ANÁLISE LABORATORIAL PRESUNTIVA DE Malassezia spp. EM AMOSTRAS DE ESCAMAS DO COURO CABELUDO OBTIDAS DE PACIENTES DE UMA CLÍNICA DE ESTÉTICA

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1 4 ANÁLISE LABORATORIAL PRESUNTIVA DE Malassezia spp. EM AMOSTRAS DE ESCAMAS DO COURO CABELUDO OBTIDAS DE PACIENTES DE UMA CLÍNICA DE ESTÉTICA LABORATORY ANALYSIS OF HAM Malassezia spp. FLAKES IN SAMPLE OBTAINED FROM THE SCALP IN AN ASSISTED PATIENTS IN CLINICAL A ESTHETICS ESPÍNDOLA, Rita de Cássia 1 ; ESTOPA, Maisa Correa 2, MELO, Adriana Mestriner Felipe de 3,FRACALOSSI, Priscila Riguetti 4. Resumo A dermatite seborreica caracteriza-se por lesões eritematosas e descamativas acompanhadas ou não de prurido, sendo associada frequentemente à colonização de Malassezia furfur. Esse fungo pode ser membro da biota normal da pele e do folículo piloso nas regiões com maior número de glândulas sebáceas. A manifestação clínica é determinada sob condições que permitem a pseudo filamentação e sua proliferação pode ser maior dependendo do estado nutricional, presença de outras infecções crônicas, sudorese excessiva, temperatura elevada e fatores emocionais. Nos últimos anos, o gênero Malassezia spp. Tem sido apontado na etiologia da dermatite seborreica, fator favorecido pela ação de suas enzimas capazes de lesar a membrana celular. O objetivo do presente trabalho foi analisar presuntivamente Malassezia spp. em amostras de escamas do couro cabeludo obtidas de pacientes de uma Clínica de Estética do Centro Universitário da Grande Dourados. A pesquisa passou por análise e aprovação do Comitê de Ética (CEP-UNIGRAN). Realizou-se a coleta de placas escamativas do couro cabeludo em placas de petri estéreis e em paralelo realizou-se também a coleta pela técnica de fita adesiva. Após cultivo em meio de cultura enriquecido com lipídio, as colônias foram submetidas ao teste da catalase e diferenciação em meio acrescido com Twenn 80 para diferenciação das espécies. Das amostras analisadas, 15 amostras foram positivas para M. furfur, sendo 5 positivas para M. pachydermatis e 5 positivas para M. symbodialis. Conclui-se presuntivamente que o agente etiológico causador de dermatite seborreica mais frequente em pacientes atendidos em uma Clínica de Estética foi de M. furfur. Palavras-chave: dermatite seborreica, Malassezia furfur, levedura. Abstract Seborrheic dermatitis is characterized by erythematous and scaly lesions with or without pruritus, and is frequently associated with colonization of Malassezia furfur. This fungus may be a member of the natural inhabitant of the skin and of the hair follicle in the regions with the highest number of sebaceous glands. The clinical manifestation is determined under conditions that allow false filamentation and its proliferation may be greater depending on the nutritional status, presence of other chronic infections, excessive sweating, high temperature and emotional factors. In recent years, the genus Malassezia spp. it has been pointed out in the etiology of seborrheic dermatitis, a factor favored by the action of its enzymes capable of damaging the cell membrane. The objective of the present study was to analyze Malassezia spp. in samples of scalp scales obtained from patients of an Esthetics Clinic of the University Center of Grande Dourados. The research was analyzed and approved by the Ethics Committee (CEP-UNIGRAN). Scaly plaques were collected from the scalp in sterile petri dishes and in parallel the collection of adhesive tape was also performed. After cultivation in lipid-enriched culture media, the colonies were submitted to the catalase test and differentiated in medium supplemented with Twenn 80 for species differentiation. Of the samples analyzed, 15 samples were positive for M. furfur, 5 positive for M. pachydermatis and 5 positive for M. symbodialis. It is presumably concluded that the etiologic agent that causes seborrheic dermatitis more frequent in patients treated at an esthetic clinic was of M. furfur. Keywords: seborrheic dermatitis, Malassezia furfur, yeast. 1 ¹Especialista em Metodologia do Ensino Superior. rita.unigran@yahoo.com.br 2 Mestre em Ciências da Saúde pela Universidade Federal da Grande Dourados. 3 Doutora em Ciências da Saúde pela Universidade de Brasília. 4 Mestre em Recursos Naturais pela Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul.

