PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE DO EXTRATO DE Helietta longifoliata (RUTACEAE) OBTIDO COM CO 2 SUPERCRÍTICO

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1 PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE DO EXTRATO DE Helietta longifoliata (RUTACEAE) OBTIDO COM CO 2 SUPERCRÍTICO Caroline Eliza Mendes 1, Anderson Luis Ohland 2, Samara dos Santos 3, Janier Sirena 2, Fabiana Casarin 1, Murilo Cesar Costelli 4, João Paulo Bender 5 Resumo: A obtenção de extratos a partir de matérias-primas de origem vegetal é uma atividade de grande interesse para a indústria de alimentos, perfumes, cosméticos, farmacêutica, entre outras. O método da extração por fluido supercrítico tem se mostrado eficiente por ser considerado uma tecnologia limpa que não deixa resíduos indesejáveis no produto final. Este trabalho teve como objetivos, realizar um planejamento experimental para extração foliar de Helietta longifoliata utilizando-se extração com dióxido de carbono em condição supercrítica e analisar previamente a composição química dos extratos obtidos. Para elaboração do planejamento experimental, variou-se três variáveis, pressão, temperatura e tempo de extração. Após a obtenção dos extratos nas condições pré-estabelecidas, analisou-se a classe de compostos extraída em cada ensaio com screening fitoquímico, com teste específico para detecção de alcalóides, terpenos e flavonóides. Para o rendimento de extrato, observou-se que apenas as variáveis tempo e temperatura são significativas, cujo rendimento aumenta com o aumento destas variáveis. Nos experimentos, com o ensaio de 250 bar, 40 ºC e 3 horas obteve-se o maior rendimento de extrato vegetal. Já na análise da classe de compostos extraídos, todos os extratos obtidos apresentaram alcalóides, flavonóides e terpenos. Uma maior quantidade de flavonóides foi observada nos testes que empregaram baixa temperatura. Alcalóides foram observados principalmente a altas temperaturas e terpenos foram visualizados em condições de alta temperatura e baixo tempo de extração, provavelmente devido a volatilidade destes compostos. Com este estudo, concluiu-se que é possível extrair terpenos, alcalóides e flavonóides de H. longifoliata utilizando-se o método de extração com fluido supercrítico. Palavras-chave: Planejamento. Alcalóides. Terpenóides. Flavonóides. 1. Introdução A utilização de extratos vegetais e plantas medicinais por humanos data de milhares de anos, sendo muito difundida no Egito Antigo, na China, na Índia e na Grécia (KAMEL, 2000). Os principais efeitos pesquisados em experimentos in vitro incluem o efeito antimicrobiano e antioxidante dos extratos herbais. Os efeitos exercidos pelas plantas podem ser explicados pela presença e constituição de seu(s) princípio(s) ativo(s) (OETTING et al., 2006). 1 Mestranda em Ciências Ambientais na Universidade Comunitária da Região de Chapecó UNOCHAPECÓ. carol_engquimica@yahoo.com.br 2 Acadêmico do curso de Engenharia Química da Universidade Comunitária da Região de Chapecó UNOCHAPECÓ. ohland@unochapeco.edu.br; janier@unochapeco.edu.br 3 Acadêmica do curso de Farmácia da Universidade Comunitária da Região de Chapecó UNOCHAPECÓ. samarasantos@unochapeco.edu.br 4 Mestre em Engenharia Química pela Universidade Federal de Santa Catarina UFSC. mccostelli@unochapeco.edu.br 5 Doutorando em Engenharia de Alimentos pela Universidade Federal de Santa Catarina UFSC. joaobender@unochapeco.edu.br

