GRUPO HOSPITALAR CONCEIÇÃO HOSPITAL NOSSA SENHORA DA CONCEIÇÃO LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS SETOR MICROBIOLOGIA

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1 Versão: 5.0 Data da efetivação: 10/04/2015 POP: M 22 Página 1 de 11 Elaborado por: Maria do Carmo F. Pereira Revisado por: Fernanda Concli Leite Aprovado por: Andréa Cauduro 1. Sinonímia: Cultura de vigilância, varreduras, descolonização. 2. Aplicabilidade: Bioquímicos, auxiliares e estagiários do setor de microbiologia do LAC-HNSC. 3. Aplicação clínica: Para controle de infecção hospitalar ou para outros cuidados na instituição. Em situações de surtos em unidades hospitalares, buscando detectar precocemente casos colonizados / infectados por microrganismos de importância epidemiológica, isolados em amostras clínicas, caracterizando que o paciente requer medidas de precaução para não disseminar o microrganismo a outros pacientes ou profissionais. 4. Princípio do teste: Culturas de vigilância são realizadas para detecção e identificação de espécies dos microrganismos relevantes (patógenos hospitalares) e determinação de seu perfil de resistência aos antimicrobianos. Visa posterior isolamento do paciente sem tratamento clínico a fim de prevenir a contaminação cruzada. Quando necessário os microrganismos isolados são armazenados, em freezer 70 C (ver POP: M23), para estudos posteriores por meio de métodos moleculares, com o objetivo de detectar possível disseminação clonal no hospital ou em outras instituições. 5. Amostra: 5.1 Preparo do paciente: Depende do microrganismo pesquisado e da medida de bloqueio epidemiológico. 5.2 Tipo de amostra: Numa coleta para vigilância, deve-se considerar o tipo de microrganismo, o perfil de resistência a ser investigado e o local da coleta da amostra.

2 Versão: 5.0 Data da efetivação: 10/04/2015 POP: M 22 Página 2 de 11 Elaborado por: Maria do Carmo F. Pereira Revisado por: Fernanda Concli Leite Aprovado por: Andréa Cauduro Amostras clínicas: Enterobactérias carbapenêmicos resistentes Swab retal /perianal ou fezes Pesquisa de Enterococcus spp. resistentes à vancomicina (VRE) Swab retal ou perianal Detecção de Acinetobacter resistente ao Imipenem. Swab retal, perianal ou colostomia Swab de pele * Periumbilical Swab orofaringe Aspirado traqueal ou outro sítio respiratório Sítio de inserção do cateter vascular central Ferida operatória ou drenos: identificando os sítios Secreções (sítio aberto), nasal... Urina Culturas especiais para CIH (CCI) Depende do germe a pesquisar. Hemocultura ** * passar um swab na seguinte seqüência pele da testa, fossa antecubital bilateral, axilas e região inguinal bilateral. Caso apresente lesões de pele, o swab deve ser passado também sobre as mesmas. ** Quando o paciente apresentar clínica de nova infecção. Ver POP: M12.

3 Versão: 5.0 Data da efetivação: 10/04/2015 POP: M 22 Página 3 de 11 Elaborado por: Maria do Carmo F. Pereira Revisado por: Fernanda Concli Leite Aprovado por: Andréa Cauduro Amostras para controle de vigilância microbiológica de superfícies: São solicitadas pelo CIH. Utilizar o cadastro rápido: - No leito: número do registro da CIH; - No nome: CIH-local onde foi coletado; - Exame: VRE, CV8, MCR, CCI; - CRM: médico responsável da CIH; - Obs: repetir o número do registro da CIH. Nas culturas de vigilância de superfície pesquisar os seguintes microrganismos: - Enterococcus vancomicina resistente. - Enterobactérias carbapenêmicos resistentes. - Acinetobacter, Pseudomonas, Burkholderia, Stenotrophomonas. - No caso de crescimento de BGP, ECN e outros colocar código E /ou no caso de isolamento de um germe especifico com valor epidemiológico. Obs: Considerando que a solicitação de controle de superfícies interdita o ambiente e/ou o leito, as mesmas devem ser consideradas urgência, devendo ser registradas e processadas imediatamente após a entrada no laboratório. 5.3 Colheita: Ver manual de coleta. 5.4 Preservação e transporte: Amostras encaminhadas ao laboratório à temperatura ambiente (20 a 25 C) no máximo até 4 horas após a coleta. No laboratório devem ser refrigeradas (2 a 8 C), antes de serem processadas. Os frascos de Hemocultura devem ser transportados à temperatura ambiente (20 a 25 C) imediatamente, ou até 12 horas após a coleta. 5.5 Identificação da amostra: Identificação feita através de etiqueta gerada pelo sistema de gerenciamento de dados do LAC Armazenamento: Temperatura ambiente: hemoculturas e swabs. Refrigeradas (2 a 8 C), após serem processadas: aspirado traqueal, secreções (sítio aberto), drenagens, urina e outros quando necessário.

