ESTUDO BIOQUÍMICO DAS PRINCIPAIS ENZIMAS DO FÍGADO EM UM MODELO EXPERIMENTAL DE FIBROSE HEPÁTICA. Lima PAC, Cardoso MAG, Sant'Anna LB
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- Isaac de Figueiredo Peixoto
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1 ESTUDO BIOQUÍMICO DAS PRINCIPAIS ENZIMAS DO FÍGADO EM UM MODELO EXPERIMENTAL DE FIBROSE HEPÁTICA Lima PAC, Cardoso MAG, Sant'Anna LB Universidade do Vale do Paraíba UNIVAP, Institudo de Pesquisa e Desenvolvimento, Av. Shishima Hifumi 2911 Urbanova, São José dos Campos, SP. s: pri_maclara@yahoo.com.br; magcard@univap.br; lucianabsa@univap.br Resumo- A fibrose hepática é a principal característica de uma gama de lesões hepáticas crônicas, incluindo doenças metabólicas, virais e colestáticas. As condições fisiológicas do fígado, bem como a integridade das membranas hepatocelulares e a habilidade do órgão de realizar diversas reações de metabolismo e secretar a bile, podem ser monitoradas através da atividade de várias enzimas. Este trabalho teve como objetivo analisar as alterações bioquímicas dos níveis séricos das principais enzimas do fígado, durante a progressão da fibrose hepática induzida pela ligadura do ducto biliar (LDB). Para este estudo, 20 ratos machos, foram divididos em grupo controle e grupo submetido a LDB, sendo os animais sacrificados após 4 e 6 semanas da indução da fibrose. As amostras foram processadas para a determinação das transaminases, fosfatase alcalina, Gama GT e bilirrubina total. Foi observado um aumento significativo dos níveis séricos das enzimas no grupo LDB, quando comparado ao grupo controle. Assim, a progressão de fibrose hepática induzida pela ligadura do ducto biliar foi confirmada através dos níveis séricos das principais enzimas hepáticas. Palavras-chave: fibrose hepática, bioquímica, ligadura do ducto biliar, colestase. Área do Conhecimento: Nutrição Introdução O figado desempenha um papel central em muitos processos fisiológicos essenciais. É o principal local de síntese de lipídeos e fonte de lipoproteínas plasmáticas, desempenhando assim uma função reguladora ou protetora para todo o organismo (CECIL 2005). A fibrose hepática é a principal característica de uma gama de lesões hepáticas crônicas, incluindo doenças metabólicas, virais, colestática (obstrução do ducto biliar comum) e genética. O fracasso da excreção de sais biliares na colestase leva a retenção da bile dentro dos hepatócitos e causa apoptose e necrose (LEE et al., 2007). Na colestase as funções do fígado se alteram, refletindo na nutrição do organismo, devido ao papel central do fígado na homeostase de nutrientes sendo responsável por inúmeras vias bioquímicas de produção, modificação e utilização de nutrientes e de outras substâncias metabolicamente importantes (BAVDEKAR et al., 2002). Bilirrubina pode alcançar níveis séricos elevados, podendo ser observada também a elevação da transaminase oxalacética (TGO) e transaminase prirúvica (TGP). A Fosfatase Alcalina (FA) e Gama-Glutamil Transferase (GGT) também aumentam consideravelmente sob esta condição (MAIA et al.; CECIL; FERNÀNDEZ- MARTINEZ et al., 2006 TAHAN., 2010). A ligadura do ducto biliar é um modelo típico de doença biliar em animais, induzindo intensa proliferação de células epiteliais do ducto biliar, necrose hepatocelular, ativação de células estreladas e, consequentimente, formação de fibrose hepática e cirrose, caracterizada histológicamente pela presença de séptos fibróticos (acumulo de colágeno) que se difundem pelo parenquima hepático distorcendo a arquitetura do figado. Os sais biliares são, em parte, responsáveis pelos danos da membrana plasmatica visto em modelos de ligadura do ducto biliar que leva ao estresse oxidativo adicional (WANG et al., 2007). Segundo estudos realizados por