2 5 Introdução As leveduras do gênero Malassezia constituem parte da microbiota de humanos sadios, podendo ser isoladas de áreas ricas em glândulas sebáceas, particularmente couro cabeludo, região toráxica e facial, podendo estar associadas às doenças cutâneas incluindo a dermatite atópica, pitiríase versicolor e dermatite seborreica (PRADO et al., 2007). Fatores hereditários, hormonais, infecções, influência neurogênica (epilepsia, siringomielia, parkinson), calor, umidade e alterações das glândulas sebáceas podem influenciar na patogênese da dermatite seborreica. Fatores emocionais são desencadeadores e/ou potencializadores mais frequentes no aparecimento da dermatite seborreica, ressaltando que a umidade e o suor pioram o quadro clínico na maior parte das pessoas que possuem esta dermatose (OLIVEIRA et al., 2002; RASTINE, 2007). O gênero Malassezia compreende fungos leveduriformes lipofílicos e lipodependentes. Além das espécies M. furfur, M. pachydermatis e M. simpodyalis, existem outras espécies que, recentemente, sofreram mudanças em sua classificação taxonômica, com a introdução de novas espécies como M. globosa, M. obtusa, M. slooffiae e M. restricta. Praticamente todas as espécies já foram isoladas em dermatites (SIDRIM, ROCHA, 2004; ALMEIDA, 2008; RENDIC et al., 2003). Na observação das manifestações clínicas do sistema tegumentar através de lesões cutâneas não é possível distinguir a espécie envolvida. O isolamento das espécies Malassezia, é possível a partir da coleta, cultivo em meio lipídico e identificação laboratorial (CAMPANHA et al., 2007; LACAZ, 2002). Existem relatos de que com o aumento de indivíduos imunocompometidos pela infecção pelo vírus HIV, sua ocorrência tem aumentado nesse grupo (SAMPAIO et al., 2011). O isolamento das espécies de Malassezia em raspados de pele foi de 63,7% de 201 pacientes analisados numa pesquisa, sendo que 87 apresentavam pitiríase versicolor, 68 dermatite seborreica associada a positividade para HIV e 46 com dermatite seborreica. Malassezia furfur foi a espécie predominante (30,8%) (GANDRA, 2004). Em outro estudo M. furfur foi predominante em lesões no tronco (34,7%) e dorso (pitiríase versicolor) (32,6%) (MIRANDA, 2006). No estudo retrospectivo do Laboratório de Micologia do HUB no Distrito Federal, sobre aspectos clínicos, laboratoriais e epidemiológicos de doenças de pele associadas com as espécies Malassezia, numa amostra de 4145 casos, 125 eram suspeitos e 75 positivos pela lâmpada de Wood. Em 60% dos exames suspeitos foram positivos para M. globosa (25,3%), M. furfur (13,3%) e M. pachydermatis (2,7%). As espécies isoladas estiveram relacionadas com a pitiríase versicolor (81,4%), foliculite (13,3%) e a dermatite seborreica (5,3%) (PILOTTO et al., 2005). Acredita-se que Malassezia sp., presente na pele de indivíduos suscetíveis, leve a uma irritação não imunogênica a partir da produção de metabólitos à base de ácidos graxos insaturados deixados na superfície cutânea. A dermatite seborreica é uma doença eritêmato descamativa de caráter crônico recidivante que acomete entre 1 e 3% da população geral dos Estados Unidos. Possui dois picos de incidência - o primeiro, durante os três primeiros meses de vida, e o segundo, a partir da puberdade, atingindo seu ápice entre os 40 e 60 anos de idade (PILOTTO et al., 2005). Sabendo-se da importância dessa infecção, o presente estudo teve como objetivo identificar a prevalência de Malassezia furfur como colonizante fúngico através de exame micológico de pessoas com suspeita de dermatite seborreica capilar atendidas na clínica de estética do Centro Universitário de Dourados (UNIGRAN)- Dourados/MS. Materiais e métodos

