IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE SNPS EM UMA POPULAÇÃO DE MAPEAMENTO DE CANA- DE-AÇÚCAR

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1 IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE SNPS EM UMA POPULAÇÃO DE MAPEAMENTO DE CANA- DE-AÇÚCAR IDENTIFICATION AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF SNPS IN A SUGARCANE MAP POPULATION Alexandre Hild Aono (1) Estela Araujo Costa (2) Hugo Rody Vianna Silva (3) James Shiniti Nagai (4) Anete Pereira de Souza (5) Reginaldo Massanobu Kuroshu (6) Resumo A cana-de-açúcar é uma das mais importantes fontes de açúcar no mundo e tem se tornado cada vez mais relevante para a produção de combustíveis renováveis. No entanto, seu grande, poliplóide e complexo genoma tem impedido avanços nos processos de seleção genômica. O objetivo desse trabalho foi a identificação de variações genéticas putativas em uma população de cana-de-açúcar utilizando dados de Genotipagem por Sequenciamento. Com a utilização de duas diferentes ferramentas para mineração de SNPs em conjunto com uma análise de enriquecimento, técnicas de estatística multivariada e aprendizado de máquina não-supervisionado, nós obtivemos resultados bastante positivos, identificando SNPs putativos em regiões genômicas associadas a importantes processos biológicos envolvidos no transporte de açúcar e metabolismo. Palavras-chave: GBS, Mineração de SNPs, GATK, SAMtools, Análise de Enriquecimento Abstract Sugarcane is one of the most important sources of sugar in the world and has become increasingly important for the production of bio-based fuels. However, its large, polyploid and complex genome has hindered advances in genomic selection processes. The objective of this work was to identify putative genetic variations in a sugarcane population using Genotyping by Sequencing data. Using two different SNP callers together with an enrichment analysis, multivariate statistical techniques and unsupervised machine learning, we obtained extremely positive results, identifying putative SNPs in genomic regions associated with important biological processes involved in the transport of sugar and metabolism. Keywords: GBS, SNP Mining, GATK, SAMtools, Enrichment Analysis 1 Graduando em Ciência da Computação pelo Instituto de Ciência e Tecnologia da Universidade Federal de São Paulo, ICT/UNIFESP, alexandre.aono@gmail.com; 2 Pós-doutoranda no ICT/UNIFESP; 3 Pós-doutorando no ICT/UNIFESP; 4 Mestrando em Ciência da Computação pelo ICT/UNIFESP; 5 Professor titular na Unicamp, Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG), Departamento de Biologia Vegetal, Instituto de Biologia; 6 Professor adjunto no ICT/UNIFESP

2 1. Introdução A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma espécie poliploide e essa condição de ploidia está presente em aproximadamente 70% das angiospermas, incluindo várias culturas economicamente importantes. Além de representar a fonte de açúcar em todos os países tropicais e subtropicais, essa cultura tem se tornado cada vez mais importante para a produção de combustíveis renováveis. Duas principais espécies, Saccharum officinarum (2n=80) e S. spontaneum (2n=40-120), contribuíram para a origem das cultivares atuais, cuja variação genômica pode nos fornecer um maior entendimento sobre morfologia vegetal, adaptação ambiental, poliploidização, acúmulo de açúcar, tolerância a stress e outras características importantes (SONG et al., 2016). Devido a diversos fatores como alto nível de ploidia, alta heterozigosidade, grande número de sequências repetidas, presença de aneuploidia e um grande genoma (SONG et al., 2016; YANG et al., 2017) compreendido entre 100 e 130 cromossomos (BALSALOBRE et al., 2017), estudos genéticos e genômicos em cana-de-açúcar têm sido um grande desafio. Em espécies com ploidia elevada, para cada loco segregante podem existir diferentes números de alelos e, dessa forma, um alto número de marcadores moleculares é necessário para garantir uma cobertura razoável do genoma da cana e permitir avanços em estudos posteriores (BALSALOBRE et al., 2017). Atualmente, as tecnologias de sequenciamento de nova geração estão aumentando nossa compreensão sobre os genomas, tornando análises genéticas mais factíveis em muitas espécies não modelo, incluindo espécies poliploides complexas como a cana-de-açúcar. Além disso, métodos que se baseiam no enriquecimento de regiões específicas e na utilização de enzimas de restrição estão sendo amplamente utilizados por terem se mostrado eficientes na produção de um subconjunto representativo de genomas para a mineração de variações genéticas (YANG et al., 2017). Uma possível abordagem para gerar dados populacionais para esta espécie é a genotipagem por sequenciamento (GBS), que permite a identificação de variações genéticas sem um genoma de referência, sendo adequada para estudos populacionais, caracterização de diversidade genética em germoplasma, melhoramento genético e mapeamento de características de importância econômica em diversos organismos (ELSHIRE et al., 2011). O objetivo deste trabalho é a identificação de marcadores moleculares SNPs, Polimorfismos de Nucleotídeo Único, utilizando dados de GBS de uma população de mapeamento de cana-de-açúcar e a associação de tais polimorfismos putativos a funções biológicas de importância à espécie.

