UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE QUÍMICA DE SÃO CARLOS

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE QUÍMICA DE SÃO CARLOS DINÂMICA DA MATÉRIA ORGÂNICA E DESTINO DE METAIS PESADOS EM DOIS SOLOS SUBMETIDOS À ADIÇÃO DE LODO DE ESGOTO Larissa Macedo dos Santos Dissertação apresentada ao Instituto de Química de São Carlos, da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências (Química Analítica). Orientador: Dr. Ladislau Martin Neto São Carlos 2006

2 À Deus pela sabedoria, visão e força. OFEREÇO Aos meus queridos pais José Alfredo e Nilcéa pelo exemplo de vida e de caráter traduzidos em um consistente alicerce familiar. À minha alegre irmã Poliana pelo carinho. DEDICO

3 AGRADECIMENTOS Ao Dr. Ladislau Martin Neto pela orientação, incentivo, confiança, amizade e preocupação com o meu bem estar durante a realização deste trabalho. Meus sinceros agradecimentos. Ao Dr. Wilson Tadeu Lopes da Silva, Dra. Débora Marcondes Bastos Pereira Milori,, Dr. Marcelo Luiz Simões, pela valiosa colaboração na realização deste trabalho. Ao Prof. Dr. Wanderley José de Melo, da Unesp-Jaboticabal, por ter concedido as amostras de solo e pelo seu atencioso acompanhamento durante todo o trabalho. À Dra. Ana Rita de Araújo Nogueira, juntamente com seus orientados Fernanda Santiago e Edivan Carvalho Vieira, pela valiosa colaboração, simpatia, atenção e boa vontade. À Profa. Dra. Maria Olímpia de Oliveira Rezende e a sua orientada Jussara Cotta, pela valiosa colaboração. Ao Renê por sua valiosa e prestativa ajuda no laboratório de química e principalmente pela criatividade tecnológica. Ao Dr. Mario Miyazawa e Vicente Parabocz do IAPAR, pela valiosa colaboração. Aos secretários, bibliotecárias, telefonistas, estagiários, técnicos, pesquisadores, etc., à todos os colegas da Embrapa, sempre atenciosos e prestativos. Aos colegas e amigos de trabalho, Lucimar, Aline, Marcilene, Kelly, Ursula (Ursulita), Juliana, Jean, Garbin, Martha, Alessandra (Ale), Humberto (Humberti), Helder, Kleber, Vanessa, Ana Flávia, Adriana, Tatiana (Tati), Tiago (Ti), Fábio Leite, Eduarda, Nelson, Thais (Tatá), Francieli (Fran), Priscila (Pri), Milena, Rafael (Ceará), Luciana, Olívia (Baiana), Jeferson, Elisângela, Fernando Garbuio meus agradecimentos pela agradável convivência e amizade. Aos meus amigos de Ponta Grossa pelo incentivo e amizade. As minhas companheiras de casa pela agradável convivência que juntas tivemos, em especial a Dona Marlene minha mãe Sãocarlense. Ao Prof. Dr. Jorge Iulek, pelo exemplo de profissional, seriedade, respeito e dedicação. A Embrapa Instrumentação Agropecuária pela infra-estrutura e pelo excelente ambiente de trabalho. Ao Instituto de Química de São Carlos da Universidade de São Paulo. A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse trabalho.

4 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS RESUMO ABSTRACT i iv vi vii viii 1 INTRODUÇÃO 1 OBJETIVOS 3 2 REVISÃO DE LITERATURA LODO DE ESGOTO Composição do lodo de esgoto O uso agrícola do lodo de esgoto MATÉRIA ORGÂNICA DO SOLO Importância da matéria orgânica para o solo Dinâmica da matéria orgânica do solo Substâncias húmicas Interações das substâncias húmicas com metais Caracterização da matéria orgânica Métodos químicos Determinação da composição elementar (CHNS) Determinação da razão C/N Determinação de carbono por via seca-total Organic Carbon 18 (TOC) Determinação do teor de matéria orgânica por via úmida (Walkley- 19 Black) Determinação de carbono por via seca-total Organic Carbon 19 (TOC) Métodos Espectroscópicos Absorção de radiação no UV-Vis FTIR RMN RPE Fluorescência FIL Contaminação do solo por metais pesados Caracterização espectrométrica ICP OES 41 3 MATERIAIS E MÉTODOS AMOSTRA DE LODO DE ESGOTO Área experimental Classificação dos solos Tratamentos Amostragem PREPARO DAS AMOSTRAS DE SOLO E LODO DE ESGOTO PARA A 45 EXTRAÇÃO 3.4 EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS HÚMICAS DETERMINAÇÃO DE METAIS NO PROCESSO DE EXTRAÇÃO DAS 47 SUBSTÂNCIAS HÚMICAS 3.6 FRACIONAMENTO FÍSICO POR GRANULOMETRIA CARACTERIZAÇÃO DA MATÉRIA ORGÂNICA 50

5 3.7.1 Métodos químicos Determinação da composição elementar (CHNS) Determinação da razão C/N Determinação de carbono por via seca (TOC) Determinação do teor de matéria orgânica por via úmida (Walkley- 50 Black) Métodos espectroscópicos Absorção de radiação no UV-Vis FTIR RMN RPE Fluorescência FIL DETERMINAÇÃO DE METAIS PESADOS ICP OES 56 4 RESULTADOS E DISCUSSÕES CARACTERIZAÇÃO DA MATÉRIA ORGÂNICA Métodos químicos Determinação da composição elementar (CHNS) Determinação da razão C/N Determinação de carbono por via seca (TOC) Determinação do teor de matéria orgânica por via úmida (Walkley- 65 Black) Métodos espectroscópicos Absorção de radiação no UV-Vis FTIR RMN RPE Fluorescência Espectros de emissão Espectros de varredura sincronizada FIL DETERMINAÇÃO DE METAIS Lodo de esgoto Solo intacto Frações físicas Fração areia (>53 µm) Fração silte grosso (20-53 µm) Fração silte fino (2-20 µm) Fração argila (<2 µm) Frações químicas Fração humina Água de lavagem da humina Fração ácido fúlvico Fração ácido fúlvico Fração ácido húmico CONCLUSÕES RESULTADOS BIBLIOGRÁFICAS 117

6 LISTA DE FIGURAS Figura Composição do lodo de esgoto doméstico (Melo; Marques, 2000) 4 Figura Modelo de ácido húmico proposto por Schulten e Schnitzer (1993) 10 Figura Modelos conceituais propostos pela teoria macromolecular: (a) moléculas das substâncias húmicas aleatoriamente enoveladas (Swift, 1989) e (b) ácido húmico proposto por Schulten e Schnitzer (1997), carbono=azul; oxigênio=vermelho; nitrogênio=preto e hidrogênio=branco. As letras A, B e C indicam os espaços vazios presentes na molécula das substâncias húmicas capazes de interagir com outros compostos Figura Esquema de estrutura das substâncias húmicas proposto por (Simpson et al., 2002b). As unidades vermelhas representam os cátions metálicos, as unidades pretas os polissacarídeos, as unidades azuis os polipeptídios, as unidades verdes as cadeias alifáticas e as unidades marrons os fragmentos aromáticos provenientes da lignina Figura Exemplos de complexos organometálicos 15 Figura Níveis de energia eletrônica molecular (Skoog; Holler; Nieman, 2002) 22 Figura Cromóforos presentes nas substâncias húmicas 23 Figura Algumas vibrações típicas de átomos. Os sinais + e significam vibrações perpendiculares ao plano do papel (Stuart, 1996) Figura Espectro de 13 C RMN típico de ácido húmico mostrando os grupos funcionais associados às bandas correspondentes (Skjemstad; Janik; Taylor, 1998) Figura Efeito Zeeman: (a) desdobramento dos níveis de energia do spin eletrônico na presença de um campo magnético; (b) forma da linha de absorção de energia do campo de microondas; (c) primeira derivada da linha de absorção Figura Esquema da estabilização do radical livre do tipo semiquinona (Senesi; Schnitzer, 1977) 33 Figura Espectro de RPE típico de ácido húmico mostrando o sinal do radical livre do tipo semiquinona 33 Figura Transição eletrônica fluorescência molecular 35 Figura Pastilhas de solo utilizadas para a obtenção do espectro de FIL 38 Figura Sistema para medida de FIL 39 Figura Biossólido originado do lodo de esgoto coletado na ETE da SABESP, Barueri-SP 43 Figura Solos Analisados: Perfil dos solos (a) LVef) e (b) LVd 44 Figura Aplicação do lodo de esgoto ao solo 44 Figura Coleta das amostras de solo 45 Figura Esquema simplificado de extração e purificação das substâncias húmicas do solo 47 Figura Esquema simplificado de extração e purificação das substâncias húmicas do solo, mostrando as etapas para determinação de metais nas diversas fases do processo 48 Figura Esquema simplificado do fracionamento físico por granulometria 49

7 Figura Valores da razão C/N obtidos para os ácidos húmicos extraídos do (a) LVef sem e com adição de lodo de esgoto e (b) LVd sem e com adição de lodo de esgoto. As profundidades variam de 0-60 cm onde: P1 0-10; P ; P e P cm. Figura Dados dos teores de carbono para as amostras de solo intacto determinados pelo método de TOC para os solos (a) LVef sem e com adição de lodo de esgoto e (b) LVd sem e com adição de lodo de esgoto em diferentes profundidades. Figura Correlações entre os teores de carbono obtidos pelos métodos: (a) análise elementar e TOC, (b) análise elementar e WalKley-Black e (c) TOC e Walkley-Black. Figura Espectros de absorção de absorção de radiação no UV-Vis de ácido húmico extraídos do (a) LVef sem adição de lodo de esgoto, (b) LVef + B com adição de lodo de esgoto, (c) LVd sem adição de lodo de esgoto e (d) LVd + B com adição de lodo de esgoto. As profundidades variam de 0-60 cm onde: P1 0-10; P ; P e P cm Figura Espectro de absorção de radiação no UV-Vis de ácido húmico extraído do lodo de esgoto. 68 Figura Valores da razão E 4 /E 6 obtidos para os ácidos húmicos extraídos do (a) LVef sem e com adição de lodo de esgoto e (b) LVd sem e com adição de lodo de esgoto. As profundidades variam de 0-60 cm onde: P1 0-10; P ; P e P cm. Figura Espectros de FTIR de ácidos húmicos extraídos do (a) LVef sem adição de lodo de esgoto e (b) LVef + B com adição de lodo de esgoto. As profundidades variam de 0-60 cm onde: P1 0-10; P ; P e P cm. Figura Espectros de FTIR de ácidos húmicos extraídos do (a) LVd sem adição de lodo de esgoto e (b) LVd + B com adição de lodo de esgoto. As profundidades variam de 0-60 cm onde: P1 0-10; P ; P e P cm Figura Espectro de FTIR do ácido húmico extraído do lodo. 74 Figura Espectros de 13 C RMN de ácidos húmicos extraídos do (a) LVef sem adição de lodo de esgoto e (b) LVef + B com adição de lodo de esgoto. As profundidades variam de 0-60 cm onde: P1 0-10; P ; P e P cm. Figura Espectros de 13 C RMN de ácidos húmicos extraídos do (a) LVd sem adição de lodo de esgoto e (b) LVd + B com adição de lodo de esgoto. As profundidades variam de 0-60 cm onde: P1 0-10; P ; P e P cm Figura Espectro de 13 C RMN do ácido húmico extraído do lodo 79 Figura Gráfico da (a) Aromaticidade e Alifaticidade das amostras de ácido húmico extraídas dos solos LVef sem adição de lodo de esgoto, LVd sem adição de lodo de esgoto, e +B refere-se aos mesmos solos tratados com lodo de esgoto e Lodo ácido húmico extraído do lodo de esgoto. Na profundidade de cm. Figura Nível de radical livre do tipo semiquinona em spins g -1 de carbono obtidos para os ácidos húmicos extraídos do (a) LVef sem e com adição de lodo de esgoto e (b) LVd sem e com adição de lodo de esgoto, em diferentes profundidades. Figura Espectros de emissão de fluorescência (λexc = 240 nm) de ácidos húmicos extraídos do (a) LVef sem adição de lodo de esgoto, (b) LVef + B com adição de lodo de esgoto, (c) LVd sem adição de lodo de esgoto e (d) LVd + B com adição de lodo de esgoto. As profundidades variam de 0-60 cm onde: P1 0-10; P ; P e P cm. Figura Espectro de emissão de fluorescência (λexc = 240 nm) do ácido húmico extraído do lodo de esgoto