2 O principal método de obtenção de extratos vegetais é a partir de solventes reativos, entre eles destacam-se o metanol, hexano, clorofórmio e acetato de etila. Porém, um grande problema encontrado neste método são os resíduos dos solventes que ficam no produto final. Residuais de solventes são indesejáveis em produtos com finalidade farmacológica e sensorial, como o caso das fragrâncias e aromas, tendo em vista sua potencial reatividade, toxicidade e interferência no sabor e aroma destes produtos (MAUL, 2000), e por este motivo, as técnicas convencionais de extração que utilizam solventes orgânicos não devem ser aplicadas. Nestes casos, é possível utilizar a extração com fluido em estado supercrítico, a qual não deixa remascentes do fluido de arraste no extrato obtido. Qualquer fluido que esteja acima da sua temperatura crítica e sua pressão crítica caracteriza um fluido supercrítico. Nestas condições o fluido apresenta propriedades distintas das do seu estado normal, que podem ser ótimas para a extração de certos compostos. Ao voltar à sua temperatura e pressão normal abaixo das propriedades críticas, o fluido deixa de ser supercrítico e volta ao seu estado fundamental. Na prática, o estado supercrítico é obtido através de um aumento simultâneo da temperatura e da pressão de uma substância (ou mistura de substâncias) de forma a modificar o estado de agregação entre suas moléculas. Esta alteração produz uma modificação na densidade da substância (ou mistura) e, como conseqüência, de seu poder de solvatação, modificando o comportamento químico da mesma (LANÇAS, 2002). O dióxido de carbono (CO 2 ) é o fluido comumente utilizado, por ser atóxico, não inflamável, altamente disponível, principalmente como subproduto de indústrias que empregam fermentação, é de fácil reciclo após o uso e despressurização, e atinge o estado supercrítico em condições relativamente amenas (31 o C e 73 atm). Sendo um gás nas condições normais, o CO 2 é fácil de ser eliminado ou reaproveitado ao concluir-se a extração, fazendo com que o extrato já esteja pronto para a análise. Porém, segundo Lanças (2002), uma grande limitação do uso da técnica de extração com fluido supercrítico, particularmente no Brasil, é o elevado custo dos equipamentos disponíveis comercialmente quando comparados a sistemas do tipo Soxhlet e extração líquido-líquido. Assim como em qualquer atividade produtiva, o projeto de uma unidade de extração com fluido supercrítico deve visar a otimização de duas variáveis que afetam diretamente a sua viabilidade econômica: tempo de extração e

3 rendimento do processo. Deve-se, portanto, encontrar as condições operacionais que maximizem a taxa de extração e a quantidade percentual de extrato obtido de uma matéria-prima vegetal, sem comprometer a qualidade do produto, que lhe confere um alto valor agregado (MARTÍNEZ, 2005). A espécie Helietta longifoliata, pertencente a família Rutaceae, que conta com cerca de 150 gêneros e espécies, distribuídas nos trópicos, subtrópicos e regiões temperadas do hemisfério sul. No Brasil está representada por mais ou menos 29 gêneros e 182 espécies (BARROSO et al., 1984). A espécie H. longifoliatta é uma planta nativa da região sul do Brasil, e poucos estudos químicos foram realizados sobre esta espécie. Desta forma, este trabalho teve como objetivos, realizar um planejamento experimental para extração foliar de Helietta longifoliata utilizando-se extração com dióxido de carbono em condição supercrítica e analisar previamente a composição química dos extratos obtidos. 2. Materiais e Métodos 2.1. Planejamento Experimental No planejamento experimental para a extração com fluido supercrítico foram avaliadas três variáveis: pressão, temperatura e tempo. Com três fatores, optou-se por um planejamento completo 2 3, com ponto central em triplicata. As variáveis e seus respectivos níveis de variação são mostrados na Tabela 1. Tabela 1: Fatores e níveis estudados durante o Planejamento Experimental. Fatores Níveis Pressão (bar) Temperatura (ºC) Tempo (h) Os níveis de variação foram definidos após estudos na literatura, ajustando-os as limitações dos equipamentos utilizados. Os resultados foram avaliados pelo software Statistica 7.0, sendo as análises de variância realizadas segundo a ANOVA. As diferenças significativas entre as médias foram determinadas pelo teste de Tukey com nível de 5% de significância.

