TÉCNICAS PARA A VALIDAÇÃO CIENTÍFICA.

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1 INTRODUÇÃO Os estudos de validação constituem uma exigência da Resolução Diretiva Colegiada, nº 48, de 16 de março de 2004, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) que visa normatizar o registro de medicamentos fitoterápicos como parte essencial das Boas Práticas de Fabricação, de modo a garantir a qualidade de um medicamento 1. A validação de um método pode também ser entendida como um processo, baseado na obtenção, documentação e análise de dados, os quais permitem tanto descrever o mesmo de forma detalhada, como identificar e controlar os fatores de variação 1. O objetivo último da validação é assegurar a reprodutibilidade dos resultados e o estabelecimento de limites de aceitação do erro analítico, através da aplicação sistemática de testes de precisão e exatidão 1. Desde o início da década de oitenta, os processos de validação têm sido desenvolvidos sob as orientações da regulamentação das Boas Práticas de Fabricação (BPF), servindo a órgãos como Food and Drug Administration (FDA) e à indústria farmacêutica 1. As elaborações e interpretações apropriadas e novas diretivas, com respeito ao processo de validação e à regulamentação das BPF são melhores abordados pela atual legislação e novas orientações da OMS 1. O rigor na avaliação dos resultados, e no estabelecimento dos limites de confiança são condicionados pela complexidade do método, precisão e sensibilidade dos instrumentos, composição e homogeneidade amostrais, além de outras exigências analíticas incidentes 1. De modo geral, quanto menor o número de etapas que constituem o método e quanto maiores a homogeneidade e uniformidade da composição do material analisado, menor será o erro inerente acumulado e, conseqüentemente, o rigor será atingido 1. Durante a prática de validação, é também importante observar a regularidade da produção. Os riscos de heterogeneidade são variáveis: número de fases, natureza dos produtos (características físicas, concentração e instabilidade), preparação e secagem, além do método de extração 1.

2 O texto abaixo foi retirado e adaptado do livro Ciências farmacêuticas: Contribuição ao desenvolvimento de novos fármacos e medicamentos de FILHO, V. C., BRESOLIN, T. M. B., p TÉCNICAS PARA A VALIDAÇÃO CIENTÍFICA. 1. Seleção da planta e preparação dos extratos A escolha da planta a ser estudada nem sempre é uma tarefa fácil, devido à grande variedade de espécies existentes. Porém, dependendo do objetivo do estudo, a escolha pode ser orientada. Por exemplo, para as plantas com interesse farmacológico, deve-se levar em conta as informações da medicina popular, além das informações botânicas e químico-taxonômicas. Informações como clima, tipo de solo, a época da coleta, etc também devem ser observadas. A preparação dos extratos brutos das plantas é o ponto de partida para uma posterior purificação. A escolha do solvente para extração deve ser feita tendo em vista os objetivos do estudo e os resultados da abordagem. Para obter uma extração eficiente é necessário usar solventes puros e condições brandas, utilizando sempre que possível, solventes de baixa reatividade. Nunca deve ser descartada a possibilidade de formação de artefatos. Outro aspecto importante a ser considerado é o processo utilizado na extração, que pode influenciar consideravelmente os resultados do estudo experimental. Existem várias técnicas de extração, entre elas: maceração, percolação, por extrator Sohxlet, etc. Quando se deseja estudar constituintes voláteis, sua extração é iniciada pela destilação por arraste de vapor. Plantas secas ao ar ou sob baixas temperaturas são extraídas com uma variedade de solventes e algumas vezes seqüencialmente de baixa para alta polaridade. Geralmente se usam solventes polares como etanol ou metanol para fazer a extração e posteriormente faz-se a separação dos compostos por técnicas cromatográficas. 2. Fracionamento e isolamento A extração dos constituintes de plantas é um exercício de acertos e erros, com o uso de diferentes solventes sob as mais variadas condições como tempo e temperatura de extração. O sucesso ou fracasso nos processos de extração pode ser observado posteriormente nos processos de purificação.