8 Figura Valores do índice de humificação obtidos para os ácidos húmicos extraídos dos solos, (a) LVef sem e com adição de lodo de esgoto e (b) LVd sem e com adição de lodo de esgoto. As profundidades variam de 0-60 cm onde: P1 0-10; P ; P e P cm. Figura Espectros de emissão de fluorescência (λexc = 465 nm) de ácidos húmicos extraídos do (a) LVef sem adição de lodo de esgoto, (b) LVef + B com adição de lodo de esgoto, (c) LVd sem adição de lodo de esgoto e (d) LVd + B com adição de lodo de esgoto. As profundidades variam de 0-60 cm onde: P1 0-10; P ; P e P cm Figura Espectro de emissão de fluorescência (λexc = 465 nm) do ácido húmico extraído do lodo. 91 Figura Valores de A 465 obtidos para os ácidos húmicos extraídos dos solos, (a) LVef sem e com adição de lodo de esgoto e (b) LVd sem e com adição de lodo de esgoto. As profundidades variam de 0-60 cm onde: P1 0-10; P ; P e P cm. Figura Espectros sincronizado de fluorescência de ácidos húmicos extraídos do (a) LVef sem adição de lodo de esgoto, (b) LVef + B com adição de lodo de esgoto, (c) LVd sem adição de lodo de esgoto e (d) LVd + B com adição de lodo de esgoto. As profundidades variam de 0-60 cm onde: P1 0-10; P ; P e P cm Figura Espectro sincronizado de fluorescência do ácido húmico extraído do lodo. 94 Figura Espectros sincronizado de fluorescência de ácidos húmicos extraídos do (a) LVef sem adição de lodo de esgoto, (b) LVef + B com adição de lodo de esgoto, (c) LVd sem adição de lodo de esgoto e (d) LVd + B com adição de lodo de esgoto. As profundidades variam de 0-60 cm onde: P1 0-10; P ; P e P cm. Figura Correlação entre as metodologias utilizadas: (a) Zsolnay e Milori; (b) Zsolnay e Kalbitz e (c) Milori e Kalbitz Figura Valores de H FIL obtidos para as amostras de solo intacto do (a) LVef sem e com adição de lodo de esgoto e (b) LVd sem e com adição de lodo de esgoto. As profundidades variam de 0-60 cm onde: P cm; P cm; P cm e P cm. Figura Correlação entre o grau de humificação determinado pela FIL e as metodologias de fluorescência em solução utilizadas: (a) H FIL e A 4 /A 1 ; (b) H FIL e A 465 e (c) H FIL e I 460 /I 399. Figura Efeitos dos teores totais de (a) Fe e (b) Mn para as amostras da fração areia (> 53 µm) extraídas do LVd submetidos à adição de lodo de esgoto. Figura Efeitos dos teores totais de (a) Cr, (b) Cu e (c) Co para a fração silte grosso (20-53 µm) extraídas do LVef submetido à adição de lodo de esgoto e efeitos dos teores totais de (d) Zn para a fração silte grosso (20-53 µm) extraídas do LVd submetido à adição de lodo de esgoto. Figura Efeitos dos teores totais de (a) Cu e (b) Zn para a fração silte fino (2-20 µm) extraídas do LVd submetido à adição de lodo de esgoto

9 LISTA DE TABELAS Tabela Solos estudados e sua classificação conforme o Sistema Brasileiro de Classificação de Solos da Embrapa (1999), as profundidades coletadas e os tratamentos aos quais foram submetidos os solos. 45 Tabela Descrição e condições operacionais do espectrômetro de ICP OES. 56 Tabela Elementos analisados e seus comprimentos de onda. 56 Tabela 3.4 Limites de detecção dos metais analisados 57 Tabela Teor de carbono, hidrogênio e nitrogênio em (%) das amostras de ácido húmico extraídas do LVef e LVd e do lodo de esgoto, determinados pelo método de análise elementar. Tabela Teor de carbono em (g kg -1 ) das amostras de solo intacto, determinados pelos métodos de análise elementar, TOC e Walkley-Black. Tabela Valor da razão C/N das amostras de ácido húmico obtidos através da determinação da composição elementar (CHNS). Tabela Dados referentes à absorção de absorção de radiação no UV-Vis em 468 nm (E 4 ) e em 665 nm (E 6 ) e a razão entre as mesmas (E 4 /E 6 ) para os ácidos húmicos extraídos do LVef e LVd e do lodo de esgoto. Tabela Intensidades relativas (porcentagem da área total) das bandas nos espectros de 13 C RMN com VACP-MAS de amostras sólidas de ácidos húmicos. Tabela Grau de Aromaticidade e Alifaticidade de amostras sólidas de ácidos húmicos extraídos dos solos e do lodo de esgoto. Tabela Concentração de radicais livres do tipo semiquinona e largura de linha das amostras de ácidos húmicos extraídos dos solos, LVef e LVd e do lodo de esgoto, fornecida pela espectroscopia de RPE Tabela Dados referentes ao índice de humificação proposto por Zsolnay. 89 Tabela Dados referentes ao índice de humificação proposto por Milori. 92 Tabela Dados referentes ao índice de humificação proposto por Kalbitz. 95 Tabela Dados referentes à análise elementar de carbono pela técnica de TOC e área dos espectros de FIL de amostras de solo intacto. 97 Tabela Concentração em mg kg -1 de metais pesados permitida e determinada para o lodo de esgoto. 100 Tabela Concentração em mg kg -1 de metais pesados determinados para o solo por ICP OES. 101 Tabela Concentração em mg kg -1 de metais de pesados determinados para a fração areia por ICP OES. 103 Tabela Concentração em mg kg -1 de metais de pesados determinados para a fração silte grosso por ICP OES. Tabela Concentração em mg kg -1 de metais de pesados determinados para a fração silte fino por ICP OES Tabela Concentração em mg kg -1 de metais de pesados determinados para a fração argila por ICP OES. 109

10 Tabela Concentração em mg kg -1 de metais de pesados determinados para a fração humina por ICP OES. 110 Tabela Concentração em mg L -1 de metais de pesados determinados para a água de lavagem da humina por ICP OES. Tabela Concentração em mg L -1 de metais de pesados determinados para a fração ácido fúlvico 1 por ICP OES. Tabela Concentração em mg L -1 de metais de pesados determinados para a fração ácido fúlvico 2 por ICP OES. Tabela Concentração em mg kg -1 de metais de pesados determinados para a fração ácido húmico por ICP OES

11 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ACF CETESB CONAMA COT CP ETE FIL FTIR IAP IAPAR IBGE ICP OES IHSS LVd LVef MAS PROSAB RMN RPE SABESP TOC UV-Vis VA Área do espectro de emissão de FIL Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental Conselho Nacional do Meio Ambiente Valor do Carbono Orgânico Total Polarização Cruzada Estação de Tratamento de Esgoto Fluorescência Induzida por Laser Infravermelho com Transformada de Fourier Instituto Ambiental do Paraná Instituto Agronômico do Paraná Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística Espectrometria de Emissão Atômica com Plasma Indutivamente Acoplado Sociedade Internacional de Substâncias Húmicas Latossolo Vermelho distrófico Latossolo Vermelho eutroférrico Rotação segundo o Ângulo Mágico Programa de Pesquisa e Saneamento Básico Ressonância Magnética Nuclear Ressonância Paramagnética Eletrônica Companhia de Saneamento Básico do Estado de São Paulo Total Organic Carbon Ultravioleta-Visível Amplitude Variável

12 RESUMO Em regiões agrícolas próximas dos grandes centros urbanos e onde há o uso intensivo de recursos naturais, em especial do solo, a reciclagem para fins agrícolas de lodos de esgotos aparece como alternativa promissora. Contudo, a sustentabilidade dessa prática deve ser avaliada, ainda mais se considerado a escassez de informações sobre possíveis impactos ambientais em áreas tropicais. Com esse objetivo esse trabalho avaliou os efeitos da adição de lodo de esgoto em dois solos, Latossolo Vermelho eutroférrico e Latossolo Vermelho distrófico, coletados no 7º ano de um experimento em campo, instalado em 1997 na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Unesp, em Jaboticabal-SP. O lodo de esgoto foi proveniente da Estação de Tratamento de Esgoto da Companhia de Saneamento Básico do Estado de São Paulo, em Barueri-SP. Para observar os efeitos da adição do lodo de esgoto foram analisados os ácidos húmicos extraídos dos solos utilizando absorção de radiação no UV-Visível, infravermelho com transformada de Fourier, ressonância magnética nuclear, ressonância paramagnética eletrônica, fluorescência e análise elementar. Para a análise do solo intacto utilizou-se a fluorescência induzida por laser, e para as frações físicas e químicas a emissão atômica com plasma indutivamente acoplado. Experimentos de infravermelho com transformada de Fourier e ressonância magnética nuclear forneceram espectros com bandas características de grupos alifáticos para o ácido húmico extraído do lodo, comprovando seu alto grau de alifaticidade. O nível de radicais livres do tipo semiquinona determinado por ressonância paramagnética eletrônica diminuiu significativamente para os solos submetidos à adição de lodo. Dados de fluorescência utilizando diferentes metodologias (Zolnay et al., 1999; Milori et al., 2002; Kalbitz et al., 1999) e fluorescência induzida por laser, de amostras de solo intacto, apresentaram comportamento similar. De forma geral, os resultados obtidos por análises espectroscópicas mostraram à incorporação de compostos menos humificados, com um alto grau de alifaticidade e baixo grau de aromaticidade. A análise de metais em solos tratados com lodo de esgoto em algumas situações não tem evidenciado o aumento destes elementos, mesmo quando o lodo apresenta níveis superiores aos valores encontrados no solo. Assim fica a pergunta, onde e como estão os metais pesados oriundos do lodo e que deveriam ser detectados em níveis maiores nos solos tratados. Neste trabalho procuramos ampliar as avaliações para além dos procedimentos convencionais com análises das frações físicas e químicas. Os metais pesados estudados foram: Cd, Cr, Cu, Fe, Co, Mn, Mo, V e Zn. Os resultados obtidos mostraram maior afinidade dos metais pelas frações físicas de menor tamanho (argila e silte fino). Contudo, maiores teores de metais foram observados nas frações químicas do solo, sugerindo maior poder de complexação das substâncias húmicas do solo. A concentração de Zn observada na água de lavagem da humina foi superior a encontrada na fração humina, mostrando maior afinidade desse metal pela matéria orgânica dissolvida. Esse resultado é importante, pois evidencia a perda desse metal durante o processo de fracionamento químico, visto que essa água é descartada. As frações de ácido fúlvico 1 e 2 apresentaram concentrações significativas de metais, principalmente Cd, Cu, Mn e Zn, sendo as maiores encontradas para o ácido fúlvico 1. O ácido húmico, devido a grande quantidade de grupos reativos (carboxílicos e fenólicos), mostrou ser um forte agente complexante de metais. Esses resultados indicam diferente afinidade dos metais pelas frações físicas e químicas do solo, ressaltando a importância do estudo do destino dos metais nas diferentes frações do solo.

