SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE UM SISTEMA MULTIFUNCIONAL SBA-16/NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS/GEL POLIMÉRICO PARA BIOAPLICAÇÕES

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1 0 Comissão Nacional de Energia Nuclear Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE UM SISTEMA MULTIFUNCIONAL SBA-16/NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS/GEL POLIMÉRICO PARA BIOAPLICAÇÕES RAQUEL CRISTINA DE SOUSA AZEVEDO Belo Horizonte 2014

2 1 Comissão Nacional de Energia Nuclear Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE UM SISTEMA MULTIFUNCIONAL SBA-16/NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS/GEL POLIMÉRICO PARA BIOAPLICAÇÕES RAQUEL CRISTINA DE SOUSA AZEVEDO Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais como requisito parcial à obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Ciência e Tecnologia dos Materiais Orientadora: Dra. Edésia Martins Barros de Sousa Belo Horizonte 2014

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4 3 DEDICATÓRIA Aos meus pais queridos (José e Elza) pelo amor e dedicação e acima de tudo por ter me tornado um ser humano melhor!!! Pai que saudades!!! ao meu lindo e grande amor Paulo e também aos meus dois amorzinhos (Bruna e Arthur). Vocês são presentes preciosos de Deus em minha vida! Eu os amo!!!

5 4 AGRADECIMENTOS A Deus pelo dom da vida, proteção, força, amor incondicional em todos os momentos, principalmente naqueles em que tudo parecia perdido!!! Ao Paulo que me aguentou reclamar e chorar, mas sempre me deu força, ficou do meu lado em todas as horas, especialmente nas piores e fazia tudo parecer mais simples do que era. O melhor companheiro que poderia ter. Te amo! Ao Paulão e Lúcia agradeço pelo apoio e incentivo para a realização desse trabalho. Aos meus queridos irmãos Ricardo, Rossi e Renê que me apoiaram, sempre torceram e acreditaram em mim e no sucesso deste mestrado. A Professora Edésia Martins Barros de Sousa pela grande dedicação, confiança e incentivo durante sua valiosa orientação, pois sem a qual não seria possível o desenvolvimento deste trabalho. E acima de tudo agradeço a grande oportunidade por ter contribuído para o meu crescimento pessoal e profissional, ensinamentos que ficaram guardados e jamais esquecidos...obrigada de todo o meu coração!!!!! Ao Professor Waldemar pelo apoio, confiança e pelas valiosas discussões durante este trabalho. Ao Professor José Domingos e a professora Adriana pela confiança ao disponibilizar os laboratórios para as medidas necessárias a esse trabalho. Aos colegas de laboratório Marcelo, André, Carol e Tiago pela colaboração e, em especial as grandes amigas Gracielle, Karina, Pamela e Érika pela grande contribuição e ajuda na realização desse trabalho e acima de tudo pelo carinho, atenção e amizade (jamais serão esquecidas!!!!) Ao Zilmar, Éden, Tiãozinho, Serginho, José Messias e Geraldo Scoralick por serem sempre gentis e prestativos. Aos amigos do prédio 7. A todos do Centro de Microscopia da UFMG pela realização das medidas de microscopia. Ao CDTN e à CNEN pela infraestrutura e pelo apoio. A CAPES, pelo apoio financeiro. Enfim, a todas as pessoas que, de alguma maneira, contribuíram para a realização deste trabalho.

6 5 Na vida, não existe nada a se temer, apenas a ser compreendido. Marie Curie

7 6 RESUMO A combinação do material mesoporoso SBA-16 com o gel polimérico poli(nisopropilacrilamida) contendo nanopartículas magnéticas pode conduzir à formação de um material híbrido interessante para aplicação em magnetohipertemia e liberação controlada de fármacos. Neste trabalho, foi explorada a estratégia de síntese de um sistema multifuncional, constituído por SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) com o objetivo de avaliar sua potencialidade de geração de calor a partir da magnetita e sua contribuição nos estudos de liberação controlada de fármacos. A caracterização dos materiais foi feita por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET), Adsorção de Nitrogênio, Espalhamento de Raios X a Baixos Ângulos (SAXS), Análise Termogravimétrica (TG), Análise Elementar (CHN), Espectroscopia na Região do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), Difração de Raios X (DRX), Espectroscopia Mössbauer, Medidas Magnéticas e Espectroscopia de Fotoelétrons Excitados por Raios X (XPS). Através da análise dos resultados obtidos foi possível confirmar a formação do híbrido, e elucidar as propriedades físico-químicas, estruturais e magnéticas das amostras. Medidas das propriedades de geração de calor mostraram que o híbrido apresentou uma variação de temperatura ( T) de 11º e 35ºC nas concentrações de 10 e de 20 mg/ml, respectivamente, no campo magnético alternado de 126 Oe; e apresentou uma variação de temperatura ( T) de 32º e 39ºC nas concentrações de 10 e de 20 mg/ml, respectivamente, no campo magnético alternado de 168 Oe. Este resultado demonstrou que este sistema multifuncional apresenta potencial como agente de hipertermia para o tratamento do câncer. Por fim, foi feito o estudo da influência dessas nanopartículas magnéticas com a presença do gel na cinética de liberação do fármaco Doxorrubicina (DOX) sob condições in vitro. A liberação foi estudada na ausência e na presença de um campo magnético alternado de 126 Oe, que se constatou a influência do campo magnético no aumento da taxa de liberação da DOX. Este resultado demonstrou que a propriedade da magnetita de gerar calor aliada às propriedades do P(N-iPAAm) de transição de fases (contração) contribuiu para uma melhor taxa de liberação da DOX. Palavras-chave: SBA-16, nanopartículas magnéticas, nanocompósito, poli(nisopropilacrilamida), liberação de fármacos, hipertermia magnética.

8 7 ABSTRACT The combination of SBA-16 mesoporous materials with gel polymer poly (Nisopropylacrylamide) containing magnetic nanoparticles can lead to the formation of an interesting hybrid material for use in hybrid magnetic hyperthermia and controlled drug release. In this study, we explored the strategy of synthesis of a multifunctional system consisting of SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) in order to assess its potential for heat generation from magnetite and its contribution in the controlled drug release. The materials were characterized by Scanning Electron Microscopy (SEM), Transmission Electron Microscopy (TEM), Nitrogen Adsorption, Small Angle X Ray Scattering (SAXS), Thermogravimetric Analysis (TG), Elemental Analysis (CHN), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), X-ray diffraction (XRD), 57 Fe Mössbauer spectroscopy, magnetic measures and X-Ray Photoeletron Spectroscopy (XPS). Through the analysis of the results it was possible to confirm the formation of the hybrid system, and elucidate the physicochemical, structural and magnetic properties of the samples. Measurements of the properties of heat generation showed that the hybrid presents a temperature variation ( T) of 11º and 35ºC in concentrations of 10 and 20 mg/ml, respectively, in the alternating magnetic field of 126 Oe, and presents a temperature variation ( T) 32º and 39ºC at concentrations of 10 and 20 mg/ml, respectively, in alternating magnetic field of 168 Oe. This result indicates that the multifunctional system shows great potential as a hyperthermia agent for cancer treatment. Finally, the study of the influence of these magnetic particles in the kinetics of release of the doxorubicin (DOX) was made in the presence of gel under in vitro conditions. The release was studied in the absence and in the presence of an alternating magnetic field of 126 Oe; it was found that the presence of magnetic field increased the release rate of DOX. This result demonstrated that the property of heat generate from magnetite combined with phase transition (contraction) properties of P(N-iPAAm) contributed to a better control of release of DOX from hybrid system. Keywords: SBA-16, magnetic nanoparticles, nanocomposite, poly (N-isopropylacrylamide) drug delivery, magnetic hyperthermia.

9 8 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Exemplos de materiais micro, meso e macroporosos, mostrando domínios de tamanho de poros e distribuição de tamanho de poros. Adaptado de SOLER et al., Figura 2 - Desenho ilustrativo das estruturas do grupo de materiais mesoporosos pertencentes à família M41S: (a) MCM-50 (lamelar), (b) MCM-41 (hexagonal), e (c) MCM-48 (cúbico). Figura adaptada de RAMAN et al., Figura 3 - Estrutura cúbica do SBA-16. Adaptado de FÚLVIO, Figura 4 - Esquema da formação da estrutura mesoporosa cúbica mediada por agente direcionador de estrutura. Figura adaptada de BALLEM et al., Figura 5 - Representação da estrutura cristalina da magnetita...26 Figura 6 - Representação dos spins da magnetita (HARRIS, 2002)...27 Figura 7 - Representação do comportamento de fases do gel termossensível P(N-iPAAm)...33 Figura 8 - Esquema de formação de um sistema baseado em SBA-15 com partículas magnéticas e P(N-iPAAm) polimerizado nos canais porosos (ZHU et al., 2007)...35 Figura 9 - Perfis típicos da concentração do fármaco na corrente sanguínea em função do tempo (a) administração convencional com múltiplas doses e (b) liberação controlada...38 Figura 10 - Exemplos das diferentes formas farmacêuticas: (a) cápsula (sistema reservatório) e (b) esfera (sistema matricial). Adaptado SOUZA, Figura 11 - Esquema de um sistema de liberação por bomba osmótica. Adaptado de RATNER et al., Figura 12 - Representação esquemática do direcionamento da droga magnética (YANG et al.,2006)...42 Figura 13 - Estrutura química da doxorrubicina...44 Figura 14 - Representação esquemática da rota de síntese da magnetita...46 Figura 15 - Representação esquemática da rota de síntese da SBA-16 tradicional...47 Figura 16 - Representação esquemática da síntese do compósito SBA-16/Fe 3 O Figura 17 - Representação esquemática da síntese do híbrido SBA-16/P(N-iPAAm)...49 Figura 18 - Representação esquemática da síntese do híbrido SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm)...50 Figura 19 - Equipamento utilizado para a realização de medidas de hipertermia magnética...55 Figura 20 - Curva de calibração para a Doxorrubicina...56 Figura 21 - Micrografia da amostra de Magnetita...57 Figura 22 - Micrografia da amostra de SBA

10 9 Figura 23 - Micrografia das amostras de (a) SBA-16/Fe 3 O 4, (b) SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) e (c) SBA-16/P(N-iPAAm)...59 Figura 24 - Micrografia das amostras com estruturas cúbicas: (a) na direção paralela ao eixo dos poros, (b) na direção perpendicular ao eixo dos poros...60, 61 e 62 Figura 25 - Micrografia das amostras SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm)...63 Figura 26 - Isoterma de adsorção de nitrogênio do SBA Figura 27 - Comparação entre as Isotermas de Adsorção de Nitrogênio das amostras SBA- 16/Fe 3 O 4, SBA-16/P(N-iPAAm) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) com o SBA Figura 28 - Distribuição de tamanho de poros para as amostras SBA-16, SBA-16/Fe 3 O 4, SBA-16/ P(N-iPAAm) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm)...67 Figura 29 - Difratogramas das amostras SBA-16, SBA-16/Fe 3 O 4, SBA-16/ P(N-iPAAm) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm)...68 Figura 30 - Representação esquemática da estrutura dos materiais mesoporosos cúbicos...69 Figura 31 - Curvas TG para as amostras estudadas...71 Figura 32 - Curva TG e sua derivada (DTG) para SBA-16 (a), SBA-16/Fe 3 O 4 (b), SBA- 16/P(N-iPAAm) (c) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) (d)...72 Figura 33 - Representação da estrutura do mero do P(N-iPAAm)...74 Figura34 - Comparação dos espectros de infravermelho de SBA-16/Fe 2 O 4 (a) e SBA- 16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) (b)...75 Figura 35 - Comparação dos espectros de infravermelho de SBA-16/P(N-iPAAm) (a) e SBA- 16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) (b)...76 Figura 36 - Difratogramas da sílica e do SBA-16/P(N-iPAAm)...78 Figura 37 - Comparação entre os difratogramas das amostras SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA- 16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) com a magnetita...79 Figura 38 - Espectros Mössbauer do 57 Fe a temperatura ambiente para (a) magnetita, (b) SBA- 16/Fe 3 O 4 e (c) SBA-16/Fe 3 O 4 /P(Ni-PAAm)...80 Figura 39 - Curvas de histerese obtidas à temperatura ambiente para a magnetita...82 Figura 40 - Curvas de histerese obtidas à temperatura ambiente com (a) e sem (b) correção de massa por grama de magnetita presente nas amostras SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(NiPAAm)...83 Figura 41 - Espectro de XPS para a amostra SBA-16/Fe 3 O Figura 42 - Espectro de XPS para a amostra SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm)...85 Figura 43 - Espectro de XPS para a amostra SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) após sputtering (a) e (b) pico Fe 2p em alta resolução antes e após sputtering...86

11 10 Figura 44 - Imagens das amostras SBA-16/Fe 3 O 4 (a) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) (b)...86 Figura 45 - Curvas de aquecimento com campo de 126 Oe para (a) concentração de 10 mg/ml e (b) concentração de 20 mg/ml...87 Figura 46 - Curvas de aquecimento com campo de 168 Oe para (a) concentração de 10 mg/ml e (b) concentração de 20 mg/ml...88 Figura 47 - Curvas TG para DOX e para as amostras incorporadas...91 Figura 48 - Perfil de liberação das amostras SBA-16, SBA-16/Fe 3 O 4, SBA-16/P(N-iPAAm) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) no ph 7,4 (a) e no ph 5,0 (b)...93 Figura 49 - Perfil de liberação da amostra SBA-16/P(N-iPAAm) em diferentes temperaturas94 Figura 50 - Perfil de liberação das amostras SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA-16/ Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) sem e com campo magnético aplicado de 126 Oe...95

12 11 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Propriedades físicas da magnetita...27 Tabela 2 - Resultados de adsorção de N 2 para as amostras estudadas...66 Tabela 3 - Parâmetros estruturais das amostras obtidos a partir do sinal de maior intensidade (110)...70 Tabela 4 - Porcentagem de perda de massa em função da temperatura para amostras obtidas...71 Tabela 5 - Porcentagens dos elementos carbono (C), hidrogênio (H) e nitrogênio (N) contidos nas amostras...73 Tabela 6 - Identificação espectrofotométrica de alguns grupos funcionais...77 Tabela 7 - Parâmetros hiperfinos dos espectros Mössbauer a temperatura ambiente para a magnetita, SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm)...81 Tabela 8 - Parâmetros de magnetização com e sem correção de massa por grama de magnetita...83 Tabela 9 - Resultados de XPS...85 Tabela 10 - Dados relativos à geração de calor nas amostras...89 Tabela 11 - Dados de incorporação de Doxorrubicina nas diferentes matrizes estudadas...90 Tabela 12 - Comparação das porcentagens de perdas de massa em função da temperatura para amostras puras e incorporadas...91 Tabela 13 - Porcentagens dos elementos carbono (C), hidrogênio (H) e nitrogênio (N) contidos nas amostras puras e incorporadas...92

13 12 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS a 0 - Parâmetro de Célula Unitária para a Rede Cúbica AFM Alternating Magnetic Field (Campo Magnético Alternado) BET - Brunauer-Emmet-Teller Bhf Campo Hiperfino (na Espectroscopia Mössbauer) C BET - Constante Calculada a partir da Equação BET CDTN - Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear CHN análise elementar de carbono, hidrogênio e nitrogênio CMC - Concentração Micelar Crítica d (110) - Espaçamento Interplanar entre os Planos 110 DDS - Drug Delivery Systems (Sistemas de Liberação de Drogas) DOX Doxorrubicina Dp- Diâmetro de Poros Calculado pelo método NLDFT DRX Difração de Raios X DTG - Derivate Termogravimetry (Termogravimetria Derivada) F127 - Pluronic poli(óxido de etileno)106-poli(óxido de propileno)70-poli(óxido de etileno)106 FDA - Food and Drug Administration FTIR - Fourier Transform Infrared Spectroscopy (Espectroscopia na Região do Infravermelho com Transformada de Fourier) h - espessura de paredes de poros H c coercividade HFMF High frequency magnetic Field (campo magnetic de alta frequência) hkl - Índices de Miller IARC - International Agency for Research on Cancer (Agência Internacional para Pesquisa em Câncer) ICC - insuficiência cardíaca congestiva INCA - Instituto Nacional de Câncer IUPAC - International Union of Pure and Applied Chemistry JCPDS - Joint Committee on Powder Diffraction Standards LCST - Lower Critical Solution Temperature (Temperatura de Solução CríticaInferior)

14 13 LCT - Liquid Crystal Templating (Mecanismo de Direc. por Cristal Líquido) MCM-41 - Mobil Composition of Matter Number 41 MCM-48 - Mobil Composition of Matter Number 48 MCM-50 - Mobil Composition of Matter Number 50 MEV - Microscopia Eletrônica de Varredura MET - Microscopia Eletrônica de Transmissão Mr magnetização remanescente Ms- magnetização de saturação NLDFT - Non-Local Density Functional Theory P(N-iPAAm) - Poli(N-isopropilacrilamida) P/P0 - Pressão Relativa SAXS - Small Angle X Ray Scattering (Espalhamento de Raios X a Baixo Ângulo) SBA-15 - Santa Barbara Amorphous Number 15 SBA-16 - Santa Barbara Amorphous Number 16 S BET - Área Superficial Específica Calculada pelo Método BET SBF - Simulated Body Fluid (Fluido Corpóreo Simulado) TEOS Tetraetilortossilicato TG - Termogravimetria ou Análise Termogravimétrica UCST - Upper Critical Solution Temperature (Temperatura de Solução Crítica Inferior) UV-VIS - Ultravioleta Visível Vp - Volume de Poros VSM - magnetômetro de amostra vibrante XPS - X Ray Photoecletron Spectroscopy (Espectroscopia de Fotoelétrons Excitados por Raios X) δ- Deslocamento Isomérico (na Espectroscopia Mössbauer) ε- Desdobramento Quadrupolar (na Espectroscopia Mössbauer)