Kountouras et al. (1984) após 15 dias da ligadura de ducto biliar (LDB) as alterações metabólicas e bioquímicas não se estabeleceram completamente. Desta maneira no presente estudo os animais foram sacrificados após 28 dias, peído onde segundo os estudos já estão estabelecidos as condições da cirrose. Adiciomalmente um grupo foi sacrificado após 42 dias, para um melhor entendimento das alterações enzimáticas na progressão da doença. Este trabalho teve como objetivo analisar as alterações bioquímicas dos níveis séricos das principais enzimas do fígado, durante a progressão da fibrose hepática induzida pela ligadura do ducto biliar. 1
2 Metodologia O trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais do IPD/UNIVAP, protocolo A030/CEUA/2011. Para este estudo foram utilizados 20 ratos machos albinos da raça Wistar, com peso aproximado de 200g a 250g. Os animais foram mantidos no biotério de passagem do IP&D (Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento) da UNIVAP (Universidade do Vale do Paraíba), em gaiolas adequadas, contendo quatro animais em cada gaiola, com ração padrão autoclavada e água ad libitum, com ciclo de 12 horas claro e 12 horas de escuridão e em temperatura ambiente constante de 22±2ºC. A higienização das gaiolas foi realizada três vezes por semana, sempre no período da tarde. Depois do período de aclimatização os animais foram separados aleatoriamente, e divididos nos seguintes grupos: grupo controle (Controle, n=4) contendo animais saudáveis e grupo tratado (LDB, n=16) contendo animais submetidos à ligadura do ducto biliar. Este grupo foi subdividido em 2 subgrupos: grupo LDB4s (n=8) e grupo LDB6s (n=8) sendo que os animais foram sacrificados após 4 e 6 semanas da indução da fibrose hepática, respectivamente. Para a indução da fibrose, foi utilizado o modelo experimental da Ligadura do Ducto Biliar (KOUNTOURAS 1984; SANT ANNA et al., 2001). Os procedimentos cirúrgicos foram realizados pelo mesmo cirurgião e as técnicas foram totalmente assépticas. Os animais foram colocados em uma câmara própria e anestesiados com Isoflorano a 4,0%. Quando o animal já estava imóvel e sem reflexo de endireitamento, foi colocadas na mesa cirúrgica em decúbito dorsal e fixadas uma máscara de oxigênio e a anestesia mantida com uma mistura de oxigênio a 2L/min com Isoflorano a 1,5%. O aparelho utilizado para a anestesia inalatória foi o Gas AnesthesianSystem (Ugo Basile) (Figura 1a). A intervenção cirúrgica iniciouse com uma tricotomia e desinfecção da região abdominal com iodopovidona 10%, seguido de uma incisão na linha mediana e exposição do ducto biliar comum, o qual foi duplamente ligado com fio de sutura Seda 4,0 (Ethicon Johnson & Johnson). A primeira ligadura foi feito abaixo da junção dos ductos hepáticos e a segunda foi feito acima da entrada do ducto pancreático, e em seguida o ducto foi seccionado entre as duas ligaduras. A incisão abdominal interna foi suturada com fio de sutura Seda 4,0 (Ethicon Johnson & Johnson) e a incisão externa foi sutura com fio de sutura Seda 3,0 (Ethicon Johnson & Johnson). Após a cirurgia, foi administrado antibiótico durante 4 dias e injeção subcutânea de vitamina K (5 mg / kg) para diminuir a mortalidade por diátese hemorrágica. Após 4 e 6 semanas da indução da fibrose os animais foram pesados, anestesiados para a coleta do sangue, a qual foi realizada por via intra cardíaca, com o auxilio de uma seringa de 1ml e agulha de calibre 30x0,7mm (Figura 1b). Após a coleta de sangue e remoção do fígado, os animais foram sacrificados com a overdose de Isoflorano. O sangue foi colocado em microtubos tipo Eppendorf devidamente identificados, a temperatura ambiente até a retração do coágulo. Em seguida as amostras foram levadas para uma centrífuga (Eppendorf Centrifuge 5804R), a 20ºC