4 2.2. Coleta e preparação do material vegetal As folhas da espécie Helietta longifoliatta foram coletadas no município de Chapecó SC, no outono de O armazenamento do material vegetal foi realizado em freezer em temperatura média de 8ºC. Para cada extração foram utilizadas 60 g de folhas previamente trituradas em liquidificador e peneiradas, sendo utilizadas somente as partículas de diâmetro médio de 120 mesh Extração com Fluido Supercrítico Tais partículas foram inseridas no extrator, ajustando-se a pressão e a temperatura para cada tratamento. Utilizou-se como fluido de arraste dióxido de carbono (CO 2 ). Após atingida as condições pré-estabelecidas de pressão e temperatura, deixou-se o sistema em equilíbrio por 1 hora e, então, iniciou-se a extração. O produto foi coletado no separador e pesado em balança analítica. Utilizou-se pressões, temperaturas e tempo variados para cada pré-tratamento, estudados através de um planejamento experimental. Os equipamentos utilizados estão ilustrados na Figura 1. Figura 1: Foto do conjunto de equipamentos para Extração Supercrítica. Legenda: 1- cilindro de CO 2 (Air Liquid); 2- banho termostático (TECNAL TE-184); 3- válvula de regulamento da pressão; 4- bomba (Maximator DLE 30-1-UU-M); 5- coluna de extração; 6- separador.

5 2.4. Análise da composição química O screening fitoquímico dos extratos obtidos foi realizado com o intuito de identificar previamente as classes de metabólitos secundários existentes em H. longifoliata e que podem ser extraídos pelo método proposto. Portanto, a fim de facilitar a identificação dos grupos presentes neste extrato, o mesmo foi solubilizado em clorofórmio, solvente que mostrou-se capaz de solubilizar todo o extrato obtido. Foram realizadas análises de três grupos de metabólitos secundários: terpenóides, flavonóides e alcalóides. Para a realização dos testes de caracterização, utilizou-se a metodologia descrita por Wagner & Bladt (1996), via cromatografia em camada delgada. Os extratos previamente solubilizados em clorofórmio foram aplicados com auxílio de tubos capilares de vidro em placas cromatográficas de sílica-gel (Macherey-Nagel) de dimensões 5 x 6 cm, formando manchas semelhantes e regulares. Três placas foram eluídas com uma solução de 10% de metanol em clorofórmio (v/v) para devida separação dos compostos de cada um dos extratos. Após a eluição e secagem, as mesmas foram expostas a luz ultravioleta (UV), sendo registrado os resultados. Cada placa foi borrifada com um dos reagentes de detecção, cuja presença ou ausência do metabólito foi identificada pelo aparecimento de coloração específica nas reações. Para verificação da presença de terpenos utilizou-se o Reagente de Liebermann-Burchard, misturando-se 5mL de ácido sulfúrico concentrado em 45mL de anidrido acético, considerando-se o teste positivo para o aparecimento de coloração rosa, vermelha ou violeta após aquecimento. Para observação da presença de flavonóides, utilizou-se o Teste de Shinoda, misturando-se 1 g de cloreto de magnésio, 5mL de ácido clorídrico (37%) e 45mL de etanol, o qual resulta em cloração vermelha ou violeta caso o teste seja positivo. Por fim, os alcalóides foram detectados com auxílio do Reagente de Dragendorff, o qual é obtido de 50% de uma solução A contendo 0,85 g de nitrato de bismuto, 10mL de ácido acético e 40 ml de água e, 50% de uma solução B contendo 8 g de iodeto de potássio e 20ml de água. O aparecimento de coloração laranja indica a presença desta classe de metabólitos.

6 3. Resultado e discussão As extrações foram realizadas em ordem aleatória, seguindo o planejamento experimental, sendo a matriz de planejamento e os resultados de rendimento dos extratos, expressos na Tabela 2. Tabela 2: Matriz do planejamento experimental e rendimento dos extratos. Ensaio Pressão [bar] Temperatura [ºC] Tempo [h] Massa [g] (-1) 20 (-1) 1 (-1) 0, (+1) 20 (-1) 1 (-1) 0, (-1) 40 (+1) 1 (-1) 1, (+1) 40 (+1) 1 (-1) 1, (-1) 20 (-1) 3 (+1) 0, (+1) 20 (-1) 3 (+1) 1, (-1) 40 (+1) 3 (+1) 1, (+1) 40 (+1) 3 (+1) 1, (0) 30 (0) 2 (0) 1, (0) 30 (0) 2 (0) 1, (0) 30 (0) 2 (0) 1,4834 Estudando-se os dados no software Statistica, analisou-se a significância das variáveis pelo gráfico de Pareto (Figura 2), o qual indicou que apenas a variável temperatura é significativa. Porém, tendo em vista que a variável tempo apresentou uma significância considerável, optou-se por avaliá-la conjuntamente com a temperatura.

