2. Validação e ferramentas estatísticas

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1 . Valdação e ferramentas estatístcas Mutos aspectos relaconados à socedade são suportados, de alguma forma, por algum tpo de medção analítca. Mlhões de medções analítcas são realzadas todos os das, em mlhares de laboratóros pelo mundo. O custo da realzação destas medções mutas vezes é elevado e custos adconas podem advr de decsões sobre falsos resultados. Defntvamente, é mportante alcançar resultados analítcos corretos e, ao mesmo tempo, ser capaz de demonstrar que eles o são. A utlzação de procedmentos analítcos valdados permte a obtenção de resultados confáves. Valdar é confrmar, através da obtenção e exame de evdêncas objetvas, que os requstos partculares para uma determnada utlzação de um método foram atngdos. Em outras palavras, a valdação de um método analítco consste em defnr os requstos analítcos necessáros para determnada aplcação, gerar resultados através da utlzação do método analítco que é objeto de valdação e, fnalmente, confrmar se o desempenho obtdo para os parâmetros defndos é consstente. No processo de valdação está mplícta a avalação dos crtéros estabelecdos, garantndo que o método é aproprado para a aplcação pretendda. Essa garanta é de extrema mportânca, sendo a mesma obtda justamente pela defnção destes crtéros. Um fator mportante durante a etapa de geração de resultados analítcos é a utlzação de equpamentos adequadamente calbrados e que estejam operando dentro das especfcações. Da mesma manera, nesta etapa, o analsta deve ter a competênca necessára, e sufcente conhecmento e capacdade para tomar as decsões apropradas, de acordo com as observações realzadas durante o processo de análse e avalação de resultados. Já que o desenvolvmento e a valdação de métodos analítcos são atvdades fortemente relaconadas, é dfícl defnr exatamente seus lmtes e, por sso, mutos dos parâmetros assocados à valdação são avalados, pelo menos aproxmadamente, como parte do desenvolvmento do método [18]. A valdação de um método analítco deve ser realzada sempre que for necessáro verfcar se o desempenho de seus parâmetros é adequado para utlzação em uma determnada aplcação. A extensão requerda da valdação

2 19 ou da revaldação va depender da natureza das alterações envolvdas. Métodos publcados, mesmo por nsttuções nternaconalmente reconhecdas, quando realzados pela prmera vez em um laboratóro, precsam ser valdados para verfcar se os parâmetros estabelecdos pelo método são alcançados pelo laboratóro [18]. A utlzação de materas de referênca é parte crítca do processo de valdação. Um certfcado de análse que caracterze completamente a substânca de referênca deve acompanhar todo padrão analítco, seja ele materal de referênca certfcado (MRC) ou um padrão de trabalho, sendo este últmo usualmente um padrão produzdo no própro laboratóro, que é quantfcado contra um materal de referênca certfcado [19]. A manera como a valdação é realzada deve ser defnda pelo laboratóro que conduz a análse, vsto que ele é o responsável por assegurar que o método utlzado está adequadamente valdado. Exstem mutas publcações que abordam a valdação de métodos analítcos através de estudos colaboratvos; entretanto, nem sempre esta é uma solução acessível e vável. Sendo assm, o laboratóro deve decdr que parâmetros de desempenho precsam ser caracterzados para a valdação do método. Um bom começo para o planejamento do processo de valdação é a consderação cudadosa das especfcações do produto a ser analsado. De uma manera geral, o laboratóro precsa fazer o melhor esforço possível dentro dos lmtes mpostos, levando em consderação os requermentos do clente, a experênca no método e os custos envolvdos [18]. Os requstos para valdação de métodos analítcos são, geralmente, defndos por publcações orentatvas, específcas para cada setor relevante. Como requsto, entenda-se a defnção dos parâmetros de mportânca e o grau em que cada um deve ser aplcado. É recomendada a completa satsfação dos requstos defndos sempre que estes estejam dsponíves para um setor específco [18]. Para o setor de defensvos agrícolas, os requstos de valdação de métodos analítcos aplcáves à determnação de teor de ngredente atvo em produtos formulados e técncos foram claramente defndos no documento

