UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA SISTEMA DE SUICÍDIO CONDICIONAL PARA LEVEDURAS

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Mirella Carvalho Braga
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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA SISTEMA DE SUICÍDIO CONDICIONAL PARA LEVEDURAS Andrea Balan e Ana Clara G. Schenberg

2 CONTEXTO Organismos geneticamente modificados MICRORGANISMOS RISCOS POTENCIAIS TRANSFERÊNCIA HORIZONTAL DE GENES NO MEIO AMBIENTE SISTEMAS SUICIDAS PARA BACTÉRIAS SISTEMAS SUICIDAS PARA EUCARIOTOS

3 ESTRATÉGIA A BACTÉRIA Serratia marcescens PRODUZ UMA PODEROSA NUCLEASE, CAPAZ DE DEGRADAR TANTO DNA QUANTO RNA, QUE EXCRETA PARA O MEIO DE CULTURA. O GENE DA NUCLEASE DE Serratia marcescens (SEM A REGIÃO QUE CODIFICA O PEPTÍDEO-SINAL DE SECREÇÃO) FOI CLONADO NA LEVEDURA Saccharomyces cerevisiae.

4 ESTRATÉGIA O GENE nuca DE Serratia marcescens FOI INSERIDO NO PLASMÍDEO pbs24, IMEDIATAMENTE A JUSANTE DO PROMOTOR ADH2 DE Saccharomyces cerevisiae, QUE É REPRIMIDO POR GLICOSE. EM CONDIÇÕES DE LABORATÓRIO, QUANDO SE MANTÉM ALTA A CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE, A EXPRESSÃO DO GENE SUICIDA PERMANECE REPRIMIDA. NO MEIO AMBIENTE, SOB CARÊNCIA DE GLICOSE, A EXPRESSÃO INTRACELLULAR DO GENE nuca OCORRERÁ E A NUCLEASE PRODUZIDA MATARÁ AS CÉLULAS.

5 CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO PCR pbgs18nuc8 ADH2 p α-factor t nuc fragment Ap R α pbs24ub URA3 LEU2-d ADH2 p nuca α-factor t Ap R pnuc URA3 LEU2-d

6 RESULTADOS Curvas de suicídio em glicose W303-1B/pBS24 ou /pnuc YPD SD

7 Curvas de suicídio em RESULTADOS em meios com outras fontes de carbono W303-1B/pBS24 ou /pnuc RAFINOSE GLICEROL

8 RESULTADOS Curvas de suicídio em glicose JSC302/pBS24 ou /pnuc YPD SD

9 RESULTADOS Curvas de suicídio em outras fontes de carbono JSC302/pBS24 ou /pnuc RAFINOSE GLICEROL

10 Efeito do extrato celular de RESULTADOS de JSC302 sobre DNA purificado 1. DNAladder 1 kb 2.CONTROL PLASMID H H H H H H 9. SM CONTROLS Nuc+ 0.7% Agarose gel. Sample DNA concentration= 0.5 µg

11 RESULTADOS Western Blot Western blot de transformantes da cepa JSC302 de S. cerevisiae, usando anticorpo anti- nuclease de S. marcescens. 1,3,5,7) JSC302/pBS24Ub, amostras de 24, 48, 72 e 96 h, respectivamente; 2, 4, 6, 8) JSC302/pUbNuc, amostras de 24, 48, 72 e 96 h, respectivamente; 9) Nuclease de S. marcescens (controle).

12 RESULTADOS CONDIÇÕES DE SIMULAÇÃO AMBIENTAL ENSAIOS DE MICROCOSMO: AS CÉLULAS DE LEVEDURA FORAM INOCULADAS EM FRASCOS CONTENDO SOLO EM ÁGUA DESTILADA E INCUBADOS À TEMPERATURA AMBIENTE. FORAM TOMADAS AMOSTRAS DE 2 EM 2 DIAS E, APÓS DECANTAÇÃO DAS PARTÍCULAS SÓLIDAS, O SOBRENADANTE FOI DILUÍDO E SEMEADO SOBRE MEIOS COMPLETO E SELETIVO, PARA AVALIAR O NÚMERO DE SOBREVIVENTES. AS CÉLULAS Nuc+ CAÍRAM PARA 0.53% APÓS 3 DIAS DE INCUBAÇÃO E, APÓS 4 DIAS, NÃO FOI ENCONTRADO MAIS NENHUM SOBREVIVENTE, ENQUANTO NO CONTROLE, FORAM DETECTADOS SOBREVIVENTES ATÉ 7 DIAS DE INCUBAÇÃO.

13 JSC302/Plasmid N o cells/ml % Plasmid 1 st Day containing cells 2 nd Day 4 th Day 5 th Day 6 th Day pbs24ub 1 x pubnuc 1 x pbs24ub 1.4 x pubnuc 5.3 x pbs24ub 3.2 x pubnuc 0 - pbs24ub 1.8 x pubnuc 0 - pbs24ub 4.4 x pubnuc 0 - RESULTADOS Ensaio de Microcosmo S. cerevisiae JSC302/pBS24Ub (control) and S. cerevisiae JSC302/pUbNuc transformants were inoculated into 100 ml of soil/water and incubated at room temperature. Aliquots were taken every 48 hs for determination of the number of viable cells and plasmid presence in YPD2% and SD8% media.(-) no cells detected.

14 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS A NUCLEASE FOI PRODUZIDA EM TODAS AS CEPAS EXAMINADAS E APRESENTOU ATIVIDADE TANTO in vitro QUANTO in vivo. O SISTEMA SUICÍDIO MOSTROU SER EFICIENTE TANTO EM CONDIÇÕES DE LABORATÓRIO, QUANTO EM CONDIÇÕES QUE SIMULAM O MEIO AMBIENTE E, PORTANTO, DEVERIA SER INTRODUZIDO EM TODA LEVEDURA TRANSGÊNICA PARA GARANTIR A BIOSSEGURANÇA.

15 RESULTADOS Ensaio Cometa A B Analysis of yeast chromosomal DNA by the comet test. Lysed sphaeroplasts, produced from S. cerevisiae JSC302 transformants, were subjected to agarose gel electrophoresis. EtBr stained gels were examined in a fluorescence microscope. (A) JSC302 strain harboring the control plasmid pbs24ub, (B) JSC302 strain harboring the pubnuc plasmid.

16 TABLE 1. Effect of the pubnuc plasmids in liquid cultures Different S. cerevisiae strains, transformed with pbs24ub (control plasmid) or with pubnuc2, 3, 4 or 5 plasmids, were grown in minimal medium containing glucose 1% (SD1%). Samples from the cultures were plated on SD1% to score the number of viable cells. STRAINS/ %SURVIVAL PLASMIDS 24 hs 48hs 72hs 96hs JSC302/pBS24Ub JSC302/pUbNuc JSC302/pUbNuc JSC302/pUbNuc W303-1B/pBS24Ub W303-1B/pUbNuc W303-1B/pUbNuc STX507-5D/pBS24Ub STX507-5D /pubnuc STX507-5D /pubnuc JRY418/pBS24Ub JRY418/pUbNuc JRY418/pUbNuc

17 RESULTS Survival of the yeast Nuc+ + cells THE YEAST Nuc+ TRANSFORMANTS SHOWED LETHALITY FROM 48H INCUBATION IN MINIMAL MEDIUM CONTAINING GLUCOSE. THE LETHAL EFFECT OF THE PLASMID WAS ENHANCED WHEN YEAST CELLS CARRYING THE rad52 MUTATION WERE USED AS HOSTS: EXPONENTIAL INACTIVATION WAS OBSERVED FROM 24H ON.

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