3 6 A pesquisa foi realizada no período de maio\10 a setembro\11 em indivíduos que procuraram voluntariamente a Clínica de Estética do Centro Universitário da Grande Dourados (UNIGRAN)- Dourados/MS com queixa de dermatite seborreica. A pesquisa foi submetida primeiramente a análise e aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa envolvendo seres humanos da Unigran conforme Resol. 466\12 (BRASIL, 2013). Após consentimento do paciente empregou-se um questionário contendo informações sobre a identificação, idade, gênero, queixa principal, história clínica atual e pregressa, características clínicas, tratamento, adesão, método de controle e evolução do caso. A coleta das escamas de pelo do couro cabeludo foi realizada com auxílio de uma cureta estéril acondicionadas em uma lâmina de microscopia (Figura 1), outra parte das amostras foram cultivadas em placas (60mm) contendo Agar Sabouraud (20mL) (Merck ) acrescido em um 0,1 % de óleo de oliva (OLIVEIRA et al., 2002) e outro com acréscimo de solução de polissorbato 80 (tween 80 ) a 0,1 % (FREITAS, 2006). Realizou-se também a coleta de amostras do couro cabeludo por meio da técnica de Jarbas Porto onde é empregado uma fita adesiva diretamente em contato com as escamas de pele (LACAZ, 2002). As lâminas contendo raspados de pele foram processadas de duas formas distintas: uma lâmina de microscopia recebeu o acréscimo do corante lactofenol azul de algodão e após colocação da lamínula foi vedada com Bálsamo do Canadá (Figura 1b). (a) (b) (c) Figura 1- (a) Coleta de cultura com cureta dermatológica para placa de Petri; (b) Imersão da escama em lâmina microscópica com corante de lactofenol-azul de algodão; (c) teste de catalase As fitas adesivas foram colocadas em outra lâmina já contendo o corante lactofenol azul de algodão de acordo com o método de Padilha-Gonçalves (1998) e a outra fita foi acondicionada em lâmina de vidro contendo a solução de KOH 10-20% para clarificação (MINAMI, 2003). Todas as lâminas foram levadas ao microscópio óptico em aumento de 40x para visualização de estruturas fúngicas em campo que houvesse até cinco células por campo (+); presença de seis a dez células por campo (++) ou quando visualizado mais de dez células por campo (+++) 17. Após crescimento das colônias realizou-se a avaliação da característica bioquímica pelo teste de produção de catalase (Figura 1c) adicionando-se uma gota de peróxido de hidrogênio 3% em uma alçada de colônia. O resultado é positivo quando ocorre o surgimento de bolhas de ar (SILVA DA ROSA et al., 2006). Resultados e discussão

4 7 De 51 pacientes participantes da pesquisa com suspeita de dermatite seborreica houve isolamento do fungo Malassezia furfur em 39 deles (73%), confirmando o que preconiza a literatura (SIDRIM; ROCHA, 2004). Desde a década de 80 já havia relatos desse envolvimento de Malassezia spp em lesões envolvendo caspa, dermatite seborreica e sebopsiríase (faergeman, 1983). De acordo com Guillit (1996) dependendo da espécie de Malazessia variações podem ocorrer no crescimento frente ao acréscimo de Twenn 80 ao