7 Figura 2: Gráfico de Pareto para o planejamento experimental. Após a realização do planejamento, o mesmo foi validado pelo teste da ANOVA, conforme expresso na Tabela 3. Tabela 3: ANOVA para a obtenção de extrato vegetal. SQ 1 GL 2 SQM 3 Regressão 0, , Resíduo 0, , Fator de Ajuste 0, Erro Puro 0, Total 0, Soma quadrática; 2 Graus de liberdade; 3 Soma dos quadrados médios Segundo Barros Neto et al. (2003) caso a razão entre SQM regressão e SQM resíduo, denominada Fator Calculado, resulte em um valor maior do que o Fator Tabelado, o qual é encontrado na Tabela de Pontos de Percentagem de Distribuição F com 5% de significância (BARROS NETO et al., 2003), tem-se evidência estatística suficiente da existência de uma relação linear entre as variáveis. No presente estudo, observou-se que o Fator Calculado resultou em um valor de 14,8221, enquanto, segundo a literatura supracitada, obteve-se um Fator

8 Tabelado de 4,46, e portanto, foi possível validar o modelo obtido e gerar a equação matemática (Equação 1) que descreve o rendimento do processo. M = 1, ,2345 * T + 0, * t (1) Na Equação (1), M corresponde a massa de extrato em gramas, T equivale a temperatura em ºC e t representa o tempo de extração em horas. Pela superfície de resposta gerada entre as duas variáveis significativas, tempo e temperatura, observa-se uma superfície linear, onde o rendimento aumenta quando o valor de ambas as variáveis é aumentado. Isto pode ser observado na região mais escura da Figura 3. Figura 3: Superfície de resposta para a obtenção de extrato vegetal Tempo versus Temperatura. O aumento do rendimento pode ser explicado devido ao fluido, nas condições de maior temperatura e pressão, encontrar-se na sua região supercrítica. Segundo Lanças (2002), o CO 2 no estado supercrítico possui propriedades de difusão similares aos gases (permitindo melhor penetração na matriz) e poder de solvatação similar aos líquidos (permitindo melhor solubilização do analito de interesse).

9 Desta forma, é possível verificar que a região ótima foi obtida utilizando-se uma temperatura de 40ºC e tempo de extração de 3 horas. Com a análise cromatográfica realizada, foi possível observar a extração das três classes de metabólitos secundários testados, em todas as condições de extração. Entretanto, em condições específicas, observou-se o aumento ou redução da intensidade das manchas características nas placas cromatográficas. Para o teste de presença de alcalóides, observou-se o aumento de manchas características desta classe de metabólitos para os tratamentos 3, 4, 7 e 8 onde nos quais manteve-se constante a temperatura (40 C) e variou-se a pressão. Sendo assim, pode-se dizer que para uma dada pressão, havendo o aumento da temperatura há o aumento de alcalóides presentes no extrato supercrítico de H. longifoliata. Efeitos similares foram obtidos por Saldaña (2002) na extração de diferentes alcalóides, a qual observa que o aumento da temperatura à pressão constante normalmente gera uma redução na densidade do alcalóide no fluido de arraste, entretanto neste caso, o aumento da pressão de vapor foi predominante para compensar esta redução na densidade, resultando no aumento da solubilidade. A classe dos terpenos apresentou-se com maior intensidade nos tratamentos 3 e 4, com média intensidade em 7 e 8 e baixa intensidade nos demais. Comparando as condições 3 e 4 com as demais, observa-se que a variável temperatura é de 40 C (máxima temperatura testada) e o tempo de extração é de 1 hora. Temperaturas inferiores a 40 C resultaram na redução do teor de terpenos o que indica uma possível correlação desta variável com o processo de extração de terpenos. No estudo realizado por Coelho et al. (2000) ao extrair o terpeno limoneno, características similares ao presente estudo, foram observadas. Segundo os autores, o aumento da temperatura resulta em uma maior poder de solvatação do CO 2 e uma maior pressão de vapor do composto o que resulta em uma maior dessorção. Além disso, observou-se que para 40 C com tempo de extração de 3 horas, houve uma pequena redução da quantidade de terpenos, podendo indicar relação inversamente proporcional entre tempo de extração e teor de terpenos. Tendo em vista a alta volatilidade desta classe de compostos, um maior tempo de extração pode resultar na perda de parte destes compostos voláteis.

