Preparo de Material de Laboratório para Análises Microbiológicas

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1 Preparo de Material de Laboratório para Análises Microbiológicas Prof. Márcia R. F. G. Perdoncini

2 Todos os materiais (frascos, vidrarias, instrumentos, utensílios, etc) utilizados em uma análise microbiológica passam por diversas etapas até que se encontrem totalmente limpos, estéreis e isentos de resíduos químicos e orgânicos. São utilizados os agentes físicos e agentes químicos. Este trabalho envolve as atividades de descontaminação, descarte dos resíduos contaminados, lavagem, acondicionamento e esterilização.

3 1. DESCONTAMINAÇÃO E DESCARTE DOS RESÍDUOS: 1.1. Material Novo: Toda a vidraria nova deve passar por um tratamento de limpeza,pois podem estar presentes esporos resistentes provenientes do material de embalagem; As vidrarias devem ser mergulhadas em água destilada, enxaguadas e submetidas a testes de ph, antes de serem utilizadas; Um outro método também utilizado é a fervura em da vidraria em solução detergente, causando assim a lise dos organismos; Proceder o resfriamento e lavagem completa com água destilada.

4 Tampas de plástico ou borracha, tubos de roscas ou outros frascos, devem passar por um tratamento para a remoção de resíduos tóxicos: Mergulhar em água destilada, autoclavar a 121 o C/15 minutos e enxaguar com água destilada. Repetir este procedimento mais de uma vez.

5 1.2. Material Contaminado: Todo o material contaminado, incluindo os meios de cultura onde foi submetido o crescimento microbiano e demais utensílios que tenham entrado em contato com os microrganismos, principalmente os patógenos, devem ser submetidos à esterilização em autoclave a 121 o C por 30 minutos, observando os seguintes cuidados:

6 Afrouxar as tampas de todos os frascos com tampa de rosca; Adicionar água ou solução detergente aos estojos de descarte de pipetas, para amolecer os resíduos e facilitar a posterior remoção; Após passar por este processo de Após passar por este processo de esterilização, os resíduos contidos nas vidrarias ou em outros materiais podem ser descartados.

7 Obs.: Pode-se também proceder a descontaminação dos materiais em estufa à temperatura de o C por um tempo de 1-2 horas. Porém deve-se levar em consideração o seguinte critério: Nem todos os tipos de materiais podem ser esterilizados em estufa. Vidrarias volumétricas ao serem submetidas ao calor dilatam e podem sofrer alterações significativas nas medidas de volume; Materiais de borrachas, plásticos, etc, não podem ser submetidos à temperaturas muito elevadas por longos períodos.

8 1.3. Material não contaminado: Materiais utilizados nas análises microbiológicas que não entram em contato com as culturas de microrganismos passam diretamente para a etapa de lavagem, descartando esta etapa de descontaminação.

9 2. LAVAGEM: Nesta etapa deve-se levar em consideração a escolha do detergente e os métodos de enxágüe, para a remoção dos resíduos Escolha do Detergente: Os detergentes mais utilizados são os aniônicos, principalmente aqueles que contém compostos alcalinos como os silicatos carbonatos ou fosfatos.

10 O detergente escolhido deverá satisfazer os seguintes critérios: Ter a capacidade de amolecer a água fornecida localmente. Obs.: Água mole é aquela que carece de íons que formam sais insolúveis com os ácidos graxos de tal forma que o sabão espumará facilmente em tal fluido. Ter a capacidade de remover rapidamente o material orgânico à temperatura de 60 o C; Ser facilmente removido da vidraria após um enxágüe normal, com ph neutro; Depois de enxaguada a vidraria deverá estar livre de fatores antimicrobianos.

11 Eventualmente, pode ser necessária a aplicação de um agente mais forte, principalmente para a limpeza de utensílios que não permitem a introdução de escovas, ou para a remoção de resíduos mais resistentes à ação dos detergentes. Nestes casos os agentes mais freqüentemente utilizados são a solução sulfocrômica e a solução de hidróxido de sódio a 1 N.

12 O enxágüe dos utensílios deve ser feito de forma a garantir a completa remoção dos resíduos de detergente, solução sulfocrômica ou outro agente de limpeza utilizado. Os resíduos destes compostos podem interferir nas análises microbiológicas, tanto por alteração das características dos meios de cultura, como por inibição do crescimento dos microrganismos.