13 ABSTRACT In agricultural regions near big urban areas and where the intensive use of natural resources exists, in particular of the soil, recycling sewage sludge with agricultural finality appears as a promising alternative. However, the sustainability of this practice needs to be further assessed, even more so when considering there is lack of information on environmental impacts in tropical areas. The present work evaluated the effects of sewage sludge addition to two soils, Rhodic Eutrodox and Rhodic Hapludox by FAO Taxonomy) colleted from a field experiment, installed in 1997 in the city of Jaboticabal, São Paulo State. Sewage sludge was obtained from the Barueri sewage sludge treatment plant, located in the metropolitan region of São Paulo State, Brazil, operated by the Basic Sanitation Company of the State of São Paulo. In order to observe the effects of the sewage sludge addition, the humic acids extracted from soils were analyzed by absorption of ultraviolet and visible radiation, Fourier transform infrared, nuclear magnetic resonance, eletronic paramagnetic resonance, fluorescence and elementar analyses. To analyse the intact soil laser induced fluorescence was used, and for physics and chemical inductively coupled plasma atomic emission was used. The results obtained by Fourier transformed infrared and nuclear magnetic resonance showed spectra with characteristic bands from aliphaticity groups for humic acid from sewage sludge, confirming their high aliphacitity degree. The level of the semiquinona free radicals determined by electronic paramagnetic resonance decreased for soils under sewage sludge application. Data from fluorescence utilizing different methodologies (Zolnay et al., 1999; Milori et al., 2002; Kalbitz et al., 1999) and laser induced fluorescence, from intact soil, showed similar results. In a general manner, the results obtained for spectroscopy analyses showed incorporation of less humified compounds, with high aliphaticity degree and lower aromaticity degree. Analyses of the metals in soils under sewage sludge application in some cases have not evidenced the increase of these elements, even when the sewage show higher levels to those found in the soils. Thus, the question remains, where and how are the heavy metals from sewage sludge? Which, should have been detected in higher levels in soils under sewage sludge application? The objective of this work was to amplify the valuations beyond the conventional proceedings with analyses of physics and chemical fractions. The heavy metals studied were: Cd, Cr, Cu, Fe, Co, Mn, Mo, V and Zn. The results obtained showed higher affinity of metals for physical fractions that have smaller size (clay and fine silt). However, higher heavy metals concentrations were observed in the chemical fractions of the soils, due to higher complexity power of the humic substances of soils. The Zn concentration observed in the water of the humin wash was higher than what was observed in the humina fraction, showing higher affinity of this metal for dissolved organic matter. This result is important, because it evidences the loss of this metal during the extraction process of the humic substances, since this water is discarded. The fractions of fulvic acids 1 and 2 showed significative concentrations of the metals, mainly Cd, Cu, Mn and Zn, being that the biggest were for humic acids, because the most quantity of the reactive groups (charboxilics and phenolics), showed to be a strong complex agent of the metals. Such results indicate different affinity of metals for physics and chemical fractions from soils, emphasizing the importance of the study of the course of heavy metals in the different fractions of the soil.

14 CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO Atualmente, em âmbito global, se discutem as causas, os efeitos e as soluções para o aquecimento do planeta e alterações nos padrões climáticos. Regionalmente, e não menos importante, a poluição de rios e a degradação dos solos são problemas graves que afetam a qualidade de vida de toda uma população local, em especial dos economicamente menos favorecidos, cujas opções de moradia, poder de consumo e acesso a medicamentos são restritos. Nesse sentido, a geração e o descarte de resíduos têm sido atacada por diversas frentes, de modo a minimizar sua geração e selecionar técnicas ecologicamente favoráveis de reutilização ou destino final dos materiais não passíveis de reuso. Dentre as medidas práticas atualmente empreendidas encontra-se o tratamento dos esgotos antes da devolução aos corpos d água receptores. Tal prática, respeitando a capacidade de suporte e resiliência do meio, melhora consideravelmente os índices de qualidade de águas superficiais (Bettiol; Camargo, 2001). Entretanto, como toda atividade humana gera resíduos, sejam decorrentes de seu próprio metabolismo ou da atividade industrial, isso não é diferente com relação ao tratamento dos esgotos nas estações, podendo-se citar dentre os resíduos mais problemáticos o lodo de esgoto. Os mais recentes resultados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE- 2000), mostram que pouco mais de 35% da população brasileira é atendida por sistema de coleta e tratamento de esgoto. No estado de São Paulo, cerca de 40% de sua população é atendida por redes coletoras e tratamento de esgoto. A SABESP maior produtora de lodo de esgoto do país, estima que a Região Metropolitana da cidade de São Paulo estará produzindo cerca de 785 toneladas (base seca) de lodo de esgoto por dia no ano de 2015 (Tsutya, 2000). Na Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) de Barueri-SP, uma das principais ETE desta região, estimou-se que a produção para os anos 2005, 2010 e 2015 será respectivamente de 227, 294 e 310 toneladas (base seca) por

15 Capítulo 1 Introdução 2 dia (Santos; Tsutiya, 1997). O estado do Paraná, pioneiro no país no tratamento de lodo de esgoto, vem desde o começo da década de 90 desenvolvendo pesquisas nesta área, atualmente, produz cerca de 54 toneladas por mês do lodo de esgoto. Devido aos baixos índices de coleta e tratamento de esgoto, há uma clara tendência a um grande aumento na produção de lodo, dados apresentados por Tsutya, Dentre as alternativas para a disposição final do lodo de esgoto, tais como, incineração, reuso industrial, disposição em aterro sanitário, disposição oceânica, o uso agrícola apresentase como uma das mais convenientes, visto que o lodo de esgoto contém matéria orgânica e nutrientes (macro e micronutrientes), fundamentais na produção agrícola e na manutenção da fertilidade do solo (Tsutya, 2000). Entretanto, este pode apresentar algumas restrições devido à presença de sais solúveis, patógenos, compostos orgânicos persistentes e metais pesados. As concentrações de metais pesados no lodo de esgoto são determinadas pela atividade e pelo tipo de desenvolvimento urbano e industrial da área que abastece a estação de tratamento (Oliveira et al., 2002). A contaminação de solos por metais pesados pode ter conseqüências maléficas para o ecossistema como, a perda da produtividade agrícola, a redução da qualidade da cadeia alimentar com danos a saúde humana e animal e a contaminação de fontes de água. Portanto, torna-se necessário determinar as concentrações disponíveis desses elementos no solo. Diversos países dispõem de legislação para o uso do lodo de esgoto na agricultura. Porém, no Brasil apenas dois estados apresentam normatização, o Estado de São Paulo, onde a prática vigente segue Norma P Aplicação de lodos de sistemas de tratamentos biológicos em áreas agrícolas - Critérios para projetos e operação, da Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental (CETESB), publicada em agosto de 1999, e o Estado do Paraná, onde a prática atual segue a Norma IAP Utilização agrícola de lodo de esgoto, do Instituto Ambiental do Paraná (IAP), publicada em dezembro de Contudo, uma regulamentação brasileira vem sendo estudada e elaborada pelos Ministérios do Meio

16 Capítulo 1 Introdução 3 Ambiente e da Agricultura, Pecuária e do Abastecimento, através do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) com a finalidade de se definir critérios e procedimentos, para o uso agrícola de lodos gerados em ETE sanitário e seus produtos derivados. OBJETIVOS Estudar através das técnicas espectroscópicas de: absorção de radiação no UV-Vis, infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), ressonância magnética nuclear (RMN), ressonância paramagnética eletrônica (RPE), Fluorescência e fluorescência induzida por laser (FIL), a dinâmica, reatividade e aspectos estruturais da matéria orgânica e seus constituintes húmicos em solos submetidos à adição de lodo de esgoto, em experimentos de campo de longa duração; Caracterizar quali e quantitativamente através da espectrometria atômica com plasma indutivamente acoplado (ICP OES) os metais pesados presentes nas amostras de solo, submetidas à adição de lodo de esgoto, e suas frações físicas (areia, argila e silte) e químicas (ácido húmico, ácido fúlvico, humina).

17 CAPÍTULO 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 LODO DE ESGOTO O lodo de esgoto é o resíduo que se obtém após o tratamento das águas servidas (esgotos), com a finalidade de torná-las o menos poluídas possível, de modo a permitir o seu retorno ao meio ambiente sem que sejam agentes de poluição significativa. Quando devidamente higienizado, estabilizado e seco, o lodo de esgoto recebe o nome de biossólido (Melo; Marques, 2000) Composição do lodo de esgoto A composição do lodo de esgoto varia enormemente em função de sua origem, ou seja, se proveniente de uma área tipicamente residencial ou industrial, da época do ano e do processo utilizado na ETE. Os dados apresentados na (Figura 2.1), dão uma idéia da composição média do lodo de esgoto. ÁGUAS RESIDUÁRIAS 99,99% 0,01% ÁGUA SÓLIDOS 70% 30% ORGÂNICO INORGÂNICO PROTEÍNAS CARBOIDRATOS LIPÍDEOS, ETC. AREIA SAIS METAIS Figura Composição típica do lodo de esgoto doméstico (Melo; Marques, 2000). Como se pode observar, cerca de 99,99% do esgoto doméstico é constituído por água. Durante o processo de tratamento, ocorre a separação das frações sólida e líquida. A fração

18 Capítulo 2 Revisão de Literatura 5 sólida, que encerra na sua composição componentes orgânicos e inorgânicos, é submetida a um processo de digestão e desidratação. Parte da fração mineral e da fração orgânica, aquela solúvel em água, permanecem na parte líquida, enquanto a areia, os sais e a fração orgânica, insolúveis em água, permanece na fração sólida. Na fração sólida encontram-se biomoléculas como carboidratos, proteínas, lipídeos, substâncias húmicas, entre outros, que se constituem em fonte de carbono e de energia para organismos heterotróficos, e cujo metabolismo conduz à liberação de gás carbônico, fosfatos, nitratos e outros íons (Melo; Marques, 2000) O uso agrícola do lodo de esgoto A utilização do lodo de esgoto em solos agrícolas vem sendo avaliada desde 1925 nos Estados Unidos da América, Holanda, Reino Unido e Dinamarca, onde cerca de 45% do lodo de esgoto produzido são aproveitados na agricultura (Kirkham, 1982; Pedroza et al., 2003). No Brasil, recentes trabalhos desenvolvidos pelo Programa de Pesquisa e Saneamento Básico (PROSAB), no estado do Paraná, confirmaram que a reciclagem agrícola do lodo é uma técnica alternativa para a disposição final do lodo, quando os teores de metais pesados e a presença de organismos patogênicos estão dentro dos limites propostos pela legislação (Fernandes; Andraus; Andreoli, 1996). Quanto à legislação, a CETESB publicou em agosto de 1999, a Norma P 4.230, com o objetivo de estabelecer os procedimentos para a elaboração de projetos sobre a utilização de biossólido em áreas agrícolas no Estado de São Paulo (CETESB, 1999) e o IAP publicou em dezembro de 2003, a Norma IAP, sobre a utilização agrícola de lodo de esgoto no Estado do Paraná (IAP, 2003). O lodo de esgoto contêm matéria orgânica, macro (nitrogênio e fósforo) e micronutrientes (zinco, cobre, ferro, manganês e molibdênio) que exercem um papel fundamental na produção agrícola e na manutenção da fertilidade do solo (Tsutya, 2000; Bettiol; Camargo, 2001).

