UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS CURSO DE AGRONOMIA NATAN RODRIGUES MARTINS

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS CURSO DE AGRONOMIA NATAN RODRIGUES MARTINS VIABILIDADE DE FUSARIUM, RHIZOCTONIA E SCLEROTIUM PRESERVADOS PELO METÓDO TERRIÇO Uberlândia-MG Agosto

2 NATAN RODRIGUES MARTINS VIABILIDADE DE FUSARIUM, RHIZOCTONIA E SCLEROTIUM PRESERVADOS PELO METÓDO TERRIÇO Trabalho de conclusão de curso apresentado ao curso de Agronomia, da Universidade Federal de Uberlândia, para obtenção de grau de Engenheiro Agrônomo. Orientador: Fernando Cezar Juliatti Uberlândia-MG Agosto

3 NATAN RODRIGUES MARTINS VIABILIDADE DE FUSARIUM, RHIZOCTONIA E SCLEROTIUM PRESERVADOS PELO METÓDO TERRIÇO Trabalho de conclusão de curso apresentado ao curso de Agronomia, da Universidade Federal de Uberlândia, para obtenção de grau de Engenheiro Agrônomo. Orientador: Fernando Cezar Juliatti Msc. Igor Forigo Beloti Membro da Banca Msc. Breno Cezar Marinho Juliatti Membro da Banca Prof. Dr. Fernando Cezar Juliatti Orientador

4 RESUMO VIABILIDADE DE FUSARIUM, RHIZOCTONIA E SCLEROTIUM PRESERVADOS PELO METÓDO TERRIÇO. As doenças de plantas são conhecidas desde os primórdios da civilização, entretanto a fitopatologia como ciência é relativamente nova, surgindo a partir dos trabalhos de De Bary (1853) quando se comprovou a natureza parasítica de alguns patógenos. Os Problemas de escassez de alimentos estão intimamente relacionados com a ocorrência de doenças e pragas. A população mundial padece de escassez de alimentos ou não tem acesso a uma dieta com calorias suficientes para uma vida saudável. No Brasil, a agricultura também experimentou o impacto negativo de doenças de plantas tendo sido registrado várias epidemias importantes em áreas de cultivos de todo país que causaram perdas significativas da produção. A manutenção de um acervo biológico permite que pesquisas possam ser realizadas utilizando microrganismos a todo o momento desde que haja condições favoráveis para o desenvolvimento das plantas. Essas pesquisas são importantes desde o desenvolvimento de material genético resistente a doenças como também para alternativas de controle do patógeno, garantindo assim o máximo da produção das lavouras. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar os métodos de preservação terriço da micoteca formada ao longo dos anos da micoteca do Laboratório de Micologia e Proteção de Plantas (LAMIP) do Instituto de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Uberlândia. Foi verificado a viabilidade dos fungos preservados através da pulverização do inoculo em tubos de ensaio contendo meio de cultura inclinado (BDA), com ph corrigido para 5,5. Foram utilizados seis tubos de ensaio para cada isolados e posteriormente identificados com a realização de lâminas em microscópio ótico (400 X). O método terriço mostrou ser uma opção viável para preservação do acervo biológico do laboratório mantendo viável isolados de Fusarium (média de 18 anos), Sclerotium rolfisii (20 anos), e Sclerotinia sclerotiorum (cinco anos). Palavra-chave: Métodos de Preservação, Preservação de fungos, Terriço.

5 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRAFICA MATERIAL E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERENCIAS... 18