3 2. Materiais e Métodos Um conjunto de 182 irmãos completos derivados de um cruzamento biparental entre as espécies comerciais IACSP e IACSP-3046 foi genotipado utilizando a tecnologia GBS (ELSHIRE et al., 2011). Como primeira parte do trabalho, foi estabelecido um pipeline para identificar SNPs e indels (inserções e deleções) a partir de dados de GBS em genomas poliplóides. Foram utilizadas como primeiras etapas no pré-processamento dos dados: (1) a demultiplexação dos dados e (2) a remoção dos barcodes utilizando o FASTX-Toolkit (GORDON; HANNON, 2010) em conjunto com algoritmos desenvolvidos. Em seguida, utilizando o BWA (0.7.15) (LI, 2013), foi realizado um alinhamento comparativo contra uma pseudo-referência do genoma da cana-de-açúcar, o genoma metil-filtrado (MF) (GRATIVOL et al., 2014). De um total de de sequências do genoma MF, selecionamos , que correspondem às sequências codificantes de DNA (CDSs) do MF. Com essa seleção, CDSs foram identificadas nos arquivos de mapeamento e as leituras correspondentes selecionadas para as análises posteriores. Com os softwares SAMtools (LI et al., 2009) e Picard tools, os seguintes passos foram executados: (1) ordenação, (2) compressão, (3) marcação de duplicatas de PCR e (4) inserção de informações relacionadas aos indivíduos às quais determinados grupos de leituras pertenciam. As variações foram identificadas usando o HaplotypeCaller, implementado no GATK v3.7 (MCKENNA et al., 2010) e SAMtools v 1.4 (LI et al., 2009) e passaram por filtros de qualidade e profundidade mínimos. Como etapa seguinte, todos os locos consenso das scaffolds de MF selecionadas (CDSs) foram alinhados contra os genomas de CDSs de Sorghum bicolor, Oryza sativa e Zea mays com uso do BLASTn (ZHANG et al., 2000) e parâmetros de cut-off de 20 e comprimento mínimo de alinhamento igual a 60. Para investigar quais funções foram consistentemente super-representadas em toda a população, uma análise de enriquecimento baseada nas categorias GO, Gene Ontology (GENE ONTOLOGY CONSORTIUM, 2004), foi realizada. Com a seleção de categorias GO específicas e a utilização do software estatístico R (R CORE TEAM, 2000), uma análise de componentes principais (PCA) foi realizada em conjunto com a execução do algoritmo K-médias para identificação de grupos na população com alto nível de similaridade utilizando um método de aprendizado de máquina não supervisionado. 3. Resultados e Discussão Com o alinhamento de 831 milhões de leituras contra o genoma MF, obtivemos uma correspondência de 96%, o que representa uma alta porcentagem de correspondência. Utilizando o GATK, pudemos identificar um total de SNPs e indels putativos; comparados com