10 Por fim, a classe dos flavonóides foi observada com maior intensidade nos tratamentos mais amenos com relação a temperatura, os quais utilizaram a menor temperatura estudada, para ambas as condições e pressão e tempo de extração. Segundo Santos (2011) diversos fatores como luz, temperatura e ph, desencadeiam a degradação oxidativa de pigmentos como o caso dos flavonóides, o que pode explicar a redução do teor de flavonóides nos testes que empregou-se maiores temperaturas. 4. Conclusão Pode-se afirmar que a análise dos resultados de um planejamento experimental completo é o melhor método para otimizar um processo que envolva várias variáveis experimentais. No presente trabalho observou-se que a variável pressão não é significativa no rendimento e que o aumento da temperatura e do tempo aumentam a resposta. Em todas as condições testadas foi possível extrair alcalóides, terpenos e flavonóides de H. longifoliatta, entretanto temperaturas altas favorecem o aparecimento de alcalóides e terpenos, enquanto baixas temperaturas resultaram em uma maior quantidade de flavonóides. 5. Referências BARROS NETO, B.; SCARMINIO, I. S.; BRUNS, R. E.. Como fazer experimentos: pesquisa e desenvolvimento na ciência e na indústria. 2. ed. São Paulo: Unicamp - Universidade Estadual de Campinas, p. BARROSO, G. M. et al. Sistemática de angiospermas do Brasil. v. 2, Viçosa: UFV p. COELHO, S. R. M.; ARAÚJO, J. M. A. SCHEUERMANN, E. S. S. Remoção de limoneno do óleo essencial de limão siciliano adsorvido em sílica gel pelo CO 2 supercrítico. Arq. Ciênc. Saúde Unipar, v. 4, n. 3, p , KAMEL, C. A novel look at a classic approach of plant extracts. Feed Mix, v. 8, n. 3, p.19-24, LANÇAS, F. M.. Extração com Fluido Supercrítico: Quo Vadis?. Revista Analytica, São Carlos, v. nov, n. 2, MARTÍNEZ, J.. Extração de Óleos Voláteis e Outros Compostos com CO 2 Supercrítico: Desenvolvimento de uma Metodologia de Aumento de Escala a

11 partir da Modelagem Matemática do Processo e Avaliação dos Extratos Obtidos f. Tese (Doutorado em Química) - Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas. Campinas, SP, MAUL, A. A.. Situação atual e futuro da extração supercrítica. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, v. 3, n. 16, p , Set./Out., OETTING, L. L. et al. Efeitos de extratos vegetais e antimicrobianos sobre a digestibilidade aparente, o desempenho, a morfometria dos órgãos e a histologia intestinal de leitões recém-desmamados. R. Bras. Zootec., Viçosa, v. 35, n. 4, jul./ago SANTOS, D. T.. Extração, micronização e estabilização de pigmentos funcionais : construção de uma unidade multipropósito para desenvolvimento de processos com fluídos pressurizados f. Tese (Doutorado em Engenharia de Alimentos) Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP SALDAÑA, M. D. A.. Extração de alcalóides de produtos naturais com fluido supercrítico f. Tese (Doutorado em Engenharia Química) Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP WAGNER, H.; BLADT, S. Plant drug analysis - A thin layer cromatography atlas. 2.ed. Berlim: Springer, 1996, 384 p.