por 15min com rotação de rpm (Figura 1c). O soro foi coletado com auxílio de uma pipeta de 1000µl e transferido para outro microtubo, para mais 2 centrifugações (20ºC por 10min a 2.500rpm), devido ainda existir resíduos de hemácias e finalmente armazenado em freezer a - 20ºC até o início das analises bioquímicas. Para a determinação dos níveis séricos de fosfatase alcalina (FA), transaminase oxalacética (TGO), transaminase pirúvica (TGP), gama glutamil transferase (GGT) e bilirrubina total, foram utilizados os kits da LabTest, segundo as metodologias de Roy modificado (para FA), Reitman e Frankel (para TGO e TGP), Szasz modificado (para GGT) e Sims-Horn (para Bilirrubina). As amostras foram quantificadas em espectrofotômetro a 450 (Quant Biotek ) (Figura 1d). Essas análises foram realizadas no Núcleo de Estudos Farmacêuticos e Biomédicos (NUFAB) da Faculdade de Ciências da Saúde, da UNIVAP. Os dados das quantificações bioquímicas foram expressos em média ± desvio padrão e analisados estatisticamente utilizando o programa BioEstat, versão 5.0, sendo p<0.05 considerado diferença significativa. Para a comparação das médias entre os grupos controle, LDB4s e LDB6s foi utilizado o teste não paramétrico ANOVA um fator, seguida do pós-teste de comparação múltipla de Tukey. 2
3 Figura 1: a) aparelho de anestesia inalatória; b) punção cardíaca; c) centrífuga; d) espectrofotômetro Resultados BT formam maiores, que no grupo LDB4s, porém sem diferença significativa entre eles, exceto para a enzima TGP, onde foi observado uma diferença significativa entre os grupos LDB4s e LDB6s. A Tabela 1 apresenta os valores das aminotransferases hepáticas (TGO e TGP), FA, GGT e BT nas quais se observou um aumento muito significativo quando comparado o grupo controle com os grupos LDB4s e LDB6s. No grupo LDB6s os valores das enzimas FA, GGT, TGO e Discussão A fibrose hepática é a principal característica de uma ampla gama de lesões hepáticas crônicas, incluindo metabólica, viral, colestática e genética (YOSHIOKA et al., 2004). Independentemente do agente causador da lesão hepática, o fígado, aparentemente, reage de cinco maneiras: 1. Necrose. 2. Degeneração. 3. Inflamação. 4. Regeneração. 5. Fibrose. A necrose pode seguir praticamente de qualquer lesão cujas mudanças são significativas, tendo uma inflamação nos hepatócitos. No entanto, antes que se torne caracteristicamente necrótica, hepotócitos podem tornar-se inchado e edemaciados com citoplasma irregular, compacto e com grandes espaços claros, características estas, relacionadas com a degeneração. A inflamação é definida pelo afluxo de células inflamatórias agudas ou crônicas no espaço portal ou parênquima. regeneração pode ocorrer e é visível o espessamento das cordas de hepatócitos (ou a sua proliferação) e certa desorganização da estrutura do parênquima. A fibrose ocorre através do aumento da deposição de colágeno, inicialmente em torno do espaço portal ou veia centro lobular. Se persistir a fibrose, o fígado será dividido em nódulos de hepatócitos cercadas por tecido cicatricial (cirrose) (JUNQUEIRA e CARNEIRO 2004). A ligadura do ducto biliar comum, é o modelo expeimental mais utilizado para induzir a fiborse e sua progressão para cirrose biliar secundária, em animais. Esse modelo apresenta semelhança em muitas caracteristicas observadas na cirrose humana As células estreladas hepáticas (lipócitos ou células hepáticas, que armazenam gordura) desempenham um papel importante na patogênese da fibrose hepática e cirrose hepática. Após a lesão do fígado, as células 3