meio de cultura. As leveduras M. furfur, M sympodialise e M. slooffiae utilizam concentrações diferentes de Tween e M. globosa e M. obtusa que utilizam a mesma concentração de Tween podem ser diferenciadas pela morfologia de suas células: células esféricas M. globosa; e células cilíndricas M. obtusa. Outra característica que pode ser utilizada para diferenciação das espécies é quando a dependência de fatores lipídicos para crescimento in vitro. Entre as seis espécies lipodependentes de Malassezia apenas a M. restricta não apresenta catalase positiva. Quanto ao crescimento, observou-se maior crescimento no meio com acréscimo de 0,1% de Tween 80 (Tabela 1) confirmando a suspeita por Malassezia furfur. Para Freitas (2006) quando ocorre menor assimilação do Tween 20 e alta do Tween 40, 60 e 80 existe o predomínio de M. sympodialis; assimilação do Tween 20, 40, 60 e 80 predomina M. furfur; pequena assimilação do Tween 80 e alta do Tween 20, 40 e 60 é M. slooffiae. Quando Tween 20 é assimilado regularmente, ainda 20, 40 e 60 pouca e ausência de assimilação do Tween 80 deve-se realizar um exame direto para ser feita a distinção. Nos achados laboratoriais de 102 pacientes que foram estudados no Instituto Adolfo Lutz, a espécie de Malassezia furfur mostrou ser catalase positiva (+) com fraca reação de β-glicosidade (Esculina) (FRAMIL et al., 2010). (a) (b) Figura 2 - (a) Cultura em meio enriquecido; (b) observação microscópica de células ovoides com lactofenol azul de algodão Ao exame microscópico direto das culturas dos pacientes da clínica de estética, foram encontradas células leveduriformes, com tamanhos e formas variadas (Figura 2) com brotamento unipolar caracterizando as três espécies M. pachydermatis, M. furfur e M. symbodialis identificadas em microscopia óptica (SIDRIM; ROCHA, 2004). Malassez, em 1874, observou em microscopia a presença de fungos constituídos por células ovoides, sugerindo

5 8 sua participação na patogenia da caspa que Sabouraud, em 1904, denominou Pityrosporun malassezzi que, mais tarde em 1913, Castellani e Chambers passaram a denominar Pityrosporun ovale (células ovoides) e em 1951 Gordon cultivou microorganismos de formato arredondado de pacientes com pitiríase versicolor e denominou Pityrosporun orbiculare (DO PRADO et al., 2007). Essa nomenclatura tem sofrido alterações (SCHLOTTFELDT et al., 2002). Dos 51 participantes, 6 (11%) eram homens e 45 (88%) mulheres, adultos jovens (18 a 27 e de 27 a 36 anos). A dermatite seborreica tem ocorrido na população mundial, três faixas etárias distintas (2-12 semanas de idade), indivíduos de meia-idade (30-50 anos) e idosos (BRASIL, 2011). A intensidade da dermatite foi quantificada de acordo com as queixas e avaliação clínica do esteticista. Das 45 mulheres pesquisadas, o prurido foi mais frequente (coceira) (60%) que o eritema (vermelhidão) (35,5%). Já nos homens as manifestações foram inversas, sendo maior o eritema, confirmando os dados de Rastine (2007). Dentre os sintomas da dermatite seborreica, especificamente na caspa, a descamação pode variar de moderada à severa (BERTI et al., 2007). Nesta pesquisa, a descamação mostrou-se leve em 16 pessoas (31%), moderada em 27 (53%) e severa apenas em 8 indivíduos (16%). Nos casos moderados a severa o tratamento é importante para amenizar e controlar o distúrbio, seja ele terapêutico isolado ou combinado com compostos