3 0 nttulado Gudelnes on method valdaton to be performed n support of analytcal methods for agrochemcal formulatons emtdo pela CIPAC (Collaboratve Internatonal Analytcal Pestcde Councl) [0]. No âmbto naconal exste a norma ABNT NBR 1409 (Agrotóxcos e afns Valdação de métodos analítcos) [14]. A nova versão desta norma oferece uma vsão completa e atual, não se restrngndo exclusvamente a análse de produtos técncos e formulados. Essa nova versão abrange também métodos para análse de traços e de resíduos e nclu como requsto a estmatva da ncerteza de medção, snalzando o nteresse na confabldade dos resultados analítcos. A valdação dos procedmentos analítcos envolvdos neste trabalho fo obtda ncalmente a partr das seguntes etapas: defnção da curva analítca, estudo de nterferêncas, estudo de precsão e exatdão, e estmatva da ncerteza de medção. Cada uma destas etapas é descrta a segur: Defnção da curva de calbração (ou curva analítca): Nesta etapa nvestgou-se a provável faxa de resposta lnear, defnu-se a melhor curva, além de estmar os lmtes superor e nferor da faxa lnear de trabalho. No presente trabalho, quando necessáro, o lmte quantfcação fo estmado e sua adequação ao uso pretenddo fo verfcada. Estudo de nterferêncas: Verfcou-se a exstênca de nterferêncas espectras, pela smples aplcação do procedmento a amostras do branco de reagente, branco da amostra (matrz) e ao materal de referênca. A verfcação de ocorrênca de efeto matrz fo realza pela utlzação dos resultados expermentas obtdos no estudo de exatdão e precsão, descrto a segur. Os dados obtdos nos ensaos de fortfcação foram utlzados para a construção da curva de fortfcação e esta fo, então, comparada com a curva de calbração. Estudo de exatdão e precsão: Selecou-se três pontos (concentrações) de forma a cobrr toda a faxa de utlzação da curva de calbração e correspondentemente de concentração das possíves amostras: nomnal, superor e nferor. Preparou-se e analsou-se, através da adção do analto ao branco da amostra, sete replcatas para cada ponto. Todo o processo de preparação e análse fo realzado sob condções de repettvdade. Após a obtenção dos resultados expermentas a exstênca de valores dspersos fo

4 1 verfcada pela utlzação do teste de Grubbs. As concentrações de cada amostra fortfcada, a concentração méda, o desvo padrão e o respectvo coefcente de varação foram calculados. Verfcou-se a adequação dos coefcentes de varação aos lmtes estabelecdos em norma de acordo com o nível de concentração. As recuperações foram calculadas. Verfcou-se a adequação das recuperações aos lmtes estabelecdos. A recuperação global do procedmento analítco também fo calculada. O desvo padrão obtdo para o ponto de menor concentração fo comparado ao do lmte de quantfcação estmado, a partr da curva de calbração, para verfcação de sua adequação como lmte de quantfcação efetvo. Dentro desta etapa foram realzados também ensaos para determnação da robustez do procedmento analítco. Para esta fnaldade foram eletas varáves que poderam ter efeto sgnfcatvo no desempenho analítco, ensaos foram realzados para avalar o efeto destas varáves. Estmatva da ncerteza de medção: A ncerteza de medção fo estmada de acordo com o Gua EURACHEM/CITAC [15] e consste bascamente da seqüênca de ações descrta a segur: ) Especfcar claramente o mensurando e as grandezas de entrada das quas ele depende. ) Identfcar as prováves fontes de ncerteza. ) Lstar as prováves fontes sgnfcatvas através de um gráfco de causa e efeto. v) Estmar a contrbução de cada componente e converter todas as contrbuções para ncerteza padrão. v) Consderar contrbuções menores que 1/3 da contrbução do maor componente como não sgnfcatvas. v) Calcular a ncerteza padrão combnada. v) Calcular os graus de lberdade efetvos, o respectvo fator de abrangênca e a ncerteza expandda. v) Conclur comparando a ncerteza de medção estmada com a tolerânca estabelecda. No tem.5, são apresentados os prncpas concetos envolvdos nesta estmatva. A estmatva da ncerteza de medção de cada um dos

