Teleóginas de R. (B.) microplus foram coletadas dos bovinos do rebanho da Unidade de Ensino e Aprendizagem (UEA) Gado Leiteiro do IFC Campus Araquari.

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1 DETERMINAÇÃO DE POPULAÇÕES DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus RESISTENTES E SUSCEPTÍVEIS À PIRETRÓIDES PARA ESTUDO DE POLIMORFISMOS RELACIONADOS Autores: Thayse Juliana RODRIGUEZ 1 *; Ohana Vilhena Castro NUNES 1 ; Ana Paula A. V. ARGUS 1 ; Marlise Pompeu CLAUS 1 ; Viviane MILCZEWSKI 1 ; Antônio Pereira SOUZA 1,2 ; André Luis Fachini SOUZA 1 **. Identificação autores: 1 Instituto Federal Catarinense Campus Araquari; 2 Universidade do Estado de Santa Catarina CAV/Lages; *Bolsista PIBITI/CNPq - Edital 503/2014; **Orientador. Introdução O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é responsável por grandes perdas econômicas na pecuária bovina. Essas perdas ocorrem por efeitos diretos como anemia, emagrecimento, diminuição do rendimento produtivo e lesões na pele que ocasionam baixa qualidade do couro e leite. Estes ectoparasitas são responsáveis por prejuízos econômicos expressivos, estimados, somente no Brasil, em 3,4 bilhões de dólares por ano (SOCIEDADE NACIONAL DA AGRICULTURA, 2015). O uso de carrapaticidas é o principal meio de combate a esse ectoparasita, entretanto, devido a constante aplicação de produtos químicos, bem como as características do ciclo de vida do carrapato e a sua distribuição nas regiões tropicais e subtropicais, houve um acentuado desenvolvimento de resistência aos carrapaticidas. Atualmente, das sete classes de carrapaticidas registradas no Brasil, cinco estão comprometidas parcial ou totalmente pela resistência, dependendo da fazenda ou região (MENDES; PEREIRA; PRADO, 2007). Nesse contexto, o controle do R. (B.) microplus representa um desafio para a viabilidade da pecuária mundial, tanto pelos custos com os tratamentos, quanto pela incerteza da eficácia pelo uso das drogas administradas. (GUERREIRO et. al., 2012). Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi isolar larvas de R. (B.) microplus resistentes e susceptíveis a piretróide (cipermetrina) para análise de polimorfismos genômicos associados à resistência de carrapatos, coletados a partir de bovinos do rebanho da Unidade de Ensino e Aprendizagem (UEA) Gado Leiteiro do Instituto Federal Catarinense (IFC) Campus Araquari, com histórico de resistência a piretróides. Material e Métodos Teleóginas de R. (B.) microplus foram coletadas dos bovinos do rebanho da Unidade de Ensino e Aprendizagem (UEA) Gado Leiteiro do IFC Campus Araquari.