4 estreladas hepáticas sofrem ativação e diferenciação em miofibroblastos, principais células produtoras de colágeno (TIEPPO et al., 2005). Na fibrose biliar, a obstrução do ducto biliar hepático comum induz o stress oxidativo, que leva à formação de radicais livres e peroxidação lipídica. O mecanismo inclui a ligação covalente de radicais livres com ácidos gordos insaturados de bio-membranas, resultando em peroxidação de lípidos e a desnaturação de proteínas e de DNA, causando a série de alterações deteriorativas nos sistemas biológicos, à inativação de células e fibrose hepática (TIEPPO et al., 2005). O corpo tem um mecanismo de defesa eficaz para prevenir e neutralizar o dano induzido pelos radicais livres. Isto é realizado por um conjunto de enzimas antioxidantes endógenos como a superóxido dismutase, catalase e GSH. Estas enzimas constituem um grupo de apoio mútuo de defesa contra a oxidação. A ligadura de ducto biliar induz um desequilíbrio da liberação de antioxidantes no que resulta em estresse oxidativo, através de uma série de eventos desregulando as funções celulares que levam ao dano hepático (SANMUGAPRIYA e VENKATARAMAN,2006). Neste estudo foi observado o efeito prejuducual da LDB sobra a função hepática, enfatizado pela elevação significativa de todas as enzimas (FA, GGT, TGO, TGP) e da BT. Embora os valores das enzimas FA, GGT, TGO e da BT foram maiores no grupo LDB6s, estes não apresentaram diferença significativa com relação ao grupo LDB4s. Este fato pode ser explicado pelo estabelecimento da fibrose já avançada (cirrose) na 4ª semana, como relatado pelos estudos de Kountouras et al. (1984) e sem grande aumento na severidade da doença na 6ª semana, uma vez que a cirrose já foi estabelecida. Esses dados tem relação com os aspectos patológicos característicos do tecido hepático com fibrose, encontrados nos estudos de Beaussier et al. (2007) e Sant Anna et al. (2011), onde não houve diferença significativa entre 4 e 6ª semana, quando avaliados os parâmetros de deposição de colágeno, proliferação ductular e quantidade de miofibroblastos, característicos da fibrose do tipo biliar. A TGO e a TGP são enzimas intracelulares presentes em grandes quantidades no citoplasma dos hepatócitos. Lesões ou destruição das células hepáticas liberam estas enzimas para a circulação. A TGP é encontrada principalmente no citoplasma do hepatócito, enquanto 80% da TGO está presente na mitocôndria. Esta diferença tem auxiliado no diagnóstico e prognóstico de doenças hepáticas. Em dano hepatocelular leve a forma predominante no soro é citoplasmática, enquanto em lesões graves há liberação da enzima mitocondrial, elevando a relação TGO/TGP (MOTTA, 2009). Em nosso estudo houve elevação das TGP e TGO no soro dos animais com na fibrose hepática, sendo a TGO com aumento (ao final de 6 semanas) maior quando comparado com a TGP ( x 31.53), o que reflete, segundo Motta (2009) um dano hepatocelular grave, coincidente com o quadro de cirrose hepática. Estes achados também estão de acordo com Silva et al. (1998) e Tieppo et al. (2005). A FA está amplamente distribuída nos tecidos humanos, notadamente na mucosa intestinal, fígado, túbulos renais, baço, ossos e placenta. A forma predominante no soro em adultos normais origina-se, principalmente, do esqueleto e fígado, onde está localizada na membrana celular dos canalículos biliares. Devido a esta localização a enzima está elevada nas desordens do trato biliar (MOTTA, 2009). O aumento da FA no soro é, então devido a síntese da enzima pelos hepatócitos, retenção de ácidos biliares no fígado, que solubilizam a fosfatase alcalina e a removem da membrana plasmática dos hepatócitos, e regurgitação da enzima para a circulação pelo impedimento da excreção. No fígado, a GGT está localizada nos canalículos das células hepáticas e, particularmente, nas células epiteliais que revestem os ductos biliares. O grau de elevação é útil no diagnóstico diferencial entre as desordens hepáticas e do trato biliar (MOTTA, 2009). Segundo Bulle et