3 Uma vez extraído da planta, o composto bioativo deve ser separado do extrato bruto. O procedimento pode envolver desde uma simples cristalização do composto até separações sucessivas com partições em solventes de polaridade diferentes e extensivas técnicas cromatográficas. Neste contexto, a cromatografia tem lugar de merecimento destaque no que concerne à separação, identificação e quantificação de compostos. Para a separação de compostos em larga escala, um método clássico e amplamente utilizado é a Cromatografia em Coluna aberta (CC), que utiliza colunas de diferentes tipos e dimensões. Por esta técnica se consegue bons resultados pela possibilidade de variação da fase estacionária, bem como da fase móvel, principalmente no isolamento dos compostos em altas concentrações na planta em estudo. Outra técnica preparativa de separação cromatográfica é a Cromatografia Preparativa de Força Centrífuga (Chromatotron), um sistema composto de uma placa circular de cromatografia em camada delgada inclinada, o que permite mais eficácia na coleta dos compostos ou frações. Este método tem sido aplicado na separação de vários produtos naturais, incluindo saponinas, flavonóides e alcalóides. A cromatografia a Gás (CG) é um método usado pra separar os componentes de uma solução e determinar sua quantidade relativa. È uma técnica útil para compostos orgânicos que não entrem em decomposição sob altas temperaturas (até aproximadamente 310ºC), possibilitando a análise de compostos obtidos de plantas pequenas quantidades (microgramas). A pureza da amostra também pode ser avaliada com o uso de CG. Este método é muito utilizado para a identificação de compostos voláteis, como sesquiterpenos, compostos fenólicos, hidrocarbonetos, carotenos, álcoois lineares e triterpênicos, esteróis, além de muitos outros que possam ser compatíveis com o sistema de separação. A cromatografia a gás pode ser combinada com espectrometria de massas. Esta técnica vem sendo utilizada como método sensível na identificação de alcalóides, quantificação de fitoesteróides, detecção de várias classes de terpenos e em outras análises. Umas das técnicas mais atuais em termos de caracterização, detecção e subseqüente separação, bem como controle final da pureza do composto isolado, é a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE ou HPLC - High Performance Liquid Chromatography). Dentre as vantagens que este sistema oferece podemos citar: A possibilidade de separação de compostos em baixas concentrações na planta, tempo curto de análise, fase móvel e estacionária com ampla faixa de polaridade (de modo que

4 a seletividade no processo de separação possa ser ajustada), além de minimização de decomposição de compostos instáveis na amostra. Este método vem sendo amplamente utilizado na quantificação de alcalóides, caracterização de compostos fenólicos, diterpenos, triterpenos, sesquiterpenos e naftoquinonas. A CLAE, acoplada de detector de radiação Ultra- Violeta (CLAE-UV) fornece informações a respeito do tipo de constituintes, ou sobre oxidações, sendo também usado para polifenóis. A CLAE associada à espectrometria de massas (CLAE-EM), torna-se um método sensível de análise molecular, fornecendo informações sobre o peso molecular dos compostos e empregada na obtenção de alcalóides, flavonóides e xantonas, etc. Uma das áreas em que a CG e CLAE se fazem presentes é no controle de qualidade, através de caracterização e padronização de amostras, avaliando o conteúdo do componente ativo e seu rendimento; também são empregadas na avaliação quanto à variação da composição química durante o crescimento de desenvolvimento de uma planta. Deve-se também levar em consideração, na separação, as características particulares de cada composto, como acides, polaridade e tamanho molecular. A purificação final, para prover compostos de pureza desejável para as análises estruturais, pode ser acompanhada por técnicas como recristalização, sublimação ou destilação. 3. Determinação estrutural O processo de determinação estrutural envolve o acúmulo de dados de numerosas fontes, cada qual fornece alguma informação estrutural e a assimilação destes dados fornece a estrutura química. Existe uma variedade de instrumentação espectroscópica como UV, Infravermelho (IV), RMN de hidrogênio (RMN 1 H) e de carbono 13 (RMN 13 C) aliado ao uso de outras técnicas de RMN e EM que tem permitido propor com segurança a estrutura molecular de substâncias naturais. O processo espectroscópico de determinação estrutural deve ser bem aliado com a literatura científica. Se o composto ainda não tiver sido descrito, ele pode ser similar a outros já descritos, o que ajudará na interpretação dos dados. Quando a análise dos dados do composto desconhecido não é conclusiva, e se este, ou um de seus derivados possuir estrutura cristalina, pode-se fazer o estudo de

5 difração de raio X. Isto envolve a análise com o auxílio de um computador da difração obtida quando um simples cristal é irradiado com raio X. Após verificar a pureza do composto isolado, sua estrutura determinada por métodos espectroscópicos, tendo então a estrutura bem definida e com bom rendimento durante sua obtenção, a síntese total ou parcial, bem como preparação de derivados ou análogos, pode ser tomada como etapa seguinte e mesmo a modulação da atividade biológica e definição da relação estrutura-atividade podem ser avaliados. 4. Controle de qualidade de preparações vegetais A dificuldade de regulamentação do uso de plantas medicinais, visto que o processo legal varia de país pra país, é particularmente um desafio dado ao desenvolvimento da medicina tradicional por diferentes culturas, em diferentes regiões, sem desenvolvimentos de padrões internacionais e métodos apropriados de avaliação. Por este motivo, poucas preparações a partir de plantas medicinais têm sido avaliadas quanto a sua eficácia e segurança. Na EUA, as plantas medicinais estão classificadas como integrantes da classe de suplementos alimentares (ver Fig. 1) e como os mesmos não requerem prova de eficácia, segurança, nem padrões de controle de qualidade, conseqüentemente, preparações vegetais não sofrem rigorosos controles como os fármacos. Ao contrário, países como Alemanha, França, Inglaterra, Canadá, Austrália e Coréia obrigam a utilização de métodos seguros e padronizados de qualidade de manufaturados vegetais. FIG.1- Exemplos plantas medicinais classificadas como integrantes da classe de suplementos alimentares. Panax ginseng, L. A Serenoa repens Allium sativa L. Hydrastis canadensis L.