5 procedmentos analítcos envolvdos neste trabalho fo realzada com o objetvo prncpal demonstrar e expressar as varáves envolvdas durante o processo de análse de teor de ngredente atvo. A contrbução da amostragem não fo consderada. No captulo 4, as ncertezas estmadas para cada um dos procedmentos analítcos envolvdos neste trabalho são apresentadas e dscutdas. Além dos parâmetros descrtos nas etapas de valdação fo avalada também a establdade do sstema analítco utlzado para as determnações espectrofotométrcas. Essa etapa fo ncada pela seleção de uma amostra conhecdamente estável e pela avalação desta pela aplcação do procedmento analítco em ntervalos prevamente defndos ao longo do período de utlzação do equpamento. Esta avalação fo realzada através da construção de gráfcos de controle. Nos subtens a segur, uma ntrodução concetual para cada uma das prncpas técncas estatístcas utlzadas na realzação deste trabalho, é apresentada..1 Gráfcos de controle Um processo é estatstcamente estável, ou está sob controle estatístco, se apresentar apenas uma varação natural, sem quasquer padrões, ou cclos, ou pontos estranhos. Quando o processo está sob controle é possível predzer o seu comportamento com certo grau de confança. Entretanto, quando ocorrem nterferêncas no sstema o processo responde a estas causas gerando resultados fora de controle e que são faclmente vsualzados nos gráfcos de controle. Os gráfcos de controle são ferramentas fundamentas, largamente utlzadas na garanta do controle estatístco de processos. Eles permtem comparar nformações de amostras que representam o atual estado de controle do processo contra os lmtes estabelecdos pela consderação da varabldade nerente ao processo. A construção e utlzação de gráfcos de controle são detalhadamente descrtas pela Internatonal Organzaton for Standardzaton ISO [1, ].

6 3 Neste trabalho, foram utlzados gráfcos de valores ndvduas (X) e de ampltudes varantes (R) para avalar a establdade do sstema espectrofotométrco. Como já menconado, uma amostra conhecdamente estável fo seleconada, a absorvânca da amostra em 80 nm fo medda em ntervalos prevamente defndos. Quando o número de dados dsponíves gualou-se a 15, os ntervalos de controle foram calculados e os gráfcos de controle construídos. O cálculo dos lmtes de controle para cada um dos gráfcos fo obtdo pelas expressões dadas a segur: ) Gráfco de valores ndvduas (X): ) IC = X ± ER (equação.1) Gráfco de ampltudes varantes (R): IC = D4 R, D 3R (equação.) Onde: R Ampltude méda X Absorvânca méda E, D 3 e D 4 são fatores para os cálculos dos ntervalos de controle []. Após a construção dos gráfcos, deu-se contnudade na determnação da absorvânca da amostra, acompanhando smultaneamente o estado de controle do sstema. Os resultados obtdos são apresentados no captulo 4.. Testes de sgnfcânca Os testes de sgnfcânca, também conhecdos como testes de hpóteses, são ferramentas que possbltam a realzação de nferênca estatístca a uma população tomando como base dados expermentas obtdos a partr de amostras desta população. Este assunto é detalhadamente dscutdo na lteratura [3, 4]. Aqu, nesse texto, a apresentação se restrnge em um breve resumo. Um teste de sgnfcânca consste bascamente de: ) Estabelecer ambas as hpóteses: Nula (H 0 ) e Alternatva (H 1 ), defnndo se o teste é do tpo blateral (H 1 : contempla snal de desgualdade ) ou unlateral (H 1 : contempla < ou >). ) Identfcar a função estatístca aproprada ao teste.

7 4 ) v) Calcular o valor da estatístca de teste com base nos valores expermentas obtdos. Obter o valor crítco tabelado para a estatístca de teste a partr do nível de sgnfcânca (α) desejado e dos graus de lberdade relatvos ao expermento. v) Comparar os valores, calculado e crítco, para a estatístca de teste. Na comparação a hpótese nula (H 0 ) deve ser rejetada se o valor calculado para a estatístca de teste for maor que o valor crítco tabelado. Entretanto, a hpótese nula (H 0 ) deve ser aceta se o valor calculado para a estatístca de teste for menor que o valor crítco tabelado. Nos subtens a segur, os testes de sgnfcânca utlzados neste trabalho são apresentados:..1 Comparação de méda populaconal (µ) e méda amostral ( X ) - Teste de t-student s: X µ t cal =, onde: (equação.3) s n s desvo padrão amostral, n número de repetções... Comparação do desvo padrão(σ) entre duas populações - Teste F: s F cal =, onde s > s 1. (equação.4) s 1..3 Verfcação da exstênca de valores dspersos - Teste de Grubbs [14]: X X 1 G1 = e (equação.5) s X n X G = n,onde: (equação.6) s