6 1 1. INTRODUÇÃO O desenvolvimento da Fitopatologia como ciência data de período relativamente recente. No entanto, o relato de doenças em plantas é bastante antigo e, desde que o homem passou a desenvolver um modo de vida sedentário e a praticar a agricultura como forma de obter alimentos para sua sobrevivência, passou também a enfrentar problemas relacionados à perda completa de plantações por questões de doenças ou pragas. As culturas exploradas economicamente são parasitadas por inúmeros fitopatógenos causadores de doença, ocasionando perdas e prejuízos financeiros durante toda a cadeia desde a sua produção até o transporte, armazenagem, comércio e consumo (Michereff, 2001). Dentre os diferentes fitopatógenos existem os fungos habitantes do solo, caracterizados por apresentarem forma de sobrevivência saprófita, e os fungos que necessitam de um hospedeiro vivo para sua sobrevivência, denominado biotróficos (Bueno, 2006). Como exemplo de fungos de vida saprófito podem ser citados os gêneros Rhizoctonia, Fusarium, Sclerotium e Verticilium. Fungos biotróficos podem ser representados por ferrugens, míldios, oídeos e carvões. (PASSADOR et al., 2010) Nem sempre é possível a preservação de microrganismos em condições naturais, portanto a preservação de fungos fitopatogênicos é de suma importância para que pesquisas possam ser realizadas a qualquer momento e com qualquer finalidade, seja em programas de melhoramento ou na obtenção de métodos de controle alternativos para o patógeno. Os métodos de preservação devem manter as condições originais do patógeno como viabilidade, capacidade esporulante e patogenicidade (BUENO 2006). Os principais métodos de preservação utilizados para fungos necrotróficos são: baixas temperaturas ou congelamento, nitrogênio líquido, sílica-gel, terriço, tecido seco de hospedeiro infectado, repicagens periódicas, água destilada ou método Castellani, liofilização e óleo mineral. Contudo, nenhuma técnica é aplicada com sucesso para todos os fungos. (MENEZES et al., 1997). Cada método de preservação possui suas particularidades como custo, mão de obra ou efeitos sobre o microrganismo preservado e sua longevidade. Sendo assim, não existe um método universal de preservação predeterminado. A escolha do método deve ser feita levando

7 2 em conta as características do fungo, da estrutura laboratorial e mão de obra disponível. Todo trabalho envolvendo microrganismos deve ser realizado sob absoluta assepsia, utilizando-se para isto, câmara de fluxo laminar, equipada com lâmpada ultravioleta germicida, para esterilização prévia, e bico de Bunsen ou lamparina (ALFENAS et al., 2007). Após correta identificação e isolamento do fungo de interesse, este deve ser preservado a fim de evitar variações genéticas e contaminações do mesmo. O tempo mínimo de preservação é de trinta dias em meio de cultura, porem existem fungos que não suportam esse período em qualquer condição. Para esses fungos, o mais indicado são os métodos de preservação a baixas temperaturas (APARECIDO et al., 2012). Sendo assim, o presente trabalho tem por objetivo avaliar a viabilidade de fungos dos gêneros Fusarium, Rizoctonia, Sclerotium e Verticillium preservados em método terriço no Laboratório de Micologia e Proteção de Plantas (LAMIP) do Instituto de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Uberlândia.

8 3 2. REVISÃO BIBLIOGRAFICA A microbiologia se desenvolveu notavelmente durante o século XIX, principalmente pelo reconhecimento do homem sobre a importância dos fungos, algas e bactérias. A partir desse momento, passou-se a dar importância em manter microrganismos a pronta disposição. Várias técnicas passaram a ser desenvolvidas com intuito de se isolar, cultivar e preservar tais microrganismos. Esses microrganismos possuem importância em diversas áreas como fins industriais, de ensino ou pesquisa e recentemente, com grande importância em estudos referentes a analise de DNA e mapeamento genético enfatizando ainda mais a importância de coleções vivas para estudos filogenéticos (PIRES et al., 2012). A preservação é de suma importância para que a pesquisa seja realizada em qualquer tempo, mesmo que as condições naturais para sobrevivência e desenvolvimento do fungo não sejam ideais. Além de manter a viabilidade, o método deve preservar as características originais dos fungos como capacidade esporulante e patogenicidade. Geralmente, essas condições são atendidas quando o meio propicia a baixa atividade biológica minimizando riscos de mutação e variabilidade genética (BUENO, 2006). A preservação das estruturas dos fungos fitopatogênicos possibilita a realização de trabalhos de pesquisa a qualquer tempo e local, eliminando a necessidade de se trabalhar com plantas hospedeiras e de encontrar áreas com fontes de inoculo natural do microrganismo de interesse. O fato de o Brasil apresentar duas estações bem definidas potencializa mais os avanços de pesquisa na área, pois nem sempre as condições do meio são favoráveis ao desenvolvimento de plantas hospedeiras ou da sobrevivência do próprio fungo (BUENO, 2006). Sendo assim, um dos principais objetivos da preservação é evitar a formação excessiva de mutações que alterem as características dos microrganismos que podem afetar a produtividade de um processo como todo. Isso é conseguido quando o meio proporciona um baixo número de gerações filhas de um microrganismo preservado, não havendo grandes variações genéticas da célula mãe. Algumas vezes pode-se desejar preservar um microrganismo que foi selecionado ou até mesmo melhorado geneticamente de forma a evitar a perda dessa modificação realizada. Porém, não basta apenas preservar as características do organismo,