19 Capítulo 2 Revisão de Literatura 6 Quanto à melhoria das condições físicas do solo, o lodo de esgoto, de maneira semelhante a matéria orgânica, aumenta a retenção de umidade em solos arenosos e melhora a permeabilidade em e infiltração nos solos argilosos, melhora o estado de agregação das partículas do solo, diminui sua densidade, aumenta a aeração e a capacidade de troca de cátions (Melo; Marques, 2000; Bettiol; Camargo, 2001). Porém, a presença de metais pesados no lodo de esgoto é motivo de grande preocupação ambiental, e vem tornado-se um entrave na generalização do uso agrícola deste resíduo (Bertoncini, 2002). Em solos poluídos, os metais podem estar na forma solúvel, adsorvidos na fração inorgânica, complexados com os componentes orgânicos ou simplesmente precipitados. Os contaminantes solúveis estão sujeitos à migração para a solução do solo, assimilação pelas plantas ou organismos aquáticos ou volatilização para a atmosfera (Fungaro; Flues; Celebroni, 2004). O comportamento dos metais pode ser influenciado por atributos do solo, tais como: teor de argila, matéria orgânica, conteúdo de óxidos e ph. Portanto, os critérios para aplicação do lodo de esgoto deveriam ser baseados também nos atributos do solo e não apenas nos teores totais de metais no lodo de esgoto. A fração orgânica do solo é muito complexa e compõe-se de uma grande variedade de compostos solúveis e insolúveis que são capazes de reagir com os micronutrientes e com os metais pesados. 2.2 MATÉRIA ORGÂNICA DO SOLO A matéria orgânica é um importante constituinte do solo, sendo um componente fundamental na qualidade dos sistemas agrícolas em razão de seu conteúdo e sua qualidade serem os mais importantes fatores que mantêm a fertilidade dos solos e a sustentabilidade dos agroecossistemas (Reeves, 1997).

20 Capítulo 2 Revisão de Literatura 7 Segundo (Stevenson, 1994), a matéria orgânica do solo consiste de uma mistura de compostos em vários estágios de decomposição, que resultam da degradação biológica de resíduos de plantas e animais, e da atividade sintética de microrganismos. Pode ser agrupada em substâncias húmicas e não húmicas. As substâncias não húmicas são compostas por substâncias com características químicas definidas, tais como, polissacarídeos, aminoácidos, açúcares, proteínas e ácidos orgânicos de baixa massa molar. As substâncias húmicas não apresentam características químicas e físicas bem definidas, e se dividem em ácido húmico, ácido fúlvico e humina, com base nas suas características de solubilidade (Stevenson, 1994) Importância da matéria orgânica para o solo Em solos tropicais e subtropicais altamente intemperizados, a matéria orgânica tem grande importância no fornecimento de nutrientes às culturas, na retenção de cátions, na complexação de elementos tóxicos e de micronutrientes, na estabilidade da estrutura, na infiltração e retenção de água, na aeração e na atividade e diversidade microbiana, constituindo assim, um componente fundamental da sua capacidade produtiva (Stevenson, 1994). Nessas regiões, a degradação da matéria orgânica em condições inadequadas de manejo é rápida e vem acompanhada de processo de deterioração das características químicas, físicas e biológicas do solo (Mielniczuk, 1999). Na recuperação dessas áreas, é preciso que sejam adotados sistemas de manejo que priorizem um maior aporte de carbono ao solo, no sentido de elevar a biodisponibilidade da matéria orgânica, a qualidade do solo e mitigar as emissões de CO 2 (Bayer et al., 2000). O uso de lodo de esgoto na agricultura é uma prática de manejo vantajosa por este se tratar de material rico em matéria orgânica Dinâmica da matéria orgânica do solo Nos últimos anos, o advento e o aperfeiçoamento do uso dos métodos químicos e espectroscópicas para o estudo da matéria orgânica vêm demonstrando o forte potencial

21 Capítulo 2 Revisão de Literatura 8 desses em auxiliar no entendimento dos processos relacionados com a dinâmica da matéria orgânica após a aplicação de resíduos ao solo (Dias, 2005). É de grande interesse o estudo da dinâmica da matéria orgânica do solo, devido sua importância tanto do ponto de vista de solos, considerando aspectos relevantes a fertilidade e estrutura, para evitar processos erosivos, quanto aspectos ambientais, com relação as reações e associações com pesticidas, metais pesados e microrganismos, em solos e águas, e ainda considerando aspectos globais da Terra, como o efeito estufa (Silva; Pasqual, 1999; Bayer, 1996; Diekow; Bayer; Mielniczuk, 2004). A dinâmica da matéria orgânica é de natureza bioquímica e envolve uma série de microrganismos e pode ser caracterizada por dois processos fundamentais: a mineralização e a humificação. Segundo (Cerri; Moraes, 1992) na mineralização, os constituintes orgânicos são transformados em compostos minerais, normalmente exportados do meio, quer na forma gasosa, quer lixiviados. Com isso, mineralização é a produção de íons inorgânicos pela oxidação de compostos orgânicos (oxidação é o processo pelo qual o carbono orgânico é convertido a dióxido de carbono e perdido para a atmosfera). Os compostos orgânicos mais facilmente decompostos são as proteínas e os carboidratos solúveis, como o amido e a pectina e, os mais difíceis, a celulose e a lignina (Silva; Fay, 2004). A humificação é o processo no qual as substâncias orgânicas formadas se associam à fração mineral e permanecem no meio. Segundo (Zech et al., 1997) a humificação é a transformação de reservas macromorfologicamente identificáveis em compostos húmicos amorfos. Com isso, as principais transformações que ocorrem durante a humificação, são a perda de polissacarídeos e compostos fenólicos, modificação das estruturas de lignina, e enriquecimento em estruturas aromáticas não lignínicas recalcitrantes. A humificação bem como a decomposição de resíduo, é mediada primeiramente por processo microbiológico,

22 Capítulo 2 Revisão de Literatura 9 controlado principalmente por variáveis locais específicas, tais como, temperatura, regime de água no solo, ph e disponibilidade de nutrientes Substâncias húmicas A habilidade dos solos em reter água e estimular o crescimento das plantas depende da matéria orgânica e especialmente das substâncias húmicas. Nos solos, a matéria orgânica pode apresentar-se em quantidades muito variadas, desde 0,5% (solos desérticos) até 95% (solos turfosos) (Luchese; Fávero; Lenzi, 2002). No Brasil, a maior parte dos solos apresentam teores de matéria orgânica entre 1 e 3% contudo, podemos encontrar solos com teores superiores a esses. As substâncias húmicas podem compor mais de 80% da matéria orgânica de um solo e por essa razão essas substâncias podem ter um profundo papel nos aspectos físicos e químicos do solo. Com base nas suas características de solubilidade as substâncias húmicas se dividem em ácido húmico, ácido fúlvico e humina. O ácido fúlvico é solúvel em água e em condições ácidas (ph < 2,0), possui maior presença de grupamentos carboxílicos e de oxigênio, e menor concentração de carbono em relação aos ácidos húmicos, que são insolúveis em meio ácido e solúveis em meio básico. A humina, por sua vez, é insolúvel em meios ácido e básico, sendo mais polimerizada do que o ácido fúlvico e o ácido húmico (Schnitzer; Kodama; Ripmeester, 1991; MacCarthy et al., 1990). As substâncias húmicas são amorfas, escuras e com grande conteúdo de grupos orgânicos, tais como, carboxílicos, fenólicos, enólicos, alcoólicos, quinonas entre outros. Possuem massa molar aparente que varia de centenas a milhares de unidade de massa atômica e são substâncias bastante resistentes à degradação química e biológica (Schnitzer; Khan, 1978; Stevenson, 1994; Schulten; Schnitzer, 1997). Segundo (Stevenson, 1994), os caminhos pelos quais as substâncias húmicas são formadas são inúmeros, devido à grande quantidade de possíveis estruturas precursoras e ao enorme número de possibilidades de interação entre elas.

23 Capítulo 2 Revisão de Literatura 10 A área da ciência do solo na qual se estuda a composição química e o modelo estrutural das substâncias húmicas, tem tido grandes avanços nas últimas décadas contudo, ainda hoje não existe um modelo estrutural para as substâncias húmicas que explique totalmente a composição química, a estrutura, a forma e o tamanho, sendo que os modelos existentes geram controvérsias e discussões (Clapp; Hayes, 1999; Burdon, 2001; Hayes e Clapp, 2001; MacCarthy, 2001; Piccolo, 2001). Muitas estruturas foram propostas, cada uma delas foi caracterizada por grupos funcionais similares e a presença de componentes alifáticos e aromáticos. Baseados em uma variedade de técnicas e análises (Schulten; Schnitzer, 1993) propuseram uma estrutura para o ácido húmico (Figura 2.2). Figura Modelo de ácido húmico proposto por Schulten e Schnitzer (1993). Neste modelo (Figura 2.2) o oxigênio está presente como grupos carboxílicos, fenólicos, hidroxílicos, ésteres e éteres, nitrogênio está presente como estruturas heterocíclicas e como

24 Capítulo 2 Revisão de Literatura 11 nitrilas. A composição elementar da estrutura do ácido húmico é C 308 H 328 O 90 N 5 e tem tamanho molecular de 5540 Da. As afirmações e citações feitas anteriormente foram baseadas na proposta que substâncias húmicas seriam macromoléculas orgânicas, com características similares às macromoléculas biológicas como, proteínas, polissacarídeos, ácidos nucléicos e lignina (Swift, 1989). No entanto, recentemente, uma discussão emergiu na comunidade científica sobre o tipo real de estrutura molecular das substâncias húmicas: se são constituídos de estruturas macromoleculares como sempre se afirmou, ou se de estruturas supramoleculares, resultantes da associação de blocos moleculares relativamente pequenos, através de ligações de hidrogênio, associações de orbitais π - π, ou usando íons metálicos como Fe (III), Al (III) ou Cu (II) como mordentes (Piccolo; Nardi; Concheri, 1996). Atualmente dois modelos tentam explicar as características observadas para as substâncias húmicas, sendo eles: Macromolecular: neste modelo as variações conformacionais das substâncias húmicas são similares àquelas observadas nas macromoléculas biológicas como, proteínas, polissacarídeos, ácidos nucléicos e ligninas (Figura 2.3a) (Swift, 1989, 1999) e dependem da concentração das moléculas húmicas (Chen; Schnitzer, 1976), do ph (Senesi, Miano, Brunetti, 1996) e da concentração iônica (Ghosh; Schnitzer, 1980; Schnitzer, 1991). Além destas características, (Schulten; Schnitzer, 1997) propõem a existência de vazios hidrofóbicos dentro das moléculas (Figura 2.3b), o que foi corroborado pelo trabalho de (Wandruska, 1998), que definiu a estrutura das substâncias húmicas como uma estrutura pseudo-micelar de natureza polimérica.

