2015 Dr. Walter F. de Azevedo Jr.

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1 Membrana Celular Objetivos Visualizar a estrutura tridimensional de membranas biológicas, a partir do uso de recursos computacionais. Identificar as principais regiões de fosfolipídios. Visualizar e analisar um modelo de bicamada lipídica. Analisar os contatos das moléculas de água com a bicamada lipídica. Visualizar a estrutura da carboxipeptidase. Calcular o potencial de membrana. Materiais 1. Computador imac; 2. Programa VMD (Visual Molecular Dynamics) para visualização de macromoléculas biológicas; 3. Programa NGS; 4. Arquivos com coordenadas atômicas. Procedimento Visualização do fosfolipídio DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicerol-3- fosfocolina). Carregar as coordenadas atômicas do fosfolipídio dppc1.pdb, da seguinte forma: na pasta Pratica4, localize o arquivo dppc1.pdb e arraste-o para a tela gráfica do VMD. Clique na tela gráfica. Você terá o fosfolipídio na tela gráfica. As representações indicam linhas para cada ligação covalente presente nos átomos. Azul para uma ligação covalente que sai de um átomo de nitrogênio, vermelho para uma ligação covalente a partir de um átomo de oxigênio, amarelo escuro para uma ligação covalente de um átomo de fósforo e ciano para uma ligação covalente de um átomo de carbono. Gire o fosfolipídio com o botão da esquerda do mouse, e gire a molécula em torno de um eixo perpendicular à tela usando-se a tecla da direita. Identifique as partes polar e hidrofóbica do fosfolipídio. Mude a representação para CPK, conforme visto nas aulas anteriores. Medida das distâncias interatômicas. O programa VMD permite a determinação da distância entre átomos, para isto use a seguinte sequência de comandos do VMD: VMD MainMouseLabelBonds, ou clique no número 2 do teclado. Tente clicar em alguns pares de átomos para determinar a distância entre eles. Os átomos não precisam estar ligados para que o programa mostre a distância entre eles. As distâncias são representadas em Ångstrom (Å), que equivale a m. Use este recurso para determinar o comprimento aproximado do fosfolipídio. Na figura 1 temos um diagrama esquemático da representação de um fosfolipídio. Olhe na tela do VMD e identifica as partes hidrofóbicas e hidrofílicas da molécula. Visualização da bicamada lipídica. Delete a molécula anterior. Carregue as coordenadas atômicas da bicamada dppc128.pdb, da forma já descrita. Clique na tela gráfica. Você terá a bicamada na tela gráfica. Com o mouse oriente a molécula de forma a ter as partes polares para cima e para baixo na tela. Identifique as partes polares e hidrofóbicas da bicamada. Figura 1. Representação esquemática da estrutura de um fosfolipídio. 1

2 A membrana celular é a fronteira entre os meios extracelular e intracelular, mas como quase toda fronteira ela limita, mas não impede a passagem de moléculas e íons. Para o trânsito de moléculas e íons são usados canais, que facilitam a comunicação entre os meios e ainda controlam que moléculas e íons irão passar em resposta a um dado estímulo fisiológico. Esses canais são proteínas que atravessam a membrana celular. Assim, a membrana é uma barreira seletiva, onde moléculas e íons autorizados podem atravessá-la. Devidos às características peculiares do ambiente físico-químico da membrana celular, as proteínas que funcionam como canais devem apresentar características específicas para atravessar a membrana. Uma delas é a extensão, a membrana celular apresenta em média uma espessura de 60 Å, assim uma proteína para atravessá-la deve ser maior que 60 Å. Outra característica é que certas estruturas secundárias se adéquam bem ao ambiente da membrana celular, entre elas as hélices. As hélices permitem que uma parte hidrofóbica fique em contato com a parte hidrofóbica da membrana, um contato intermolecular favorável a estabilidade do sistema membrana-proteína. Penicilina A penicilina é um dos maiores sucessos da história da descoberta de fármacos. Para entendermos o seu sucesso, temos que estudar seu mecanismo de ação. Sabemos que bactérias são ameaças constantes aos seres humanos e uma forma de identificar novos agentes antibacterianos é observar como plantas, outros animais e fungos protegem-se. Foi assim, de maneira acidental, que Alexander Fleming identificou a ação antibacteriana da penicilina em Fleming observou que a presença de mofo (figura 2), numa colônia de bactérias, adiava o crescimento dessas. Um estudo posterior, identificou que o mofo estava inundando a colônia de bactérias com uma molécula, a penicilina. Figura 2. Micrografia eletrônica do fungo da penicilina crescido no pão. Disponível em: < > Acesso em: 26 de agosto de A penicilina ataca um aspecto único da vida das bactérias, sem atacar o metabolismo humano, um processo chamado toxicidade seletiva. Outra razão para o sucesso da penicilina, é que os alvos são proteínas que se encontram fora da membrana citoplasmática, assim não há necessidade de atravessar a membrana para atingir o alvo. Quando tratada com baixas doses de penicilina, as bactérias mudam de formato e longos filamentos crescem a partir do corpo central da bactéria (figura 3). Um aumento da dose de penicilina, leva à perda da integridade estrutural da superfície da bactéria, ela incha e finalmente se rompe. 2