15 14 SUMÁRIO 1 - INTRODUÇÃO OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Materiais Mesoporosos Mecanismos de Formação dos Materiais Mesoporosos Nanopartículas Magnéticas Magnetita Métodos de Síntese de Magnetita Géis Poliméricos Géis Responsivos Poli(N-isopropilacrilamida) - P(N-iPAAm) Híbridos Multifuncionais a base de Sílica Mesoporosa Bioaplicações Hipertermia Liberação Controlada de Fármacos Doxorrubicina METODOLOGIA Síntese das Nanopartículas de Magnetita Síntese da Sílica Mesoporosa SBA Síntese do Compósito SBA-16/Fe 3 O Síntese do Híbrido Mesoporoso SBA-16/P(N-iPAAm) Síntese do Sistema Multifuncional SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) Caracterização das Amostras Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) Adsorção de Nitrogênio Espalhamento de Raios X a Baixos Ângulos Análise Termogravimétrica Análise Elementar Espectroscopia na Região do Infravermelho por Transformada de Fourier Difração de Raios X (DRX)...53

16 Espectroscopia Mössbauer Medidas Magnéticas Espectroscopia de Fotoelétrons Excitados por Raios X (XPS) Bioaplicações Hipertermia Estudo de Liberação Controlada de Fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) Adsorção de Nitrogênio Espalhamento de Raios X a Baixos Ângulos Análise Termogravimétrica Análise Elementar Espectroscopia na Região do Infravermelho por Transformada de Fourier Difração de Raios X (DRX) Espectroscopia Mössbauer Medidas Magnéticas Espectroscopia de Fotoelétrons Excitados por Raios X (XPS) Bioaplicções Medidas de Hipertermia Magnética Estudo de Liberação Controlada de Fármacos CONCLUSÕES PROPOSIÇÕES FUTURAS PRODUÇÕES CIENTÍFICAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...99

17 16 1 INTRODUÇÃO Desde a descoberta da sílica mesoporosa ordenada em 1992, a síntese e as aplicações destes materiais têm recebido atenção intensiva devido à sua estrutura altamente ordenada, variados tamanhos de poros e alta área superficial. Na última década, os materiais mesoporosos têm encontrado muitas aplicações, sobretudo nas áreas de separação, catálise, sensores e dispositivos (TAGUCHI & SCHÜTH, 2005), entretanto devido à estrutura mesoporosa estável e propriedades superficiais bem definidas, além da biocompatibilidade, estes materiais parecem ideais para encapsulamento de fármacos, proteínas e outras moléculas biológicas. Nos últimos anos o emprego de materiais mesoporosos para encapsulação e liberação de uma variedade de moléculas de interesse farmacêutico vem sendo estudado (HE et al., 2010; YANG et al., 2013; ZHENG et al., 2013). Dentre os diversos tipos de sílica, o SBA-16 (Santa Barbara Amorphous number 16) é constituído por uma matriz de sílica mesoporosa cúbica com um ordenamento espacial correspondente ao grupo Im3m (MESA et al., 2008), com poros de tamanhos entre 2-30 nm e elevada área superficial ( m 2.g -1 ). A estrutura 3D confere a esses materiais aplicações variadas. As características estruturais, a conectividade e a porosidade são parâmetros importantes para sua aplicação (ANDRADE, 2011). Vários estudos vêm sendo realizados com esses materiais mesoporosos contendo óxidos de ferro estimulados pelas suas potenciais aplicações em diferentes campos tecnológicos, particularmente em biomedicina e bioengenharia, em tratamentos por magnetohipertermia, como carreadores de fármacos, biosensores e melhoria na qualidade das imagens por ressonância magnética nuclear (BRUCE et al., 2009; AZZAZY & MANSOUR, 2009; KIM et al., 2008; QIN et al., 2009; YIU et al., 2010). Uma importante aplicação das nanopartículas de óxido de ferro magnéticas que merece ser destacada é o tratamento de câncer por hipertermia artificialmente induzida (CHASTELLAIN et al., 2004). O tratamento consiste na dispersão de partículas magnéticas no tecido doente e aplicação de um campo magnético alternado com intensidade e frequência suficientes para provocar o aquecimento das partículas. Este tratamento está baseado na observação de que células tumorais são menos resistentes ao aumento da temperatura quando comparadas com uma célula saudável. A temperatura em torno de 42 C a 45 C causa lise das células tumorais

18 17 sem causar danos às células normais. Além disso, a hipertermia pode ser aplicada junto com outros tratamentos, como radioterapia e quimioterapia, potencializando os efeitos (BAE et al., 2009). Um exemplo muito estudado dessas nanopartículas magnéticas é a magnetita. A magnetita nanoparticulada é particularmente interessante para estes propósitos porque ela apresenta magnetização de saturação e susceptibilidade magnéticas relativamente altas (significa que elas podem ser facilmente magnetizadas por um campo magnético externo), biocompatibilidade, além de ser menos sensível à oxidação que os metais de transição magnéticos. Entretanto, estas nanopartículas tendem a aglomerar-se e formar grandes agregados (o que pode resultar em embolias quando administradas por via endovenosa), com a consequente perda de características adequadas para bioaplicações. As dimensões reduzidas aumentam a reatividade destas nanopartículas, que podem sofrer rápida degradação em ambientes biológicos (BERRY & CURTIS, 2003). Para aplicações in-vivo, é importante envolver as nanopartículas com uma camada não magnética, prevenindo a agregação e a sedimentação, além de permitir a funcionalização para aplicações específicas e a redução da toxicidade. Estas nanopartículas vêm sendo revestidas com polímeros, nanopartículas de ouro, nanotubos de carbono, entre outros. Um interessante revestimento inorgânico, levando em conta seu custo relativamente baixo e sua grande disponibilidade é a sílica, como por exemplo, a SBA-16. A sílica tende a favorecer a dispersão dessas nanopartículas em meio líquido, tornando a superfície quimicamente funcional, reduzindo a toxicidade, além de tornar as nanopartículas magnéticas mais estáveis em relação à oxidação. A sílica apresenta em sua superfície grupos silanóis que podem se ligar covalentemente a ligantes específicos de interesse para determinadas aplicações biomédicas. Outra importante aplicação utilizando estes materiais nanocompósitos sílica-magnetita é no sistema para liberação de fármacos em que a taxa de liberação pode ser ativada por estímulos externos. Estes estímulos podem ser temperatura, ph, campo magnético, dentre outros (LANGER, 1990). No caso dos sistemas contendo magnetita, essa ativação pode ser induzida pela interação de um campo magnético externo com partículas magnéticas nanoestruturadas previamente nucleadas no interior de uma matriz de sílica, formando um compósito magnético (QIN et al., 2009). Uma vez que a ação do campo magnético pode gerar calor,

19 18 outro estímulo externo pode atuar no sistema, que é a temperatura. Neste caso, a utilização de um híbrido multifuncional responsivo é proposta como uma alternativa mais eficiente para o desempenho do dispositivo final. Assim, este híbrido é composto de sílica mesoporosa (SBA- 16), partículas magnéticas e um gel termossensível. Dentre os géis termossensíveis mais estudados, destaca-se o poli(n-isopropilacrilamida) P(N-iPAAm), que se expande em água e, à medida que a temperatura aumenta, ele se contrai, passando por uma transição de fases descontínua em torno de 32 C (FREITAS & CUSSLER, 1987A; FREITAS & CUSSLER, 1987B). A contração do gel na transição de fases pode provocar a liberação de fármacos incorporados em sua rede favorecendo assim um tratamento associado à hipertermia. Neste contexto, o que se busca com tal sistema multifuncional é manipular a cinética de liberação de um fármaco antineoplásico, por exemplo, a Doxorrubicina (DOX) a partir da variação da temperatura causada pela ação das partículas magnéticas no tratamento com hipertermia. O presente trabalho está dividido e estruturado da seguinte forma. Os objetivos são explicitados no Capítulo 2. No Capítulo 3 é apresentada uma revisão bibliográfica sobre materiais mesoporosos ordenados, nanopartículas magnéticas, magnetita, géis poliméricos, híbridos baseados em materiais mesoporosos e bioaplicações: hipertermia, liberação controlada de fármacos e agente neoplásico Doxorrubicina. O Capítulo 4 descreve as metodologias empregadas neste trabalho, bem como as técnicas utilizadas para a caracterização e aplicações dos materiais. No Capítulo 5 são apresentados e discutidos os resultados; e no Capítulo 6 estão expostas as conclusões. O Capítulo 7 apresenta as proposições futuras, no Capítulo 8 são apresentadas as produções científicas e, no Capítulo 9, encontram-se as referências bibliográficas utilizadas no desenvolvimento deste trabalho.

20 OBJETIVOS Objetivo geral Sintetizar um sistema híbrido multifuncional a base de sílica mesoporosa/nanopartículas magnéticas/gel polimérico visando à possibilidade de sua aplicação em hipertermia e liberação controlada do fármaco Doxorrubicina Objetivos específicos Sintetizar o sistema multifuncional sílica mesoporosa/fe 3 O 4 /P(N-iPAAm); Caracterizar as propriedades físico-químicas e estruturais do sistema multifuncional através de diferentes técnicas; Avaliar a potencialidade de geração de calor desse sistema; Estudar a utilização dos compósitos obtidos como dispositivos de liberação controlada de droga sem influência de campo magnético e com campo magnético.

21 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Materiais Mesoporosos De acordo com a classificação da IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), materiais porosos são divididos em três classes, baseado no tamanho de seus poros: microporosos (< 2nm), mesoporosos (2-50nm) e macroporosos (> 50nm) (McCusker et al., 2001). Exemplos típicos de materiais macroporosos são os vidros porosos convencionais. Mesoporos estão presentes em aerogéis, xerogéis e materiais mesoporosos ordenados. Alguns exemplos ilustrativos são apresentados na Figura 1. Figura 1 - Exemplos de materiais micro, meso e macroporosos, mostrando domínios de tamanho de poros e distribuição de tamanho de poros. Adaptado de SOLER et al., Da família de materiais microporosos, as zeólitas são os representantes mais conhecidos. Elas apresentam uma estreita distribuição de tamanho de poros e uniformidade nos microporos, e são empregados como adsorventes, catalisadores, suportes de catalisadores, no craqueamento de petróleo etc. Entretanto, o pequeno tamanho de poros restringe o uso de zeólitas a processos que envolvem compostos relativamente pequenos. Devido à limitação imposta pelos microporos das zeólitas, em 1992, pesquisadores da Mobil Oil Corporation anunciaram a descoberta de materiais mesoporosos compostos de silicatos ou aluminossilicatos, os quais foram chamados de família M41S (KRESGE et al.,1992; BECK et

22 21 al., 1992). Esses materiais possuem diâmetros de poros bem definidos na faixa de 1,5 a 10 nm, estreita distribuição de tamanho de poros e elevadas áreas superficiais. Ao invés de usar pequenas moléculas orgânicas modeladoras, como na síntese das zeólitas, os pesquisadores utilizaram longas cadeias de surfactante (templates) para direcionar a estrutura desses materiais. Além de modelar a estrutura final, os direcionadores de rede são responsáveis pela formação do sistema de poros do material. Dependendo da matéria-prima inicial e variando as condições de síntese, óxidos de sílica mesoporosa com diferentes estruturas ordenadas em forma hexagonal (denominada MCM-41), cúbica (denominada MCM-48) e lamelar (denominada MCM-50) podem ser formados. A Figura 2 representa um esquema destas estruturas. Figura 2 - Desenho ilustrativo das estruturas do grupo de materiais mesoporosos pertencentes à família M41S: (a) MCM-50 (lamelar), (b) MCM-41 (hexagonal), e (c) MCM-48 (cúbico). Figura adaptada de RAMAN et al., Dentre estes materiais mesoporosos, o MCM-41(Mobil Composition of Matter Number 41) tem sido bastante estudado devido à sua síntese ser mais complexa do que os outros dois tipos: MCM-48 e MCM-50 (LANDRY & GALLIS, 1997). O MCM-41 possui poros com formato cilíndrico e ordenados em um arranjo hexagonal, com diâmetros bem definidos e ajustáveis na faixa de 1,5 a 10 nm. As paredes dos poros desse material são formadas por sílica amorfa. Essas paredes são relativamente finas com espessura variando de 0,6 a 1,2 nm. O MCM-41 possui distribuição de tamanho de poros muito estreita e elevada área superficial em torno de m 2.g -1. Durante a síntese do MCM-41 pode-se controlar várias parâmetros como, por exemplo, diâmetro de poros, volume de poros e área superficial específica. Com todas essas possibilidades, diversos materiais tendo como modelo o MCM-41 com características distintas podem ser sintetizados e estudados para serem utilizados em diversas aplicações como: catalisadores, adsorventes, suportes para catalisadores, dispositivos para liberação de fármacos e outras (VALLET-REGÍ et al., 2001).

23 22 Materiais mesoporosos com maiores tamanhos de poros e melhor estabilidade comparados com material M41S, foram sintetizados com o direcionador não iônico, copolímero tribloco poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno), por Zhao e colaboradores (ZHAO, 1998). Essas novas sílicas mesoporosas foram denominadas de materiais SBA-n, e dentre essas, tem-se materiais que exibem estrutura de poros bi e tridimensional hexagonal (SBA-2, 12, 3 e 15) e cúbicas (SBA-1, 6 e 16) (CHENG, 2003). Da família SBA-n, o SBA-16 (Santa Barbara Amorphous number 16) é constituído por uma matriz de sílica mesoporosa cúbica com um ordenamento espacial correspondente ao grupo Im3m (MESA, et al., 2008), com poros apresentando tamanhos entre 2-30 nm e elevada área superficial ( m 2. g -1 ). Com um formato de poros esférico, apresenta estrutura cúbica de corpo centrado, como pacote embrulhado (Figura 3). Estudos de cristalografia eletrônica indicam que cada mesoporo de SBA-16 está ligado a oito mesoporos vizinhos. A estrutura 3D confere a esses materiais aplicações variadas como na catálise, detecção e separação química e na adsorção. As características estruturais, a conectividade e a porosidade são parâmetros importantes para sua aplicação (ANDRADE, 2011). Figura 3 - Estrutura cúbica do SBA-16. Adaptado de FÚLVIO, Classicamente, a síntese do SBA-16 ocorre pela junção de um sistema ternário de água, butanol e copolímero tribloco não iônico PLURONIC F127 (PEO 106 PPO 70 PEO 106 ), realizado em meio ácido através do mecanismo S 0 H + X - I +. Esse mecanismo consiste da reação entre uma fonte de sílica representada por I +, com carga positiva, geralmente, uma espécie de silício monomérico. S 0 H + representa um surfactante que forma ligação de hidrogênio com íons hidrônios (H 3 O + ). Normalmente, para se obter o ph baixo é usado o ácido clorídrico, e o íon clorídrico é representado por X -. Esse íon é responsável pela interação entre as espécies,

24 23 formando ligações fracas não covalentes entre o surfactante copolímero tribloco e a sílica. Como fonte de sílica, geralmente é empregado o tetraetil ortosilicato (TEOS). Algumas condições de síntese, como temperatura, ph, concentração de sílica, tipo de surfactante, tempo de agitação e de envelhecimento afetam a evolução da morfologia do SBA-16 (BALLEM et al., 2010) Mecanismos de Formação dos Materiais Mesoporosos São vários os mecanismos propostos para explicar a síntese desses materiais mesoporosos. Um mecanismo proposto, inicialmente, é baseado na síntese de sílica mesoporosa a partir da formação de mesofases, estruturas de fases líquido-cristalinas de moléculas anfifílicas (surfactantes), que servem como direcionadores para uma polimerização in situ de ácidos ortossilícicos. Esse mecanismo é conhecido como direcionamento por cristal líquido, LCT (Liquid Crystal Templating). A síntese pode ser realizada em condições ácidas ou básicas, e a fonte de sílica pode ser silicato de sódio ou um óxido tetra-alquil silano. O primeiro material relatado por pesquisadores da Mobil (designado como MCM-41) era uma partícula de tamanho micrométrico com mesoporos hexagonais ordenados (BECK, 1992). Duas formas de sínteses podem ser realizadas com direcionamento por cristal líquido, a síntese direta e indireta. Os critérios para selecionar as condições de síntese direta de direcionamento por cristal líquido se diferem dos critérios para a síntese do cristal líquido indireto quanto à concentração do surfactante. No caso do direcionamento por cristal líquido indireto, a concentração do surfactante é baixa, e nessa concentração as moléculas do surfactante existem na forma micelar, porém não se obtém uma organização de longo alcance das estruturas do surfactante. Já no caso da síntese direta de direcionamento cristal-líquido, a concentração de surfactante é alta o suficiente para formar o ordenamento a longa distância, mesmo sem a interação sílicasurfactante. Portanto, não é necessário criar fortes interações sílica-surfactante, já que essas podem perturbar as interações de longo alcance existentes nas matrizes do surfactante. Por essa razão as sínteses em sistemas ternários são realizadas no ponto isoelétrico da sílica (ph 2) para minimizar as interações eletrostáticas. Para não se criar essas interações fortes, o uso de surfactantes Plurônicos não iônicos é mais adequado para esse tipo de síntese do que surfactantes carregados (FENG, 2000).

