) A técnica recomendada (TLC = cromatografia em camada delgada) para a análise das amostras situadas dentro da faixa suspeita (-21,5 a 23,4 0 / 00 ) possuía vários inconvenientes: não era capaz de detectar fraude por adição de xarope de cana de açúcar; o julgamento da amostra podia ser subjetivo já que muitas vezes as bandas cromatográficas eram muito tênues difíceis de serem observadas; HFCS muito refinado podia não ser detectado, devido a seu teor reduzido em oligossacarídeos. A adição de um padrão interno Para superar todos esses inconvenientes que podiam ser responsáveis por erros na avaliação da pureza das amostras, começaram a serem procuradas alternativas que pudessem melhorar a confiabilidade dos resultados obtidos pela análise da composição isotópicas das amostras de mel. Em 1989 White e Winters propuseram a utilização de um padrão interno para cada amostra, ou seja, algum componente próprio da amostra serviria como padrão para a mesma, de maneira que se a amostra fosse adulterada a composição isotópica do padrão interno não se alteraria, mas a da amostra com um todo sim. Passou-se então a se estudar o emprego da proteína como padrão interno; presente na faixa de 58 a 786 mg/100g do produto (X=169), ela é originaria na sua maior parte das abelhas que as produzem e incorporam ao mel na forma de enzimas, quando da passagem do néctar pelo aparelho digestivo do
7 inseto. Alem disso pode ser originária do pólen recolhido pelas abelhas quando coleta o néctar. Para testar essa hipótese, determinaram os valores de δ 0 / C de 19 amostras de pureza e origem desconhecidas e de suas respectivas proteínas (White e Winters, 1989). Pelos resultados pode-se observar a grande semelhança entre as médias do mel (-24,40 0 / 00 ) e da proteína (-24,24 0 / 00 ); segundo os resultados foram tão bons que os encorajaram a examinar um grupo representativo de amostras de pureza e origem conhecidas. Com base nos resultados obtidos preconiza-se que quando diferenças negativas maiores que 1 0 / 00 entre a proteína e o mel, a amostra deve ser considerada adulterada. Segue abaixo a fórmula de calculo da porcentagem de adulteração: Adulteração % 100[δ 13 C (proteína) - δ 13 C (mel)] δ 13 C (proteína) (- 9,17) A utilização desse padrão interno pode ser visualizado no trabalho de White et al., 1998; onde analiso 137 amostra de méis americanos a serem exportados para Alemanha. Resultados de méis brasileiros Os únicos dados disponíveis referem-se a 10 amostras de mel analisadas na década de 70, cujos resultados haviam publicado White et al 1998, até a publicação de ROSSI et al., 1999; onde mostra o analise isotópico só do mel e não da proteína. Foram analisado 61 amostras das quais 5 mostraram estavam adulteradas. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DONER, L. W. Verifiying the authenticity of plant-derived material by stable isotope ratio and chomatografic methodologies. Journal of the Associacion of Officil Analytical Chemists, v.74, p.14-19, DONER, L. W., WHITE JR., J.W. Carbon-13/- ratio is relatively uniform among honeys. Science, v.197: p ,
8 ROSSI, N. F., MARTINELLI, L. A. LACERDA, T. H. M. CAMARGO, P.B., VICTORIA, R. L. Análise da adulteração de méis por açucares comerciais utilizando-se a composição isotópica de carbvono. Ciên. Tecnol. Aliment. WHITE, J. W. High-fructose corn syrup adulteration of honey: confirmatory testing required with certain isotope ratio values. Journal of the Association of Official Analytical Chemists, v. 63, p. 1168, WHITE, J. W. Internal standard stable carbon isotopic ratio method for determination of C4 plant surgs in honey: collaborative study, and evalution of improved protein preparation procedure. Journal of the Association of Official Analytical Chemists, v. 75, p , WHITE J. W. & DONER L. W. Mass spectrometric detection of high-fructose corn syrup in honey by use of 13C/12C ratio: collaborative study. Journal of the Association of Official Analytical Chemists, v. 61, p , 1978a. WHITE J. W. & DONER L. W. The 13C/12C ratio in honey. Journal of Apicultural Research, v. 17, p , 1978b. WHITE, J. W. & ROBINSON F. A. 13C/12C ratios of citrus honeys and nectars and their regulatory implications. Journal of the Association of Official Analytical Chemists, v. 66, p. 1-3, WHITE JR. J. W. & WINTERS, K. Honey protein as internal standard for stable carbon isotope detection of adulteration of honey. Journal of the Association of Official Analytical Chemists, v.72, p , WHITE JR, J. W., WINTERS, K., MARTIM, P., ROSSMANN, A. Stable carbon isotope ratio analysis of honey: validation of internal standard procedure for worldwide application. J. AOAC. Int., v81, p , 1998.
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