25 Capítulo 2 Revisão de Literatura 12 (a) (b) Figura Modelos conceituais propostos pela teoria macromolecular: (a) moléculas das substâncias húmicas aleatoriamente enoveladas (Swift, 1989) e (b) ácido húmico proposto por Schulten e Schnitzer (1997), carbono=azul; oxigênio=vermelho; nitrogênio=preto e hidrogênio=branco. As letras A, B e C indicam os espaços vazios presentes na molécula das substâncias húmicas capazes de interagir com outros compostos. Supramolecular: neste modelo é proposto que as substâncias húmicas em solução formem grandes agregados húmicos que são estabilizados por ligações fracas, tais como, ligações de hidrogênio e/ou interações hidrofóbicas. Além disso, é proposto que as substâncias húmicas são provenientes de produtos de degradação enzimática de plantas e complexos de ligninas (Wershaw, 1986, 1993). Esse modelo foi embasado por (Conte; Piccolo, 1999) que deu origem à teoria supramolecular (Piccolo, 2001, 2002), na qual as substâncias húmicas são formadas por moléculas pequenas e heterogêneas de várias origens, auto-organizadas em conformações supramoleculares, o que explicaria o grande tamanho molecular aparente das substâncias húmicas. No conceito supramolecular, os ácidos fúlvicos são associações de pequenas moléculas hidrofílicas dispersas em solução devido à repulsão eletrostática das cargas negativas provenientes da dissociação dos grupos ácidos, como por exemplo, os carboxílicos, a qualquer valor de ph. Os ácidos húmicos são constituídos por associações de estruturas predominantemente hidrofóbicas (cadeias polimetilênicas, ácidos graxos e esteróides), que são estabilizadas em ph neutro por forças dispersivas hidrofóbicas

26 Capítulo 2 Revisão de Literatura 13 (van der Waals, π-π, e ligações CH-π). Os ácidos húmicos crescem gradualmente em tamanho com o decréscimo do ph até a sua precipitação. Segundo (Piccolo, 2001), a influência do ph ocorre por meio da protonação da molécula e conseqüente aumento das ligações de hidrogênio intermoleculares. O modelo supramolecular foi reforçado pelos resultados obtidos por (Simpson, 2002ab). Estes autores demonstraram que as substâncias húmicas extraídas de solos são formadas por uma mistura de substâncias agregadas de baixo peso molecular (em torno de 2000 Da) e propuseram um esquema de estrutura (Figura 2.4) para ilustrar como as principais estruturas identificadas nas substâncias húmicas poderiam formar um agregado na presença de cátions metálicos de ocorrência natural nos ecossistemas terrestres. Figura Esquema de estrutura das substâncias húmicas proposto por Simpson et al. (2002b). As unidades vermelhas representam os cátions metálicos, as unidades pretas os polissacarídeos, as unidades azuis os polipeptídios, as unidades verdes as cadeias alifáticas e as unidades marrons os fragmentos aromáticos provenientes da lignina. Diallo et al. (2003), utilizando dados experimentais e métodos computacionais, excluíram os modelos que sugerem que as substâncias húmicas sejam macromoléculas com alta massa molar ou a mistura de compostos orgânicos complexos e heterogêneos e observaram que as estruturas existentes possuem as características necessárias para formar

27 Capítulo 2 Revisão de Literatura 14 supramoléculas. Contudo, não conseguiram um modelo de isômero em três dimensões (3D) definitivo para o ácido húmico, sendo que apenas alguns isômeros prováveis foram propostos. Ainda que, inquestionáveis avanços foram promovidos pelo surgimento do modelo que propôs as substâncias húmicas como uma mistura de moléculas reativas e heterogêneas, ele ainda apresenta inúmeras limitações (Clapp; Hayes, 1999; Burdon, 2001; Hayes; Clapp, 2001; MacCarthy, 2001; Piccolo, 2001). A maior dificuldade encontrada na definição de um modelo para as substâncias húmicas, que englobe composição, estrutura, tamanho e reatividade, é a heterogeneidade química, sendo que há uma variabilidade desta heterogeneidade de acordo com a origem (aquática ou terrestre) ou da localização geográfica (Simões, 2005). Uma recente revisão (Sutton; Sposito, 2005) entende que o modelo que melhor descreve essas propriedades é aquele que propõe que as substâncias húmicas são agrupamentos de diversos componentes de relativamente baixa massa molecular formando associações dinâmicas estabilizadas por interações hidrofóbicas e pontes de hidrogênio Interações das substâncias húmicas com metais Uma das mais importantes propriedades das substâncias húmicas é a sua capacidade de interagir com íons metálicos do solo, tanto nutrientes quanto tóxicos, para formar complexos organometálicos e quelatos de diferentes estabilidades e características estruturais (Senesi; Sposito; Martin, 1986), podendo até mesmo controlar sua disponibilidade para as plantas. De modo geral, em solos minerais, pode-se esperar que mais de 50% do total dos elementos traços esteja associado a matéria orgânica (Kabata-Pendias; Pendias, 1985). A complexação de íons metálicos pelas substâncias húmicas é extremamente importante para a retenção e mobilidade dos contaminantes em solos e águas (Sparks, 1999). Interações entre substâncias húmicas e metais têm sido descritas como troca de íons, sorção superficial, quelação, coagulação e peptização (Kabata-Pendias; Pendias, 1985). Os grupos funcionais das

28 Capítulo 2 Revisão de Literatura 15 substâncias húmicas possuem diferentes afinidades por íons metálicos na ordem decrescente como se mostra abaixo (Sparks, 1999): Apesar do conhecimento da existência da interação das substâncias húmicas com íons metálicos (Stevenson, 1982), a natureza e extensão dessas interações não são completamente entendidas. O cátion pode estar ligado a dois ou mais ligantes de diferentes moléculas (Kabata-Pendias; Pendias, 1985). Praticamente todos os aspectos da química e da reatividade de elementos traços no solo estão relacionados à formação de complexos estáveis com substâncias orgânicas (Stevenson, 1994). Enquanto cátions monovalentes (Na +, K +, etc.) são mantidos principalmente pela simples formação de sais por reações de troca de cátions envolvendo grupos, tais como, carboxílicos e fenólicos. Cátions polivalentes (Cu 2+, Fe 3+ e outros), podem formar ligações coordenadas com moléculas orgânicas. A (Figura 2.5) mostra duas propostas de ligação com o Cu 2+, (a) a primeira com ligantes nitrogenados, mais estável e portanto menos disponível para as plantas e (b) a segunda, com ligantes oxigenados, menos estável (Martin-Neto et al., 1991). (a) (b) Figura Exemplos de complexos organometálicos.

29 Capítulo 2 Revisão de Literatura 16 Espectroscopia e outros métodos físico-químicos aplicados às substâncias húmicas mostram que existem quatro principais características estruturais dos ácidos húmicos e fúlvicos influenciando suas reatividades químicas (Sposito, 1989): Polifuncionalidade: que representa a existência de vários grupos funcionais, com reatividade diferentes, que são representativos de uma mistura heterogênea de polímeros que interagem entre si; Carga macromolecular: possui caráter aniônico, produzindo efeitos na reatividade dos grupos funcionais e na conformação molecular; Hidrofilicidade: a tendência que as substâncias húmicas possuem de formarem fortes ligações de hidrogênio com moléculas de água do meio, desta forma, solvatando grupos funcionais como COOH e OH; Labilidade estrutural: devido à capacidade de associações intermoleculares e de mudanças conformacionais em resposta a mudanças de ph, condições redox, concentração iônica e ligações químicas. A habilidade de um solo para reter cátions é uma propriedade de suas partículas minerais (argilas) e de seu comportamento húmico, assim ambos contribuem na capacidade de troca de cátions (Stevenson, 1994). A presença de cargas elétricas nas frações argilosas é resultado das substituições isomórficas, da ionização dos grupos OH e de cargas dependentes do ph associadas a óxidos de alumínio. Na estrutura macromolecular das substâncias húmicas as cargas provêm da ionização dos grupos carboxílicos e fenólicos, o que confere características polieletrolíticas que permitem formar ligações de hidrogênio com as águas de hidratação de cátions metálicos bem como, interações eletrostáticas mais fracas como, forças de van der Waals. A presença de grupos carboxílicos e fenólicos, permite também a formação de ligações químicas simples e ligações polidentadas produzindo quelatos.

30 Capítulo 2 Revisão de Literatura 17 Contudo, é necessário aprofundar os estudos sobre a complexação dos metais pesados com as frações da matéria orgânica do solo, visando esclarecer o destino destes metais no solo e a participação das substâncias húmicas e das frações físicas na retenção dos metais Caracterização da matéria orgânica Efeitos benéficos da utilização de lodo de esgoto na agricultura têm sido evidenciados por alguns pesquisadores (Berton; Camargo; Valadares, 1989; Oliveira, 2000; Melo; Marques, 2000; Simonete, 2001; Rocha; Gonçalves; Moura, 2004), no entanto, permanecem algumas dúvidas sobre a qualidade da fração orgânica do lodo de esgoto, sua dinâmica após aplicação no solo e os efeitos no estoque de carbono e na qualidade da matéria orgânica em áreas tratadas com esse resíduo. Com isso, os métodos químicos e espectroscópicos tem ampla aplicação no estudo da matéria orgânica do solo, especialmente das substâncias húmicas, bem como na identificação e caracterização dos diferentes compostos húmicos, na avaliação das alterações desses compostos e, no entendimento dos processos relacionados com a dinâmica da matéria orgânica após a aplicação do lodo de esgoto ao solo Métodos químicos O conhecimento dos teores de matéria orgânica é fundamental em diversas áreas da ciência do solo, visto que a matéria orgânica do solo desempenha um papel de suma importância do ponto de vista químico, físico e biológico. Diversos métodos têm sido utilizados para a determinação do teor de matéria orgânica do solo. Porém, há uma carência de informações consistentes quanto à definição e recomendação do método mais adequado para a obtenção de resultados confiáveis e satisfatórios (Conceição et al., 1999) Determinação da composição elementar (CHNS)

31 Capítulo 2 Revisão de Literatura 18 A análise elementar é o método mais usado para a determinação da composição elementar das substâncias húmicas, se baseia na detecção de quatro componentes (nitrogênio, carbono, hidrogênio e enxofre) de uma mistura, eluída e separada por uma coluna cromatográfica e detectada por um detector, na seqüência N 2, CO 2, H 2 O e SO 2. Com os dados da análise elementar não é possível se chegar a fórmula molecular dos ácidos húmicos ou ácidos fúlvicos, mas é possível ter uma noção da composição geral da molécula. A composição das substâncias húmicas é afetada por diversos fatores, como ph, material de origem, vegetação e uso do solo. Assim, solos neutros apresentam uma faixa estreita de valores para carbono, hidrogênio e nitrogênio, enquanto que solos ácidos apresentam uma faixa mais larga. Os ácidos fúlvicos são mais ricos em oxigênio e enxofre, enquanto que os ácidos húmicos são mais concentrados em carbono, hidrogênio e nitrogênio (Senesi; Loffredo, 1999). De um modo geral, os ácidos húmicos extraídos do lodo de esgoto apresentam altos teores de nitrogênio e enxofre, devido a decomposição de proteínas e surfactantes contendo enxofre Determinação da razão C/N A partir dos dados da análise elementar é possível calcular a razão C/N, que é uma das formas mais utilizadas para inferir o grau de humificação. Quanto menor a razão C/N maior o grau de humificação (Nicolardot; Recous; Mary, 2001). A razão C/N pode ser utilizada ainda para inferir o grau de estabilização da matéria orgânica, do ponto de vista ao ataque microbiano (Fernandes, 2000) Determinação de carbono por via seca - Total Organic Carbon (TOC) O carbono total é determinado pela oxidação do carbono orgânico e inorgânico à CO 2, devido ao aumento da temperatura a 900ºC.