9 4 deve-se também conhecer a máxima preservação e viabilidade das células bem como o número de células vivas que o método proporciona ao isolado (APARECIDO et al., 2013). A falta de métodos de preservação de fungos in vitro por um longo período de tempo se torna uma barreira para os estudos da fisiologia, genética e patogenicidade. A obtenção de inoculo livre de contaminações em quantidades suficientes e em boas condições de viabilidade é necessária para a caracterização dos fungos e para proceder a comparações entre diferentes espécies, identificação de novas raças, estudos laboratoriais além de potencializar os resultados em programas de melhoramento genético de plantas (BUENO, 2006). O conjunto de fungos preservados por algum meio seja para uso imediato ou para eventuais interesses futuros é denominado micoteca. As micotecas possuem função próxima da função dos bancos de germoplasma, sendo assim, a partir delas culturas podem ser solicitadas por pesquisadores de instituição de pesquisa. Além de se obter um inoculo viável e livre de contaminações, as micotecas diminuem o risco de entrada de patógenos exóticos e reduzem a dependência de material vindo do exterior (APARECIDO et al., 2007). No Brasil, a principal micoteca de interesse fitopatogênico é a Mário Barreto Figueiredo, do laboratório de Micologia Fitopatológica do Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Vegetal do Instituto Biológico de São Paulo. A micoteca se iniciou em 1961 pelo agrônomo e fitopatologista Mário Barreto Figueiredo e conta hoje com mais de 900 materiais, em sua maioria formada a partir da analise clinica de matérias para obtenção de laudo técnico pelo Instituto Biológico (APARECIDO et al., 2007). Repicagens periódicas, preservação em óleo, em água, em solo ou em silica-gel, são de baixo custo e não requerem trabalho intensivo, assegurando a preservação do material biológico por longos períodos (ALFENAS et al., 2007). O método de rotina mais utilizado para a manutenção de culturas a curto prazo é o método de repicagens periódicas. Consiste na repicagem periódica do fungo em estudo para novos tubos de ensaio ou placas de Petri, contendo o meio de cultura adequado para seu crescimento e esporulação. Os tubos ocupam menos espaço e possuem superfície exposta bem menor em relação à placa de Petri, estando menos sujeitos a contaminações. Estes são mantidos em temperatura que favoreça o crescimento do fungo até que colonize todo o meio de cultura. Após, devem ser mantidos a baixa temperatura, em refrigerador (10 C), buscando a redução da atividade metabólica do microrganismo. Os tubos de ensaio devem ser mantidos com