4 Versão: 5.0 Data da efetivação: 10/04/2015 POP: M 22 Página 4 de 11 Elaborado por: Maria do Carmo F. Pereira Revisado por: Fernanda Concli Leite Aprovado por: Andréa Cauduro 5.7 Amostras inadequadas: Critérios de rejeição: - Rejeição de amostras sem identificação e mal acondicionadas. - Amostras colhidas em frasco ou tubos não estéreis. Critérios de aceitação para amostras em condições desfavoráveis: 6. Reagentes e materiais: 6.1 Materiais: - Sangue com 16 mcg/ml de Imipenem (ASIM) - Ágar de Mueller Hinton - Ágar Azida - Ágar Sangue - Ágar Mac Conkey - Ágar Cromogênico - VRE - Fr. hemoculturas aeróbias, anaeróbias e pediátricas. - Insumos da automação (identificação) - Citrato, Malonato, TSI, Lisina, MIO, Dnase - Ágar bile esculina. - Meio OF - Alça bacteritéril descartável e calibrada 1 µl - Discos para antibiograma: Ver POP: M 6 - Micropipetas automáticas 50 µl - Ponteiras - Pinça - Alça bacteriológica estéril descartável e calibrada 1 mcl - Lâminas para confecção do esfregaço - Caldo TSB - Caldo tioglicolato - Swab com meio de transporte (coleta) - Pipeta automática

5 POP: M 22 Página 5 de Preparo: Meios de cultura comerciais ou preparados no laboratório e corantes utilizados no método de coloração de Gram Ver POP: M Estabilidade: Dos insumos preparados no laboratório é de acordo com o prazo de validade descrito no rótulo ou na planilha de controle de qualidade. Os comerciais, os prazos de validade do fabricante. 6.4 Armazenamento: - Refrigeração (2-8ºC): reagentes, controles, insumos da automação (identificação + ATB), discos para antibiograma, meios de cultura. - Temperatura ambiente: corantes. 7. Equipamentos: Microscópio Estufa. Autoclave. Refrigerador. Cabine de segurança biológica (CSB) Equipamento de automação (identificação) Bico de Bunsen 8. Calibração: 9. Procedimento: 9.1 Rotina para solicitação: - Requisição de SADTs (não pelo prontuário eletrônico), preenchida manualmente com nome completo, registro e leito do paciente. - O campo do exame pode ser preenchido como: - Cultura ou controle de vigilância para... - Swab de vigilância ou swab retal de vigilância para... - Pesquisa de VRE. - Pesquisa MCR. - Pesquisa para carbapenêmicos resistentes.

6 POP: M 22 Página 6 de 11 - Assinada pelo médico, enfermeira assistente ou CIH do respectivo hospital. - A requisição deverá acompanhar o material clínico identificado com nome do paciente e sítio. - O swab retal ou perianal pode ser o mesmo (um único) para as pesquisas de VRE, MCR e Acinetobacter. 9.2 Rotina para registro: - Registrar na Entrada de Amostra. - Registrar com os códigos específicos dos exames: Enterobactérias carbapenêmicos resistentes Pesquisa de Enterococcus spp. resistentes à vancomicina Detecção de Acinetobacter resistente ao Imipenem. Culturas especiais para CIH Código: MCR Amostra: Swab retal, perianal ou fezes Código: VRE Amostra: Swab retal ou perianal Códigos e amostras: CV1 Swab de pele; CV2 Swab retal ou perianal; CV3 Swab orofaringe; CV4 Aspirado traqueal; CV5 Sítio de inserção do cateter vascular central; CV6 ferida operatória ou drenos; CV7 Periumbilical; CV8 Secreções (sítio aberto), nasal e outros; CV9 Urocultura (HCR) Código: CCI Amostra: depende do germe a pesquisar ou em sabonetes, soro ou outros insumos encaminhados - Digitar registro do paciente no campo destinado ao leito. - Encaminhar para o setor e colocar as fichas na bancada específica para as vigilâncias, colocar no refrigerador R01 (2 a 8 C) as amostras antes de serem processadas.