8 5 X 1 prmero termo da sére, X n últmo termo da sére...4 Verfcação da homogenedade de varâncas (σ ) - Teste de Cochran s [4]: s H, onde: (equação.7) x cal = s s x maor desvo padrão do conjunto de dados avalado, s somatóro das varâncas do conjunto avalado. Os valores crítcos desta estatístca (H crt ) são apresentados no Anexo I [4]. O valor crítco, a ser utlzado em teste, é obtdo em função do número de graus de lberdade, do nível de sgnfcânca desejado, e do número de determnações realzadas para obtenção dos valores médos e respectvos desvos padrões...5 Detecção de curvatura [4]: Este teste é utlzado para determnar o ponto máxmo onde ocorre à descontnudade de lneardade na curva analítca. É um teste do tpo unlateral no qual a hpótese alternatva é: H 1 : (µ A µ B ) > 0. t cal rh =, onde: (equação.8) n + 1 ( RSD) n r H resíduo para a amostra de concentração mas elevada, RSD Desvo padrão resdual da curva, n número de pontos na curva. µ A méda dos resíduos para todas as amostras acma do lmte de lneardade µ B méda dos resíduos para todas as amostras abaxo do lmte de lneardade

9 6..6 Comparação entre duas relações lneares: Quando duas relações lneares são comparadas ndretamente estão sendo comparados os respectvos coefcentes lnear e angular. Idealmente cada coefcente deve concdr para que as relações sejam consderadas dêntcas, mas de uma perspectva estatístca, um grau defndo de smlardade também pode fornecer a sgnfcânca necessára para a consderação de gualdade. O processo de comparação é baseado em análse de regressão lnear smples, para cada conjunto orgnal de dados separadamente, e na análse de regressão não lnear múltpla com a nclusão de varáves de ndcação para a avalação do conjunto unfcado de dados. Cada etapa do processo é explcada em detalhes por Wllam Gardner [5]. A segur, um resumo do processo é apresentado. O procedmento de teste é ncado por avalar separadamente a sgnfcânca das retas a serem comparadas. É precso consderar os valores obtdos para o coefcente de correlação e p-valor respectvo ao coefcente angular. Consdera-se que relações lneares são estatstcamente sgnfcatvas quando estas apresentam R > 0,99 e p-valor < 0,05. Caso os pré-requstos defndos sejam atenddos então a unfcação dos dos conjuntos deve ser realzada pela cração de um únco conjunto que atenda ao segunte modelo: Y = α + β + 1X 1 + β X β 3 X 1X Onde:Y Todos os valores da varável resposta para os dos conjuntos, X 1 Todos os valores da varável de entrada para os dos conjuntos, X Um (1) quando os dados forem orgnáros do prmero conjunto e Zero (0) quando os dados forem orgnáros do segundo, X 1 X O produto da coluna X 1 pela coluna X A nformação estatístca relaconada ao ajuste dos dados a este modelo é a base para a comparação que é composta dos dos testes, descrtos a segur: O Teste 1 avala se o melhor ajuste é obtdo para um únco conjunto ou para dos conjuntos dstntos: Um conjunto composto por todos os dados dos dos conjuntos orgnas para formar uma únca curva ou dos conjuntos dstntos formando retas dstntas.

10 7 Hpóteses: H 0 : Não há dferença entre curva únca ou duas retas dstntas (β = β 3 = 0) H 1 : Curva únca é por que duas retas dstntas (pelo menos um dos parâmetros (β, β 3 ) é dferente de zero) Teste blateral. Teste estatístco: F F cal cal SEQSS( X, X1X X1) / =, que equvale a: (equação.9) QM Re s ( SQ ( X, X X X ) SQ ( X )) Re gn 1, 1 Re gn 1 / =, onde: (equação.10) QM Re s QM RES é o quadrado médo do resíduo da regressão não lnear múltpla. SEQSS(X,X 1 X X 1 ) = SQ Regn (X 1, X, X 1 X ) - SQ Regn (X 1 ) SQ Regn (X 1, X, X 1 X ) Soma dos quadrados dos resíduos da regressão múltpla para o modelo não lnear contemplando X 1, X, X 1 X. SQ Regn (X 1 ) Soma dos quadrados da regressão para o modelo lnear smples contemplando apenas X 1. Valor Crítco: Obtdo da tabela de dstrbução F para ν 1 = e ν = (n A + n B 4) F (α/; ν1; ν) Teste blateral se NC = 95% α = 0,05 e α/= 0,05; onde: n A n de pontos do prmero conjunto orgnal. n B n de pontos no segundo conjunto orgnal Sempre que no Teste 1 a hpótese nula for aceta, não é necessáro realzar o Teste. O Teste consste em avalar se as retas dstntas são paralelas, ou seja, se os coefcentes angulares não são sgnfcatvamente dferentes. Hpóteses: H 0 : As retas são paralelas (β 3 = 0) H 1 : As retas não são paralelas (β 3 0) Teste blateral.