25 24 Os templates orgânicos mais utilizados são: surfactantes (catiônicos, aniônicos e neutros), templates poliméricos (copolímeros em bloco, dendrímeros e látex) e sistemas biológicos (proteínas, polissacarídeos, bactérias e vírus). Os surfactantes possuem uma estrutura molecular consistindo de um grupo funcional hidrofóbico (cauda apolar) junto a um grupo hidrofílico (cabeça polar). Esta estrutura é conhecida como anfifílica. Moléculas anfifílicas se auto-organizam em uma variedade de estruturas. A forma mais simples destas estruturas é a micela. Micelas são agregados moleculares possuindo ambas as regiões estruturais, hidrofílica e hidrofóbica, que dinamicamente se associam espontaneamente em solução aquosa a partir de certa concentração micelar crítica (CMC), formando grandes agregados moleculares de dimensões coloidais. Esses agregados coloidais podem apresentar diferentes microestruturas: esférica, cilíndrica, planar etc (SOUSA, 2009). Em soluções muito diluídas as moléculas surfactantes presentes no sistema binário surfactante-água encontram-se sob a forma monomérica. À medida que a concentração aumenta, as moléculas se agregam para formar micelas. O aumento da concentração pode promover transições na morfologia dos agregados e as fases líquido-cristalinas podem ser verificadas em soluções ainda mais concentradas. O tamanho dos poros das mesofases obtido pelo sistema binário é limitado pelo comprimento da cadeia do surfactante e pela variação da composição (COLEMAN & ATTARD, 2001). Tentativas de expandir a composição e o tamanho de poros resultaram em materiais com perda do ordenamento a longo alcance (STUCKY, 1994). Com o objetivo de introduzir maior flexibilidade e diversidade no processo de síntese de materiais mesoporosos, Feng e colaboradores (FENG, 2000) relataram uma síntese de sílica mesoporosa baseado em fases líquido-cristalinas de surfactantes preparada a partir de sistema ternário consistindo de copolímero tribloco anfifílico, F127 (PEO 106 PPO 70 PEO 106 ), cosurfactante tais como butanol e pentanol e água. O pluronic F127, por ter um grande peso molecular com um volume hidrofílico elevado, é o surfactante ideal para esse tipo de síntese. A longa cadeia hidrofílica oferece a possibilidade de sintetizar óxidos mesoporosos com paredes espessas que podem levar a uma maior estabilidade térmica e hidrotérmica. A vantagem do uso de co-surfactante é a forma como esse permite o controle do tamanho de poros (Figura 4).

26 25 Figura 4 - Esquema da formação da estrutura mesoporosa cúbica mediada por agente direcionador de estrutura. Figura adaptada de BALLEM et al., Nanopartículas Magnéticas Nanopartículas magnéticas oferecem atrativas possibilidades de aplicação em biotecnologia. Primeiro, elas têm tamanhos que as colocam com dimensões comparáveis à de um vírus ( nm), uma proteína (5-50 nm) ou um gene (2 nm de largura e nm de extensão). Segundo, sendo magnéticas, obedecem à lei de Coulomb e podem ser manipuladas por um gradiente de campo magnético externo. Terceiro, apresentam grande área superficial, característica que pode contribuir para ligação com agentes biológicos. As nanopartículas magnéticas de óxido de ferro, em especial a magnetita (Fe 3 O 4 ) são as mais usadas em aplicações biomédicas, devido às suas propriedades magnéticas e à sua toxicidade relativamente baixa no corpo humano. O Fe 3 O 4 foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) para o uso como agente de contraste em imagem por ressonância magnética (TIEFENAUER, 2007) Magnetita A magnetita se cristaliza em uma estrutura tipo espinélio inverso, AB 2 O 4, em que os íons O -2 formam um arranjo cúbico denso de face centrada, gerando dois tipos de interstícios, o primeiro tetraédrico (A), formado por quatro íons oxigênio, e o segundo, octaédrico [B], formado por seis íons oxigênio (Figura 5) (FABRIS & COEY, 2002). Nos interstícios tetraédricos (A) posicionam-se os íons de Fe 3+, e nos intersísticios octaédricos [B] posicionam-se iguais números de íons Fe 3+ e Fe 2+. Esta disposição resulta em 24 átomos de Fe

27 26 (16 íons Fe 3+ e 8 íons Fe 2+ ), com fórmula mínima {(8Fe 3+ ) A [(8Fe 2+ )(8Fe 3+ )] B O 32 }, arranjados em uma célula unitária composta por 8 fórmulas mínimas. Oxigênio Sítio tetraédrico (Fe 3+ ) Sítio octaédrico (Fe 2+ e Fe 3+ ) Figura 5 - Representação da estrutura cristalina da magnetita. A magnetita exibe magnetização espontânea devido à sua estrutura de espinélio inverso. Existe uma forte interação de intercâmbio entre os cátions tetraédricos e octaédricos devido à geometria dos orbitais envolvidos, que podem ser interações do tipo A-O-B ou interações B- O-B. Interações do tipo AO-B com ângulos próximos de 135º são dominantes na estrutura de espinélio inverso, levando a uma magnetização de saturação, na temperatura 0 K. Esta magnetização depende somente dos íons Fe 2+, já que os spins dos cátions Fe 3+ coordenados octaedricamente se cancelam com os spins do Fe 3+ do sítio tetraédrico por serem antiparalelos (Figura 6).

28 27 Figura 6 - Representação dos spins da magnetita (HARRIS, 2002). Algumas constantes importantes da magnetita relacionadas com suas propriedades magnéticas e cristalinas são mostradas na Tabela 1. Tabela 1 - Propriedades físicas da magnetita. Parâmetro de rede (a) 8,393 8,3963 Å Magnetização de saturação (M S ) 471 emu/cm 3 Constantes de anisotropia magnetocristalina a 300K Temperatura de Curie (θ C ) K 1 = - 1,35 x 10 5 erg/cm 3 K 2 = - 0,44 x 10 5 erg/cm K A superfície da magnetita tem átomos de ferro que não estão ligados aos átomos de oxigênio e podem agir como ácidos de Lewis coordenando as moléculas que podem doar par de elétrons (bases de Lewis). Em sistemas aquosos, os átomos de ferro coordenam-se com moléculas de água, que se dissociam deixando a superfície do óxido de ferro funcionalizada com grupos hidroxila, que podem reagir com ácidos ou bases devido ao seu caráter anfótero. A superfície da magnetita pode ser positiva ou negativa em dispersões aquosas dependendo do ph da solução. O ph no qual a superfície tem o mesmo número de cargas positivas e negativas é o chamado ponto isoelétrico, que é 6,8 para a magnetita. A magnetita nanoparticulada pode ser estabilizada por estabilização estérica ou por modificação do ponto isoelétrico com revestimentos diversos como sílica, polímeros, nanopartículas de ouro, nanotubos de carbono

29 28 entre outros. A estabilização é necessária para a obtenção de ferrofluidos estáveis contra agregação na presença de campo magnético (HARRIS, 2002) Métodos de Síntese de Magnetita A síntese de nanopartículas com propriedades magnéticas desejadas, tamanho e forma controlada tem sido um desafio científico e tecnológico. A maior dificuldade na síntese de partículas ultrafinas é o controle do tamanho de partículas na escala nanométrica. Essa dificuldade aumenta como um resultado da alta energia de superfície desses sistemas. A tensão interfacial age como uma força diretora para redução espontânea da área superficial pelo crescimento durante a etapa inicial de precipitação (nucleação e crescimento) e durante a agitação (SUGIMOTO, 1987). Assim, a pesquisa para rotas sintéticas fáceis e flexíveis para produzir nanopartículas magnéticas com tamanho desejado e distribuição de tamanho aceitável sem agregação de partículas é de extrema importância para alcançar a potencialidade integral desses materiais quando aplicados em biomedicina. Métodos químicos vêm sendo amplamente usados para produzir materiais nanoestruturados devido à sua natureza direta e seu potencial para produzir grandes quantidades de produto final (TARTAJ et al., 2005). Vários métodos de preparo de nanopartículas de magnetita que incluem co-precipitação (KONISHI et al., 2004), micro-emulsão (LIU & WANG, 2004), síntese eletroquímica (FRANGER et al., 2004), pirólise (GUNKO et al., 2001), síntese hidrotérmica (WU et al., 2005) foram desenvolvidos. Mas a maioria deles apresenta problemas de produção em massa. Por exemplo, elas envolvem dificuldades na prevenção de floculação e no controle da proporção de Fe 2+ e Fe 3+ no processo de co-precipitação, e na remoção de surfactantes no processo de micro-emulsão. O método para preparo de nanopartículas de magnetita desenvolvido por Thapa (THAPA et al, 2004) tem sido bastante executado. Esse método de preparo de magnetita é chamado de método de oxidação-precipitação. Depois da alcalinização do íon ferroso com solução alcalina para formar um líquido suspenso, empregando uma alta quantidade de um oxidante moderado, o hidróxido ferroso na suspensão líquida é parcialmente oxidado a hidróxido férrico, e então, a magnetita começa a nuclear, crescer e precipitar. Foi verificado que este método pode facilmente controlar a proporção de Fe 2+ e Fe 3+ na amostra e nanopartículas podem ser sintetizadas in situ, sem qualquer surfactante. A formação de Fe 3 O 4 segue o mecanismo de nucleação-crescimento quando a razão molar de Fe(OH) 2 /Fe(OH) 3 torna-se 1:2, que é o valor característico da estrutura da magnetita, a

30 29 nucleação das partículas de magnetita ocorre e então o núcleo de magnetita começa a crescer. O processo reacional pode ser escrito como segue: Fe OH - Fe(OH) 2 (Equação 1) Fe(OH) 2 + oxidante Fe(OH) 3 (Equação 2) Fe(OH) 2 + 2Fe(OH) 3 Fe 3 O 4 + 4H 2 O (Equação 3) Como a solubilidade do Fe(OH) 3 é muito menor que a do Fe(OH) 2, o hidróxido férrico poderá precipitar primeiro se a oxidação de Fe 2+ para Fe 3+ for rápida. Em um estudo prévio (JIA & GAO, 2006), foi mostrado que a razão molar inicial dos reagentes de Fe 2+ /Fe 3+ de 1:2 é uma etapa importante para obter magnetita pura. Se o processo de oxidação não for controlado, haverá excesso de Fe(OH) 3 e, assim, há formação de goethita ( -FeOOH), como pode ser visto na equação (4): Fe(OH) 3 -FeOOH + H 2 O (Equação 4) A taxa de nucleação parece ser responsável pela morfologia do produto (ZHANG et al., 2006). Quando a taxa de reação, isto é, a taxa de consumo de Fe(OH) 3 é igual à taxa de oxidação de Fe(OH) 2 e as concentrações de Fe(OH) 2, Fe(OH) 3 ao redor do núcleo de Fe 3 O 4 são aproximadamente iguais e a taxa de crescimento de núcleos de Fe 3 O 4 nas três direções são equivalentes, resulta na formação de nanopartículas octaédricas Géis Poliméricos O gel polimérico pode ser definido como uma rede polimérica, unida por ligações cruzadas, que, quando imersa em solventes compatíveis, se expande e retém o solvente dentro de sua estrutura tridimensional, não se dissolvendo no mesmo, devido à existência de interações intermoleculares e reticulações (SHIBAYAMA & TANAKA, 1993; CUSSLER et al., 1993). Quando o meio de expansão do gel é aquoso, ele é denominado hidrogel (WANG et al., 1993). Uma das mais importantes propriedades dos géis poliméricos é o grau de expansão, uma vez que outras propriedades, como permeabilidade a solutos dissolvidos, cinética de expansão e

31 30 características mecânicas, são diretamente influenciadas por ele (FREITAS & CUSSLER, 1987a; FREITAS & CUSSLER, 1987b; SOUSA, 2009). O grau de expansão varia com a estrutura do gel, com o tipo de solvente em contato e com as variáveis do meio em que o gel se encontra. Os géis que sofrem variação no grau de expansão de acordo com variáveis do meio, tais como temperatura, ph e luz, são denominados géis responsivos (DUSEK, 1993). Quando o gel está em estado expandido, ocorre a formação de interações polímero-solvente preferenciais como, por exemplo, ligações de hidrogênio. No entanto, quando o gel atinge um estágio crítico, caracterizado por uma transição de fases, o mesmo passa para o estado contraído, havendo o rompimento das ligações polímero-solvente, que são substituídas pelas interações polímero-polímero e solvente-solvente Géis Responsivos Géis responsivos apresentam a capacidade de alterar suas propriedades de forma reversível a partir de um estímulo externo (IRIE, 1993). Entre os estímulos externos mais comuns no estudo de géis responsivos destacam-se temperatura, ph, composição do solvente, tensão mecânica, campo elétrico e luz. É importante ressaltar o caráter reversível dessas mudanças, que garante que o gel possa repetir o ciclo expansão-contração uma série de vezes, apresentando um elevado tempo de vida útil. Géis sensíveis ao ph são aqueles que apresentam grupos ionizáveis, uma vez que o grau de ionização do gel, e sua consequente sensibilidade ao ph, é determinado por esse parâmetro (SHIBAYAMA & TANAKA, 1993). Hidrogéis sensíveis ao ph possuem grupos pendentes ácidos, como ácido carboxílico e ácido sulfônico, ou básicos, como sais de amônio. Esses grupos pendentes podem ser receptores ou doadores de prótons, de acordo com o ph do meio em que estão inseridos (SILVA, 2006). Géis que sofrem expansão no volume com o aumento do ph são denominados géis polieletrólitos aniônicos, enquanto que aqueles que se expandem com a redução do ph são ditos polieletrólitos catiônicos. Portanto, a quantidade de grupos ionizáveis do gel determina o grau de expansão em um determinado ph.

32 31 Alguns géis apresentam mudanças em suas propriedades estimuladas pela presença de luz. Esse tipo de sensibilidade se demonstra bastante interessante pelo fato de a luz sobre um gel poder ser colocada ou retirada instantaneamente, além de sua intensidade poder ser facilmente controlada (SILVA, 2006). Os géis sensíveis a meios bioquímicos são aqueles que apresentam um comportamento de fase diferente frente a um tipo particular de molécula. Quando essas moléculas entram na estrutura do gel, o elemento ativo, presente no interior do gel, as converte em outras moléculas ou formam complexos, que são capazes de perturbar o equilíbrio do gel, ocasionando a expansão ou contração de sua estrutura (SHIBAYAMA & TANAKA, 1993). Os géis sensíveis podem apresentar ainda diferentes comportamentos de fase frente a campos elétricos, tensões mecânicas, entre outros (SHIBAYAMA & TANAKA, 1993). Como exemplo, pode-se citar a aplicação em liberação controlada de insulina, na qual uma mistura de gel com partículas magnéticas vem sendo usada para liberar continuamente essa substância, quando sujeitos a um campo magnético (KOST & LANGER, 2001). Um gel é dito termossensível quando suas características de expansão e contração são função da temperatura. De modo geral, esses géis apresentam uma grande variação no grau de expansão volumétrico para variações relativamente pequenas na temperatura, constituindo a classe de gel mais estudada entre os responsivos (FREITAS & CUSSLER, 1987a; FREITAS & CUSSLER, 1987b). Para que a síntese de um gel termossensível seja possível, é necessário que o monômero ou o agente reticulante apresente solubilidade capaz de variar com a temperatura. Desse modo, buscando uma variação significativa do grau de expansão com a variação de temperatura, um dos componentes do gel deve ser insolúvel acima ou abaixo de um ponto crítico de temperatura. Portanto, o sistema deve apresentar uma temperatura crítica inferior (LCST lower critical solution temperature) ou superior (UCST upper critical solution temperature) (BROMBERG & RON, 1998). Os géis que possuem comportamento LCST reduzem o volume com o aumento da temperatura. Em temperaturas inferiores à temperatura crítica inferior, as interações polímerosolvente são favorecidas, de modo que o polímero absorve solvente e se expande, até que o

33 32 equilíbrio termodinâmico seja atingido. Quando a temperatura é aumentada para valores próximos à temperatura crítica, ocorre uma alteração na conformação das cadeias poliméricas do gel, que passam de um estado solvatado, com dispersão aleatória no solvente, para um estado globular, com maior proximidade entre as cadeias poliméricas (OLIVEIRA, 1992). Nesse estado, o polímero se torna hidrofóbico, sendo rompidas as ligações de hidrogênio entre polímero e solvente, enquanto as interações polímero-polímero e solvente-solvente passam a ser predominantes. Dessa forma, as cadeias poliméricas se atraem, acarretando a contração do polímero e a consequente liberação do solvente. Os géis que apresentam temperatura crítica superior possuem um comportamento oposto, se contraindo com a redução de temperatura. Abaixo da temperatura crítica, o polímero se comporta como hidrofóbico, não absorvendo água. Acima dessa temperatura, as cadeias poliméricas interagem com a água, permitindo que essa entre na rede tridimensional do gel, acarretando sua expansão. Logo, a contração da estrutura polimérica do gel pode ser atribuída à mudança do caráter hidrofílico das cadeias poliméricas quando o sistema atinge a temperatura crítica. Na temperatura crítica, as cadeias se tornam hidrofóbicas, ocorrendo a contração do gel e tornando a separação de fases termodinamicamente favorável. É importante ressaltar que cada sistema gel-solvente apresenta um valor específico de temperatura crítica. O valor da temperatura de transição está diretamente relacionado com a intensidade da interação entre o polímero e o solvente Poli(N-isopropilacrilamida) - P(N-iPAAm) O poli(n-isopropilacrilamida) - P(N-iPAAm) é um hidrogel termossensível que apresenta em solução aquosa comportamento de fases do tipo LCST, isto é, apresenta temperatura de solução crítica inferior em torno de 32ºC (FREITAS & CUSSLER, 1987A; FREITAS & CUSSLER, 1987B). Abaixo dessa temperatura ele encontra-se no estado expandido quando em contato com água. Com o aumento da temperatura acima da LCST, o hidrogel sofre uma contração expulsando a água de seu interior. A Figura 7 apresenta esquematicamente esse comportamento de fases. Devido a essa transição de fases, esse hidrogel tem sido muito empregado na confecção de dispositivos de liberação controlada de fármacos (PEPPAS & LANGER, 2003; COUGHLAN et al., 2006).