6 Silybum foenungraecum Tanacetum parthenium Cimicifuga racemosa Nem o guia de boas práticas laboratoriais, ou de boas práticas de produção, nem as autoridades regulamentares estipulam quais as técnicas cromatográficas e métodos devem ser utilizados quando se deseja realizar um controle de qualidade para um produto. Pesquisas realizadas neste sentido demonstram que os equipamentos necessários para um correto controle de qualidade envolvem instrumentação cromatográfica como CLAE, CG, CCD, além de dados espectroscópicos dos constituintes presentes e ou responsáveis pela atividade farmacológica. Também a CG tem sido um valioso instrumento na padronização de muitas plantas medicinais. O conceito inicial de controle de qualidade foi concentrado especialmente na avaliação da eficiência analítica, isto é, teste da sensibilidade analítica e especificidade, bem como da exatidão e reprodutibilidade dos métodos. Mais tarde, este conceito foi expandido para confiança da qualidade, o qual inclui resultados, como a preparação da amostra, coleta, processamento do material, eficiência da medição, validação dos resultados, bom como seu relatório e interpretação. Uma nova expansão deste modelo conduziu ao enfoque da gestão da qualidade, a qual enfatiza os benefícios para a sociedade. Para atingir a qualidade, a qual enfatiza os benefícios para a sociedade. Para atingir a qualidade total é necessário incluir regulamentações nacionais e internacionais, referência dos procedimentos e dos materiais. 5. Variabilidade de preparações vegetais Atualmente, a forma de padronização de plantas medicinais continua insuficiente e esta ausência de informações pode ser facilmente compreendida por razões de variabilidade dos constituintes presentes em uma planta. Os constituintes químicos podem se diferenciar intensamente de uma amostra pra a outra, quanto à qualidade e quantidade de metabólitos secundários, bioativos dependendo de sua origem, das condições de crescimento, dos constituintes do solo, da variação sazonal, da influência climática e da data de coleta.

7 Outro problema que pode ocorrer é a interação da planta a ser utilizada com outras plantas e até com microorganismos, a polaridade do solvente durante a extração e a instabilidade da composição química da preparação, frente a fatores como luz, calor e solventes. Os fatores que podem influenciar na estabilidade do material vegetal podem ser controlados quando a natureza dos constituintes químicos é conhecida. Para a padronização qualitativa dos extratos, os procedimentos cromatográficos dão bons resultados, garantindo a confiabilidade, permitindo a exclusão ou a descoberta de adulterações, caso nenhuma degradação tenha ocorrido durante o processo extrativo. 6. Caracterização de preparações vegetais A caracterização de um material vegetal, com princípios ativos conhecidos, desconhecimentos ou uma mistura de várias plantas, requer a combinação de dois ou mais métodos cromatográficos, incluindo dados espectroscópicos. 7. Padronização e avaliação da eficácia de preparações vegetais É bem conhecido que a eficácia terapêutica de um material vegetal geralmente está relacionado não a um simples composto, mas a vários grupos de constituintes. Neste caso, a análise química deve ser caracterizada de forma mais completa possível. A padronização não é somente uma operação analítica e não termina com a identificação e análise dos constituintes principais. Padronização significa um grupo de informações necessárias para garantir não somente sua constância química, mas também sua eficácia. Somente se um controle de qualidade for rigidamente aplicado a um produto natural, podem estes produtos realmente competir com os medicamentos sintéticos já existentes. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. < Acessado em 14 de abril de FILHO, V. C., BRESOLIN, T. M. B. Ciências farmacêuticas: Contribuição ao desenvolvimento de novos fármacos e medicamentos. 1ª ed. Univali. Itajaí/ SC, p

8 JÂNIE ALVES DE AZEVEDO TÉCNICAS PARA A VALIDAÇÃO CIENTÍFICA DE FITOFÁRMACOS E FITOTERÁPICOS. PONTA GROSSA 2006

9 JÂNIE ALVES DE AZEVEDO TÉCNICAS PARA A VALIDAÇÃO CIENTÍFICA DE FITOFÁRMACOS E FITOTERÁPICOS. Trabalho apresentado à disciplina de Tecnologia de Fitoterápicos do curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa. Profª. Orientadora: Dionezine Navarro PONTA GROSSA 2006