11 8 Teste estatístco: F F cal cal SEQSS( X 1 X X 1, X ) =, que equvale a: (equação.11) QM Re s ( SQ ( X, X, X X ) SQ ( X, X ) Re ng 1 1 Re ng 1 ) =, onde: (equação.1) QM Re s QM RES é o quadrado médo do resíduo da regressão não lnear múltpla. SEQSS(X 1 X X 1, X ) = SQ Regn (X 1, X, X 1 X ) - SQ Regn (X 1, X ). SQ Regn (X 1, X, X 1 X ) Soma dos quadrados dos resíduos da regressão múltpla para o modelo não lnear contemplando X 1, X, X 1 X. SQ Regn (X 1, X ) Soma dos quadrados dos resíduos da regressão múltpla para o modelo não lnear contemplando X 1 e X. Valor Crítco: Obtdo da tabela de dstrbução F pra ν 1 = 1 e ν = (n A + n B 4). F (α /; ν1; ν) Teste blateral se NC = 95% α = 0,05 e α/= 0,05; onde: n A n de pontos do prmero conjunto orgnal, n B n de pontos no segundo conjunto orgnal..3 Análse de varânca A análse de varânca, também conhecda como ANOVA, é um teste de sgnfcânca, que utlza a dstrbução F para detectar dferenças entre médas de mas de duas populações, comparando varâncas. Esta técnca é abordada em detalhes por Montgomery [6]. A aplcação da análse de varânca envolve as seguntes consderações relaconadas com as populações em estudo: homogenedade de varâncas, dstrbução normal e que as amostras são mutuamente ndependentes e obtdas de forma aleatóras. Na realzação do presente trabalho, os recursos da planlha eletrônca do Excel foram utlzados de acordo com o descrto por Juan C. Laponn [7]. Vsando resumr como os resultados dos cálculos obtdos a partr da planlha de cálculos do Excel foram nterpretados, estão ctados a segur os prncpas tens consderados para a nterpretação:

12 9 Hpóteses Hpótese nula (H 0 ): Todas as populações têm a mesma méda (µ 1 = µ =...= µ n.) Hpótese alternatva (H 1 ): Pelo menos uma das populações apresenta méda dferente. Teste estatístco: F s QM F F cal = =, onde: (equação.13) sre s QM Re s QM F é o quadrado médo do fator que é equvalente sua varânca, QM Res é o quadrado médo dos resíduos, equvalente a varânca dos resíduos. Valor crítco: O valor crítco da estatístca pode ser obtdo de tabela de dstrbução F unlateral, consderando α = 5% e os respectvos graus de lberdade para o fator e para os resíduos. A decsão, como em qualquer outro teste de sgnfcânca, é de rejetar H 0 se o valor calculado para a estatístca de teste for maor que o valor crítco tabelado, ou acetar H 0 caso contráro. A análse de varânca fo utlzada para avalar o mpacto de fatores como comprmento de onda e ph sobre os valores obtdos para absorvânca. Amostras foram seleconadas e submetdas a condções varadas destes fatores, a fm de estmar o ntervalo no qual o procedmento analítco pode ser consderado robusto. Os resultados obtdos são apresentados no próxmo capítulo..4 Análse de regressão A análse de regressão é a ferramenta estatístca que permte a avalação de séres emparelhadas de dados com o objetvo de determnar a exstênca de uma relação sgnfcatva entre as varáves de entrada e de resposta. Além de defnr a forma especfca da curva, através de um modelo, esta análse possblta a estmatva das ncertezas assocadas ao uso subseqüente do