10 5 tampões de algodão hidrofóbico, evitando-se contaminações; no caso de placas de Petri, estas devem ser vedadas com parafilme ou rolopac (ALFENAS et al., 2007). O tempo de repicagem das culturas varia com o fungo, o meio de cultura, a umidade e a temperatura de armazenamento. Quando em meio inclinado e armazenado em geladeira são usualmente repicadas a cada seis meses. Além de laboriosas, as repicagens periódicas podem induzir o patógeno ao hábito saprofítico, alterar sua morfologia, acarretar a diminuição e a perda de sua capacidade de esporular, além de proporcionar a diminuição de sua agressividade e a perda da patogenicidade (MENEZES et al., 1997). O método de preservação em água esterilizada foi descrito pela primeira vez por Castellani (1939) para a preservação de fungos de interesse médico, dos gêneros Candida, Geotrichum, Cladosporium, entre outros. Este método é um processo simples e econômico, que substitui o meio de cultura por água destilada e esterilizada (ALFENAS et al., 2007). O fungo é cultivado em meio contendo ágar por tempo suficiente, até que seja possível a retirada de discos de cultura, os quais são inseridos em frascos de vidro contendo água destilada esterilizada ou em solução aquosa de NaCl 0,85 % (CASTELLANI, 1939). O método de preservação em óleo mineral consiste em cobrir as colônias de fungos crescidas em meio de cultivo contendo ágar, com óleo mineral esterilizado; após, as colônias são mantidas à baixa temperatura (4 C) (ALFENAS et al., 2007). O princípio do método baseia-se em minimizar ou estagnar a multiplicação do fitopatógeno sob óleo mineral, devido à redução da disponibilidade de oxigênio. O tempo de preservação sem perda da viabilidade depende da espécie fúngica, podendo variar de meses a vários anos. A preservação em sílica-gel permite a manutenção de fungos com boa esporulação por longos períodos, mas a viabilidade depende do microrganismo e da temperatura de armazenamento (MENEZES et al., 1997). A preservação em terriço é uma técnica de fácil execução, requer pouco espaço, possibilita a obtenção de grande quantidade de propágulo de microrganismos e garante sua viabilidade por muito tempo (ALFENAS et al., 2007)(MENEZES et al., 1997). A metodologia descrita por Alfenas et al., (2007) consiste na adição de 1 ml de suspensão concentrada de esporos em frascos, contendo 5g de solo (areia e argila) autoclavado a 121 C/1h por dois dias sucessivos. A adição de farelo de trigo ou grãos de aveia em solo argilo-arenoso possui bons resultados. Após 15 dias em temperatura que favoreça o

11 6 crescimento micelial, este é colocado em geladeira a 4-5 C ou à temperatura ambiente (± 20 C). Fungos habitantes do solo, como Rhizoctonia spp. Sclerotium spp., Alternaria sp., Cochliobolus sp., Cylindrocladium spp., Cylindrocladiella spp., Falcocladium spp., Fusarium spp., Trichoderma spp. e Gliocladium spp., podem ser preservados com sucesso por esta técnica. Adaptações do método podem ser empregadas, como a adição de farelo de trigo ou grãos de aveia em solo argilo-arenoso, com bons resultados para fungos do solo. Grandes coleções podem ser preservadas por este método, a baixas temperaturas (4 a 5 C) (ALFENAS et al., 2007).

12 7 3. MATERIAL E MÉTODOS Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Micologia e Proteção de Plantas (LAMIP) do Instituto de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Uberlândia. A grande maioria dos fungos dessa coleção foi isolada de plantas recebidas pela clínica do LAMIP como material a ser analisado, objetivando emissão de laudo contendo a identificação do agente causal, bem como medidas de manejo. Uma pequena parte é proveniente de coleções de outros institutos de pesquisa nacionais. Observou-se a viabilidade dos fungos preservados através da pulverização de inoculo em tubos de ensaio contendo meio de cultura inclinado (BDA), ph corrigido para 5,5. Adicionouse a cada litro de BDA 15 mg dos antibióticos Clorofenicol, Estreptomicina, Ampicilina na tentativa de minimizar contaminantes como Aspergillus Rhizopus e Penicillium (Adaptado de ALFENAS et al., 2007). Foram utilizados seis tubos de ensaio para cada isolados sendo estes mantidos em câmara climatizada (20 ± 2 C). (Figura 1) Figura 1. Tubos de ensaio com meio de cultura BDA pulverizados com terriço utilizados para crescimento dos isolados. Dos isolados que apresentaram viabilidade foram feitas lâminas para avaliação em microscópio ótico (400 X) observando-se a capacidade esporulativa do fungo e confirmação de sua identidade. Os esporos e estruturas encontrados foram comparados com as ilustrações do livro de identificação de fungos deuteromicetos de Barnett (2004). Os testes foram realizados com os 61 isolados pertencentes ao LAMIP. A coleção foi formada por 4 gêneros de fungos isolados de diversos hospedeiros (Tabela1).