34 33 Figura 7 - Representação do comportamento de fases do gel termossensível P(N-iPAAm). O poli(n-isopropilacrilamida) pode ser sintetizado a partir de reações de copolimerização em solução, por crescimento em cadeia, via mecanismo de radicais livres. Os monômeros utilizados na reação de polimerização são N-isopropilacrilamida, (N-iPAAm) e o agente reticulante, sendo o N,N - Metilenobisacrilamida (MBAAm) um dos mais utilizados. Os iniciadores empregados são o persulfato de amônio (PA) e metabissulfito de sódio (MS). A transição do gel entre os estados expandido e contraído é proveniente do balanceamento entre os grupos hidrofóbicos e hidrofílicos existentes na estrutura do gel (DIEZ-PEÑA et al., 2002). Vários trabalhos têm como tema central a incorporação de drogas na estrutura do P(NiPAAm) e consequente liberação, modulada pela cinética de expansão e contração do gel em função da temperatura. Dentre os trabalhos pioneiros pode-se citar o de Hoffman (HOFFMAM, 1987) que propôs a aplicação do P(N-iPAAm) e seus copolímeros para liberação controlada de drogas regulada pelo aumento da temperatura que provoca a contração do hidrogel. Durante a contração, a droga que está distribuída eventualmente dentro da estrutura do gel é expulsa para fora como resultado da elevação da temperatura. Estudos dos efeitos da expansão no perfil de liberação de drogas a partir do P(N-iPAAm) em função das propriedades físico-químicas das drogas foram realizados por Coughlan e colaboradores (COUGHLAN et al., 2006). Eles verificaram que a expansão do hidrogel diminuiu na presença de drogas hidrofóbicas e o efeito oposto foi observado para drogas hidrofílicas. Eles também observaram que o hidrogel, mesmo no estado contraído, apresentou

35 34 liberação do fármaco, sendo essa liberação dependente da solubilidade da droga no meio e da massa molar do hidrogel Híbridos Multifuncionais a base de Sílica Mesoporosa Os híbridos são materiais formados pela combinação de dois ou mais componentes distintos, sendo de natureza inorgânico-orgânica. As propriedades desses materiais dependem não somente das propriedades individuais dos componentes, mas também das características interfaciais, uma vez que, à medida que o tamanho da fase dispersa diminui, as forças interfaciais se tornam mais significativas (CASTELVETRO & DE VITAA, 2004). Estes materiais denominados híbridos orgânico-inorgânicos constituem uma classe de materiais que tem sido alvo de intensa investigação nos últimos anos. As propriedades finais de um híbrido são alcançadas pela seleção da natureza química das fases orgânica e inorgânica, pelo controle do tamanho e da morfologia dos domínios e da natureza da interface orgânico-inorgânica. A interface é a grande responsável pelas propriedades dos materiais híbridos orgânico-inorgânicos, as quais não resultam apenas do somatório das características inerentes de cada componente. Trabalhos envolvendo a síntese de híbridos formados por sílica mesoporosa e géis poliméricos responsivos vêm sendo descritos na literatura (CHUN & TIAN, 2008; LOPEZ et al., 2003). No trabalho de Sousa (SOUSA, 2009), foi desenvolvido a síntese e caracterização do material híbrido SBA-15/poli(N-isopropilacrilamida) para avaliar sua aplicação como sistema de liberação controlada do fármaco atenolol. Os resultados foram promissores para estudos da capacidade de adsorção e cinética de liberação do fármaco atenolol a partir da estrutura porosa do híbrido modulada pela incorporação do gel polimérico. Um híbrido multifuncional responsivo foi desenvolvido por Zhu e co-autores (ZHU et al., 2007). Esse sistema é composto de sílica mesoporosa SBA-15, poli(n-isopropilacrilamida) e partículas magnéticas. Como apresentado no esquema desenvolvido pelos autores (Figura 8), inicialmente as partículas magnéticas foram formadas a partir da adição de cloreto férrico (FeCl 2 ) durante a síntese do SBA-15. Em seguida, uma solução contendo o monômero e o iniciador foi gotejada em uma determinada massa do compósito SBA-15/partículas magnéticas previamente formado. A polimerização foi realizada a 80ºC. Mesmo após a

36 35 incorporação do gel e das partículas magnéticas, esse sistema apresentou diâmetro e volume de poros relativamente grandes (3,8 nm e 0,47 cm 3.g -1, respectivamente). Sendo assim, o fármaco ibuprofeno foi incorporado nos poros desse material e um teste de liberação in vitro modulado pela temperatura foi realizado. Figura 8 - Esquema de formação de um sistema baseado em SBA-15 com partículas magnéticas e P(N-iPAAm) polimerizado nos canais porosos (ZHU et al., 2007). A obtenção do sistema multifuncional contendo sílica mesoporosa, partículas magnéticas e polímero termossensível, cada um com sua função específica, que apresentem capacidade para serem utilizados em tratamentos associados de hipertermia e liberação de drogas são de grande interesse para aplicações médicas. Para tanto, questões básicas ainda devem ser resolvidas. As nanopartículas magnéticas apresentam uma elevada área superficial, elas podem facilmente formar agregados e reagir com o oxigênio no ar. Além disso, a reatividade das partículas do óxido do ferro parece aumentar extremamente quando suas dimensões são reduzidas, e podem sofrer uma rápida biodegradação quando expostas diretamente aos sistemas biológicos. Dessa forma, um revestimento apropriado nestas nanopartículas é essencial para impedir tais limitações. A maior motivação deste estudo é de que a estrutura da sílica mesoporosa SBA-16 possa proporcionar um efetivo caminho para prevenir a aglomeração e evitar a biodegradação das nanopartículas. A arquitetura de poros do SBA-16 resulta em um material promissor para dispositivos magnéticos de liberação de drogas bem como hipertermia. Aproveitando da propriedade de gerar calor das nanopartículas magnéticas,

37 36 a incorporação de um gel termossensível P(N-iPAAm) contribuirá na multifuncionalidade deste sistema, através do seu comportamento de fases que poderá favorecer nos estudos de liberação controlada de fármacos Bioaplicações Hipertermia Uma importante aplicação das nanopartículas magnéticas é no tratamento de câncer por hipertermia artificialmente induzida. O tratamento consiste na dispersão de nanopartículas magnéticas no tecido doente e aplicação de um campo magnético alternado com intensidade e frequência suficientes para provocar o aquecimento das nanopartículas. Este tratamento está baseado na observação de que células tumorais são menos resistentes ao aumento da temperatura quando comparadas com uma célula saudável. Nas temperaturas em torno de 42 C a 45 C haverá lise das células tumorais sem haver danos às células normais (LEE et al., 2012). As células cancerosas geralmente perecem em torno de 43º C, pois sua fonte de oxigênio via vasos sanguíneos não é suficiente, enquanto células normais não são danificadas na mesma temperatura. Além disso, os tumores são mais facilmente aquecidos do que os tecidos normais vizinhos, já que os vasos sanguíneos e o sistema nervoso são pobremente desenvolvidos no tumor. Desta forma, espera-se que a hipertermia seja um tratamento de câncer útil com poucos efeitos colaterais. Várias técnicas para aquecimento dos tumores tais como tratamento com água quente, radiação infravermelha, ultrassom, e microondas, têm sido testadas. Entretanto, tumores localizados em partes profundas do corpo não são efetivamente aquecidos usando-se essas técnicas (KAWASHITA, et al., 2005). A aplicação de materiais magnéticos para hipertermia de tecido biológico é conhecida por mais de cinco décadas (HERGT et al., 1998). Em 1979, Gordon e colaboradores (GORDON et al., 1979) propuseram o conceito de indução de hipertermia intracelular usando nanopartículas de magnetita ligadas à dextrina. Eles administraram nanopartículas de magnetita intravenosamente em carcinoma mamário de ratos e mostraram que houve indução de calor por AFM em seus experimentos (ITO et al. 2005).

38 37 Kawashita e colaboradores (KAWASHITA, et al., 2005) estudaram a capacidade de vitrocerâmicas de formarem microesferas de 20 a 30 m de diâmetro de Fe 3 O 4 com capacidade de produzir calor, para uso em hipertermia no tratamento de câncer, principalmente em tumores localizados em partes profundas do corpo. Hu et al., 2008 estudaram um caminho para liberação de fármacos a partir de nanoesferas magnético-sensíveis para liberar de forma instantânea e controlada em uma concentração terapeuticamente efetiva por meio de um campo magnético de alta frequência (HFMF). Vários estudos têm sido realizados com os sistemas sílica mesoporosa/partículas magnéticas para aplicações em hipertermia. Os pesquisadores Julián-López et al., 2007 realizaram um estudo desse sistema em hipertermia. Eles sintetizaram microesferas de sílica mesoporosa tipo SBA-15/maguemita e MCM-41/maguemita pelo método spray-drying. Além disso, funcionalizaram a superfície destes materiais para serem usados no transporte de moléculas bioativas em aplicações biomédicas. Foi possível observar que o novo sistema é uma fonte efetiva de aquecimento, embora seu desempenho tenha apresentado menor eficiência do que as nanopartículas dispersas em água. O encapsulamento das nanopartículas pela sílica mesoporosa melhora a dispersão das nanopartículas, aumenta sua estabilidade química em meio biológico e reduz a toxicidade. Além disso, a sílica apresenta grupos silanóis em sua superfície que podem facilmente ser funcionalizados, servindo como matriz suporte para incorporar diversas moléculas de interesse farmacológico. Essas vantagens têm que ser levadas em conta ao se avaliar o menor desempenho deste sistema na geração de calor quando comparado com o das nanopartículas dispersas em água somente. Outro estudo que merece ser destacado é o de Souza (SOUZA, 2011). Neste trabalho foi explorada a possibilidade de sintetizar três nanocompósitos à base de sílica mesoporosa e nanopartículas magnéticas (SiO 2 -Fe 3 O 4 ). Os dois primeiros nanocompósitos, séries A e B, foram obtidos pela preparação de um precursor de óxido de ferro em etanol e a subsequente impregnação das sílicas mesoporosas SBA-15 e MCM-41, respectivamente. O óxido de ferro foi formado dentro da estrutura de poros, produzindo-se, assim, um dispositivo magnético. Na terceira série de nanocompósitos, série C, foi sintetizado pelo método sol-gel e o precursor da fase magnética foi adicionado durante a síntese da sílica mesoporosa. Medidas das propriedades de aquecimento induzido pelo campo de corrente alternada dos nanocompósitos obtidos mostraram que as amostras são apropriadas como agentes de hipertermia para

39 38 aplicações biológicas. Foi feito o estudo da influência dessas partículas magnéticas na cinética de liberação de dois fármacos modelo, doxorrubicina e atenolol sob condições in vitro. Os resultados mostraram que a liberação de fármacos é dependente do tipo de fármaco empregado. No caso do atenolol, a liberação foi fortemente dependente do campo magnético aplicado, porém não apresentou efeitos na liberação da doxorrubicina Liberação Controlada de Fármacos Por definição, o termo sistema de liberação de fármacos refere-se à tecnologia utilizada para otimizar a liberação de um fármaco, onde o princípio ativo deve ser liberado e/ou absorvido, melhorando a resposta terapêutica. Os tratamentos convencionais utilizados para combater processos infecciosos (soluções, suspensões, pílulas, entre outros) requerem uma administração por um longo período de tempo, visando manter os níveis terapêuticos do fármaco no organismo. Muitas vezes, tais níveis não são alcançados, pois o tratamento não exibe resultados ou apresenta efeitos colaterais devido à alta concentração do fármaco. A manutenção da concentração do medicamento na corrente sanguínea dentro da faixa terapêutica do medicamento leva à redução no número de doses requeridas e ao aumento na eficácia do tratamento, pois desta forma diminui a possibilidade de alcançar níveis tóxicos ou subterapêuticos (faixa ineficaz). A Figura 9 ilustra a comparação entre o método convencional de multidosagem e o sistema de liberação controlada. Figura 9 - Perfis típicos da concentração do fármaco na corrente sanguínea em função do tempo. (a) administração convencional com múltiplas doses e (b) liberação controlada. Nos sistemas convencionais, a concentração do fármaco no sangue segue o perfil mostrado na figura 9 a, em que a concentração do fármaco na corrente sanguínea apresenta um aumento, atinge um pico máximo e então declina. Os níveis plasmáticos são dependentes das doses

40 39 administradas e cada fármaco possui uma faixa de ação terapêutica acima da qual ela é tóxica e abaixo da qual ela é ineficaz. Na liberação controlada busca-se o desenvolvimento de um sistema que mantenha a concentração do medicamento na corrente sanguínea dentro da faixa terapêutica, por um tempo prolongado, utilizando uma única dosagem, como descrito na figura 9 b. Os sistemas de liberação controlada, frequentemente descritos como Drug Delivery Systems (DDS) oferecem numerosas vantagens quando comparados às formas de administração tradicionais, tais como: - Maior eficácia terapêutica, com liberação progressiva e controlada do fármaco; - Diminuição significativa da toxicidade, maior tempo de permanência na circulação; - Natureza e composição dos veículos, além de proteção contra mecanismos de instabilidade e decomposição do fármaco (inativação prematura); - Administração segura, sem reações inflamatórias locais; - Diminuição do número de doses devido à liberação progressiva; - Possibilidade de direcionamento a alvos específicos. Existem diversas classificações para os sistemas de liberação controlada de drogas, segundo alguns critérios. De acordo com a rota de administração, por exemplo, tais sistemas podem ser classificados em quatro classes: oral, transdérmico, injetável e inalável. Segundo o tipo de liberação eles podem ser de liberação sustentada, prolongada ou retardada. O tipo de mecanismo que controla a liberação do fármaco também determina a sua classificação, que é feita tomando-se por base o mecanismo principal. Existem três mecanismos primários pelos quais os fármacos podem ser liberados a partir de um dispositivo: (1) difusão, (2) reação química ou enzimática e (3) ativação pelo solvente por meio de osmose ou expansão/contração do sistema. Em função desses mecanismos, os sistemas podem ser classificados em: sistemas controlados por difusão, sistemas controlados quimicamente, sistemas osmoticamente controlados e sistemas controlados por expansão e contração. Nos sistemas controlados por difusão, a etapa determinante do processo de liberação do fármaco é a difusão do mesmo através da matriz, devido ao gradiente de concentração. Os sistemas controlados por difusão são os mais comuns e dois tipos são descritos: reservatório e matricial (RATNER, 1996; SIMÓ et al., 2003).