13 30 mesmo. Consderou-se em detalhe o modelo lnear de regressão: y = mx + b, que assume como varável de aleatóra (x), que é conhecda, e a varável resposta, ou dependente (y), que é desconhecda. O método dos mínmos quadrados é utlzado para estmar o coefcente lnear (b) e o coefcente angular (m) do modelo. Nos processos de medção químca medmos o valor de y para estmar o valor de x utlzando a regressão nversa. Consderou-se que todos os desvos de pontos ndvduas da lnha reta são decorrentes de erros de medda, ou seja, não há erros no exo do x. Para utlzar um modelo como curva de calbração, além das consderações já menconadas, é necessáro que os seguntes requstos sejam satsfatoramente atenddos: () lneardade do modelo, () aleatoredade dos erros, () homogenedade das varâncas, (v) forma de dstrbução dos erros. Quando detectada a heterocedastcdade do conjunto, à utlzação da regressão lnear ponderada é recomendada. A regressão lnear smples pode ser utlzada para estabelecer a relação entre concentração(x) e desvo padrão(s). Utlza-se então esta relação para estmar os desvos padrão referentes a cada ponto da curva. Os coefcentes de ponderação (w ), dados pela expressão a segur, são utlzados para a construção da curva de calbração. O método dos mínmos quadrados ponderados é utlzado neste caso [4]. 1 w = s 1 s (equação.14) * n Pela utlzação da regressão ponderada atrbu-se menor mportânca aos pontos que apresentam maor desvo padrão, mnmzando o somatóro dos quadrados dos resíduos ponderados. Isto resulta no deslocamento do ponto centróde da curva com estretamento dos ntervalos de confança em baxas concentrações e conseqüente alargamento dos ntervalos de confança nas concentrações mas elevadas. Anda como parte do estabelecmento da curva de calbração é precso defnr a faxa de trabalho. O lmte mínmo pode ser estabelecdo pela

14 31 estmatva do lmte de detecção ou de quantfcação. O lmte máxmo é estabelecdo pelo ponto de descontnudade de lneardade da curva analítca através do teste de sgnfcânca apresentado no tem..5. O lmte de detecção de um analto pode ser descrto como a concentração na qual o nstrumento apresenta um snal sgnfcatvamente dferente do snal da amostra de branco ou do ruído de fundo. Fo estabelecdo que esta sgnfcânca é alcançada quando o snal obtdo equvale ao snal da amostra do branco (Y b ) mas três vezes o desvo padrão da amostra do branco (s b ), que pode ser representada pela expressão a segur: Y = Y + 3S (equação.15) D b b O snal do branco da amostra (Y b ) corresponde ao coefcente lnear da curva de calbração. Para obter o valor da concentração no lmte de detecção (L D ) é precso substtur estes valores na equação de calbração e assm pode-se expressar o lmte de detecção em termos de desvo padrão de uma amostra de branco (S b ) e do coefcente angular (m) da curva analítca [8]: L D 3Sb = (equação.16) m O lmte de quantfcação, que pode ser defndo como a mas baxa concentração do analto determnável com exatdão e repettvdade acetáves, é dado por: L Q 10Sb = (equação.17) m Quando a homogenedade das varâncas é observada o desvo padrão resdual da curva analítca (RSD) é uma boa estmatva para o desvo padrão de todos os pontos da curva, nclusve para o ponto com concentração gual à concentração do branco da amostra. Desta forma é possível estmar dretamente ambos os lmtes pela utlzação desta estatístca. 3RSD L D = e (equação.18) m 10RSD L Q = (equação.19) m

15 3 A formula para o cálculo do desvo padrão resdual na regressão lnear smples (RSD) é apresentada a segur: RSD = ( y yˆ ) ( n ) (equação.0) Nos casos onde a heterocedastcdade é sgnfcatva, o desvo padrão do ponto de menor concentração da curva deve ser menor que o desvo padrão resdual ponderado (RSD W ) dado pela expressão a segur: ( y yˆ ) w RSDW = ( n ) (equação.1) A estmatva do desvo padrão para amostras de concentração desconhecda, que tveram sua concentração determnada a partr de uma curva de calbração específca, é obtda a partr de uma das expressões a segur: Quando é observada homogenedade de varâncas: S( x ) ( X X ) RSD 1 1 = + +, onde: (equação.) m p n S xx p é o número de replcatas na determnação de X, n é o número de determnações (pontos) na curva de calbração, X é a concentração de analto determnada para a amostra, X é a concentração méda da curva de calbração, ( ) X S xx = X. (equação.3) Quando é observada heterocedastcdade: S( x ) ( X X ) RSDW = + + +, sendo: (equação.4) m p n w S wxx ( X ) S wxx = w X (equação.5)