3 Figura 3. Efeito da penicilina na bactéria Escherichia coli. Na parte inferior vemos o corpo central arredondado da bactéria, onde temos protrusões na parte esquerda e direita superior. Essas protrusões devem-se à ação da penicilina, que afeta a parede celular e deforma a célula antes do rompimento que mata a bactéria. Fonte da imagem: Acesso em: 26 de agosto de A penicilina ataca enzimas envolvidas na montagem de uma forte rede de cadeias de proteínas e carboidratos, chamada peptídeoglicano. O peptídeoglicano é a estrutura responsável pela rigidez estrutural da parede celular de bactérias e determina a forma da bactéria. Outra característica dos peptídeoglicanos, é a proteção contra a lise osmótica, quando em meio hipotônico. A molécula da penicilina é quimicamente similar aos blocos construtivos do peptídeoglicano, e sua ação inibe a montagem desses. As proteínas alvo da penicilina são chamadas de proteínas que se ligam à penicilina (penicillin-binding proteins). Uma dessas proteínas é carboxipeptidase, que catalisa a ligação de peptídeos para formar uma rede que envolve a bactéria. As proteínas que se ligam à penicilina são alvos para a ação da família de antibióticos chamados beta lactâmicos, como a cefalosporina. A figura 4 traz a estrutura cristalográfica da carboxipeptidase em complexo com a cefalosporina. Figura 4. Estrutura cristalográfica da carboxipeptidase em complexo com o antibiótico cefalosporina. 3

4 Abra o programa VMD e carregue as coordenadas do arquivo carboxypeptidase.pdb. Mude a representação para New Cartoon, usando como método de coloração (Coloring Method) o Secondary Structure. Depois clique em Create Rep. Com a nova representação criada, mude para CPK, usando como método de coloração (Coloring Method) o Name. Clique em Selections, neste novo Menu, no campo Selected Atoms, apague a palavra All, e na opção Singlewords clique em hetero, depois clique em Apply. Teremos na tela a estrutura mostrada na figura 4. Gere o arquivo formato tga da estrutura, depois mude o formato para png e salve em seu pendrive, conforme mostrado nas aulas anteriores. Potencial de membrana Ao inserimos eletrodos na célula e ligarmos tais eletrodos a um voltímetro (osciloscópio), podemos medir um potencial elétrico, denominado de uma forma geral de potencial de membrana da célula. Assim, para qualquer situação fisiológica, o potencial elétrico medido na célula é chamado de potencial de membrana. Não precisa que a célula esteja em repouso. Quando a célula está em repouso, o potencial de membrana recebe um nome específico, potencial de repouso. Caso a célula receba um estímulo, alto o suficiente, teremos como resultado que o potencial de membrana apresentará uma súbita elevação, tal etapa é chamada potencial de ação e será estudado na aula seguinte. Figura 5. Diagrama esquemático do arranjo experimental para a medida do potencial de membrana de um neurônio. Um dos eletrodos é inserido no axônio e o outro é mantido no meio extracelular. O potencial elétrico é amplificado e inserido num osciloscópio, que mede o potencial elétrico. Na situação de repouso é negativo, aproximadamente 60 mv. O diagrama não está em escala. Programa NGS Usaremos agora o programa NGS (Nernst/Goldman Simulator) para análise de diversos parâmetros do potencial de membrana. O programa NGS é uma representação gráfica das equações de Nernst e GHK (Goldman-Hodgkin-Katz). Vimos que o potencial de repouso da célula é determinado pela ação conjunta da bomba de sódio e potássio e pelo canal de potássio. O que determina o potencial elétrico da célula é a diferença de concentrações iônicas. O programa NGS permite que usemos os valores das concentrações iônicas, para determinarmos o potencial elétrico da célula, chamado de forma geral de potencial de membrana. A figura 6 traz a interface gráfica do programa NGS. 4