13 8 Tabela1. Nome do patógeno, hospedeiro, date de entrada. Uberlândia (MG), Código Nome do Fungo Nome do Hospedeiro Data de entrada LAMIP 010 Fusarium oxyporum Algodão 01/12/1998 LAMIP 011 Fusarium oxyporum Algodão 09/05/2001 LAMIP 012 Fusarium oxysporum Algodão 16/05/2001 LAMIP 013 Fusarium oxysporum Algodão 01/02/1999 LAMIP 014 Fusarium oxysporum Banana 15/05/1995 LAMIP 015 Fusarium oxysporum Banana 03/05/2001 LAMIP 016 Fusarium oxysporum Feijão 01/12/1995 LAMIP 017 Fusarium oxysporum Feijão 01/12/1996 LAMIP 018 Fusarium oxysporum Feijão 03/10/2001 LAMIP 019 Fusarium oxysporum Soja 01/01o/1999 LAMIP 020 Fusarium oxysporum Soja 16/05/2001 LAMIP 021 Fusarium oxysporum Tomate 05/07/2001 LAMIP 022 Fusarium oxysporum Tomate 20/06/2001 LAMIP 023 Fusarium oxysporum Tomate 03/10/1988

14 9 Tabela1. Continuação LAMIP 024 Fusarium oxysporum Tomate 01/12/1996 LAMIP 025 Fusarium oxysporum Tomate 13/11/2001 LAMIP 026 Fusarium oxysporum Tomate 18/04/1990 LAMIP 027 Fusarium oxysporum Tomate 18/04/1990 LAMIP 028 Fusarium oxysporum Tomate 18/04/1990 LAMIP 029 Fusarium oxysporum Tomate 20/06/2001 LAMIP 030 Fusarium oxysporum Tomate 19/06/2001 LAMIP 031 Fusarium oxysporum Tomate 13/11/2001 LAMIP 032 Fusarium oxysporum Tomate 05/06/2001 LAMIP 033 Fusarium oxysporum Tomate 24/09/2001 LAMIP 034 Fusarium oxysporum Tomate 20/11/2001 LAMIP 035 Fusarium oxysporum Tomate 19/06/2001 LAMIP 036 Fusarium oxysporum f. Lycopersici Tomate 07/05/1997 LAMIP 037 Fusarium oxysporum f. Lycopersici Tomate 25/04/1997 LAMIP 038 Fusarium oxysporum f. Lycopersici Tomate 26/11/1992 LAMIP 039 Fusarium oxysporum f. Lycopersici Tomate 24/09/2001 LAMIP 042 Fusarium Solani Soja 01/02/1999

15 10 Tabela1. Continuação LAMIP 044 Fusarium sp. Maracujá 01/03/1999 LAMIP 045 Fusarium sp. Maracujá 09/05/2001 LAMIP 046 Fusarium sp. Maracujá 20/11/2001 LAMIP 047 Fusarium sp. Maracujá 20/11/2001 LAMIP 061 Rizoctonia Alface 01/04/2000 LAMIP 062 Rizoctonia Café 23/05/2001 LAMIP 063 Rizoctonia Café 10/01/2002 LAMIP 064 Rizoctonia Café 15/05/1995 LAMIP 065 Rizoctonia Tomate 20/11/2001 LAMIP 066 Rizoctonia Tomate 05/06/2001 LAMIP 067 Rizoctonia Soja 10/01/2002 LAMIP 068 Rizoctonia Algodão 16/11/1976 LAMIP 069 Rizoctonia Algodão 11/11/1993 LAMIP 070 Rizoctonia Algodão 03/12/1993 LAMIP 071 Rizoctonia Algodão 03/12/1993 LAMIP 072 Rizoctonia Algodão 12/11/1993

16 11 Tabela1. Continuação LAMIP 073 Sclerotium rolfsii Pimentão 01/04/1994 LAMIP 074 Sclerotium rolfsii Pimentão (caule) 01/04/1994 LAMIP 075 Sclerotium rolfsii Pimentão 23/05/2001 LAMIP 076 Sclerotium rolfsii Pimentão (caule) 05/06/2001 LAMIP 077 Verticillium Tomate 01/12/1996 LAMIP 078 Verticillium Tomate 10/01/2002 LAMIP 112 Rhizoctonia sp. Maracujá Desconhecido LAMIP 113 Fusarium oxysporum Alho 22/10/2002 LAMIP 114 Rhizoctonia Canola 06/09/2005 LAMIP 116 Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum Algodão 17/11/2003 LAMIP 117 Fusarium oxysporum Alho 22/10/2002 LAMIP 118 Fusarium Algodão 14/02/2003 LAMIP 118 Fusarium Algodão 14/02/2003 LAMIP 119 Fusarium Algodão 15/01/2003

17 12 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO A preservação de fungos pelo método terriço conseguiu manter a viabilidade e a esporulação de vários gêneros de fungos de diferentes hospedeiros, no acervo biológico do LAMIP (Tabela2).