16 33 Além da construção da curva de calbração utlzou-se a técnca de regressão lnear também como ferramenta para a comparação de procedmentos analítcos dstntos. A comparação fo realzada pela análse de regressão lnear dos resultados obtdos através de procedmento cromatográfco (x), consderado como referênca, com os resultados obtdos pela aplcação do procedmento espectrofotométrco (y), procedmento proposto para análse de amostras para ensaos toxcológcas. A sgnfcânca do modelo, propramente dto, e dos respectvos coefcentes lnear e angular, é o ponto de partda para esta avalação. Como os valores obtdos para os coefcentes lnear e angular, que correspondem respectvamente às tendêncas fxa e relatva observadas, é fácl conclur comparando estes valores a 0,00 e 1,00 respectvamente [4]..5 Incerteza de medção Toda medção, ação realzada através de uma seqüênca lógca de ensaos, ajustes e observação de um nstrumento, tem como objetvo determnar a grandeza de um mensurando especfco. O resultado de uma medção é verdaderamente uma aproxmação ou estmatva do valor do mensurando e, assm, para ser consderado completo é precso que seja composto também por uma declaração da ncerteza. A ncerteza de medção é um parâmetro assocado ao resultado de uma medção, que caracterza a dspersão dos valores que poderam ser razoavelmente atrbuídos ao mensurando [9]. Este parâmetro pode ser dado por um desvo padrão, ou múltplos deste ou anda pela metade do ntervalo correspondente ao nível de confança declarado [30]. Estmando a ncerteza padrão: Mutas vezes o valor de uma grandeza, aqu desgnado por Y, é obtdo de manera ndreta, através de uma relação funconal f e de grandezas de entrada X 1,X..Xn: Y = f X, X,..., X ) (equação.6) ( 1 n

17 34 As ncertezas das grandezas de entrada devem ser expressas na forma de um desvo padrão e podem ser estmadas a partr de nformações dsponíves ou de observações repetdas através de dos métodos dstntos e defndos a segur: Incerteza tpo A: Uma sére valores é obtda, através de medções ndependentes, sob condções aparentemente dêntcas. O desvo padrão expermental da méda é determnado e utlzado como a estmatva da ncerteza padrão (u p ). s u p =, onde: (equação.7) n s desvo padrão de uma sere de dados, n número de termos nesta sére de dados. Incerteza tpo B: Um valor é obtdo dretamente de um documento ou ldo de um nstrumento. O método de avalação de tpo B é baseado em nformações dsponíves sobre a varabldade da grandeza e pode nclur: ) Dados de medções prévas. ) ) v) Experênca ou conhecmento e propredades da matéra e nstrumentos relevantes. Especfcações do fabrcante. Dados fornecdos em certfcados. v) Incertezas atrbuídas a dados extraídos de manuas. No caso da avalação pelo método tpo B a estmatva da ncerteza padrão (u p ) é obtda dvdndo-se a metade do ntervalo (a) atrbuído à grandeza pelo fator referente ao tpo de dstrbução de probabldade conhecdo para esta grandeza. A Fgura.1 lustra o ntervalo a para as dstrbuções, normal, retangular e trangular. Apresentamos na Tabela.1, a segur, o fator dvsor para os casos de dstrbução mas freqüentemente utlzados:

18 35 Fgura.1 Representação gráfca da metade dos ntervalos de confança, a, para as dstrbuções normal, retangular e trangular, respectvamente. Tabela.1 - Valores do fator dvsor para as funções de dstrbução de probabldade mas utlzadas. Tpo de Dstrbução de probabldade Fator dvsor Observação Retangular 3 Trangular 6 Normal A varânca da dstrbução retangular é gual a (a/ 3). Esta dstrbução é utlzada quando não se tem nformação sobre o tpo de dstrbução da grandeza. A varânca da dstrbução trangular é gual a (a/ 6). Para a dstrbução normal o ntervalo com 95 % de confança corresponde a (µ±σ), onde σ é o desvo padrão e µ a o valor médo. Combnando ncertezas: A ncerteza da grandeza de saída Y é composta por todas as ncertezas geradas no processo de medção, nclusve as ncertezas de cada uma das grandezas de entrada. Ela é estmada na forma de ncerteza padrão combnada (u c(y) ) pela expressão a segur: u c ( y) N N 1 N f f f = u x u ( x, x j ) 1 x + = = 1 j= + 1 x x j (equação.8) Que é equvalente a: u c ( y) N N 1 N f f f = u x u ( x ) u( x j ) r( x, x j ) 1 x + = = 1 j= + 1 x x j (equação.9)