7 POP: M 22 Página 7 de Rotina interna dos auxiliares: Utilizar EPI - equipamento proteção individual - Ver POP L Processar em cabine de segurança biológica (CSB) e quando necessário o bico de Bunsen semear em bancada aberta. - Após o termino da rotina realizar a limpeza e desinfecção da superfície: retirar todo o material utilizado da CSB e umedecer uma gaze com álcool 70% e friccionar em toda a superfície. Deixar secar. Quando indicado repetir o processo por 3 vezes, com intervalo de 30 segundos. - Separar cuidadosamente os swabs de um mesmo paciente podendo ou não usar atilho ou estante. - Colocar nas culturas de vigilância: data, horário e rubrica. - Não realizar Gram da amostra. - No caso de swab retal utilizar o mesmo swab para todas as pesquisas, semeando primeiro no ASIM, segundo no agar cromogênico (VRE) e terceiro no caldo TSB (MCR). - Incubar em estufa bacteriologia aeróbia a 35 +/- 1ºC. Caldo TSB ou caldo tioglicolato por 12 a 18 horas antes do repique em meio sólido. Enterobactérias carbapenêmicos resistentes (MCR) Pesquisa de Enterococcus spp. resistentes à vancomicina (VRE) Detecção de Acinetobacter resistente ao Imipenem. (CV..) Culturas especiais para CIH noite: adicionar um disco de ertapenem (10ug) em tubo contendo 10ml de caldo TSB, introduzir o swab no caldo, homogeneizar, retirar e descartá-lo. tarde: Semear o caldo em meio sólido (Ágar MC) por esgotamento e a seguir aplicar obre a superfície do meio já semeado dois discos de ertapenem no inicio e final das estrias. noite: semear em agar cromogênico. Quando insumo em falta não processar, triar e deixar a ficha no escaninho. noite: semear aspirado traqueal, swab retal e urina diretamente em meio sólido (ASIM). Os demais swabs, semear no caldo TSB (5 ml) todos juntos. tarde: Semear o caldo em meio sólido (Agar ASIM) esgotamento. por noite: semear em agar sangue carneiro e caldo tioglicilato. (repique em MC). Dependendo do insumo encaminhado realizar a cultura em frasco de hemocultura, aspirando assepticamente o fluido para inocular no frasco, fazendo anti-sepsia prévia do local retirado e da tampa do frasco de hemocultura somente com clorohexidina alcoólica.

8 POP: M 22 Página 8 de Colocar na ficha o horário e data da primeira semeadura. 2. Colocar no primeiro tubo da seqüência o horário e o dia a ser semeado no meio sólido, contando-se 12 a 18 horas após o último tubo semeado. 3. Quando semear a última placa anotar o horário e o dia na primeira placa da seqüência. 9.4 Rotina interna dos bioquímicos: - Realizar a leitura das placas cultivadas no período da manhã e à tarde, para agilizar a liberação dos resultados. - Observar o aspecto das colônias, sua morfologia através da coloração de Gram, oxidase ou outro teste quando necessário. - Culturas especiais para CIH CCI - reportar o microrganismo isolado. Só realizar o antibiograma dependendo de solicitação da CIH. - Quando positivos, após liberar no SIL, avisar o respectivo CIH e registrar no na Assessoria Médica / Valores Críticos (POP L12). - Leitura de placas semeadas diretamente do material (VRE, CV4, CV2 e CV9): 24 horas. - Leitura das placas de materiais previamente semeados em TSB: 18 a 24h de incubação. Pesquisa de Enterococcus spp. resistentes à vancomicina (VRE): - Triagem das placas semeadas, observando aspecto das colônias. - Realizar coloração de Gram. - Quando crescimento abundante no meio cromogênico, realizar Gram e/ou GPI e liberar o resultado. Culturais negativos deixar incubado por 24 a 36 horas e liberar como sítio não colonizado. - No caso de falta do Agar Cromogênico, liberar na observação o código: 1143 Exame não realizado por falta de insumo. Detecção de Acinetobacter resistente ao Imipenem: - Triagem das placas semeadas, observando aspecto das colônias, sua morfologia. - A resistência para o Imipenem é observada pelo crescimento no meio de ASIM. - Realizar Gram urgente e repicar em TSI; se necessário identificar na automação. - Deixar culturais negativos incubados por 24 horas a 36 horas. - Culturais que são semeados primeiro no caldo TSB, o meio sólido (ASIM) pode ser liberados após 24 horas de incubação (liberar paciente do isolamento). - Ausência de crescimento de Acinetobacter: liberar como sítio não colonizado.