5 Figura 6. Interface do programa NGS, disponível em: Acesso em: 26 agosto de Potencial de membrana com o NGS A equação de Nernst é uma tentativa de elaborarmos um modelo computacional para determinarmos o potencial elétrico do sistema biológico membrana celular (E i), devido aos íons. Na equação abaixo usamos uma temperatura em Kelvin representada por T, a constante dos gases por R, a constante de Faraday por F e a valência do íon por z. E RT [Íon - ln( zf [Íon i, os termos [Íon O e [Íon i indicam as concentrações extra e intracelulares do íon, respectivamente. O log representa o logaritmo. O potencial da membrana (E i) é dado em milivolts (mv), 1 mv = 10-3 V. Na janela gráfica do NGS, clique em Nernst@37 o C. Depois em ION/PERMEABILITY PRESETS: escolha SKELETAL MUSCLE. Clique na janela Azul Escuro à esquerda para selecionar o íon sódio. E i (calculado com o NGS) = O valor obtido é o esperado? i o ) 5

6 A equação de Nernst foi uma tentativa de criarmos um modelo computacional para previsão do potencial elétrico da célula, baseado nas informações sobre as concentrações iônicas. Ao compararmos os valores previstos pela equação de Nernst, com os valores experimentais, verifica-se que esta equação falha em obter os valores medidos. Tal falha da equação de Nernst, para previsão do potencial de membrana, deve-se à sua simplicidade, onde diversos fatores importantes para o estabelecimento do potencial de membrana não são considerados no modelo computacional. Entre os fatores importantes, podemos destacar a permeabilidade iônica, que indica a facilidade com que um dado íon atravessa a membrana celular. A diferença de permeabilidade iônica, deve-se à presença de diferentes tipos de canais iônicos, inseridos na membrana celular. A análise da permeabilidade (facilidade com a qual os íons atravessam a membrana) levou a uma equação mais realística, como a desenvolvida por Goldman (1943), Hodgkin & Katz (1949) (Equação de GHK). Na equação os termos P Na, P K e P Cl são as permeabilidades dos íons de Na, K e Cl respectivamente. Como a permeabilidade para os outros íons é desprezível, comparadas às do Na, K e Cl, para as condições do potencial de repouso, os termos referentes aos outros íons não são incluídos na equação. Na equação abaixo a temperatura em Kelvin é representada por T, a constante dos gases por R e a constante de Faraday por F.. E m RT P - ln F P Na Na [Na [Na ex in P [K K P [K K ex in P P Cl Cl - [Cl - [Cl in ex Na equação os termos P Na, P K e P Cl são as permeabilidades dos íons de Na, K e Cl respectivamente. Os termos entre colchetes [ são as concentrações iônicas. O termo ln é o logaritmo natural. Para passar a temperatura de Celsius para Kelvin, some 273,15 à temperatura em Celsius. O potencial da membrana (E m) é dado em milivolts (mv). Use a equação de GHK, implementada no programa NGS para calcular o potencial de repouso para os sistemas biológicos indicados nas tabelas a seguir. 6

7 Axônio Sépia a 37 o C Na janela gráfica do NGS, clique em Goldman@37 o C. Depois em ION/PERMEABILITY PRESETS: escolha SQUID AXON. Você terá os valores indicados abaixo. Íon Concentração iônica intracelular [Íon in (mm) Concentração iônica extracelular [Íon ex (mm) Permeabilidade iônica relativa K Na Cl E m (calculado com o NGS) = Músculo esquelético a 37 o C Na janela gráfica do NGS, clique em Goldman@37 o C. Depois em ION/PERMEABILITY PRESETS: escolha SKELETAL MUSCLE. Você terá os valores indicados abaixo. Íon Concentração iônica intracelular [Íoni n (mm) Concentração iônica extracelular [Íon ex (mm) Permeabilidade iônica relativa K ,5 100 Na Cl- 4, E m (calculado com o NGS) = Depois de determinar o potencial de membrana para temperatura em 37 o C, varie a temperatura e verifique o que acontece com o potencial de membrana. Você acha que o modelo computacional é coerente com o sistema biológico? Justifique. Referências GOLDMAN D. E. potential, impedance, and rectification in membranes J Gen Physiol. 1943;27(1): HODGKIN, A. L., Ionic movements and electrical activity in giant nerve fibres. Proc. R. Soc. B., 148: HODGKIN A. L., KATZ B. The effect of sodium ions on the electrical activity of giant axon of the squid. J Physiol. 1949;108(1): LOURA, L. M. S. & de Almeida, R. F. M. Tópicos de Biofísica de Membranas (2004). Lidel Edições Técnicas Lda. Lisboa, Portugal. OLIVEIRA, J.R, WACHTER, P.H, AZAMBUJA, A.A. Biofísica para Ciências Biomédicas. Porto Alegre: EDIPUCRS, p. 7