41 40 No sistema reservatório é possível identificar um núcleo diferenciado (Figura 10 a), que pode ser uma droga sólida, uma solução diluída ou altamente concentrada dentro de uma matriz. Nesse caso, o fármaco encontra-se envolvido por um filme ou uma membrana de um material controlador da taxa de liberação. A única estrutura que efetivamente limita a liberação da droga é a camada de material que envolve o reservatório. Mudanças na natureza e na espessura dessa camada promovem alterações na velocidade de liberação da droga. A membrana que envolve o reservatório permite a difusão da droga contida dentro do núcleo para o meio externo. Esse sistema inclui: membranas, cápsulas, nanocápsulas e lipossomas. Já no sistema matricial (Figura 10 b), a droga encontra-se homogeneamente dispersa no material que forma o dispositivo ou adsorvida na superfície. Sua liberação ocorre por difusão através dos poros da matriz ou por degradação do material ou, ainda, por uma combinação desses dois mecanismos. (a) ativo distribuído uniformemente no interior (b) ativo concentrado no núcleo Figura 10 - Exemplos das diferentes formas farmacêuticas: (a) cápsula (sistema reservatório) e (b) esfera (sistema matricial). Adaptado SOUZA, Os sistemas controlados quimicamente fazem uso da bioerosão, onde o material utilizado se desgasta ao sofrer reações químicas, liberando o fármaco para a distribuição no alvo. Esses sistemas são classificados em duas categorias: Sistemas de imobilização física: também conhecidos como biodegradáveis, nos quais o fármaco, fisicamente imobilizado pela rede do material, é liberado após a bioerosão da rede;

42 41 Sistemas de imobilização química: nos quais o fármaco está quimicamente ligado ao esqueleto da rede do material ou ele próprio é parte desse esqueleto. A liberação de fármaco destes sistemas é governada principalmente pela cinética de degradação da interação, sendo, portanto, específica para cada sistema. Nos dispositivos do tipo bomba osmótica o agente osmótico está contido dentro de uma câmara rígida e separado da droga por uma partição móvel. Um dos lados do compartimento rígido é uma membrana semipermeável. Quando o dispositivo é imerso em um ambiente aquoso, a água entra no dispositivo através da membrana aumentando o volume do compartimento osmótico que por sua vez exerce uma pressão sobre a parte móvel, forçando o agente ativo a sair por meio de um orifício (SILVA, 2006). Este tipo de sistema é capaz de produzir uma liberação com cinética de ordem zero, ou seja, com uma velocidade constante em função do tempo, por um período de tempo maior do que os outros dispositivos, além de liberar o fármaco com uma maior taxa do que aquela conseguida pelos sistemas controlados por difusão. Adicionalmente, este sistema é aplicável a fármacos com diversas composições e massas molares, o que não é conseguido por meio do mecanismo de difusão. A Figura 11 mostra esquematicamente esse tipo de dispositivo. Figura 11 - Esquema de um sistema de liberação por bomba osmótica. Adaptado de RATNER et al., Nos sistemas controlados por expansão e contração, o fármaco encontra-se dissolvido ou disperso em um suporte polimérico hidrofílico reticulado, o qual pode expandir sem se dissolver quando em contato com o meio aquoso. A migração do fármaco para o meio aquoso de um sistema como esse implica em um processo de absorção de água e dessorção do fármaco. O grau de expansão (consequentemente, a quantidade de fármaco liberada) dependerá do balanço hidrofílico/hidrofóbico do material polimérico e do grau de ligações cruzadas. Além disso, conforme mencionado anteriormente, fatores externos como

43 42 temperatura, ph, tensão mecânica, resistência iônica, campo elétrico e luz podem fazer com que o polímero reticulado sofra expansão ou contração controlando, desse modo, a liberação do princípio ativo. Alguns sistemas podem ser ativados externamente para liberar mais fármaco quando necessário, usando forças, tais como magnetismo. Nesse caso, um campo magnético externo causa a vibração das partículas magnéticas envolvidas em uma matriz, forçando mais fármaco a sair da matriz (Figura 12) (LANGER, 1990; DASH & CUDWORTH II, 1998; LIU et al., 2006). Figura 12 - Representação esquemática do direcionamento da droga magnética. (YANG et al.,2006). Quando a matriz entra em contato com o sistema biológico, ocorre a difusão normal do fármaco devido ao gradiente de concentração. Entretanto, sob a exposição de um campo magnético externo oscilante, maior quantidade pode ser rapidamente liberada (DASH & CUDWORTH II, 1998.). A maior vantagem desse tipo de liberação é a possibilidade de manipular a cinética de liberação da droga usando um estímulo externo.

44 43 A combinação de todos os mecanismos acima citados é possível. As taxas de liberação de sistemas poliméricos podem ser controladas pela natureza do material polimérico (por exemplo, cristalinidade ou estrutura de poros para sistemas de difusão controlada; a interações de ligações ou a hidrofobicidade de monômeros para sistemas controlados quimicamente) e o design do sistema (por exemplo, espessura e forma). A vantagem de sistemas com mecanismos de liberação diferentes é que cada qual pode alcançar diferentes objetivos Doxorrubicina O impacto do câncer no mundo tem crescido de forma significativa, sobretudo devido ao envelhecimento populacional e às mudanças de hábitos de vida. A Agência Internacional para Pesquisa em Câncer divulgou que, no ano de 2008, ocorreram cerca de sete milhões de óbitos por câncer no mundo (IARC, 2008). No Brasil, as estimativas, para o ano de 2014, apontam para a ocorrência de 580 mil casos novos de câncer (INCA, 2013). Dentre as terapias empregadas para o combate ao câncer, a quimioterapia é a modalidade de tratamento mais utilizada. Entretanto, o maior desafio do tratamento antineoplásico, que é matar seletivamente as células neoplásicas com reduzido ou inexistente dano às células sadias, ainda permanece para ser superado. Muitos antineoplásicos têm sido amplamente utilizados na prática da quimioterapia. Os antibióticos obtidos por fermentação natural, derivados de várias espécies do gênero Streptomyces, estão entre estes quimioterápicos. Alguns antibióticos atuam como citotóxicos levando às células neoplásicas a morte e outros agem como citostáticos interferindo no crecimento celular (ALTIERI, 2001; ASHIKAWA et al., 2004). O cloridrato de doxorrubicina (DOX) é um antibiótico antineoplásico do grupo das antraciclinas, isolado a partir de culturas fúngicas de Streptomyces peucetus var. caesius, relatado como de uso corrente em oncologia humana (SILVA & CAMACHO, 2005). Doxorrubicina é uma molécula tetracíclica, contendo três anéis de hidroxiantraquinona planares e aromáticos, que funcionam como um cromóforo, e um anel não planar e não aromático ligado a uma cadeia lateral aminoglicosídica (Figura 13).

45 44 Figura 13 - Estrutura química da doxorrubicina. A DOX é ativa durante todo o ciclo de divisão celular, incluindo a interfase e tecidos de rápida proliferação. Os tecidos tumorais, células da medula óssea, mucosa gastrintestinal e oral e folículos pilosos são os mais sensíveis aos efeitos antiproliferativos da DOX. Ela não é absorvida pelo trato gastrintestinal, uma vez que o fármaco é irritante para os tecidos, devendo ser administrado pela via endovenosa (CHARROIS & ALLEN, 2004). Esse fármaco é metabolizado principalmente pelo fígado e, por isso, pode induzir hepatotoxicidade. O seu principal metabólito é o 13-OH-doxorrubicinol, que possui certo grau de atividade antitumoral. Após a administração endovenosa, os níveis plasmáticos de DOX seguem um declínio multifásico, com uma meia vida terminal de 20 a 48 horas. A depuração plasmática varia de 8 a 20 ml/min/kg e deve-se principalmente ao metabolismo e a excreção biliar. Aproximadamente 40% da DOX administrada é recuperada na bile ou fezes em 5 dias; 5 a 12% do fármaco e os seus metabólitos aparecem na urina durante esse período (CHABNER & CALABRESI, 2001). A DOX tem sido usada com êxito para produzir regressão em várias neoplasias, tais como carcinoma da mama, pulmão, bexiga, tireóide e ovariano; sarcomas ósseos e dos tecidos moles; linfomas de Hodgkin e não-hodgkin; neuroblastoma; tumor de Wilms; leucemia linfoblástica aguda e leucemia mieloblástica aguda. Este fármaco tem proporcionado

46 45 resultados positivos nos tratamentos de tumores superficiais da bexiga por administração intravesical (aplicação dentro da bexiga) após ressecção do tumor por via transuretral (BAPTISTA, 2005). A DOX é considerada um dos agentes mais ativos disponíveis para o tratamento quimioterápico do câncer e é parte importante de regimes curativos utilizados como adjuvante para o tratamento da doença em estado precoce. A eficácia, entretanto, está associada a reações adversas que incluem granulocitopenia, náusea, vômitos, alopecia, reações de extravasamento, estomatite e cardiotoxicidade (BAPTISTA, 2005), mesmo respeitando-se a dose terapêutica e o intervalo de aplicação recomendados. No homem, o risco de cardiomiopatia grave e irreversível aumenta se a dose cumulativa máxima de 550 mg/m 2 for excedida. A síndrome que resulta do efeito cardiotóxico da doxorrubicina é caracterizada, clinicamente, por insuficiência cardíaca congestiva (ICC), hipotensão, anormalidades eletrocardiográficas, arritmias e morte súbita (SILVA & CAMACHO, 2005). Dessa forma, a incorporação da DOX tanto em sistemas transportadores matriciais (nano e micropartículas, entre outros) como em sistemas reservatórios (microcápsulas, lipossomas, entre outros) é uma estratégia para reduzir a hepato e a cardiotoxicidade cumulativa doserelacionada da DOX convencional.

47 METODOLOGIA O procedimento experimental consistiu na síntese dos materiais SBA-16 e SBA-16/P(NiPAAm) e na síntese do nanocompósito SBA-16/Fe 3 O 4 para serem usados em comparação ao sistema multifuncional SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) obtido neste presente trabalho Síntese das Nanopartículas de Magnetita As nanopartículas de magnetita foram sintetizadas pelo método de oxidação-precipitação (ZHANG et al., 2006), baseados na metodologia proposta por Sugimoto et al (SUGIMOTO & MATIJEVIC, 1979). Nesse processo, 0,25 mol de hidróxido de potássio dissolvido em 50 ml de água deionizada e 0,06 mol de sulfato de ferro (II) heptahidratado dissolvido em 200 ml de água deionizada foram misturados para formar uma solução rica em hidróxido de ferro (II). Após 5 minutos de agitação magnética a 200 rpm, foi incorporada a esta mistura uma solução de 0,1 mol de nitrato de potássio, um oxidante moderado, em 100 ml de água deionizada. A mistura reacional foi aquecida a 90 ºC em atmosfera de argônio por 2 horas e depois, após a remoção do fluxo de argônio, a solução foi resfriada e permaneceu a temperatura ambiente por 1 h. O produto final obtido foi então lavado por precipitação magnética com água deionizada até atingir o ph 7 (Figura 14). Figura 14 - Representação esquemática da rota de síntese da magnetita.

48 Síntese da Sílica Mesoporosa SBA-16 Nanopartículas de sílica SBA-16 foram preparadas a partir da dissolução de 3,0 g do surfactante não iônico F127 (PEO 106 PPO 70 PEO 106 ) em uma mistura de 144 ml de água destilada e 14,0 ml de ácido clorídrico (HCl 38 %), colocados em um pote de Teflon. A mistura foi mantida sob agitação durante 30 minutos. Na sequência, adicionou-se 11,1 ml de butanol e após uma hora, a esta solução, foi adicionado 15,3 ml de tetraetilortossilicato (TEOS) sob agitação. Logo em seguida, o recipiente de Teflon foi fechado e mantido a temperatura constante de 45 C, durante 24 horas. A mistura final foi mantida por mais 24 horas em uma estufa a temperatura de 100 C. Na sequência, a mistura foi filtrada a quente e o material sólido obtido foi seco em estufa a 60 C, por aproximadamente 24 horas. O material obtido até esta etapa ainda apresenta em sua estrutura o agente direcionador de rede, que é o surfactante F127. Assim, para sua retirada, procedeu-se com a calcinação da amostra, conduzida em um forno tubular horizontal no qual o material sintetizado foi aquecido, sob fluxo de nitrogênio, a uma taxa de 5 C/min até a temperatura de 550 C. Após alcançar essa temperatura, o fluxo de nitrogênio foi mantido por mais uma hora. Em seguida, o fluxo foi desligado e as entradas do forno foram abertas onde a amostra foi resfriada à taxa de 5 C/min (Figura 15). Figura 15 - Representação esquemática da rota de síntese da SBA-16 tradicional.

49 Síntese do Compósito SBA-16/Fe 3 O 4 O SBA-16 foi utilizado como matriz suporte das nanopartículas magnéticas. Seguindo o protocolo de síntese do SBA-16, após a solubilização do surfactante em água deionizada e em meio fortemente ácido, a magnetita previamente sintetizada foi adicionada ao meio reacional na proporção de 58 % p/p de magnetita. O precursor da sílica foi então adicionado. A solução foi mantida sob agitação magnética por 24 horas em um recipiente de Teflon hermeticamente fechado. A temperatura do sistema foi mantida constante a 45 ºC em banhomaria. Após esse tempo, o material foi envelhecido a 100 ºC por 24 horas, e depois filtrado. A extração do surfactante foi feita por um processo de calcinação a 550 ºC, sob fluxo de nitrogênio (Figura 16). Figura 16 - Representação esquemática da síntese do compósito SBA-16/Fe 3 O Síntese do Híbrido Mesoporoso SBA-16/P(N-iPAAm) A síntese do híbrido foi realizada em duas etapas distintas. Na primeira etapa, 0,7 g de SBA- 16 foi adicionado ao monômero N-isopropilacrilamida (0,343 g) juntamente com a solução de 0,7 ml contendo o agente reticulante N, N -metileno-bisacrilamida (MBAA). Essa mistura foi transferida para uma incubadora com agitação orbital (150 rpm, 25 ºC) para completa homogeneização dos reagentes, por 3 horas. Após o sistema ser resfriado a 10 ºC, iniciou-se a adição de 0,7 ml de solução do iniciador persulfato de amônio (PA) e 0,7 ml de solução do

50 49 iniciador metabissulfito de sódio (MS). Para um volume total de 7,0 ml, foram utilizadas as quantidades de 0,343 g de N-iPAAm, 0,007 g de MBAA e 0,7 g de SBA-16. As soluções de agente reticulante e de iniciadores foram preparadas separadamente utilizando-se um volume de 0,7 ml de solução preparada a partir de 0,025 g de cada um deles em um volume de 10 ml. O híbrido obtido foi denominado SBA-16/P(N-iPAAm). No decorrer da adição dos iniciadores, um fluxo de N 2 de 1 ml/min, aproximadamente, foi mantido constante dentro do vaso de reação. Em seguida, essa mistura foi colocada sob agitação por 24 horas, período suficiente para que ocorresse a formação do gel. Após esse período o material obtido foi secado a 60 ºC durante 24 horas. A segunda etapa consistiu na lavagem do híbrido, que foi realizada com o objetivo de se remover o excesso de reagentes (monômeros, agente reticulante e iniciadores). Para isso, o material foi finamente dividido com o auxílio de um graal de ágata. Em seguida, foi suspenso em 50 ml de água e submetido a uma agitação, sendo o sobrenadante separado por centrifugação a 3600 rpm por três minutos. Esse processo de centrifugação foi realizado duas vezes. O precipitado foi seco em estufa a 60 ºC durante 24 horas. O processo de lavagem e separação por centrifugação foi utilizado devido à dificuldade em separar as fases por filtração à vácuo, uma vez que a fração polimérica não incorporada na sílica forma uma camada sobre o elemento filtrante (papel de filtro ou membrana filtrante), dificultando assim a filtração (Figura 17). Figura 17 - Representação esquemática da síntese do híbrido SBA-16/P(N-iPAAm).

51 Síntese do Sistema Multifuncional SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) Inicialmente, 0,7g de SBA-16/Fe 3 O 4 calcinado foi secado a 200 ºC durante 12 horas e resfriado a temperatura ambiente. Em seguida, adicionou-se o monômero N- isopropilacrilamida juntamente com a solução contendo o agente reticulante N,N -metilenobisacrilamida (MBAA), em proporções previamente determinadas para cada híbrido sintetizado. Essa mistura foi transferida para uma incubadora com agitação orbital (150rpm, a temperatura ambiente) para completa homogeneização dos reagentes, por 3 horas. Após o sistema ser resfriado a 10 ºC, iniciou-se a adição das soluções de iniciadores persulfato de amônio (PA) e do metabissulfito de sódio (MS). As massas dos monômeros e do agente reticulante foram determinadas em função da concentração e quantidade de gel a ser obtida Para um volume total de 7,0 ml, foram utilizadas as quantidades de 0,343 g de N-iPAAm, 0,007 g de MBAA e 0,7 g de SBA-16/Fe 3 O 4. As soluções de agente reticulante e de iniciadores foram preparadas separadamente utilizando-se um volume de 0,7 ml de solução preparada a partir de 0,025 g de cada um deles em um volume de 10 ml. O híbrido obtido foi denominado SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) (Figura 18). Figura 18 - Representação esquemática da síntese do híbrido SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm).