9 POP: M 22 Página 9 de 11 Detecção de enterobactérias carbapenêmicos resistentes (código MCR): - Triagem das placas semeadas, observando crescimento de enterobactérias dentro do um halo com diâmetro igual ou menor que 27 mm ao redor do disco de ertapenem (halo para triagem). - Na suspeita de não fermentador realizar oxidase, Gram urgente e repicar em TSI. - Selecionar a colônia ou as colônias suspeitas, identificar, solicitar teste fenotípico para carbapenemase e interpretar conforme descrito no POP: M Quando necessário encaminhar para o LACEN/GAL isolar em placa de ágar de Mueller Hinton. - Reportar o negativo como sítio não colonizado e os positivos a identificação e o resultado do teste. - No caso de falta do disco de ertapenem, liberar na observação o código: 1143 Exame não realizado por falta de insumo. Limitações do método: - Enterobactérias podem apresentar resistência aos carbapenêmicos por mecanismos outros que não carbapenemases, sendo o mais comum à expressão de cefalosporinase de espectro estendido, como a enzima AmpC ou um ESBL combinado com a perda de porina. Estes isolados vão crescer no ágar MacConkey e identificados como resistentes ou intermediários aos carpapenêmicos no antibiograma pelo método da difusão do disco. Independente do mecanismo envolvido, enterobactérias que apresentam o fenótipo intermediário ou de resistência aos carbapenêmicos são preocupantes para o CIH. O resultado deve ser reportado o mais rapidamente possível pelo laboratório para SCI, para implementação de precauções de contato ou isolamento dos pacientes colonizados com esta bactéria. - Pacientes podem ser colonizados com Enterobactérias resistente aos carbapenêmicos (ERC) ou Enterobactérias produtoras de carbapenemases em concentrações que não pode ser detectada por este método. Estudos descritos por Landman et al. e estudos realizados no CDC sugerem que o menor limite de detecção está entre 1X10 2 a 1X10 6 UFC/mL. - Bacilos Gram-negativos não fermentadores com resistência aos carbapenêmicos, como Acinetobacter spp. e Pseudomonas aeruginosa, serão detectados no ágar Mac Conkey. 9.5 Maiores detalhes consultar os POPs : M 3, M 4, M 5, M Controle de qualidade: 10.1 Interno: Ver POP: M Externo: Ver POP: M 1.

10 POP: M 22 Página 10 de Resultados: 11.1 Unidades: 11.2 Cálculos: 11.3Critérios de aceitação: Resultados cujas amostras foram preparadas rigorosamente dentro das condições estabelecidas. Os controles de qualidade devem apresentar resultados dentro dos valores estabelecidos. 12. Valores de referência: Ver Manual de Exames. 13. Valores críticos: Ver POP: L Especificações de desempenho: 15. Fontes potenciais de variabilidade: 16. Limitações do método: 17. Interpretação dos resultados: N/A 18. Biossegurança: Ver POP: L 15 Biossegurança.

11 POP: M 22 Página 11 de Anexos: 19.1 Controle de Qualidade: Ver formulários: Form nº 8.12 V 2.0 Form nº V 1.0 Form nº 5.5 V Bibliografia: 1. Oplustil, C.P.; Zoccoli, C.M.; Tobouti, N.R.; Sinto, S.I. - Procedimentos Básico Microbiologia Clínica. São Paulo 2010 Brasil, Editora Sarvier, 3ª edição. 2. Koneman, E.W.; Allen,S.D.; Janda, W.M.; Schereckenberger,P.C.; Winn Jr., W.C. Color atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 5 ed., Philadelphia, Lippincott-Raven, Termo de Cooperação n 37 Agência Nacional de Vigilância Sanitária / Organização Pan-Americana da Saúde / Organização Mundial da Saúde. 4. MICROBIOLOGIA (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) Perguntas&Respostas KPC Dra. Flávia Rossi. Dra. Denise Andreazzi. Dr. João Nóbrega. Dra. Ana Paula Cury. 4. Nota técnica conjunta CEVS e IPB LACEN/RS nº 01/ Notificação e Investigação de Bactérias Multiresistente: Bactéria portadora de gene KPC no RS Fevereiro Nota técnica ANVISA n 01/2013 Medidas de Prevenção e Controle de Infecções por Enterobactérias Multiresistentes Abril 2013.