4 SNPs e indels do SAMtools. Utilizando a intersecção das ferramentas, obtivemos um total de SNPs e 290 indels, demonstrando a alta sobreposição de SNPs identificados por ambas as ferramentas. De modo a garantir uma maior acurácia aos resultados, utilizamos nas análises posteriores apenas as variações identificadas por ambas as ferramentas. Com o uso da análise de enriquecimento realizada em conjunto com as variações identificadas pela intersecção das ferramentas, encontramos importantes categorias GO envolvidas no transporte de açúcar e metabolismo. Tais categorias foram identificadas em 72 diferentes scaffolds de MF com incidência de 538 SNPs, representando os seguintes processos biológicos: formação da substância orgânica, processo biossintético de pequenas moléculas, transporte de substância orgânica e transporte de íons transmembrana. Essas variações foram selecionadas para realização da PCA de modo a entender a influência de tais marcadores na população. Com o mesmo conjunto de dados, utilizamos o algoritmo de K-médias para identificação de dois diferentes grupos baseando-se na similaridade de genótipos entre cultivares. Utilizando as classes definidas pelo K-médias e os componentes principais 1 e 2 da PCA, pôde ser verificada uma clara segregação entre indivíduos da população, não havendo sobreposições de genótipos de grupos diferentes. Dessa forma, o conjunto de SNPs putativos identificados nesse estudo e que foram associados a categorias GO relevantes em estudos de cana-de-açúcar foi suficiente para definição de grupos de genótipos na população, o que representa indícios de como essas variações genéticas podem estar envolvidas em genes que controlam importantes características fenotípicas, possibilitando representar diferentes possíveis fenótipos para tais características. 4. Conclusão Usando esse pipeline trouxe resultados extremamente positivos para poliplóides complexos como a cana-de-açúcar, tornando todas essas seqüências de consenso com possíveis SNPs uma importante fonte de dados. Ainda, esses SNPs serão candidatos prioritários para o desenvolvimento de marcadores específicos funcionais, sendo extremamente promissores para estudos genéticos e genômicos na cana-de-açúcar.

5 Referências BALSALOBRE, T. W. A.; PEREIRA, G. S.; MARGARIDO, G. R. A.; GAZAFFI, R.; BARRETO, F. Z.; ANONI, C. O.; CARDOSO-SILVA, C. B.; COSTA, E. A.; MANCINI, M. C.; HOFFMAN, H. P.; SOUZA, A. P.; GARCIA, A. A. F; CARNEIRO, M. S. GBS-based single dosage markers for linkage and QTL mapping allow gene mining for yield-related traits in sugarcane. BMC genomics, v. 18, n. 1, p. 72, ELSHIRE, R. J.; GLAUBITZ, J. C.; SUN, Q.; POLAND, J. A.; KAWAMOTO, K.; BUCKLER, E. S.; MITCHELL, S. E. A robust, simple genotyping-by-sequencing (GBS) approach for high diversity species. PloS one, v. 6, n. 5, p. e19379, GENE ONTOLOGY CONSORTIUM. The Gene Ontology (GO) database and informatics resource. Nucleic acids research, v. 32, n. suppl_1, p. D258-D261, GORDON, A.; HANNON, G. J. Fastx-toolkit. FASTQ/A short-reads preprocessing tools (unpublished) cshl. edu/fastx_toolkit, v. 5, GRATIVOL, C.; REGULSKI, M.; BERTALAN, M.; MCCOMBIE, W. C.; SILVA, F. R.; ZERLOTINI, A.; VICENTINI, R.; FARINELLI, L.; HEMERLY, A. S.; MARTIENSSEN, R. A.; FERREIRA, P. C. G. Sugarcane genome sequencing by methylation filtration provides tools for genomic research in the genus Saccharum. The Plant Journal, v. 79, n. 1, p , LI, H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM. arxiv preprint arxiv: , LI, H.; HANDSAKER, B.; WYSOKER, A.; FENNELL, T.; RUAN, J.; HOMER, N.; MARTH, G.; ABECASIS, G.; DURBIN, R. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics, v. 25, n. 16, p , MCKENNA, A.; HANNA, M.; BANKS, E.; SIVACHENKO, A.; CIBULSKIS, K.; KERNYTSKY, A.; GARIMELLA, K.; ALTSHULER, D.; GABRIEL, S.; DALY, M.; DEPRISTO, M. A. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing nextgeneration DNA sequencing data. Genome research, v. 20, n. 9, p , SONG, J.; YANG, X.; RESENDE, M. F. R.; NEVES, L. G.; TODD, J.; ZHANG, J.; COMSTOCK, J. C.; WANG, J. Natural allelic variations in highly polyploidy Saccharum complex. Frontiers in plant science, v. 7, p. 804, TEAM, R. Core. R language definition. Vienna, Austria: R foundation for statistical computing, YANG, X.; SONG, J.; YOU, Q.; PAUDEL, D. R.; ZHANG, J.; WANG, J. Mining sequence variations in representative polyploid sugarcane germplasm accessions. BMC genomics, v. 18, n. 1, p. 594, ZHANG, Z.; SCHWARTZ, S.; WAGNER, L.; MILLER, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational biology, v. 7, n. 1-2, p , 2000.