52 Caracterização das Amostras Microscopia Eletrônica de Varredura As imagens dos materiais sintetizados foram obtidas por microscopia eletrônica de varredura para o estudo da morfologia. Utilizou-se o microscópio eletrônico de varredura com canhão de emissão por efeito de campo modelo Quanta 200-FEG-FEI-2006 do Centro de Microscopia da UFMG para a realização dessas imagens. As amostras na forma de pó foram suspensas em uma solução de etanol e gotas dessa suspensão foram adicionadas em uma fita condutora de carbono dupla-face. A amostra foi exposta a uma nuvem de ouro sublimado por 30s Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) As imagens das amostras deste trabalho foram feitas no Centro de Microscopia da UFMG, utilizando-se o microscópio eletrônico de transmissão Tecnai G2-20-FEI 2006 de 200 kv. O SBA-16 e os híbridos contendo o gel polimérico P(N-iPAAm) foram dispersos em etanol e sonicados por 5 minutos em banho de ultrasom. Após decantação por 10 minutos uma gota da solução foi depositada sobre uma grade suporte de cobre de 300 mesh. As amostras magnéticas foram recobertas com um filme polimérico ao serem depositadas nas grades para proteção do canhão de elétrons. A captura das imagens foi realizada com câmera CCD, com o software item da AnalySis Adsorção de Nitrogênio O método foi usado para caracterizar diâmetro e volume dos poros e determinar a área superficial das amostras. As características dos poros das amostras foram analisadas usando um equipamento Quantachrome Autosorb iq, o qual é composto por um sistema de adsorção física automatizada que fornece dados de equilíbrio de adsorção e dessorção. As amostras sem polímero tiveram um pré-tratamento antes de cada ensaio a 300ºC sob vácuo, por 2 horas e as amostras híbridas tiveram um pré-tratamento a 40ºC sob vácuo por 48 horas. Os dados de volume adsorvido e dessorvido em várias pressões relativas foram utilizados para gerar informações sobre a área superficial por Brunauer-Emmett-Teller (BET),

53 52 volume de poros, distribuição e tamanho médio de poros calculados pelo método Non-Local Density Functional Theory (NLDFT) Espalhamento de Raios X a Baixos Ângulos Os materiais mesoporosos ordenados caracterizam-se por serem materiais amorfos, porém o arranjo periódico dos poros e a diferença de densidade das paredes dos poros possibilitam a detecção desse ordenamento a ângulos baixos pela difração de raios X. A técnica de espalhamento de raios X a Baixos Ângulos (SAXS) foi utilizada para obter informações a cerca do ordenamento estrutural das diferentes amostras sintetizadas no presente trabalho. A análise destas amostras foram obtidas utilizando um gerador 3 KW de rotação do ânodo do equipamento de difratometria de Raio X Ultima IV (Rigaku Inc). O instrumento é equipado com um ânodo de cobre (comprimento de onda λ= 1,54 Ǻ). O gerador foi operado em 40 KV e 30 ma, fazendo varredura de 4 o /min entre os ângulos de espalhamento (2θ) de 0 o e 2 o. A radiação espalhada foi gravada utilizando um contador de cintilação. A fita de níquel é usada para filtrar os brancos de radiação gerados pelo anodo cobre. A distância amostra-detector foi cerca de 30 cm Análise Termogravimétrica As análises termogravimétricas (TG) foram realizadas no equipamento TGA 50 WS (Shimadzu). Os materiais sintetizados (8 mg) foram analisadas nas seguintes condições: razão de aquecimento 5 C/min, faixa de temperatura de 25 a 800 C sob atmosfera de nitrogênio (N 2 ) com fluxo de 20 ml/min e célula de platina aberta. Através dessas análises foi possível avaliar a estabilidade térmica dos materiais estudados, avaliar a presença do gel polimérico nas matrizes e no nanocompósito, e também utilizou-se esta técnica para estimar o percentual de incorporação do antineoplásico Doxorrubicina presente nas amostras Análise Elementar O conteúdo de moléculas do gel P(N-iPAAm) e do antineoplásico Doxorrubicina incorporados na matriz de sílica SBA-16 e na matriz das amostras híbridas foi avaliado através da leitura dos teores de carbono, hidrogênio e nitrogênio presente nas amostras. As

54 53 determinações foram realizadas em um equipamento da CHNSO da Perkin-Elmer, modelo Espectroscopia na Região do Infravermelho por Transformada de Fourier Espectroscopia na Região de Infravermelho por Transformada de Fourrier (FTIR) foi empregada para caracterizar os grupos funcionais típicos da rede de sílica e para caracterizar os grupos funcionais adicionados a matriz. Os espectros de IV abrangendo a região de cm -1 foram obtidos por meio de um espectrofotômetro FTIR Thermo Scientific Nicolet Os espectros foram obtidos à temperatura ambiente, em pastilhas sólidas do pó com KBr, e foram adquiridos com resolução de 4 cm -1 e 64 scans/min Difração de Raios X (DRX) As amostras sintetizadas foram caracterizadas por difração de raios X, pelo método de pó, usando radiação K do cobre, com comprimento de onda ( ) igual a 1,54 Å. Os difratogramas foram obtidos em equipamentos da Rigaku, modelo Geigerflex-3034, semiautomático. As medidas foram feitas usando velocidade do goniômetro de 0,5º por minuto, sob corrente de 30 ma e tensão de 40 kv Espectroscopia Mössbauer A espectroscopia Mössbauer foi utilizada para identificar as fases de ferro presentes na amostra e os seus respectivos percentuais. Os espectros foram obtidos através de um espectrômetro Mössbauer convencional operando em modo de aceleração constante em geometria de transmissão, utilizando fonte de 57 Co em matriz de Rh, e calibrado em referência ao -Fe à temperatura ambiente. As medidas foram feitas sem aplicação de um campo magnético externo e à temperatura ambiente. Os espectros foram ajustados pelo método dos mínimos quadrados utilizando o programa numérico NORMOS Medidas Magnéticas As propriedades magnéticas da magnetita e dos híbridos foram avaliadas em um magnetômetro de amostra vibrante (LakeShore) a 300 K. Como resposta das medidas de

55 54 VSM (magnetômetro de amostra vibrante), foi possível obter a curva de histerese (curva de magnetização versus campo aplicado, que no caso foi de até 10 kgauss), e, através dela, os seguintes parâmetros: magnetização de saturação (valor máximo de magnetização alcançada com o campo aplicado), remanência (valor de magnetização em campo zero) e campo coercivo (valor do campo magnético que deve ser aplicado no material para levar a magnetização a zero) Espectroscopia de Fotoelétrons Excitados por Raios X (XPS) Os espectros de XPS foram obtidos em um sistema de ultra alto vácuo para espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios X marca Specs GmbH. A amostra é excitada pela radiação emitida em um tubo de raios X monocromático, que utiliza como alvo o alumínio e cuja linha de emissão - linha k (alfa) - tem energia de 1486,6 ev. A energia cinética dos elétrons excitados, provenientes da superfície do material estudado, é medida utilizando-se um analisador de elétrons Specs Phoibos 150 MCD-9 detector XP. Os espectros amplos de XPS foram obtidos na região entre 0 e 1200eV, e os de alta resolução nas regiões dos picos de fotoemissão do carbono C 1s (285,6eV), do nitrogênio N 1s (400eV), do Fe 2p 3/2 (708,1 ev) e do silício Si 2p (99eV). As análises foram realizadas com as amostras coladas sobre um portaamostras de inox com auxílio de uma fita adesiva. A pressão na câmara de ultra alto vácuo foi de 5,0x10-10 mbar Bioaplicações Hipertermia Para a realização dos testes de hipertermia utilizou-se um indutor de campo magnético variável, modelo EasyHeat, da Ameritherm (Figura 19). O equipamento utiliza uma bobina de cobre de três voltas onde são gerados campos magnéticos alternados com frequêcia de 222 khz. Utilizando este equipamento, foram realizados testes de aquecimento da amostra quando submetida a um campo magnético alternado. O equipamento utilizado permite uma variação do campo magnético aplicado e do tempo de exposição da amostra. Os testes foram realizados com as amostras em solução aquosa na concentração de 10 e 20 mg/ml. As amostras em solução foram submetidas ao ultrasom por 30 minutos com o intuito

56 55 de dispersar o pó em água. Foram testadas duas correntes diferentes, de 300 A (126 Oe) e 400 A (168 Oe) em intervalos de cinco minutos até atingir 30 minutos. Para as medidas de T foi posicionado um termômetro digital acima da amostra dentro da bobina logo após o término da indução e as medidas de temperatura foram feitas no centro da amostra. Figura 19 Equipamento utilizado para a realização de medidas de hipertermia magnética Estudo de Liberação Controlada de Fármacos O fármaco utilizado para estudo de liberação foi o antineoplásico Doxorrubicina (DOX). Inicialmente foi realizada a incorporação da DOX nestas matrizes. Utilizou-se 250 mg das amostras SBA-16, SBA-16/P(N-iPAAm), SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) em 20 ml de solução de DOX, com concentração de 2,5 mg/ml. Cada mistura foi incubada com agitação orbital no equipamento Shaker-INNOVA 4200, durante 72 horas (200 rpm, 25ºC). Após 72 horas, as misturas foram filtradas em um sistema Millipore de filtração a vácuo e secadas a 40ºC. As medidas da concentração de DOX das soluções preparadas para incorporação foi feita em um espectrofotômetro Shimadzu UV-VIS V Para calcular a quantidade de DOX incorporada em cada material, foi medida a concentração das soluções antes e após a incorporação. Para quantificar a concentração do medicamento incorporado e posteriormente liberado, foi feita uma curva de calibração para a DOX com comprimento de onda fixo em 480 nm. A

57 Absorbância 56 curva de calibração apresentada na Figura 20 possibilitou a quantificação da concentração da DOX durante as medidas. 1.0 Curva de Calibração Doxorrubicina = 480 nm Equation y = a + b*x Adj. R-Square Value Standard Error Absorbância Intercept Absorbância Slope E Concentração g/ml) Figura 20 - Curva de calibração para a Doxorrubicina. O estudo da liberação da DOX incorporada nas amostras SBA-16, SBA-16/P(N-iPAAm), SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) foi realizado in vitro, utilizando as amostras em forma de pastilha de 50 mg. Os dispositivos de liberação obtidos foram imersos em 10 ml de solução tampão acetato de fosfato ph 5,0 e em solução SBF (fluido corpóreo simulado) ph 7,4 com o intuito de avaliar o comportamento da DOX em diferentes phs (CHEN et al., 2013). A mistura permaneceu sob agitação de 50 rpm a 37 o C. Para a amostra SBA-16/P(NiPAAm) foi testada outra temperatura de 45 o C com o objetivo de avaliar se o comportamento do gel termossensível P(N-iPAAm) sob temperaturas maiores altera a taxa de liberação da DOX. A liberação da DOX nas amostras magnéticas SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) foi testada na presença de um campo magnético de 126 Oe em uma corrente alternada de 222 khz. Estas medidas de liberação com campo magnético foram realizadas para avaliar a funcionalidade dos materiais Fe 3 O 4 e P(N-iPAAm) no dispositivo final. A geração de calor proporcionado pelas nanopartículas de magnetita pode favorecer a mudança do comportamento de fase (contração) do P(N-iPAAm) contribuindo na cinética de liberação do fármaco.

58 Número de partículas RESULTADOS E DISCUSSÃO Microscopia Eletrônica de Varredura A Figura 21 mostra as imagens feitas em microscópio eletrônico de varredura, por elétrons secundários, para a magnetita sintetizada em diferentes aumentos e que foram utilizadas para realizar o cálculo de distribuição do diâmetro médio das partículas através do programa de análise de imagens Quantikov Image Analyzer (PINTO, 1996). O diâmetro médio calculado para as partículas de magnetita foi de 250 nm. 30 Magnetita Diâmetro médio das partículas (nm ) Figura 21 - Micrografia da amostra de Magnetita.

59 Número de partículas 58 As imagens mostram o material com uma morfologia uniforme e na forma de cristalitos quadrados. Pode-se ver também aglomeração das partículas devido à interação magnética entre elas. Em um aumento maior, observa-se a cristalinidade das partículas, com uma morfologia muito plana, em forma de octaedros regulares com superfície lisa, em acordo com a literatura (YU et al., 2006), indicando que as partículas foram bem cristalizadas. A Figura 22 mostra que o SBA-16 apresenta partículas esféricas, resultado condizente com o descrito na literatura (ZHAO, 2004). Observa-se, porém, agregados de tamanhos variados, sugerindo que não há uniformidade de tamanho das partículas obtidas. Foram realizadas, também, imagens de microscopia dos materiais híbridos, Figura 23 a, b e c, que apresentaram partículas esféricas similares as da amostra pura (SBA-16). Esse resultado evidencia que mesmo após a introdução de magnetita e P(N-iPAAm) a morfologia da sílica mesoporosa não sofreu modificação significativa. O diâmetro médio das partículas foi calculado também pelo o programa de análise de imagens Quantikov Image Analyzer. Para isso, foram utilizadas as imagens que forneceram melhor visualização e contraste. O diâmetro médio calculado para as partículas de SBA-16 foi de 2,7 μm. Os valores para as amostras híbridas não sofreram variação significativa de tamanho. 20 SBA Diâmetro médio das partículas ( m) Figura 22 - Micrografia da amostra de SBA-16.

60 59 (a) (b) (c) Figura 23 - Micrografia das amostras de (a) SBA-16/Fe 3 O 4, (b) SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) e (c) SBA-16/ P(N-iPAAm) Microscopia Eletrônica de Transmissão A técnica de microscopia eletrônica de transmissão foi utilizada para elucidar e comparar a estrutura de poros das amostras SBA-16/Fe 3 O 4, SBA-16/P(N-iPAAm) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(NiPAAm) em relação ao SBA-16. A Figura 24 mostra a imagem das amostras obtidas com o feixe incidente na direção paralela ao eixo dos poros (a), e obtida na direção perpendicular ao eixo dos poros (b) revelando claramente um arranjo cúbico de canais uniformes e equidistantes, confirmando um arranjo altamente ordenado em todas as amostras. Esse ordenamento fornece características favoráveis ao material tais como estabilidade térmica, tamanho de poros bem definidas e distribuição estreita de tamanho de poros condizente com o descrito na literatura (SAKAMOTO, 2000).

61 60 (a) SBA-16 (b) SBA-16 (a) SBA-16/Fe 3 O 4

62 61 (b) SBA-16/Fe 3 O 4 (a) SBA-16/P(N-iPAAm) (b) SBA-16/P(N-iPAAm)

63 62 (a) SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) (b) SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) Figura 24 - Micrografia das amostras com estruturas cúbicas: (a) na direção paralela ao eixo dos poros, (b) na direção perpendicular ao eixo dos poros. Pelas imagens mostradas na Figura 24, observa-se que a estrutura ordenada de poros com arranjo cúbico do SBA-16 foi preservada durante a síntese do compósito e dos híbridos. A Figura 25 mostra a imagem obtida por microscopia eletrônica de transmissão para o SBA- 16/Fe 3 O 4 e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm), indicando que duas regiões com densidade eletrônica diferentes podem ser distinguidas: uma região mais densa (preta) localizada no núcleo que corresponde à fase da magnetita, e uma região menos densa (cinza), recobrindo o núcleo, que supõe-se ser a sílica revestindo as nanopartículas.

64 63 (a) (b) Figura 25 - Micrografia das amostras SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) Adsorção de Nitrogênio A adsorção de gases em materiais sólidos pode ser descrito pelas isotermas de adsorção. A sílica mesoporosa ordenada possui isotermas do tipo IV (SING et al., 1985), com a presença da etapa de condensação capilar (a uma dada pressão relativa) que está relacionada ao tamanho dos seus mesoporos. A análise do tamanho de poros dos materiais mesoporosos por isotermas de adsorção é baseada na interpretação dos mecanismos de condensação e evaporação capilar associados ao fenômeno de histerese. O oposto da condensação capilar é a evaporação capilar, que não ocorre na mesma posição da pressão relativa da condensação, levando à chamada histerese de adsorção/dessorção. A Figura 26 apresenta a isoterma de adsorção de N 2 do SBA-16. A porção inicial da isoterma corresponde à adsorção na região de baixas pressões relativas (P/P 0 : 0,05 a 0,35) devido ao preenchimento dos microporos e à formação de um filme nas paredes dos poros. Em seguida, observou-se um aumento linear do volume adsorvido que foi atribuído à adsorção na monocamada e multicamada sobre a superfície do material, incluindo a superfície dos mesoporos (P/P 0 : 0,35 a 0,6). A etapa de condensação capilar acentuada indica uma estreita distribuição de tamanho de poros (P/P 0 : 0,6 a 0,95 e de 0,95 a 0,65). No ponto próximo da união das isotermas (P/P 0 : 0,65), em pressões relativas altas, ocorre a adsorção nos macroporos. A dessorção é consideravelmente tardia (P/P 0 : 0,5) e essencialmente não ocorre

65 Volume Adsorvido (cm 3.g -1 ) 64 até o ponto mais largo da curva seguida por uma acentuada etapa em uma pressão relativa de 0, SBA Pressao Relativa (P/P 0 ) Figura 26 - Isoterma de adsorção de nitrogênio do SBA-16. A isoterma da amostra pura apresenta ramos de adsorção e dessorção que formam uma histerese assimétrica e triangular, classificada pela IUPAC como sendo do tipo H2, que pode ser atribuída a sistemas de poros com conectividade de rede de poros e efeito de bloqueio de poros. Uma comparação entre as isotermas de adsorção de nitrogênio da amostra SBA-16 e das amostras SBA-16/Fe 3 O 4, SBA-16/P(N-iPAAm) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) pode ser observada na Figura 27. Percebe-se através dessas isotermas que as histereses das amostras SBA-16/P(N-iPAAm) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) sofreram uma redução nos valores de volume de gás adsorvido para todas as pressões relativas. Este tipo de alteração sugere uma diminuição do tamanho e volume de poros destas amostras. Contudo, os perfis das isotermas dos sistemas híbridos preservaram as características estruturais da matriz mesoporosa SBA- 16.

66 Volume Adsorvido (cm 3.g -1 ) SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) SBA-16/P(N-iPAAm) SBA-16/Fe 3 O 4 SBA Pressao Relativa (P/P 0 ) Figura 27 - Comparação entre as isotermas de adsorção de Nitrogênio das amostras SBA-16/Fe 3 O 4, SBA-16/P(N-iPAAm) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) com o SBA-16. A partir desta técnica é possível observar uma diminuição bastante acentuada na área superficial de ambas as amostras, além da diminuição de volume de poros (Tabela 2), indicando a incorporação da magnetita e do gel polimérico P(N-iPAAm) na matriz de sílica. Embora ocorra esta diminuição nas características estruturais das amostras, estes resultados indicam que tanto o hidrogel quanto a magnetita presentes na estrutura da sílica não ocupam completamente o espaço disponível do material, de modo que ainda há algum volume livre para a incorporação de fármacos nestes sistemas. A Tabela 2 apresenta os resultados obtidos das medidas de adsorção de N 2, que mostram os valores numéricos para os parâmetros texturais comumente utilizados para caracterizar materiais porosos. Nesta tabela, estão listados os valores da área superficial específica calculada por BET (S BET ), os valores obtidos do volume total de poros (Vp) e diâmetro de poros (Dp) calculado pelo método NLDFT das amostras de SBA-16, SBA-16/Fe 3 O 4, SBA-16/P(N-iPAAm) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm).