13 2.2. Procedimento para a lavagem: a. Remover todo o material contaminado nos frascos e utensílios; b. Mergulhar todo o material em solução detergente e deixar de molho por 2 horas ou mais, dependendo do grau de aderência do material a ser removido. Deve-se fazer um pré lavagem para retirar o excesso de material orgânico nas bacias de lavagem; Os tubos de Durhan devem ser colocados de molho em frascos separados, reesistentes ao calor, e submetidos à ação do vapor fluente por 15 minutos para a remoção dos resíduos de meio de cultura.

14 c. Com o auxílio de escovas e esponjas, esfregar os frascos e demais utensílios; d. Enxaguar todo o material em água corrente, por dez vezes consecutivas. e. Enxaguar em seguida com água destilada, pelo menos uma vez. menos uma vez. No caso de pipetas recomenda-se o uso de um lavador de pipetas, mantendo cada batelada sob enxágüe contínuo, por pelo menos uma hora.

15 3. SECAGEM: Após a etapa de lavagem, as vidrarias e demais utensílios passam para a etapa de secagem; Esta etapa é geralmente realizada em estufa ou em forno próprio para a secagem de materiais à temperatura de 100 o C por aproximadamente 1 a 2 horas.

16 4. ACONDICIONAMENTO: Os procedimentos seguintes referem-se aos frascos e utensílios vazios. Material com meios de cultura, diluentes e reagentes devem ser preparados, acondicionado e esterilizado seguindo as orientações geralmente contidas nos rótulos de embalagens ou no manual próprio de preparo de reagentes e meios de culturas.

17 a) Placas de Petri: devem ser acondicionadas em estojos porta placas de alumínio ou aço inoxidável, em grupos de mesma dimensão, ou embrulhadas em papel Kraft em grupos de até dez placas. b) Pipetas: Preencher o bocal com algodão e acondicionar em estojos porta pipetas de alumínio ou aço inoxidável, em grupos de mesmo volume com as pontas para baixo, na extremidade oposta à tampa do estojo. Proteger o fundo dos estojos com um chumaço de algodão ou gaze para evitar danos nas pontas das pipetas. Pode-se também embrulhar as pipetas individualmente em papel Kraft, lembrando-se de identificar a extremidade do embrulho que deve ser aberta no momento da análise, e e anotar externamente o volume da pipeta.

18 c) Tubos de ensaio vazios: tampar com tampão de algodão ou de gaze, ou ainda com as respectivas tampas no caso dos tubos rosqueáveis. Acondicionar em grupos de 4 a 6 tubos de mesmo tamanho e volume, embrulhar com papel Kraft e vedar com fita crepe especial. d) Frascos de homogeneização e outros frascos vazios tampados com tampão de algodão, gaze ou tampa própria: Cobrir a tampa ou o tampão com papel Kraft. e) Espátulas, pinças, tesouras e demais utensílios: embrulhar individualmente com papel Kraft, lembrando-se de identificar a extremidade do embrulho que deve ser aberta no momento da análise.

19 5. ESTERILIZAÇÃO: A destruição de todos os microrganismos presentes em um material, incluindo os esporos, é denominada esterilização. Todo o material de laboratório vazio (placas, pipetas, tubos de ensaio, frascos, pinças, tesouras, etc)após a etapa de acondicionamento devem ser esterilizados em autoclave (calor úmido) ou estufa (calor seco).

20 A esterilização pode ocorrer por agentes físicos (calor, radiações, filtrações) ou químicos (óxido de etileno, beta propiolactona, glutaraldeido, formaldeido) Esterilização pelo calor: A temperatura elevada é um dos métodos de maior eficiência e um dos mais utilizados na destruição de microrganismo. O calor pode ser aplicado tanto em condições úmidas (vapor ou água) quanto secas. O método que utiliza temperaturas extremas para matar os microrganismos é o da incineração

21 5.1. Esterilização pelo calor seco: Calor seco ou ar quente em temperaturas suficientemente altas, levam os microrganismos a morte. Entretanto esta técnica não é tão efetiva quanto o calor úmido e, portanto, são necessárias temperaturas muito altas e tempos de exposição maior. Por exemplo: a esterilização de vidrarias de laboratórios (como placas de petri, pipetas) requer um tempo de 2 horas de exposição a o C, enquanto que a esterilização dos mesmos materiais em autoclave requer somente 15 minutos a 121 o C. Há situações entretanto em que um material não poderá ser exposto à umidade, e o método pelo calor seco é preferido.