32 Capítulo 2 Revisão de Literatura 19 A determinação do carbono inorgânico é realizada através da acidificação (ácido fosfórico) e, posterior aquecimento a 200ºC. Por diferença do carbono total e inorgânico é calculado o valor do carbono orgânico das amostras Determinação do teor de matéria orgânica por via úmida (Walkley-Black) A determinação da quantidade de matéria orgânica do solo baseia-se na sua oxidação à CO 2 por íons dicromato, em meio fortemente ácido. Em amostras que requeiram maior precisão, a determinação da quantidade de íons Cr(III) reduzidos é realizada indiretamente, por titulação dos íons dicromato em excesso, com íons Fe 2+. Alternativamente, pode-se determinar diretamente a quantidade de íons Cr(III) por colorimetria, medindo-se a intensidade da cor verde produzida por estes íons em solução. A determinação por colorimetria, normalmente utilizada em rotina, requer a montagem de uma curva-padrão de calibração. Essa curva é feita com uma série de amostras de solo, nas quais o teor de matéria orgânica é determinado por titulação, que apresenta maior precisão (Cantarella; Quaggio, Van Raij, 2001). Nos dois casos, a oxidação da matéria orgânica dá-se pela reação (Equação 2.1): 2 (Cr 2 O 7 ) C H + 4Cr CO H 2 O (2.1) Na reação, considera-se o dicromato reduzido equivalente ao carbono orgânico existente na amostra de solo, e o excesso de dicromato é titulado com íons de Fe 2+ obtidos a partir de uma solução padronizada de sulfato ferroso amoniacal. (Cr 2 O 7 ) Fe H + 2Cr Fe H 2 O (2.2) Na determinação por titulação, a quantidade de carbono orgânico é obtida pela diferença entre a quantidade de Fe 2+ gasta na titulação da prova em branco (Cr(VI) total adicionado) e aquela gasta na titulação do dicromato que restou após a oxidação do carbono da amostra. Convém frisar, que este método assume que todo o carbono da matéria orgânica está no estado de oxidação zero (Nelson; Sommers, 1996). Basicamente, trata-se de uma modificação do método conhecido por Walkley-Black, proposto para medir a matéria orgânica facilmente

33 Capítulo 2 Revisão de Literatura 20 oxidável ou decomponível do solo, que inclui húmus e resíduos, mas exclui carvão e carbonatos (Walkley, 1947; Walkley; Black, 1934). A reação, no método Walkley-Black, ocorre sem aquecimento externo, contando somente com o calor desprendido pela diluição do H 2 SO 4. Desse modo, a oxidação do carbono da matéria orgânica não é completa, para compensar a oxidação parcial aplica-se um fator de correção (1,33). Como o método determina o teor de carbono orgânico, a conversão para o teor de matéria orgânica é realizada através do fator de van Bemmelen (1,724), com base no pressuposto de que a matéria orgânica do solo contém 58% de carbono orgânico. A fórmula empregada é: Carbono Orgânico (g kg -1 ) / 1,724 = Matéria Orgânica (2.3) Métodos espectroscópicos A extração de substâncias húmicas e sua caracterização por meio de técnicas espectroscópicas têm gerado importantes resultados na avaliação da qualidade do solo, sob condições temperadas e tropicais, uma vez que fornecem informações sobre os grupos funcionais que constituem a matéria orgânica, muito embora, em sistemas tropicais, esses estudos sejam ainda reduzidos (Martin-Neto et al., 1991, 1994ab, 1998; Bayer et al.,1997; Milori et al., 2002; González-Perez et al. 2004). Mangrich (2001) ressalta que o conhecimento das estruturas químicas das substâncias húmicas é essencial para entender a sustentabilidade dos diferentes sistemas agrícolas, o ciclo global do carbono e a lixiviação de espécies químicas, que causam poluição das águas e o empobrecimento do solo Absorção de radiação no UV-Vis A espectroscopia na região do Ultravioleta ( nm) e Visível ( nm) permite a identificação de transições de elétrons dos orbitais moleculares σ-, π- e n- de seu estado energético fundamental para orbitais de maior energia em um estado excitado (Skoog; Holler; Nieman, 2002).

34 Capítulo 2 Revisão de Literatura 21 A absorção de radiação ultravioleta ou visível geralmente resulta da excitação de elétrons de ligação, como conseqüência, os comprimentos de onda dos picos de absorção podem ser correlacionados com os tipos de ligações nas espécies em estudo. A espectroscopia de absorção molecular é, portanto, valiosa para identificar grupos funcionais em uma molécula. Mais importantes, no entanto, são as aplicações da absorção de radiação no UV-Vis na determinação quantitativa de compostos contendo grupos absorventes (Skoog; Holler; Neuman, 2002). Conforme mostrado na (Figura 2.6), as energias dos vários tipos de orbitais moleculares diferem significativamente. Quase sempre o nível de energia de um elétron não-ligante situase entre os níveis de energia dos orbitais σ e π ligantes e antiligantes. As transições eletrônicas entre certos níveis de energia podem ocorrer por absorção de radiação. As transições possíveis de serem observadas nos espectros eletrônicos são: σ σ*, n σ*, n π* e π π*. Destas transições, a σ σ* é o único tipo que pode ocorrer com elétrons envolvidos em ligações simples, por exemplo, o metano, que contém apenas ligações simples C H e pode, portanto, sofrer apenas transições σ σ*, apresenta um máximo de absorção em 125 nm. Em relação a outras transições possíveis, a energia necessária para induzir uma transição σ σ* é alta, correspondendo a freqüências na região ultravioleta de vácuo. As transições n σ* ocorrem em geral em compostos saturados contendo átomos com pares de elétrons não compartilhados, tais como, oxigênio, nitrogênio e enxofre. Em geral essas transições requerem menos energia que o tipo σ σ* e podem ser produzidas por radiação na região entre 150 e 250 nm, com a maior parte dos picos aparecendo abaixo de 200 nm. As transições n π* e π π* são consideradas intensas, a maioria das aplicações da espectroscopia de absorção a compostos orgânicos esta baseada em transições de elétrons n e π para o estado excitado π*, porque as energias necessárias para esses processos situam-se em uma região espectral experimentalmente conveniente (200 a 700 nm). Ambas as transições

35 Capítulo 2 Revisão de Literatura 22 requerem a presença de um grupo funcional insaturado para fornecer os orbitais π (Skoog, Holler; Nieman, 2002). E σ* π* n π σ anti-ligante não-ligante ligante Figura Níveis de energia eletrônica molecular (Skoog; Holler, Nieman, 2002). A absorção de radiação UV-Vis de maior comprimento de onda está restrita a um número limitado de grupos funcionais (chamados cromóforos) que contêm elétrons de valência com energias de excitação relativamente baixas. Os elétrons que contribuem para a absorção de uma molécula orgânica são aqueles que participam diretamente na formação de ligação entre átomos e, portanto, estão associados a mais de um átomo e elétrons não-ligantes ou isolados externos que estão comumente localizados em átomos como, oxigênio, halogênios, enxofre e nitrogênio (Skoog; Holler; Neiman, 2002). Em função da grande quantidade e variabilidade de grupos cromóforos existentes nas macromoléculas húmicas, os espectros obtidos são geralmente formados pela sobreposição de várias bandas, sem picos definidos, apresentando absorção decrescente com o aumento do comprimento de onda. Os grupos responsáveis pela cor escura das substâncias húmicas ainda não estão completamente estabelecidos, mas se suspeita de uma combinação de vários tipos de estruturas (Figura 2.7). Alguns dos grupos mais comuns são (Stevenson, 1994):

36 Capítulo 2 Revisão de Literatura 23 Figura Cromóforos presentes nas substâncias húmicas. Na região do visível a razão entre as absorbâncias em 465 e 665 nm, chamada de razão E 4 /E 6, tem sido amplamente usada para caracterização das substâncias húmicas. Segundo (Stevenson, 1994), esta razão decresce com o aumento da massa molecular e da condensação dos anéis, sendo utilizada como um indicador do grau de condensação dos anéis aromáticos das substâncias húmicas e, portanto grau de humificação. Outros autores, entretanto, não relacionam a razão E 4 /E 6 a cadeias aromáticas condensadas, mas apenas à presença de cadeias aromáticas. Espectros de fluorescência absorvendo em menores comprimentos de onda e estudos com 13 C RMN poderiam indicar melhor a presença de estruturas condensadas e o grau de humificação entre substâncias húmicas isoladas de materiais diversos. Assim, (Chen; Senesi; Schnitzer, 1977) relaciona a razão E 4 /E 6 ao tamanho e ao peso molecular das substâncias húmicas, e não à concentração de anéis aromáticos condensados. Baes e Bloom (1990) relacionam a razão E 4 /E 6 apenas a absorção de fótons por grupos cromóforos, e conseqüentemente à quantidade destes. Colnago et al. (1997) estudando a correlação entre a razão E 4 /E 6 e aromaticidade dada por 13 C RMN em amostras de ácidos húmicos de Latossolo Vermelho, observaram uma correlação positiva (r = 0,67), bem como, aumento da aromaticidade e/ou diminuição da alifaticidade, porém concluem que esta razão relaciona-se a presença de anéis pouco ou muito condensados na molécula e não à aromaticidade total da molécula.

37 Capítulo 2 Revisão de Literatura 24 Os dados obtidos a partir da razão E 4 /E 6 são controversos na literatura e devem ser utilizados e correlacionados com o devido cuidado com outros parâmetros espectroscópicos mais precisos, como, nível de radicais livres do tipo semiquinona por RPE e grau de aromaticidade por 13 C RMN FTIR A radiação de infravermelho é a parte do espectro eletromagnético entre a região visível e as microondas. A região de maior interesse para a espectroscopia é de 4000 a 400 cm -1 (Stevenson, 1994). Absorção na região do infravermelho é causada por movimentos rotacionais e vibracionais dos grupos moleculares e ligações químicas de uma molécula. Essencialmente, existem duas vibrações fundamentais: estiramento, onde os átomos permanecem no mesmo eixo da ligação, porém a distância entre os átomos aumenta e diminui, e, deformação, onde as posições dos átomos mudam em relação ao eixo de ligação original. Quando luz infravermelha de mesma freqüência de vibração de estiramento ou de deformação incide na amostra a energia é absorvida e a amplitude de vibração é aumentada. Devido à energia de absorção na freqüência de ressonância, o detector do espectrômetro de infravermelho grava um pico de absorção naquele comprimento de onda (Stevenson, 1994). Vibrações típicas de um grupo de átomos são ilustradas na (Figura 2.8).