al. (1990), a GGT é o indicador de colestase mais sensível do dano ao fígado causado pela obstrução do ducto biliar. De acordo com Castro e Silva (1997) a obstrução biliar causa dois problemas mecânicos importantes. Primeiro, substâncias excretadas pelo fígado não chegam ao duodeno. Segundo, a elevação da pressão nos ductos biliares impede a excreção da bile e facilita o seu refluxo para o sangue. Assim, a bilirrubina total, a fosfatase alcalina, os ácidos biliares e a gama-glutamil transferase estão aumentados no plasma (LEE, 1994) Em nosso estudo, todos os principais marcadores da colestase (FA, GGT e BT) foram avaliados, apresentando seus níveis séricos aumentados no grupo LDB, o que está de acordo com Castro e Silva et al. (1997), Fernandez- Martinez et al. (2006) e Tahan et al. (2010), confirmando assim a especificidade dessas enzimas na colestase. Em adição, os ácidos biliares responsáveis por danos na membrana dos hepatócitos também contribuem para a elevação das aminotrasnferases, TGO e TGP, 4
5 favorecendo a gravidade da lesão hepática e colestase (WANG et al., 2007). Conclusões: Podemos concluir com este estudo, que a progressão de fibrose hepática induzida pela ligadura do ducto biliar, foi confirmada através dos níveis séricos das principais enzimas hepáticas. Referências Bibliográficas: BAVDEKAR,A.; BHAVE, S.; PANDIT, A. Nutritional management in chronic liver disease. Indian J. Pediatr., V. 69, p , BULLE, F.; MAVIER, P.; ZAFRANI, E.S.; PREAUX, A.M.; LESCS, M.C.; SIEGRIST, S.; DHUMEAUZ, D.; GUELLAEN, G. MECHANISM of g-glutamyl transpeptidase release in serum during intrahepatic and extrahepatic cholestasis in the rat: a histochemical, biochemical and molecular approach. Hepatology. V.11, p , CASTRO e SILVA JR. O.Alterações hepáticas na icterícia obstrutiva. Medicina, Ribeirão Preto. V. 30, p , FERNANDEZ-MARTINEZ, E.; PÉREZ-ÀLVAREZ, V.; TSUTSUMIC, V.; SHIBAYAMA, M.; MURIEL, P. Chronic bile duct obstruction induces changes in plasma and hepatic levels of cytokines and nitric oxide in the rat. Experimental and Toxicologic Pathology. V.58, p.49-58, effects of common bile duct ligation in Wistar rats. Acta. Cir. Bras. V.18, n.1, p , MOTTA, V.T. Bioquímica Clínica: princípios e interpretações. 9.ed. Rio de Janeiro: Ed. Medbook Editora Científica, SANMUGAPRIYA E, VENKATARAMAN S. Studies on hepatoprotective and antioxidant actions of Strychnos potatoram Linn. seeds on CCl4 induced acute hepatic injury in experimental rats. J Ethnopharmacol. 2006; 105: SANTOS JS, ZUCOLOTO S, SILVA Jr OC, SALGADO Jr W, CENEVIVA R. Cirrose biliar secundária. In: Silva OC, Zucoloto S, Beer A, editores. Modelos experimentais de pesquisa em cirurgia. São Paulo: Robe; TIEPPO J, VERCELINO R, DIAS AS, MARRONI CA, MARRONI N. Common bile duct ligation as a model of hepatopulmonary syndrome and oxidative stress. Arq Gastroenterol 2005; 42: WANG G, SHEN H, RAJARAMAN G, ROBERTS MS, GONG Y, JIANG P, BURCZYNSK F. Expression and antioxidant function of liver fatty acid binding protein in normal and bile-duct ligated rats. Eur J Pharmacol. 2007; 560: LEE TY, CHANG HH, Chenjenn H. Herb medicine ameliorates hepatic fibrosis in bile duct ligation rats. J Ethnopharmacol. 2007; 109: GOLDMAN, L.; AUSIELLO, D. Cecil Tratado de Medicina interna, 12. ed. Ed. Elsevier / Medicina Nacionais, JUNQUEIRA, L.C.U., CARNEIRO, J. Histologia Básica. 8.ed. Rio de Janeiro: Ed. Guanabara Koogan, LEE RG. Cholestasis and biliary obstruction. In: LEE RG. Diagnostic liver pathology. Mosby, St. Louis, p ,1994. KOUNTOURAS J, BILLING BH, SCHEUER PJ. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhoses in the rat. Br J Exp Pathol.V.65, p , MAIA, E.L.C.; GUIMARÃES, S.B.; MAIA, A.C.S.; MAIA, J.S.; VASCONCELOS; P.R.L. Temporal 5
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