22 Flambagem: Consiste em passar o material sobre a chama de um bico de Bunsen ou lamparina. Utilizado para bocas de tubos de ensaio, lâminas de vidro e, eventualmente para espátulas, sondas, etc. Para tubos de ensaio, a flambagem tem finalidade de evitar possíveis contaminações na transferência ou inoculação de culturas. No caso de lâminas, espátulas e sondas a flambagem é efetuada após imersão em álcool, não implicando necessariamente em esterilização Aquecimento ao rubro em chama: Utilizado para esterilização de alças e agulhas de inoculação.

23 Uma alça de inoculação pode ser esterilizada colocando-se na chama do bico de Bunsen por alguns segundos. Parte mais quente x Parte mais fria Quando a alça de inoculação é colocada na chama, gotículas podem ser formadas, resultando em propagação de organismos vivos. Para prevenir, deve-se colocar a alça primeiramente na porção mais fria da chama e só depois colocá-la na parte mais quente.

24 Ar quente (Estufa ou forno de Pasteur): Pipetas e placas de Petri são esterilizadas a uma temperatura de o Cpor um período de 1 a 2 horas em equipamento denominado Forno de Pasteur ou mais conhecido como estufa de esterilização. O papel que protege o material deve adquirir cor parda, porém não deve escurecer muito ou se tornar quebradiço. Após o término da esterilização, deve-se esperar a o resfriamento total da estufa antes de se abrir a porta da mesma. Isto deve ser feito para se evitar mudança brusca de temperatura nas vidrarias o que levaria à quebra das mesmas.

25 5.2. Esterilização por Calor Úmido: O calor úmido é muito mais eficiente que o calor seco para destruir os microrganismos. Isto porque o calor úmido causa desnaturação e coagulação das proteínas vitais como as enzimas, enquanto o calor seco causa oxidação dos constituintes orgânicos da célula (isto é, ele queima lentamente as células). A desnaturação de proteínas celulares ocorre com temperaturas e tempos de exposição menores do que aqueles requeridos para a oxidação.

26 Por exemplo: os esporos de Bacillus anthracis são destruídos entre 2 e 15 minutos pelo calor úmido a 100 o C, mas com o calor seco leva mais de 180 min a 140 o C para conseguir o mesmo resultado. Endósporos bacterianos são as formas mais resistentes de vida. Por outro lado as formas vegetativas das bactérias são Por outro lado as formas vegetativas das bactérias são muito mais sensíveis ao calor e usualmente são mortas dentro de 5 a 10 minutos pelo calor úmido a o C.

27 Células vegetativas de leveduras e outros fungos são geralmente destruídas entre 5 e 10 minutos pelo calor úmido a o C. Para matar os esporos dos fungos no mesmo período de tempo são necessárias temperaturas de o C. A susceptibilidade dos protozoários e de muitos vírus ao calor é similar àquela da maioria das células vegetativas. O calor úmido utilizado para matar os microrganismos pode ser na forma de vapor, água fervente ou água aquecida a temperaturas abaixo do seu ponto de ebulição.

28 Vapor d água sob pressão: O uso do vapor d água sob pressão é o método mais prático e seguro de aplicação do calor úmido. Em um sistema fechado de volume constante, um aumento de pressão permitirá um aumento na temperatura. Vapor d água sob pressão fornece temperaturas maiores do que aqueles possíveis com vapor sem pressão ou água fervente. Há a vantagem também de um aquecimento rápido e maior penetração do calor. O aparelho destinado a esterilizar com vapor de água sob pressão é a autoclave.

29 AUTOCLAVE: Desenvolvida no século XIX, a autoclave é um equipamento essencial em todo o laboratório de microbiologia. Muitos meios de culturas, soluções e materiais contaminados são esterilizados rotineiramente com este aparelho. A autoclave parece uma panela de pressão no sentido em que ambas utilizam vapor sob pressão, porém a temperatura e a a pressão interna na autoclave podem ser bem mais controladas.

30 Â câmara de parede dupla da autoclave é primeiramente lavada com vapor fluente, para remover todo o ar. É então preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e pressão por um período especifico de tempo. É essencial que todo o ar residual inicialmente presente na câmara seja completamente substituído por vapor d água. Se o ar estiver presente, reduzirá a temperatura interna da autoclave. É a temperatura e não a pressão no interior da câmara, que mata os microrganismos

31 Uma autoclave é usualmente operada a uma pressão de 15 lb/pol 2, na qual a temperatura do vapor é 121 o C. O tempo necessário para esterilizar nesta temperatura depende do material que está sendo tratado. Leva mais tempo para o calor penetrar em um material viscoso ou sólido do que em material fluido. O tempo necessário também depende do volume do material que está sedo esterilizado. Por exemplo, tubos contendo 10 ml cada de um meio líquido podem ser esterilizados em 10 a 15 minutos a 121 o C, enquanto o mesmo volume de meio (10 litros) em um único frasco necessitará de uma hora ou mais, pois mais tempo será requerido para o calor penetrar no centro do material volumoso.