2 As fêmeas ingurgitadas foram pesadas e incubadas em estufa bacteriológica para realização da postura em temperatura (27 29 C) e umidade (70 90%) controladas. Após a postura, um pool de ovos proveniente de 2 a 3 teleóginas foi transferido para seringas de plástico e novamente incubados nas mesmas condições para eclosão. As larvas contidas nas seringas foram submetidas à testes de imersão de larvas (TIL), sendo submersas em soluções de cipermetrina (piretróide), em três diferentes diluições (0,2 mg/ml, 0,1mg/ml e 0,05 mg/ml), durante cinco segundos. Os grupos controle foram submersos em água destilada por igual período de tempo. Na sequência, o excesso de líquido foi removido e os conjuntos foram colocados na capela de exaustão por 1 hora para secagem e mantidos em temperatura ambiente por 24 horas. Após esse período, a separação e contagem de larvas vivas e mortas foi realizada com auxílio de uma fonte luminosa em uma superfície branca. Considerando que a concentração de 0,1 mg/ml de cipermetrina é recomentada pelo fabricante para banho de aspersão no tratamento do rebanho, as larvas mortas na diluição 0,05 mg/ml e as larvas vivas da diluição 0,2 mg/ml foram consideradas exemplares dos grupos susceptível e resistentes, respectivamente. Esses grupos foram armazenados a -20 C para posterior extração de DNA. Para análise das diferenças entre as médias das taxas de mortalidade de larvas em diferentes concentrações de cipermetrina, foi utilizado o teste t com nível de significância de 1%. Para a extração de DNA genômico foi testado um protocolo baseado em Sheppard e Hinkley (1992) com modificações. A separação e estimativa do tamanho dos fragmentos foi realizada por eletroforese em gel de ágar 1% (p/v) e os géis foram corados em solução de brometo de etídio (0,5 µg/ml) e visualizados sob radiação ultravioleta em sistema de foto documentação PIX EX Loccus Biotecnologia (SAMBROOK et. al. 1989). Resultados e discussão Atualmente, o controle dos carrapatos R. (B.) microplus é baseado no uso de carrapaticidas, porém o uso intensivo destes compostos tem contribuído para o aparecimento da resistência genética às várias drogas, entre elas os piretróides, representando um sério problema no controle de carrapatos nas propriedades rurais. Os

3 piretróides, em nível molecular, podem interagir com canais de sódio, potássio e ATPases de membrana (MILLER, 1988). Mutações no gene que codifica o canal de sódio podem estar relacionadas com a resistência do carrapato à cipermetrina (PEREIRA et al., 2004). Optou-se por utilizar um piretróide como o carrapaticida de escolha nesse trabalho, por ser um dos produtos mais utilizados em bovinos leiteiros. A utilização massiva destes produtos ocorre devido à disponibilidade comercial, preço acessível e pouco tempo de carência para utilização do leite após aplicação em vacas em lactação. Entretanto, esses mesmos motivos também levaram ao uso indiscriminado do produto que ao longo do tempo acabou determinando a seleção de cepas resistentes. Os carrapatos estudados nesse trabalho foram obtidos a partir do rebanho da UEA- Gado Leiteiro, composto pelas raças Holandesa, Jersey e Pardo Suíço, pois os prejuízos decorrentes deste parasitismo tendem a ser mais expressivos em animais de origem europeia, as quais são marcadamente mais sensíveis aos carrapatos que as raças zebuínas (VERÍSSIMO et al., 2002). Os testes de imersão de larvas revelaram que a taxa de mortalidade frente às diferentes diluições de cipermetrina foi de uma média de 99% (diluição 0,2 mg/ml), 79% (diluição 0,1 mg/ml) e 93% (diluição 0,05 mg/ml) (Figura 1). Apesar das variações na taxa de mortalidade, não foi observada diferença significativa (p > 0,01) nas diferentes diluições testadas. No grupo controle observou-se um percentual médio de mortalidade de 20%. a a a b Fig. 1. Percentual de mortalidade de larvas em diferentes concentrações de cipermetrina. Diluições testadas: 0,2 mg/ml, 0,1 mg/ml (concentração recomendada pelo fabricante) e 0,05 mg/ml. Letras iguais indicam que não houve diferença significativa entre os grupos ao nível de significância de 1%. A seleção de larvas resistentes e susceptíveis à cipermetrina é essencial para a