ceratolíticos e\ou agentes citostáticos (reduzem as mitoses) (FORMARIZ et al., 2005). Para Maraschin et al. (2008) as leveduras do gênero Malassezia podem ser habitantes da microbiota normal, entretanto, hábitos incorretos podem ajudar a transformá-la em patógeno. Dentre os agentes utilizados para controle do crescimento fúngico no couro cabeludo estão o xampu, loções ou sabonetes à base de sulfeto de selênio e piritionato de zinco (BERTI et al., 2007). Conclusão Malassezia furfur foi a espécie mais prevalente nos pacientes com suspeita de dermatite seborreica capilar que procuraram atendimento na clínica de estética da UNIGRAN-Dourados/MS no período de maio de 2010 a outubro Referências bibliográficas ALMEIDA,S.R. de. Micologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, BERTI, J., RODRIGUES, J., LODO, C., & LEONARDI, G. R. Substâncias ativas utilizadas em produtos anticaspa. Infarma - Ciências Farmacêuticas, v, 19, n. 9\10, p , BRASIL. AGÊNCIA NACIONAL DA VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde. Edição Comemorativa para o IX Congresso Brasileiro de Controle de Infecção e Epidemiologia Hospitalar.Salvador, Disponível em< lmicrobiologiacompleto.pdf>acesso em 25 de setembro de BRASIL. Conselho Nacional de Saúde. Resolução n 466, de 12 de dezembro de Aprova normas regulamentadoras de pesquisas envolvendo seres humanos. Brasília: Diário Oficial da União, CAMPANHA, Á. M., TASCA, R. S., & SVIDZINSKI, T. I. Dermatomicoses: freqüência, diagnóstico laboratorial e adesão de pacientes ao tratamento em um sistema público de saúde, Maringá-PR, Brasil. Lat Am J Pharm, v. 26, p , DE MELLO MARASCHIN, M., SPADER, T., MARIO, D. A. N., ROSSATO, L. & LOPES, P. G. M. Infecções causadas por Malassezia: novas abordagens. Saúde. V. 34, n. 1-2, p. 4 8, DO PRADO, M. R., BRILHANTE, R. S. N., SIDRIM, J. J. C., & ROCHA, M. F. G. Malassezia spp. em humanos e pequenos animais: uma abordagem teórica Malassezia spp. in humans and small animals: a theoretical approach. Revista Portuguesa de ciência Veterinária. V. 102, p , 2007.

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7 10 Tabela 1 - Resultados das análises laboratoriais das amostras coletadas de pacientes (51) com suspeita de dermatite seborreica Pacientes Sexo Espécie catalase Agar Sabauroud + 0,1% de Tween 80 Agar Sabauroud + 0,1% de óleo de oliva 1 F M. furfur + + +/- 2 F M. furfur + + +/- 3 F M. furfur + + +/- 4 F M. furfur + + +/- 5 F M. furfur + + +/- 6 F M. furfur + + +/- 7 F M. furfur + + +/- 8 F M. furfur +/- +/- +/- 9 F M. furfur + + +/- 10 F M. furfur + + +/- 11 F M. furfur + + +/- 12 F M. furfurs + + +/- 13 F M. furfur M M. furfur + + +/- 15 F M. furfur + + +/- 16 F M. furfur + + +/- 17 F M. furfur + + +/- 18 F M. furfur + + +/- 19 F M. furfur F M. furfur + + +/ 21 M M. furfur + + +/ 22 M M. furfur F M. furfur + + +/ 24 F M. furfur + + +/ 25 F M. furfur + + +/ 26 F M. furfurs + + +/ 27 F M. furfur +/- + +/- 28 F M. furfur M M. symbodialis + +/ F M. furfur F M. pachydermatis +/ F M. symbodialis + +/ F M. furfur F M. pachydermatis +/ F M. furfur F M. furfur F M. furfur F M. symbodialis + +/ F M. furfur F M. furfur M M. pachydermatis +/ F M. furfur F M. symbodialis + +/ F M. furfur + + -

8 11 45 F M. furfur F M. furfur F M. pachydermatis +/ F M. furfur M M. furfur F M. symbodialis + +/- +/- 51 F M. furfur ( + ) Excelente (+/-) Moderado ( - ) Ausente