38 Capítulo 2 Revisão de Literatura 25 Figura Vibrações típicas de átomos. Os sinais + e significam vibrações perpendiculares ao plano do papel (Stuart, 1996). A FTIR é uma ferramenta que permite informar sobre a natureza, reatividade e arranjo estrutural de grupos funcionais contendo oxigênio, a presença de proteínas e carboidratos, e a eficiência do processo de purificação da amostra quanto a contaminantes como argila, metais e sais (Stevenson, 1982). Os espectros de infravermelho podem revelar as interações entre grupos orgânicos, como os carboxílicos e metais pesados, visto que a coordenação dos grupos funcionais orgânicos com metais provoca deslocamento na freqüência de absorção das ligações do íon carboxilato, o que permite a identificação da natureza (iônica ou covalente) da ligação organometálica (Vinkler; Lakatos; Meisel, 1976; Hernandez; Moreno; Costa, 1993). A espectroscopia de infravermelho tem sido extensivamente usada para a pesquisa de substâncias húmicas e tem fornecido considerável entendimento sobre a natureza, reatividade e arranjo estrutural do grupos funcionais contendo oxigênio nas substâncias húmicas. Espectros no infravermelho de substâncias húmicas resultam da absorção da radiação infravermelha por uma mistura complexa de moléculas que são por si próprias multifuncionais. O resultado do espectro infravermelho contém uma variedade de bandas que

39 Capítulo 2 Revisão de Literatura 26 podem indicar diferentes grupos funcionais presentes nesta mistura complexa (Stevenson, 1994). Em complementação aos dados obtidos por RMN, as análises de FTIR têm sido tradicionalmente usadas para identificar grupos funcionais como: grupos carboxila, amina, hidroxila, carbonila e outros (Schnitzer; Khan, 1972; Stevenson, 1994). Estas informações são úteis, pois permitem identificar possíveis processos de oxidação e alteração de grupos funcionais, associados aos efeitos de manejos, devido, por exemplo, ao aumento ou redução de aeração do solo, mudança no ph, complexação com micronutrientes provenientes de fertilizantes ou naturalmente ocorrendo no solo, e ainda com metais pesados. Vibrações de deformação geralmente requerem menos energia e são encontradas em freqüências menores do que as vibrações de estiramento. Estiramento devido à tripla ligação ( cm -1 ) é mais forte do que duplas ligações ( cm -1 ) e estas são mais fortes do que ligações simples, como C-C, C-O e C-N ( cm -1 ). Vibrações de estiramento envolvendo prótons (ex. C-H, O-H e N-H) ocorrem em freqüências entre 3700 e 2650 cm -1. O estiramento da ligação O-H ocorre em freqüência mais alta ( cm -1 ) do que para estiramento C-H ( cm -1 ) (Stevenson, 1994). Os principais grupos de absorção no infravermelho (região cm -1 ) nas substâncias húmicas são: cm -1 (estiramento OH ligado e estiramento N-H); 2930 cm -1 (estiramento CH alifáticos); cm -1 (estiramento C=O das cetonas e dos ácidos COOH); cm -1 (estiramento assimétrico C-O dos íons carboxilato COO-estiramento C=C dos anéis aromáticos, estiramento C=O e deformação N-H das amidas primárias); 1510 cm -1 (deformação N-H de amida II e estiramento C=C dos aminoácidos); 1450 cm -1 (deformação C-H dos CH 2 e CH 3 ); 1420 cm -1 (estiramento assimétrico C-O, deformação O-H e deformação C-O-H dos COOH e estiramento simétrico dos íons COO-);

40 Capítulo 2 Revisão de Literatura cm -1 (estiramento simétrico C-O e deformação OH dos COOH); 1125 cm -1 (estiramento C-O de álcoois, éteres, ésteres e COOH); 1035 cm -1 (estiramento C-O de polissacarídeos). As impurezas inorgânicas encontradas nesta região são: 3700 cm -1 estiramento axial de OH externo da estrutura da caulinita; 3620 cm -1 estiramento axial de OH interno da estrutura da caulinita; 3520, 3445, 3390 cm -1 estiramento OH em gibbsita; cm -1 estiramento Si-O-Si; quartzo; cm -1 caulinita, glauconita, montmorilonita, quartzo RMN A 13 C RMN é basicamente uma outra forma de espectroscopia de absorção, semelhante à FTIR ou UV-Vis. Sob condições apropriadas em um campo magnético, uma amostra pode absorver radiação eletromagnética na região de radiofreqüência em uma freqüência governada pelas características estruturais da amostra (Carvalho et al., 2004). A absorção é função de determinados núcleos das moléculas. Essencialmente, um experimento de 13 C RMN consiste em posicionar uma amostra entre os pólos de um campo eletromagnético e aplicar uma radiofreqüência variável. A excitação do núcleo do estado fundamental para um estado de energia mais alto resulta na absorção de radiação a uma freqüência própria, dando um espectro o qual consiste de uma ou mais linhas de ressonância. Um espectro de 13 C RMN é um registro gráfico das freqüências dos picos de absorção contra suas intensidades. O número e a intensidade dessas linhas estão relacionados com a estrutura da molécula (Carvalho et al., 2004). Com a técnica de 13 C RMN podemos fazer um estudo direcionado para um determinado núcleo, sendo esta uma das grandes vantagens da técnica.

41 Capítulo 2 Revisão de Literatura 28 A 13 C RMN é atualmente a técnica instrumental mais usada para caracterização das substâncias húmicas do solo, sendo possível a utilização de amostras sólidas e líquidas (Carvalho et al., 2004). Uma das observações de grande interesse na avaliação da estrutura de compostos húmicos são as possíveis mudanças estruturais destes, que refletem em alteração de suas propriedades nos solos. Tanto a RMN de 13 C quanto a de 1 H têm sido aplicadas em estudos relativos a conformações e estruturas moleculares da matéria orgânica com grande sucesso. A utilização de 13 C RMN de estado sólido é cada vez maior, porque possibilita o estudo de substâncias que são pouco solúveis ou mesmo insolúveis. A técnica não é destrutiva, preservando a amostra para outras análises, economizando solventes e permitindo a avaliação in situ da matéria orgânica do solo. Segundo (Preston, 1996), a ênfase inicial em estudos com 13 C RMN em ácidos húmicos e ácidos fúlvicos deve-se à necessidade de isolar a matéria orgânica do solo em frações solúveis e com alta concentração de carbono, a fim de sobrepor algumas limitações das técnicas espectroscópicas disponíveis. Com o desenvolvimento da 13 C RMN e a disponibilidade de equipamentos de maior potência, a técnica de 13 C RMN tem sido aplicada, no estudo da matéria orgânica, em amostras de solo intactos. No entanto, esta técnica apresenta algumas limitações, tais como, baixa sensibilidade devido a pequena abundância natural da maioria dos núcleos, entre eles o 13 C (~1,1%), chamado de núcleo raro, e os tempos de relaxação muito longos que exigem experimentos com longa duração. No caso de medidas de estado sólido, para obter espectros de alta resolução, devem ser resolvidos os três problemas seguintes (Carvalho et al., 2004): 1 - alargamento devido as interações dipolares heteronucleares ( 13 C, 1 H); 2 - alargamento devido a anisotropia do desvio químico; 3 - baixa sensibilidade devida aos longos tempos de relaxação spin-rede dos núcleos raros ( 13 C).

42 Capítulo 2 Revisão de Literatura 29 Estas três interações anisotrópicas estão presentes também nos líquidos, mas felizmente, são eliminadas pelo rápido movimento isotrópico browniano das moléculas. Estas limitações da 13 C RMN de estado sólido têm sido melhoradas recentemente com o desenvolvimento de técnicas novas e sofisticadas, tais como: desacoplamento de alta potência, técnica de rotação segundo o ângulo mágico (MAS) e polarização cruzada (CP) (Stevenson 1994). A técnica de desacoplamento é utilizada para o estudo de núcleos raros, a eliminação do alargamento de linha dipolar internuclear. O campo local que surge sobre os núcleos raros é devido à presença de núcleos abundantes, como exemplo, prótons em sólidos orgânicos. Desde que exista uma interação dipolar heteronuclear, é possível desacoplar os núcleos raros que estão sendo observados pelos abundantes. O desacoplamento é feito via redução do momento magnético efetivo do núcleo abundante, pela aplicação de um campo de radiofreqüência que mantém o momento de dipolo magnético do mesmo em alta rotação (Carvalho et al., 2004). A técnica de MAS é usada para eliminar a interação dipolar (homo e heteronuclear), fazendo a amostra rotacionar em torno de um certo ângulo denominado ângulo mágico, que é de Além de eliminar as interações dipolares esta técnica elimina também anisotropias do deslocamento químico e de interações quadrupolares (Jelinski; Melchior, 2000). Para superar os problemas relativos à baixa sensibilidade dos núcleos raros e seus longos tempos de relaxação spin-rede foi proposto o método de dupla ressonância denominado CP (Jelinski; Melchior, 2000). A idéia básica deste método é usar a relativamente intensa polarização de spins abundantes para aumentar, por transferência de polarização a pequena polarização dos núcleos raros. Desta técnica resulta um sinal de maior intensidade para núcleos raros e grande redução em seus tempos de relaxação spin-rede (Jelinski; Melchior, 2000).

43 Capítulo 2 Revisão de Literatura 30 Figura Espectro de 13 C RMN típico de ácido húmico mostrando os grupos funcionais associados às bandas correspondentes (Skjemstad; Janik; Taylor, 1998). Através da RMN podemos identificar grupos funcionais que possibilitam caracterizar a estrutura das substâncias húmicas. O espectro de 13 C RMN de um ácido húmico ou fúlvico, fornece um inventário de diferentes componentes dos quais o material é composto. Os principais grupos funcionais detectados por 13 C RMN no estado sólido em substâncias húmicas são (Figura 2.7) (Skjemstad; Janik; Taylor, 1998): grupos alifáticos (0-46 ppm), N-alifáticos e metoxílicos (46-67 ppm), o-alifáticos (67-94 ppm), di o-alifáticos ( ppm), aromáticos ( ppm), o-aromáticos ( ppm), carboxílicos ( ppm) e carbonílicos ( ppm). Uma das observações de grande interesse na avaliação do efeito dos diferentes manejos do solo sobre os compostos húmicos e frações organominerais são as possíveis mudanças estruturais destes, que refletem em alteração de suas propriedades nos solos. Estas mudanças podem afetar significativamente a dinâmica dos elementos químicos no solo, especialmente os micronutrientes e elementos traços. Certamente a 13 C RMN é a principal técnica para

44 Capítulo 2 Revisão de Literatura 31 identificar essas alterações e sua metodologia está bem estabelecida, principalmente a nível internacional RPE Internacionalmente, os primeiros estudos em ciências do solo envolvendo RPE foram desenvolvidos na década de 60 (Rex, 1960; Steelink; Tollin, 1962; Lagercrantz; Yhland, 1963; Steelink, 1964). No Brasil, o uso desta técnica na avaliação qualitativa da matéria orgânica é recente, sendo os primeiros resultados publicados na década de 90 (Martin-Neto et al., 1991, 1994ab, 1998; Bayer et al.,1997). A RPE ou ressonância de spin eletrônico é o fenômeno de absorção de energia de elétrons desemparelhados de um átomo, molécula ou íon, quando estes se encontram sujeitos a aplicações de um campo magnético e um pulso de radio freqüência, obedecendo ao efeito Zeeman. Ou seja, a transição entre os dois níveis ocorrerá quando uma energia E = g β Ho for fornecida ao sistema. Quando a condição de ressonância é satisfeita, o momento magnético sofre uma transição de uma posição paralela ao campo magnético Ho para uma posição antiparalela a este. A energia E normalmente é fornecida ao sistema através da exposição a um campo de microondas de freqüência fixa perpendicular ao campo Ho, o que é variado até que ocorra a transição.