18 13 Tabela 2. Nome do patógeno, hospedeiro, date de entrada e data de inoculação, tempo de preservação em anos, esporulação. Uberlândia (MG), Código Nome do fungo Hospedeiro Data de entrada Data de inoculação Tempo de preservação (anos) Esporulação LAMIP 011 Fusarium oxyporum Algodão 09/05/ /04/ ,9 + LAMIP 012 Fusarium oxysporum Algodão 16/05/ /04/ ,9 + LAMIP 013 Fusarium oxysporum Algodão /02/99 08/04/ ,2 + LAMIP 014 Fusarium oxysporum Banana 15/05/ /04/ ,9 + LAMIP 018 Fusarium oxysporum Feijão 03/10/ /04/ ,5 + LAMIP 020 Fusarium oxysporum Soja 16/05/ /04/ ,9 + LAMIP 022 Fusarium oxysporum Tomate 20/06/ /04/ ,8 + LAMIP 023 Fusarium oxysporum Tomate 03/10/ /04/ ,5 + LAMIP 026 Fusarium oxysporum Tomate 18/04/ /04/ ,0 + LAMIP 028 Fusarium oxysporum Tomate 18/04/ /04/ ,0 + LAMIP 031 Fusarium oxysporum Tomate 13/11/ /04/ ,4 + LAMIP 032 Fusarium oxysporum Tomate 05/06/ /04/ ,8 + LAMIP 033 Fusarium oxysporum Tomate 24/09/ /04/ ,5 + LAMIP 034 Fusarium oxysporum Tomate 20/11/ /04/ ,4 + LAMIP 036 Fusarium oxysporum f. lycopersici Tomate 07/05/ /04/ ,9 - LAMIP 037 Fusarium oxysporum f. lycopersici Tomate 25/04/ /04/ ,0 + LAMIP 038 Fusarium oxysporum f. lycopersici Tomate 26/11/ /04/ ,4 + LAMIP 039 Fusarium oxysporum f. lycopersici Tomate 24/09/ /04/ ,5 + LAMIP 043 Fusarium Soja 01/05/ /04/ ,9 + LAMIP 044 Fusarium sp. Maracujá 01/03/ /04/ ,1 - LAMIP 045 Fusarium sp. Maracujá 09/05/ /04/ ,9 - LAMIP 046 Fusarium sp. Maracujá 20/11/ /04/ ,4 -

19 14 Tabela 2. Continuação LAMIP 047 Fusarium sp. Maracujá 20/11/ /04/ ,4 LAMIP 073 Sclerotium rolfsii Pimentão 01/04/ /05/ ,1 LAMIP 113 Fusarium oxysporum Alho 22/10/ /04/ ,5 + LAMIP 116 Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum Algodão 17/11/ /04/ ,4 + LAMIP 119 Fusarium Algodão 15/01/ /04/ ,2 + T7 Sclerotinia sclerotiorum Soja 23/03/ /05/2014 5,1