4 determinação de polimorfismos associados. Isso exige uma metodologia de seleção que proporcione uma taxa de mortalidade média relativamente constante para cada diluição testada, de modo que a diferenciação entre os dois grupos de larvas seja confiável. Entretanto, foi observado nesse trabalho a existência de uma grande heterogeneidade de mortalidade de larvas entre as repetições de cada grupo (com diferenças significativas). Esses resultados indicam uma grande variabilidade genética na população de carrapatos do rebanho bovino do Campus Araquari, ocorrendo inclusive uma variabilidade genética entre populações de diferentes piquetes da UEA. Essa variabilidade, além de inviabilizar a seleção de populações resistentes e susceptíveis para extração de DNA e determinação de polimorfismos associados à resistência, alertam para a necessidade de práticas de manejo do rebando, bem como a gravidade dos problemas relacionados à resistência aos carrapaticidas. Esses problemas podem se refletir na qualidade dos produtos obtidos a partir desse rebanho. Com a seleção de larvas possivelmente resistentes e susceptíveis à cipermetrina buscou-se a otimização de uma técnica de extração de DNA total. Foi simplificado o método proposto por Sheppard e Hinkley (1992), desenvolvendo-o em três passos: i) rompimento mecânico da camada externa de quitina por meio de maceração e fervura em tampão de lise contendo dodecil sulfato de sódio para lise celular; ii) precipitação proteica com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico e iii) precipitação e lavagem do DNA purificado. Os resultados revelaram que o protocolo testado demanda alguns ajustes, pois o DNA purificado tem apresentado sinais de degradação (bandas arrastadas). Dessa forma, a resistência em populações da UEA e, sobretudo, a grande variabilidade genética, é preocupante, pois demonstra que os métodos de manejo e controle desse ectoparasita são ineficientes. Esses resultados contribuíram para o entendimento do nível de resistência da população de carrapatos do rebanho bovino estudado, podendo contribuir para melhorar o manejo da unidade, bem como as práticas de aplicação de carrapaticidas e seleção de grupos susceptíveis e resistentes para determinação de polimorfismos. Adicionalmente, esses resultados sugerem que a metodologia utilizada para a determinação do grau de resistência de carrapatos pode ser revista em função da dinâmica espacial do rebanho na propriedade rural, com potencial de servir o arranjo rural local por meio do entendimento das particularidades de cada

5 propriedade, evitando o uso desnecessário e excedente de carrapaticidas. Conclusão As mortalidades inconstantes das larvas quando submetidas às diferentes concentrações de piretróides, não permitiram a seleção confiável de cepas resistentes e suscetíveis de R. (B.) microplus. A dificuldade encontrada nos ensaios de mortalidade revelou o desenvolvimento de populações resistentes e geneticamente diversas, além de espacialmente distribuída nos carrapatos do rebanho bovino do IFC Araquari. Também, a simplificação da metodologia de extração de DNA genômico de larvas de carrapatos apresentou sinais de degradação, inviabilizando em adição à grande heterogeneidade do grau de resistência do rebanho bovino do IFC Araquari, a determinação de polimorfismos associados à resistência à piretróide. Referências GUERREIRO, F.D.; LOVIS, L.; MARTINS, J.R. Acaricide resistance mechanisms in Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Rev. Bras. Parasitol. Vet. 2(1), MENDES, M.C.; PEREIRA, J.R.; PRADO, A.P. Sensitivity of Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) to pyrethroids and organophosphate in farms in the Vale do Paraiba region, São Paulo, Brazil. Arqu. Inst. Biol., 74(2), 81-85, MILLER, T.A. Mechanisms of resistance to pyrethroid insecticides. Parasitol. Today, 4(7), PEREIRA, C.D.; SOUZA, G.R.L.; FRANCO, M.M.; KERR, W.E.; GOULART FILHO, L. R. Identificação de mutações no gene do canal de sódio associado à resistência em Boophilus microplus por RT-PCR assimétrico de baixa adstringência. Biosci. J., 20(2), SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.; MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring-NY, v SOCIEDADE NACIONAL DA AGRICULTURA. Perdas causadas por carrapatos em bovinos alcançam US$ 3,4 bi por ano Disponível em: < Acesso em: 04 de out. de SHEPPARD, D.C., HINKLE, N.C. A field procedure using disposable materials to evaluate horn fly insecticide resistance. J. Agric. Entomol VERÍSSIMO, C.J.; OTZUK, I.P., DEODATO, A.P., LARA, M.A.C., BECHARA, G.H. Infestação por carrapatos Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) em vacas das raças Gir, Holandesa e mestiça sob pastejo. Arqu. Inst. Biol., 69(Supl):87-89, 2002.