19 36 Nos casos onde as grandezas de entrada são ndependentes, sto é, as grandezas de entrada não são correlaconadas, o segundo termo da expressão é elmnado fcando: u N f c( y) u x = 1 x = (equação.30) Se fzermos: f f c = = x1, x,..., xn, onde: (equação.31) x X c é o coefcente de sensbldade e descreve quanto da grandeza de saída y vara com alterações nos valores da grandeza de entrada x 1, x...x n. Então poderemos expressar a ncerteza combnada na forma: u N N c = c u x = y ( u y ) ) ( ) = 1 = 1 N = 1 (, onde: (equação.3) u ( y) Somatóro das ncertezas padrão das grandezas de entrada. Porém, em mutos casos a expressão para combnação de ncertezas reduz-se a expressões bem mas smples, duas regras báscas são apresentadas a segur: Regra 1: Para modelos que ncluem apenas operações de soma e subtração, como por exemplo: Y = ( p + q + r...) (equação.33) A ncerteza padrão combnada é obtda por: u u + u + u... (equação.34) c( y) = ( p) ( q) ( r) + Regra : Para modelos que ncluem apenas operações de multplcação e dvsão, como no exemplo: pq Y = (equação.35) r

20 37 A ncerteza padrão combnada é obtda por: u ( y ) u( p) u( q) u( r) c = y + +, onde: (equação.36) p q r u ( x ) x ncertezas das grandezas de entrada expressas na forma de desvo padrão relatvo. Na prátca, como modelos que envolvem ambos os tpos de operações são muto comuns, nestes casos os componentes da ncerteza são agrupados em parcelas que envolvem operações uncamente de soma e subtração e combnados, posterormente então combnados os grupos que envolvem operações referentes à segunda regra. Este agrupamento de componentes de ncerteza é faclmente conduzdo quando levamos em consderação as undades referentes a cada grandeza envolvda. Estmando a ncerteza expandda: Bascamente a ncerteza expandda (U) é um ntervalo de confança, e como tal, precsa necessaramente ter seu nível de confança estabelecdo. É obtda pela multplcação da ncerteza padrão combnada pelo fator de abrangênca (k): U = k (equação.37) u c( y) A seleção do valor do fator de abrangênca deve ser realzada com base no conhecmento sobre o tpo de dstrbução, o nível de confança exgdo e o número de graus de lberdade envolvdos. Se uma varável aleatóra é normalmente dstrbuída com esperança µ z, desvo padrão populaconal σ, méda artmétca z, de n observações ndependentes, e desvo padrão amostral s( z ), então a dstrbução de Student s, ou dstrbução-t, da varável será dada pela expressão a segur para (ν = n-1) graus de lberdade. ( z ) µ t = z (equação.38) s(z)

21 38 De uma manera geral, o número de graus de lberdade é gual ao número de termos em soma menos o número de restrções aos termos da soma [30]. Por exemplo, para uma grandeza únca estmada pela méda artmétca de n observação o número de graus de lberdade, ν, é gual a n-1. Se n observações ndependentes são utlzadas para determnar os coefcentes lnear e angular de uma lnha reta pelo método dos mínmos quadrados, então os graus de lberdade de suas respectvas ncertezas padrão é dado por n-. Em geral a dstrbução-t não descreve bem a dstrbução da varável ( Y ) / u c ( y ) y se u c(y) é a soma de dos ou mas componentes de varânca estmada, mesmo quando cada uma das grandezas de entrada estmada é normalmente dstrbuída. Consdera-se, entretanto, que a dstrbução desta varável seja aproxmada à dstrbução-t com graus de lberdade efetvos ν ef obtdos a partr da equação de Welch-Satterthate [30]: 4 uc( y) ν ef = (equação.39) n u = 1 4 ( y) ν A Tabela. apresenta os valores para o fator de abrangênca consderando-se dstrbução-t e o nível de confança mas comumente utlzado, 95,45%, em função do número de graus de lberdade envolvdos no cálculo do ntervalo. Depos de calcular a ncerteza expandda é possível expressar o resultado da medção por meo de um ntervalo de confança no qual se espera abranger a fração especfcada da dstrbução dos valores que podem ser atrbuídos razoavelmente a Y. O resultado de medção deve ser reportado na forma da expressão a segur, defnndo claramente o nível de confança seleconado: Y = y ± U. (equação.40)

22 39 Tabela. Valores do fator de abrangênca para nível de confança de 95,45% [30]. Fator de abrangênca (k) Graus de lberdade (ν) Fator de abrangênca (k) Graus de lberdade (ν) 1 13,97 16,17 4,53 17,16 3 3,31 18,15 4,87 19,14 5,65 0,13 6,5 5,11 7,43 30,09 8,37 35,07 9,8 40,06 10,5 45,06 1,3 50,05 13,1 100,05 14,0,000 15,18 - -