20 15 Bueno (2006) afirma que o método de repicagem periódicas não consegue preservar Sclerotinia sclerotiorum por muitos anos podendo levar o organismo a perda da patogenicidade. Métodos que não permitem sucessivas gerações, como é o caso do terriço, são mais indicados para estes gêneros. Michereff (2001) relata que Fusarium oxysporum produz clamidósporos, estruturas de resistência, de parede espessa e lisa, o que permite ao fungo sobreviver no solo por mais de 10 anos. A espessura das paredes do fungo podem ser uma das repostas que explique a longevidade de Fusarium oxysporum preservados em terriço e ate mesmo em condições ambientais quando este se encontra no solo. A resistência dessas estruturas também permite a sua preservação por outras técnicas, algumas inclusive mais agressivas como é o caso da liofilização. Aparecido et al.(2007) relata a preservação de Fusarium oxysporum pela técnica de liofilização por mais de 20 anos e em Castellani por mais de 1 ano. Segundo Bueno (2004), o número médio de clamidósporos de F. oxysporum é maior, com o aumento do teor de umidade do solo. Técnicas de preservação como liofilização e sílica retiram grande parte da umidade do meio e dos próprios esporos. Contudo a quantidade de clamidósporos de F. oxysporum que conseguem resistir à técnica pode ser suficiente para colonizar o meio desejado. Bueno (2004) avaliou a sobrevivência de estruturas de resistência de Fusarium oxysporum e Rhizoctonia solani. O armazenamento das estruturas foi feito em frasco de 500 ml, com duas repetições por patógeno, sendo cada frasco mantido em temperatura de -20 ºC, 5 ºC e em temperatura ambiente. Após um ano de avaliação, realizou-se teste de patogenicidade das estruturas de cada patógeno que sobreviveu no melhor tratamento (temperatura). Os melhores resultados para os isolados de F. oxysporum preservados por terriço foram os que estavam mantidos na temperatura de -20 C e 5 C. O oposto pode ser observado para Rhizoctonia solani que não pode ser preservados em temperatura de -20 C e 5 C devido à perda de viabilidade. Esse fato pode ser uma resposta para a não preservação do gênero feito pela micoteca do LAMIP, pois todas as amostras foram armazenadas em condição de geladeira e freezer. Finatti (2009) ressalta que esporos do fungo de gênero Verticillium apresentam esporos extremamente delicados, incapazes de resistir a processos de preservação agressivos. Ressalta

21 16 ainda que fungos do gênero Verticillium preservados em Castellani mostrem maior agressividade em seu desenvolvimento e patogenicidade, mostrando assim ser um bom método para o gênero.

22 17 5. CONCLUSÃO O método de terriço mostrou ser uma opção viável para preservação do acervo biológico do laboratório mantendo viável isolados de Fusarium (máximo 25 anos), Sclerotium rolfisii (20 anos), e Sclerotinia sclerotiorum (5 anos). As condições de preservação em -5 ºC e -20 ºC não foram favoráveis para a preservação de Rhizoctonia solani. Os isolados de Verticilium não conseguiram manterem-se viáveis por apresentarem esporos mais frágeis.

23 18 REFERENCIAS ALFENAS, A.C., MAFIA, R.G. Métodos em Fitopatologia. Viçosa UFV APARECIDO, C.C, & CAMILO, C. Comparação de métodos para a preservação de fungos do gênero Colletotrichum em láboratorio. Biólogico, p APARECIDO, C.C, HUANG, C., PASSADOR, M., FINATTI, D., & FIGUEIREDO, M. Avaliação da viabilidade de culturas fúngicas preservadas pelo métodos de Castellani (água destilada) e liofilização. Biológico, p APARECIDO, C.C, PIRES, G.C.C, FINATTI, D., CAMILO, C. M. Preservação de microorganismos a -80º C. Biológico, v.74, p BUENO, C. Métodos de preservação para fungos fitopatoênicos habitates do solo. Pesquisa&Tecnologia, vol BUENO, C.J. Produção e preservação de estruturas de resistência de fungos fitopatogênicos habitantes do solo F.45. Tese de doutorado em proteção de plantas-faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP-Campus de Botucatu. UNESP, Botucatu. CATELLI, Lizandra Lucy. Resistência da soja à ferrugem asiática e ao oídio: herança de caracteres quali-quantitativos e mapeamento genético xi, 95 f. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Disponível em: < FINATTI, D., & APARECIDO, C.C. Caracterização fisiológica e comparação de diferentes métodos na preservação, em laboratório, de isolados do gênero Verticillium. Biológico, MENZES,M; HANLIN, D.M.W.S. Guia prático para fungos fitopatoênico. Recife.UFRPE, Impressa universitária MICHEREFF, S.J. Fundamentos de Fitopatologia. Recife: UFRPE.2001 PASSADOR, M., PIRES, G., FINATTI, D., APARECIDO, C., & FIGUEIREDO, M. Manutenção da viabilidade e patogenicidade de culturas fungicas mantidas na micoteca " Mario Barreto FIGUEIREDO". Biológico, PASSADOR, M.M; COUTINHO, L.N; FIGUEIREDO, M.B. Avaliação da viabilidade, esporulação e patogenicidade de culturas de Verticillium fungicola conservadas pelo método de Castellani. Biológico, São Paulo. p PIRES, G., APARECIDO, C.C, & FINATTI, D. Preservação em laboratório de fungos filamentosos por longos períodos de tempo. Biológico,