67 66 Tabela 2 - Resultados de adsorção de N 2 para as amostras estudadas. Amostras S BET (m 2 /g) V P (cm 3 /g) C BET D P (DFT) (nm) SBA , ,6 SBA-16/Fe 3 O , ,6 SBA-16/P(N-iPAAm) SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) ,194 0,081 S BET = área específica; D p (DFT) = diâmetro médio de poros pelo método NLDFT; V p = volume médio de poros; C BET = constante calculada a partir da equação BET ,6 3,5 A presença de nanopartículas magnéticas e do P(N-iPAAm) na estrutura do SBA-16 leva ao decréscimo tanto da área superficial quanto do volume de poros. Entretanto, o tamanho de poros não é afetado pela presença destes dois materiais, como indicado na Tabela 2 que apresenta o tamanho de poros em torno de 3,5 nm, tanto para a sílica mesoporosa, quanto para as demais amostras. Para materiais a base de sílica, os valores calculados para C BET são utilizados para inferir sobre a polaridade superficial (SING et al., 1985). Valores de C BET são altos para superfícies polares e baixos para superfícies apolares. Uma diminuição significativa no valor da constante C BET para as amostras contendo P(N-iPAAm) pode ser observada na Tabela 2. Tal alteração pode estar ocorrendo em função das possíveis interações entre os grupos amida e carbonila das moléculas dos grupos isopropilacrilamida com os grupos hidroxila da sílica, que causam uma diminuição na quantidade de grupos hidroxila livres presentes na superfície da sílica. As curvas de distribuição de tamanho de poros foram analisadas pelo método NLDFT (Non Localized Density Functional Theory) e são apresentadas na Figura 28. Percebe-se que tanto o SBA-16 quanto as demais amostras apresentam uma distribuição de tamanho de poros muito estreita, centrada em torno de 3,5 nm, característica de materiais mesoporos, com arranjo estrutural bem ordenado.

68 dv(r) (cm 3.nm -1.g -1 ) SBA-16 SBA-16/Fe 3 O 4 SBA-16/P(N-iPAAm) SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) Diâmetro de poros (nm) Figura 28 - Distribuição de tamanho de poros para as amostras SBA-16, SBA-16/Fe 3 O 4, SBA-16/P(N-iPAAm) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm). Analisando o gráfico de distribuição de tamanho de poros, verifica-se uma diminuição de dv(r) para as amostras contendo nanopartículas de magnetita e P(N-iPAAm). Este resultado indica que estes materiais não estão preenchendo todos os espaços intracanais viáveis da estrutura do mesoporoso. Pode-se observar também neste gráfico, a presença de uma pequena contribuição de microporos centrada em torno de 1,5 nm para todas as amostras estudadas Espalhamento de Raios X a Baixos Ângulos Os materiais mesoporosos ordenados se caracterizam por serem materiais amorfos, porém o arranjo periódico dos poros e a diferença de densidade da parede e dos poros possibilitam a detecção desse ordenamento a ângulos baixos pela difração de raios X. Essa técnica foi utilizada para verificar a ocorrência de possíveis alterações causadas pela introdução das partículas magnéticas e do P(N-iPAAm) na estrutura da sílica. Variações nas posições e intensidade dos picos, bem como mudanças nos valores de espaçamento interplanar d (110) e parâmetro de célula unitária cúbica a 0, são indícios de alterações causadas na estrutura de poros dos materiais mesoporosos. Os difratogramas das diferentes amostras, apresentados na Figura 29, mostram que apenas um sinal de difração correspondente ao plano (hkl), ou seja, baseado no índice de Miller (110) foi identificado. Embora três picos baseados nos índices de Miller (110), (200) e (211) sejam típicos deste tipo de estrutura, o pico de maior intensidade (110) pode ser indicativo do

69 Intensidade (u. a.) 68 arranjo estrutural proposto. Esses picos se encontram na região de 2θ = 0,5-1,5 º, com um pico principal em 2θ em torno de 0,75º (110) SBA16 SBA16/P(N-iPAAm) SBA16/Fe 3 O 4 SBA16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) (graus) Figura 29 - Difratogramas das amostras SBA-16, SBA-16/Fe 3 O 4, SBA-16/ P(N-iPAAm) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm). Observa-se um pequeno deslocamento dos sinais das amostras SBA-16/Fe 3 O 4, SBA-16/ P(NiPAAm) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) em 2θ para ângulos maiores, Tabela 3, indicando uma diminuição da distância interplanar, podendo ser atribuído a diminuição do volume dos poros devido a ocupação das nanopartículas magnéticas e do P(N-iPAAm) na estrutura da sílica. Essa diminuição do volume dos poros pode ser confirmada com a técnica de adsorção de nitrogênio em que se observa uma diminuição do volume de gás adsorvido com a presença desses materiais. Além dos planos característicos, é possível obter a distância interplanar d, ou seja, a distância entre os planos cristalográficos. Os valores de espaçamento interplanar (d) podem ser obtidos a partir da equação de Bragg: d = λ/ sen 2 θ (Equação 5) Onde θ é o ângulo de incidência, d é a distância interplanar e λ é o comprimento de onda incidente (comprimento de onda do cobre λ= 1,54 Ǻ). Usando valores da distância interplanar é possível obter o parâmetro de célula unitária que no caso da mesoestrutura cúbica é calculado por:

70 69 a 0 = d (110) x 2 (Equação 6) A Figura 30 apresenta um esquema da estrutura dos materiais mesoporosos cúbicos. A partir dessa ilustração é possível compreender melhor o significado dos parâmetros d (110) e a 0. d (110) a 0 Figura 30 - Representação esquemática da estrutura dos materiais mesoporosos cúbicos. A partir dos valores de diâmetro de poros obtidos dos dados de adsorção de nitrogênio (BET), pode-se ainda calcular a espessura de paredes de poros (h), através da equação (Equação 7), pela diferença do parâmetro de rede (a 0 ) e o diâmetro de poros: h = a 0 D p (Equação 7) Valores relativos ao espaçamento interplanar (d), ao parâmetro de célula unitária (a 0 ) e à espessura da parede de poros (h) são apresentados na Tabela 3. Não foram observadas alterações significativas nos valores da espessura da parede de poros das amostras em relação ao SBA-16, portanto as características fornecidas por se ter uma estrutura de parede de poros espessas, como maior estabilidade térmica e hidrotérmica, permanecem presentes nas amostras híbridas.

71 70 Tabela 3 - Parâmetros estruturais das amostras obtidos a partir do sinal de maior intensidade (110). Amostras 2 θ d 110 (nm) a 110 (nm) h (nm) SBA-16 0,75 11,83 16,73 12,60 SBA-16/Fe 3 O 4 0,76 11,61 16,42 12,79 SBA-16/P(N-iPAAm) 0,76 11,61 16,42 12,79 SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) 0,78 11,32 16,00 12,54 Os resultados obtidos através desta técnica (SAXS) mostram que a incorporação das partículas magnéticas e do P(N-iPAAm) não afeta de forma significativa a ordem estrutural da sílica. Porém ocorrem pequenos deslocamentos dos picos de reflexão para ângulos mais altos, apresentando assim, parâmetros de redes e distâncias interplanares menores. Além disso, uma diminuição na intensidade dos picos é observada ao se comparar as amostras híbridas com a amostra pura, que pode indicar uma possível alteração na densidade eletrônica entre as paredes dos poros e os espaços vazios entre eles Análise Termogravimétrica A Análise Termogravimétrica (TG) foi utilizada para verificar a estabilidade térmica, a temperatura de degradação e estimar a quantidade de P(N-iPAAm) incorporado na matriz de sílica e na matriz de sílica-magnetita. Essa técnica se baseia na perda de massa de uma amostra em função da variação da temperatura, produzindo curvas termogravimétricas. Uma quantidade conhecida da amostra é submetida a um aumento gradual de temperatura em um forno, sob atmosfera controlada, e a perda de massa resultante dos processos decorrentes deste aumento de temperatura é detectada por uma termobalança. As curvas TG do SBA-16, SBA-16/Fe 3 O 4 e dos híbridos SBA-16/P(N-iPAAm) e SBA- 16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) são apresentadas na Figura 31. As perdas de massa dos diferentes materiais foram calculadas no intervalo de temperatura de 25 a 800 C, em atmosfera de N 2. Percebe-se que o SBA-16 apresenta uma perda de massa em torno de 11% no intervalo de temperatura compreendido entre a temperatura ambiente a 150 ºC, atribuída à remoção de água fisicamente adsorvida. A perda de massa do nanocompósito SBA-16/Fe 3 O 4 no intervalo de temperatura de 25 a 150 ºC foi em torno de 7% que também pode ser atribuída à remoção de água fisicamente adsorvida. A porcentagem de perda de água nessa faixa de temperatura foi menor com a amostra que contém a magnetita, pois a mesma inserida na matriz de sílica

72 Perda de massa (%) 71 impede a adsorção da água. Isto ocorre devido à diminuição dos grupos hidroxilas livres presentes na superfície da sílica quando a magnetita é incorporada. Esta proposta está de acordo com o resultado obtido na técnica de adsorção de gases, cujo valor da C BET para a amostra com magnetita foi menor do que a C BET da sílica pura, confirmando assim a diminuição destes grupos hidroxilas. Acima dessa temperatura e até 650 ºC, não se verifica nenhuma perda de massa significativa nesses dois materiais. Portanto, o SBA-16 e o compósito SBA-16/Fe 3 O 4 apresentam excelente estabilidade térmica na faixa de temperatura investigada, uma vez que não sofrem nenhuma decomposição ou degradação estrutural. A Tabela 4 apresenta as perdas de massas dos materiais na faixa de temperatura de 25 a 800 C SBA-16 SBA-16/P(N-iPAAm) SBA-16/Fe 3 O 4 SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) Temperatura ( o C) Figura 31 - Curvas TG para as amostras estudadas. Tabela 4 - Porcentagem de perda de massa em função da temperatura para amostras obtidas. Amostra Perda de Massa (% m/m) Resíduos (% m/m) C C C SBA-16 11,3 2,3 86,4 SBA-16/Fe 3 O 4 6,7 2,6 90,7 SBA-16/P(N-iPAAm) 11,7 23,1 65,2 SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) 5,6 33,0 61,4 Para as amostras híbridas SBA-16/P(N-iPAAm) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm), as perdas de massa ocorreram em duas regiões distintas. A primeira região compreende o intervalo de

73 % Perda de Massa -DTG % Perda de Massa -DTG % Perda de Massa -DTG % Perda de Massa -DTG 72 temperatura ambiente até 150 ºC, com uma perda de massa em torno de 12 a 5%, respectivamente, atribuída à perda de água residual presente na estrutura desses híbridos. A porcentagem de perda de água nessa faixa de temperatura foi menor com a amostra SBA- 16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm), provavelmente devido à inserção da magnetita na matriz de sílica impedindo a adsorção da água. A segunda região de perda de massa ocorreu no intervalo de temperatura entre 150 a 650 ºC, correspondendo a um valor em torno de 23 e 33 para as amostras SBA-16/P(N-iPAAm) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm), respectivamente. Essa perda de massa está relacionada com a completa degradação das cadeias poliméricas. Portanto, os híbridos apresentam estabilidade térmica até 300 ºC, quando se inicia a degradação do gel polimérico. As perdas de massas podem ser melhor visualizadas na Figura 32 a, b, c e d através da análise da derivada da curva termogravimétrica (DTG) SBA SBA-16/Fe 3 O o C 2.3% Temperatura ( o C) (a) Temperatura ( o C) (b) o C 20.6% SBA-16/P(N-iPAAm) o C 27.7% SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) o C 1.6% Temperatura ( o C) (c) Figura 32 - Curva TG e sua derivada (DTG) para SBA-16 (a), SBA-16/Fe 3 O 4 (b), SBA-16/P(N-iPAAm) (c) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) (d) o C 6.9% Temperatura ( o C) (d)

74 73 A curva de DTG (Figura 32 b) mostra uma segunda região de perda de massa para o SBA- 16/Fe 3 O 4, numa temperatura de 431 o C equivalente a 2,3% e que não é visível na curva TG podendo ser atribuída à decomposição de surfactante residual. Observa-se que para as amostras híbridas SBA-16/P(N-iPAAm) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(NiPAAm) (Figura 32 c e d) ocorrem outras duas regiões de perda de massa (224 ºC - 1,6%; 358 ºC - 20,6%) e (181 ºC - 6,9%; 362 ºC - 27,7%) respectivamente. Uma possível explicação para esse comportamento pode ser devido ao fato de que a degradação das cadeias poliméricas não ocorre em uma única etapa, mas sim por meio de etapas sucessivas, devido, provavelmente, à heterogeneidade de reticulação do gel polimérico. Resultado semelhante foi encontrado no trabalho de Sousa (SOUSA, 2009), que também observou uma perda de massa em etapas sucessivas no intervalo de temperatura entre 150 e 650 ºC Análise Elementar A técnica de análise elementar indica a presença dos elementos carbono (C), hidrogênio (H) e nitrogênio (N) nas amostras. A técnica foi utilizada para avaliar a eficiência da formação do P(N-iPAAm) na matriz de sílica e também avaliar o percentual de resíduo dos elementos carbono e hidrogênio presentes no surfactante (F127) utilizado na síntese da sílica. As porcentagens dos elementos carbono (C), hidrogênio (H) e nitrogênio (N) na sílica pura e nas amostras com magnetita e com P(N-iPAAm) são mostradas na Tabela 5. Tabela 5 - Porcentagens dos elementos carbono (C), hidrogênio (H) e nitrogênio (N) contidos nas amostras estudadas. Amostras C% ΔC% H% N% C/N(exp.) C/N(teórico) Magnetita 0,10±0, SBA-16 0,19±0,022-1,55±0, SBA-16/Fe 3 O 4 1,91±0,067-1,22±0, SBA-16/P(N-iPAAm) 17,93±0,109 17,7 4,13±0,383 3,61±0,325 5,79 5,00 SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) 23,08±0,151 21,2 4,63±0,282 5,09±0,323 5,29 5,00 Os dados obtidos indicam um baixo percentual de resíduos do elemento carbono nas amostras SBA-16 e SBA-16/Fe 3 O 4, que podem ser atribuídos à presença de surfactante F127 residual.

75 74 O gel polimérico P(N-iPAAm) apresenta em sua estrutura grupos metil, etil e propil (elementos carbono e hidrogênio) e grupo amida (elemento nitrogênio) (Figura 33). Figura 33 - Representação da estrutura do mero do P(N-iPAAm). Conforme Tabela 5, observa-se que as amostras contendo o P(N-iPAAm) apresentaram um percentual dos elementos carbono, hidrogênio e nitrogênio bem maior do que as amostras SBA-16 e SBA-16/Fe 3 O 4. Considerando a razão molar entre os elementos carbono e nitrogênio do mero do P(N-iPAAm) de aproximadamente 5, os resultados desta razão para os sistemas híbridos indicam que houve a formação do P(N-iPAAm) nas matrizes de sílica e magnetita, pois os valores encontrados são muito próximos Espectroscopia na Região do Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) A técnica de espectroscopia na região do infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) foi empregada para caracterizar a estrutura química do SBA-16, SBA-16/Fe 3 O 4 e dos híbridos SBA-16/P(N-iPAAm) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm). A análise por infravermelho de materiais de sílica tem sido reportada por diversos autores, que foram usados como referências nesta discussão (SOUSA, 2009; SOUZA, 2011). Os espectros obtidos para as amostras são apresentados nas Figuras 34 e 35, enquanto que, as atribuições dos números de onda observados nesses espectros, são resumidas na Tabela 6.

76 Transmitância, u. a. Transmitância, u. a. 75 A Figura 34 mostra os espectros de infravermelho das amostras magnéticas SBA-16/Fe 3 O 4, SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) em comparação com SBA-16 e a magnetita. SBA-16/Fe 3 O 4 SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) SBA-16 SBA-16 Magnetita O-H ( ) H 2 O (1640) Si-O-Si ( ) Si-O (806) Si-OH (960) Si-O-Si (460) Magnetita O-H ( ) H 2 O (1640) Si-O-Si ( ) Si-O (806) Si-OH (960) Si-O-Si (460) Fe-O ( ) Número de onda (cm -1 ) Número de onda (cm -1 ) Fe-O ( ) (a) (b) Figura 34 - Comparação dos espectros de infravermelho de SBA-16/Fe 3 O 4 (a) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) (b). Ambas as amostras SBA-16/Fe 3 O 4, SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) apresentam bandas características de absorção referentes às vibrações fundamentais da rede de sílica, em torno de 460, 806, 960, , cm -1. Entre 1080 e 1300 cm -1 estão presentes bandas de vibração características da sílica. A banda em 960 cm -1 é atribuída ao estiramento da ligação Si-OH. A banda em torno de 806 cm -1 é relativa ao estiramento simétrico da ligação Si-O-Si e a banda em torno de 460 cm -1 está relacionada ao modo de vibração de deformação Si-O-Si. A banda larga na região de cm -1 relaciona-se aos modos de estiramento da ligação O-H da água ou do grupo silanol (Si-OH). Uma característica relevante desses materiais é a presença de uma grande quantidade de grupos silanóis livres (Si-OH), nas paredes dos poros. A presença de uma banda próxima a 960 cm -1 pode indicar o teor da população de grupos silanóis na superfície da sílica. A Figura 34 revela que a banda em 960 cm -1 exibe diminuição de intensidade para amostras SBA- 16/Fe 3 O 4 e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) quando comparados com a intensidade do SBA-16.