32 Vapor sob Pressão (autoclave): É o método mais eficiente para esterilizar meios de cultura e soluções diluentes. Deve ser utilizado para todo meio que resiste a altas temperaturas sem se alterar. Também é utilizado para vidrarias e para esterilização de cultivos e material contaminado antes da lavagem. A esterilização na autoclave geralmente é atingida a uma temperatura de 121 o C por minutos a uma pressão de 15 lbs.

33 Obs. Ao usar a autoclave é importante que todo o ar seja removido antes que a pressão seja aumentada, pois uma mistura de ar e vapor resulta numa temperatura menor a uma dada pressão. Por exemplo: se 1/3 do ar permanece na autoclave, a temperatura atingida será de apenas 115 o C.

34 Corte longitudinal de uma autoclave ilustrando as partes e a via do fluxo de vapor.

35 Vapor Fluente: Consiste em tratar térmica,mente um material à temperatura de 100 o C, em autoclave, sem utilizar a pressão de vapor. É utilizados para certos meios de cultura que É utilizados para certos meios de cultura que sofrem alterações quando submetidos a tratamentos térmicos acima de 100 o C.

36 O tratamento pode ser: Por aquecimento a 100 o C por no mínimo 60 minutos por máximo de 90 minutos; Calor intermitente (tindalização): por aquecimento a 100 o C por 30 minutos, repetindo este tratamento por três dias consecutivos, sendo o meio incubado nas condições que será usado entre um aquecimento e outro. O aquecimento do primeiro dia mata as formas microbianas vegetativas presentes no meio; Durante a incubação entre um aquecimento e outro, possíveis formas esporuladas germinam e então são destruídas nos aquecimentos subseqüentes.

37 5.3. Esterilização por Filtração: Os filtros são utilizados para esterilizar materiais que não podem ser submetidos aos outros processos de esterilização. São utilizados filtros ou membranas filtrantes capazes de reter os microrganismos. Estas membranas filtrantes são discos de ésteres de celulose finos (150 µm), com poros pequenos, que retém os microrganismos.

38 Um sistema de filtração por pressão positiva muito utilizado para pequenos volumes (até 100 ml) é o Swinnex filter-holderr (Millipore Filter Corporations) que é facilmente adaptados a seringas hipodérmicas. Para evitar a contaminação do analista por partículas aerossóis que são emitidas durante a manipulação de materiais biológicos, foram desenvolvidas cabines de segurança biológica que empregam sistema de filtração. O ar é aspirado para dentro do equipamento e filtrado através de filtros de acetato de celulose aderido a uma folha de alumínio, com a finalidade de reter 99 % de partículas presentes no ar.

39 5.4. Esterilização por radiações: Radiação ultra violeta ( nm) agem sobre o DNA da célula do microrganismo tornando-o inativo. As fontes são: lâmpadas de vapor de mercúrio a baixa pressão.

40 6. SECAGEM DE MATERIAIS: Esta etapa pode ou não ser realizada. É utilizada quando a etapa de esterilização é por calor úmido (autoclave). Geralmente após este tipo de esterilização, os materiais ficam úmidos, podendo facilitar uma contaminação. A secagem pode ser realizada em estufa de Pasteur a temperaturas de no máximo 100 o C. A armazenagem dos materiais deve ocorrer apenas após os mesmo estarem totalmente secos.

41 Aula Prática ROTEIRO: Preparar os materiais e vidrarias para serem utilizados em análises microbiológicas, seguindo a seguinte ordem: 1. Descontaminação em autoclave (121oC por 30 minutos) 2. Descarte dos resíduos; 3. Lavagem e enxágüe; 4. Secagem; 5. Acondicionamento em papel Kraft; 6. Esterilização em autoclave; 7. Armazenamento

42 Obs. Identificar os pacotes de vidrarias acondicionados com o nome da equipe, a data da esterilização e volume da vidraria quando pertinente; Usar luvas de borracha para a lavagem das vidrarias; Usar avental especial para a lavagem das vidrarias; Não esquecer do último enxágüe em água destilada; Não esquecer de retirar o ar residual da autoclave.