77 Transmitância, u. a. CH 3 (isopropil) ( ) Transmitância, u. a. CH 3 (isopropil) ( ) 76 Isso indica um consumo dos grupos silanóis da superfície da sílica devido à ligação formada com a magnetita após sua incorporação. O espectro da magnetita apresenta uma banda bem definida em torno de 600 cm -1 atribuída a vibrações de estiramento Fe-O (ARRUEBO et al., 2006). Essa banda é também verificada no espectro das amostras SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm), embora com uma menor magnitude. Esses dados indicam que interações Fe-Si ocorreram nestas amostras. A Figura 35 mostra os espectros das amostras SBA-16, SBA-16/P(N-iPAAm), SBA- 16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) em comparação ao gel polimérico P(N-iPAAm). É possível observar a presença de bandas de absorção características das vibrações da rede de sílica, bem como bandas de absorção referentes às vibrações do material polimérico, indicando a incorporação do gel polimérico P(N-iPAAm) na estrutura da sílica. P(N-iPAAm) P(N-iPAAm) C-H(CH 2,CH 3 ) ( ) SBA-16/P(N-iPAAm) SBA-16 C-H (CH 2, CH 3 ) C-H(CH (1456) 2,CH 3 ) ( ) N-H (1550) O-H ( ) Si-O (806) Si-OH (960) (460) ( ) Si-O-Si Número de onda (cm -1 ) O-H ( ) SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) SBA-16 N-H (1550) ( ) Número de onda (cm -1 ) C-H (CH 2, CH 3 ) (1456) Si-O (806) Si-OH (960) (460) Si-O-Si (a) Figura 35 - Comparação dos espectros de infravermelho de SBA-16/P(N-iPAAm) (a) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) (b). (b) O gel P(N-iPAAm) apresenta bandas de estiramento de N-H de amidas secundárias na região de cm -1 ; bandas de absorção na região de cm -1, referentes aos modos de vibração de estiramento C-H de grupos CH 3 e CH 2 ; bandas relacionadas à deformação angular no plano do grupo N-H, em torno de 1550 cm -1 ; bandas correspondentes às vibrações de deformação C-H de CH 2 e CH 3 em 1456 cm -1 ; bandas características de deformação no plano de isopropilas no intervalo de frequências de cm -1 (SOUSA, 2009).

78 77 No espectro do gel observa-se uma banda larga na região entre cm -1, característica de vibrações de estiramento da ligação O-H devido a sua maior afinidade pela água quando comparado ao monômero. Pelo espectro de FTIR dos híbridos SBA-16/P(N-iPAAm) e SBA- 16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) é possível observar a presença de bandas de absorção na região características das vibrações da rede de sílica (regiões entre cm -1, cm - 1 ), bem como bandas de absorção referentes às vibrações do material polimérico (aproximadamente nas regiões cm -1 e cm -1 ), indicando a incorporação de P(N-iPAAm) na estrutura da sílica. É importante destacar que grande parte dos modos vibracionais do P(N-iPAAm) presentes no híbrido não podem ser completamente visualizados, uma vez que a rede de sílica apresenta bandas relativamente intensas e largas nos intervalos de números de onda onde existem vibrações relativas ao gel polimérico. De forma semelhante, a presença de água no híbrido, devido ao grande caráter hidrofílico do gel e à elevada área superficial da sílica, dificulta essa visualização. Tabela 6 - Identificação espectrofotométrica de alguns grupos funcionais. Números de onda (cm -1 ) , , Atribuição estiramento de diversos grupos hidroxil, estiramento N-H (amida II) estiramenro simétrico C-H(CH 3 ); estiramento simétrico C-H(CH 2 ) modo de vibração de deformação H-O-H modo de vibração de deformação NH (amida II) modo de vibração de deformação CH 3 modo de vibração de deformação CH2=C- estiramento assimétrico das ligações Si-O-Si do SiO 4 estiramento Si-O do grupo silanol estiramento simétrico da ligação Si-O estiramento Fe-O modo de vibração de deformação Si-O-Si Como foi mostrado na Figura 35 b, o espectro do sistema multifuncional SBA-16/Fe 3 O 4 /P(NiPAAm) apresenta bandas de absorção nas regiões características das vibrações da rede de sílica (regiões entre cm -1 e cm -1 ), bem como bandas de absorção referentes às vibrações do material polimérico (aproximadamente nas regiões cm -1 e cm -1 ), indicando a incorporação de P(N-iPAAm) na estrutura da sílica. Além

79 Intensidade, u. a. 78 dessas bandas, pode-se observar uma banda de vibração característica de ligação Fe-O em torno de cm -1 indicando a incorporação da magnetita Difração de Raios X (DRX) Todas as amostras sintetizadas foram analisadas através da difração de raios X (DRX), onde se buscou obter informações a respeito da composição química dessas amostras e de sua cristalinidade. A Figura 36 mostra os difratogramas de raios X das amostras SBA-16 e SBA- 16/P(N-iPAAm). Estas amostras apresentam um pico largo e de baixa intensidade característica de uma fase amorfa centrada em 2θ = 25 referente à sílica mesoporosa. SBA-16/P(N-iPAAm) SBA (graus) Figura 36 - Difratogramas da sílica e do SBA-16/P(N-iPAAm). A Figura 37 mostra os difratogramas de raios X das amostras de magnetita, SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm). Os picos foram identificados seguindo o arquivo do JCPDS nº referente à magnetita estequiométrica (Fe 3 O 4 ). Os planos de reflexão da magnetita previamente sintetizada com os respectivos índices de Miller foram comparados com a da magnetita presente no nanocompósito e no híbrido. Ambas as amostras apresentaram picos de difração da magnetita pura em (220), (311), (222), (400), (422), (511) e (440), o que confirma

80 Intensidade, u. a. 79 a formação da estrutura cristalina destas nanopartículas na estrutura da sílica e na estrutura da sílica-p(n-ipaam). Além dos picos bem definidos característicos da magnetita em ambas as amostras, pode-se observar uma fase amorfa centrada em 2θ = 25 referente à sílica mesoporosa amorfa, indicando que a estrutura não é alterada após a impregnação com o óxido magnético. (311) SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) SBA-16/Fe 3 O 4 Magnetita (220) (400) (222) (422) (511) (440) (graus) Figura 37 - Comparação entre os difratogramas das amostras SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) com a magnetita Espectroscopia Mössbauer Com o intuito de determinar as fases contendo Fe presentes nas amostras SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) e complementar os dados obtidos pela técnica de difração de raios X, foram feitas medidas de espectroscopia Mössbauer a temperatura ambiente. Os espectros Mössbauer e respectivos parâmetros hiperfinos obtidos à temperatura ambiente são mostrados na Figura 38 e na Tabela 7. Os desvios isoméricos se referem sempre ao Fe metálico, à temperatura ambiente. Nos espectros Mössbauer, os pontos indicam os dados experimentais, a linha contínua, o ajuste e as linhas coloridas se referem aos subespectros associados às fases e/ou sítios cristalinos presentes nos materiais.

81 Transmissão Relativa 80 O espectro Mössbauer para a magnetita (Figura 38 a) inicialmente foi ajustado com parâmetros hiperfinos para dois sextetos característicos (deslocamento isomérico δ 0,63 mm/s, deslocamento quadrupolar ε 0,00 mm/s; campo hiperfino Bhf 45,8 T e δ 0,27 mm s -1 ; ε -0,01 mm/s; Bhf 49,1 T), com razão de área sítio A/sítio B (A)/[B] de aproximadamente 0,5 condizentes com os valores encontrados na literatura para a magnetita estequiométrica (DAOU et al., 2006). (a) (b) (c) Fe 3 O 4 - Sítio Tetraédrico Fe 3 O 4 - Sítio Octaédrico Velocidade (mm/s) Figura 38 - Espectros Mössbauer do 57 Fe a temperatura ambiente para (a) magnetita, (b) SBA-16/Fe 3 O 4 e (c) SBA-16/Fe 3 O 4 /P(Ni-PAAm). Os espectros à temperatura ambiente das amostras SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(NiPAAm) foram ajustados com um conjunto de dois sextetos e um dubleto (Figura 38 b e c). Observando estes espectros e seus respectivos parâmetros hiperfinos (Tabela 7), pode-se notar que nenhuma outra fase contendo ferro foi detectada nestas amostras, corroborando os resultados obtidos pela técnica de DRX (FELLENZ et al., 2011)

82 81 A presença do dubleto nos espectros das amostras SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(NiPAAm) cujas frações espectrais de dois sítios de Fe foram de 18(+/-1)% e 15%(+/-1), respectivamente, sugere que ocorreu uma interação de uma fração pequena do ferro com os grupos silanóis presentes na superfície da sílica. Tabela 7 - Parâmetros hiperfinos dos espectros Mössbauer a temperatura ambiente para a magnetita, SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm). Amostra Sítio δ mm/s ε (mm/s) B hf (T) mm/s Área (%) (A)/[B] (±0.02) (±0.02) (±0.2) (±0.04) (±1) Fe 3 O 4 (A) * 0,27-0,01 49,1 0,35 33,3 0,5 [B] * 0,63 0,00 45,8 0,65 66,7 SBA-16/Fe 3 O 4 (A) 0,27-0,02 48,7 0, ,5 [B] D 0,67 0,37 0,06 0,77 45,2-0,46 0, SBA-16/ Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) (A) 0,27 0,001 48,7 0, ,5 [B] 0,65 0,03 45,6 0,52 56 D 0,37 0,78-0, * (A) e [B] são sítios tetraédricos e octaédricos de Fe 3 O 4 ;, ε e B HF são deslocamento isomérico, desdobramento quadrupolar e campo magnético hiperfino, respectivamente, e Área é a fração espectral de dois sítios de Fe. D = dubleto correspondente a interação superficial magnetita-silica. A razão das áreas dos sítios A e B obtidos para as amostras SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA- 16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) está em concordância com os valores encontrados para a magnetita estequiométrica sintetizada, ou seja, não houve desvio estequiométrico com a incorporação da magnetita na matriz de sílica-gel polimérico Medidas Magnéticas Foram realizadas medidas de magnetização à temperatura ambiente através da análise por VSM (magnetômetro de amostra vibrante). As amostras apresentam curvas de magnetização características de materiais ferrimagnéticos. A magnetização de saturação (M s ), a coercividade (H c ) e magnetização remanente (M R ) da magnetita pura e do nanocompósito, foram obtidas através de curvas de magnetização inicial e das curvas de histerese. A partir da magnetização inicial (Figura 39), foi possível obter dados da magnetização de saturação, que foi de 90,4 emu/g para a magnetita sintetizada. Este valor está próximo do valor teórico para a

83 M (emu/g) M (emu/g) 82 magnetita bulk (HAN, et al; 1994), o que indica alta pureza da magnetita sintetizada (250 nm) se comparado com as magnetitas sintetizadas (150 nm) por GOYA, et al; 2003 que obteve 75,6 emu/g, e com as as magnetitas sintetizadas (20 nm) por LEE, et al; 2012 que obteve 58,0 emu/g H (Oe) Magnetita H (Oe) Figura 39 - Curvas de histerese obtidas à temperatura ambiente para a magnetita pura. A Tabela 8 mostra os parâmetros de magnetização para as amostras com e sem correção de massa por grama de magnetita. A magnetização de saturação com correção de massa nas amostras SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) foi de 69,2 emu/g e 66,1 emu/g respectivamente, e sem correção de massa M s foi de 17,1 emu/g e 14,0 emu/g respectivamente. Estes valores foram menores em comparação com M s da magnetita pura. Essa redução pode estar associada à perda de massa magnética, além dos efeitos de superfície, tais como desordem, variação estequiométrica, distribuição de cátion, fatores estes que também influenciam nos valores de coercividade e remanência. A partir das curvas de histerese medidas a temperatura ambiente, (Figura 40), obteve-se os parâmetros M s, H c e M R. No estudo apresentado por Zhao (ZHAO et al, 2011), foi desenvolvido um método de síntese de nanopartículas de SBA-16/magnetita variando proporção de Fe e TEOS. Foram obtidos resultados de magnetização de saturação no intervalo de 1,1 a 5,7 emu/g, valores estes menores do que foi obtido no presente trabalho.

84 M (emu/g) M (emu/g) M (emu/g) M (emu/g) 83 Tabela 8 - Parâmetros de magnetização com e sem correção de massa por grama de magnetita. Amostras H c (Oe) M r (emu/g) M s (CCM) (emu/g) M s (SCM) (emu/g) Magnetita ,8 90,4 - SBA-16/Fe 3 O ,8 69,2 17,1 SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) 124 8,9 66,1 14,0 CCM = com correção de massa por grama de magnetita; SCM = sem correção de massa por grama de magnetita (grama massa total da amostra) H (Oe) Magnetita SBA-16/Fe 3 O 4 SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) H (Oe) (a) Magnetita SBA-16/Fe 3 O 4 SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) Figura 40 - Curvas de histerese obtidas à temperatura ambiente sem (a) e com (b) correção de massa por grama de magnetita presente nas amostras SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(NiPAAm) Magnetita -40 SBA-16/Fe 3 O 4 SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) H (Oe) (b) H (Oe) Magnetita SBA-16/Fe 3 O 4 SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) As alterações nos parâmetros M S, Hc e M R observadas nas amostras SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA- 16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) em relação à magnetita pura é uma indicação de que está ocorrendo recobrimento da sílica nas nanopartículas de magnetita Espectroscopia de Fotoelétrons Excitados por Raios X (XPS) A análise da superfície dos materiais obtidos foi feita empregando-se a espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios X (XPS). Os elementos presentes na superfície dos materiais foram caracterizados qualitativamente por meio da determinação das energias de ligação dos (b) SBA-16

85 Intensidade 84 picos fotoelétricos do espectro amplo. O espectro XPS amplo da amostra SBA-16/Fe 3 O 4 é mostrado na Figura O (1s) SBA-16/Fe 3 O Fe (2p) 2000 C (1s) Si (2p) Energia de Ligação (ev) Figura 41 - Espectro de XPS para a amostra SBA-16/Fe 3 O 4. Os resultados apontaram a presença de Si, O, e C, um contaminante comumente encontrado. Foi observado o pico 2p do Fe que corresponde a uma área relativa de 0,976%; este valor é considerado insignificante já que o fator de sensibilidade do Fe (RSF = 10,8) é 13 vezes maior do que o do Si (RSF = 0,81). Portanto, este resultado demonstra que o Fe não está na superfície, o que indica um possível recobrimento do mesmo pela matriz de sílica. A Figura 42 mostra o espectro de XPS para a amostra SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm). Observase o pico 2p do Fe que corresponde a uma área relativa de 0,360%; de forma semelhante ao comportamento apresentado pela amostra SBA-16/Fe 3 O 4, este valor é considerado insignificante. Neste caso, também o Fe pode estar sendo recoberto pela sílica. Além dos picos de Si, O, e C, observa-se o pico de nitrogênio (N 1s) cuja área relativa é de 5,916%. Este resultado demonstra que uma pequena parcela do P(N-iPAAm) está presente na superfície da sílica.

86 Intensidade O (1s) SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) C (1s) 2000 Fe (2p) 1500 N (1s) 1000 Si (2p) Energia de Ligação (ev) Figura 42 - Espectro de XPS para a amostra SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm). A partir da integração dos sinais fotoelétricos as porcentagens atômicas relativas de cada elemento foram calculadas e estão apresentadas na Tabela 9. Tabela 9 - Resultados de XPS. Amostra Sinal EL(eV) % atômica Si 2p 103,6 28,63 SBA-16/Fe 3 O 4 C 1s 284,6 23,8 O 1s 533,3 46,6 Fe 2p 710,6 0,97 Si 2p 103,6 13,8 C 1s 284,6 51,74 SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) O 1s 533,3 28,2 Fe 2p 710,6 0,36 N 1s 401,6 5,9 EL = Energia de ligação, % atm = Concentração dos elementos em porcentagem atômica relativa. Após um ciclo de sputtering de 16 minutos (Figura 43 a), nota-se um aumento da % atômica do Fe 2p (2,09) (Figura 43 b). Neste caso é possível inferir que o óxido de ferro está recoberto por uma camada de óxido de silício que foi retirada após o processo de erosão causado pela incidência dos íons de argônio.

87 Intensidade Intensidade O (1s) SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) Fe (2p) Fe (2p) C (1s) N (1s) Si (2p) Energia de Ligação (ev) 900 Fe (2p) após sputtering Fe (2p) antes sputtering Energia de Ligação (ev) (a) Figura 43 - Espectro de XPS para a amostra SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) após sputtering (a) e (b) pico Fe 2p em alta resolução antes e após sputtering. (b) 5.12 Bioaplicações Medidas de Hipertermia Magnética Foram realizadas medidas de aquecimento por indução magnética visando verificar o potencial de aplicação em hipertermia magnética para as amostras SBA-16/Fe 3 O 4 e SBA- 16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm). A Figura 44 mostra as imagens das nanopartículas dispersas em água e atraídas com um imã. (a) Figura 44 - Imagens das amostras SBA-16/Fe 3 O 4 (a) e SBA-16/Fe 3 O 4 /P(N-iPAAm) (b). (b)