45 Capítulo 2 Revisão de Literatura 32 m s = +1/2 hν = aβh m s = -1/2 Espectro de Absorção 1ª derivada do sinal Figura Esquema mostrando: (a) desdobramento dos níveis de energia do spin eletrônico na presença de um campo magnético; (b) forma da linha de absorção de energia do campo de microondas; (c) primeira derivada da linha de absorção. Com isso, essa técnica é sensível a espécies paramagnéticas, isto é, espécies que possuem átomos ou moléculas com pelo menos um elétron desemparelhado. Incluem-se nessa categoria os elementos de transição, semicondutores e radicais livres. Os processos de transformação da matéria orgânica no ambiente são conectados com várias reações envolvendo radicais livres. Estes radicais livres podem ser detectados nas substâncias húmicas pela RPE com um sinal estreito e intenso com g entre 2,0030 e 2,0043. Riffaldi e Schnitzer (1972), ressaltam a importância dos radicais livres como catalisadores nas reações de polimerização das substâncias húmicas, e (Steelink; Tollin, 1985), enfatizam a importância dos mesmos na germinação de sementes e no crescimento de raízes. Stevenson (1994) cita as quinonas presentes nos ácidos húmicos como a principal fonte de radicais livres das substâncias húmicas. Riffaldi e Schnitzer (1972), afirmam que os radicais livres do tipo semiquinona são formados a partir da remoção de H dos grupos OH dos fenóis (dehidrogenação oxidativa de compostos fenólicos), e que portanto, quanto maior a

46 Capítulo 2 Revisão de Literatura 33 concentração de fenóis no material de origem maior a concentração de spins nos ácidos húmicos formados a partir deles. Figura Esquema da estabilização do radical livre do tipo semiquinona (Senesi; Schnitzer, 1977). Figura Espectro típico de RPE de ácido húmico mostrando o sinal do radical livre do tipo semiquinona. A técnica de RPE pode informar sobre a natureza e concentração dos radicais livres orgânicos e inorgânicos, assim como da interação destes com íons metálicos paramagnéticos nas formas livres ou complexadas. Uma das principais informações a respeito das substâncias húmicas é a medida do grau de humificação (Martin-Neto; Rossel; Sposito, 1998). Um parâmetro que reflete essa propriedade intrínseca das substâncias húmicas é o nível de radicais livres do tipo semiquinona. A técnica de RPE permite detectar e quantificar os radicais livres do tipo semiquinona, e conseqüentemente o grau de humificação das substâncias húmicas. O número

47 Capítulo 2 Revisão de Literatura 34 de spins de radicais livres do tipo semiquinona é proporcional ao grau de humificação da matéria orgânica (Martin-Neto et al., 1994a). A técnica de RPE é uma das poucas, entre os métodos de laboratório que pode fornecer informações estruturais sem artefatos ou condições experimentais restritivas sobre a complexação dos íons metálicos paramagnéticos, grande parte micronutrientes (Fe, Cu, Cr, Mn, Mo) com as substâncias húmicas (Martin-Neto et al., 1991) Fluorescência O estado fundamental de uma molécula caracteriza-se pela configuração de menor energia que seus elétrons podem ocupar, ou seja, é o estado mais estável em que a molécula pode permanecer. Com energias acima do estado fundamental existem diversos outros níveis, denominados estados excitados, os quais podem ser acessados quando a molécula recebe um valor de energia equivalente à diferença de energia entre esses estados e o fundamental. Em cada um desses estados existem diversos níveis de energia vibracional. No estado fundamental os elétrons da molécula ocupam o nível de menor energia vibracional, mas ao serem excitados podem ser promovidos para qualquer nível vibracional de um estado excitado (Figura 2.13). Cerca de s depois ocorre a relaxação vibracional, um processo de decaimento não radioativo, que leva o elétron ao nível de menor energia vibracional do estado eletrônico em que ele se encontra. A molécula pode continuar perdendo energia por processos não radioativos até que o elétron excitado retorne ao estado fundamental ou o elétron pode permitir a diferença de energia na forma de radiação. Essa emissão é chamada de fluorescência e terá sempre uma energia menor que a energia de excitação da molécula devido à relaxação vibracional e a outros processos não radioativos que possam ocorrer (Skoog; Holler; Nieman, 2002). Transições típicas desse tipo envolvem a promoção de elétrons não-ligantes (n) ou ligantes (π) para orbitais antiligantes (π*). O processo de fluorescência envolve a emissão de fótons menos energéticos (maior λ) do que aqueles absorvidos para produzir o estado

48 Capítulo 2 Revisão de Literatura 35 excitado, é um processo rápido, que dura de 10-9 a 10-6 s. Esses processos são altamente prováveis em sistemas moleculares contendo átomos com pares de elétrons não compartilhados, tais como, oxigênio e nitrogênio e em estruturas aromáticas e/ou sistemas alifáticos conjugados de insaturações com alto grau de ressonância, isto é, deslocalização eletrônica de elétrons, como é o caso das substâncias húmicas (Senesi et al., 1991). Estruturas fluorescentes nativas ou incorporadas às substâncias húmicas, constituem apenas uma pequena porção da macromolécula húmica, entretanto sua variedade e a dependência de suas propriedades, de parâmetros moleculares e ambientais moleculares, permitem a obtenção de informações sobre seu comportamento fluorescente e sobre a natureza química das substâncias húmicas (Senesi; Loffredo, 1999). O comportamento fluorescente médio da molécula é o resultado da soma de todos os espectros individuais dos diferentes fluoróforos da molécula. π* n Absorção n π* Fluorescência π* n Decaimento não radioativo π Fosforescência π n Decaimento não radioativo Figura Transição eletrônica fluorescência molecular. A análise da fluorescência de um composto é uma técnica muito sensível devido à capacidade de se detectar o sinal proveniente de moléculas quando excitadas por um comprimento de onda específico. É também bastante seletiva, uma vez que os comprimentos de onda de excitação e emissão dependem do mesmo composto de interesse, fazendo com que o sinal de fluorescência coletado seja característico de cada molécula em estudo.

49 Capítulo 2 Revisão de Literatura 36 O uso da técnica de fluorescência nos estudos sobre substâncias húmicas está apoiado pela presença estável de várias estruturas fluorescentes intrínsecas a molécula húmica e a seus precursores, particularmente anéis aromáticos, fenóis e grupos quinona (Senesi et al, 1991). Algumas metodologias tem sido sugeridas na literatura (Zsolnay et al., 1999; Kalbitz; Geyer; Geyer, 1999; Milori et al., 2002) no sentido de aplicar esta técnica para avaliação da humificação das substâncias húmicas. Os espectros de fluorescência podem ser obtidos de três modos: emissão, excitação e excitação com varredura sincronizada. Os espectros de emissão são obtidos medindo a intensidade de radiação emitida como função do comprimento de onda, mantendo fixo o comprimento de onda de excitação, enquanto que os espectros de excitação são obtidos pela medida da intensidade de emissão, fixando o seu comprimento de onda de emissão e variando o comprimento de onda de excitação. Os espectros de excitação com varredura sincronizada são obtidos medindo a intensidade de fluorescência, quando a molécula é varrida por ambos os comprimento de onda, mas mantendo uma diferença de λ = λ em - λ exc, entre eles. Quando essa diferença é usada, esta técnica pode aumentar a intensidade de alguns picos, aumentando a sensibilidade do método. A localização do espectro de emissão pode indicar o grau de humificação das substâncias analisada, como indicavam os primeiros trabalhos com fluorescências em substâncias húmicas. Zsolnay et al. (1999) desenvolveram um índice de humificação baseado na localização do espectro de fluorescência no modo de emissão. Este índice considera a área de nm e a divide pela área de nm, quando os espectros forem obtidos através de excitação em 240 nm e ph da solução igual a 2,0. A partir de resultados obtidos, verificaram que quanto maior a área na região de maiores comprimentos de onda, maior seria o índice de humificação. Os resultados coincidiram com menores valores razões H/C e, portanto com maior grau de humificação das substâncias húmicas analisadas. Os autores citam a técnica

50 Capítulo 2 Revisão de Literatura 37 como promissora, visto que é mais rápida e menos custosa que as técnicas de FTIR ou 13 C RMN, e dependendo da amostra não são necessárias a concentração e separação dos componentes. Milori et al. (2002), usaram comprimento de onda azul (465 nm) como fonte de excitação. Observaram que esta absorção é mais ressonante com estruturas cuja concentração aumenta com o grau de humificação de ácidos húmicos. A partir desses estudos definiram que a área total sobre o espectro de fluorescência (A 465 ) é proporcional ao grau de humificação. Seus estudos foram realizados com amostras de ácidos húmicos extraídos de diferentes solos brasileiros, sobre condições climáticas distintas e com diferenças texturais e mineralógicas. Kalbitz, Geyer e Geyer (2000) utilizaram a técnica de fluorescência em modo de excitação com varredura sincronizada, analisaram amostras de águas de lagos sem nenhuma preparação e ácidos fúlvicos. Comparando os resultados verificaram que os resultados foram similares, o que significa que não havia necessidade de extração e fracionamento das substâncias húmicas quando o teor de carbono orgânico dissolvido fosse menor que 3,0 mg de carbono L -1, o que facilitaria na obtenção de resultados como a presença de estruturas aromáticas e o grau de humificação. Também, observaram que como nos espectros de emissão, mudanças para maiores comprimentos de onda nos espectros scans síncronos indicam aumento do número de núcleos aromáticos condensados e maior humificação das substâncias húmicas analisadas. Portanto, mudanças nos espectros de emissão e scan síncrono de substâncias húmicas, para maiores comprimentos de onda, ao longo do tempo ou após à adição de resíduos orgânicos aos solos, indicam maior humificação das substâncias húmicas nativas ou incorporação de compostos mais aromáticos e condensados à estrutura das substâncias húmicas nativas FIL

51 Capítulo 2 Revisão de Literatura 38 As metodologias de fluorescência citadas anteriormente exigem a extração e fracionamento químico das substâncias húmicas do solo, resultando na geração de resíduos químicos e tornando a análise de solos um processo lento e trabalhoso. Além disso, os produtos deste tratamento (ácido húmico, ácido fúlvico e humina) podem sofrer modificações em relação a sua forma in situ (Feller; Beare, 1997). Em contrapartida, a FIL aplicada à solos é uma nova metodologia, que tem se mostrado eficiente na análise da matéria orgânica de solos intactos, fornecendo resultados de uma maneira ágil, limpa e em condições próximas das naturais (Milori et al., 2003, 2006). Baseado neste fato é possível propor a FIL como parâmetro para estudar os processos de humificação em solos submetidos à adição de lodo de esgoto. Sua utilização é de maior relevância para os Latossolos, solos em que os conteúdos de ferro inviabilizam os estudos dos parâmetros de humificação através da 13 C RMN e RPE. A proposta de cálculo deste índice de humificação é a razão entre o valor da área do espectro de emissão de FIL (ACF) e o valor de carbono orgânico total (COT) presente na amostra de solo intacto (Milori et al., 2001), ou seja: H FIL = ACF (2.4) COT A FIL baseia-se na análise de pastilhas de solo (Figura 2.14), amostras de solos prensadas em molde de aço (1cm de diâmetro e 2 mm de espessura). Figura Pastilhas de solo utilizadas para a obtenção do espectro de FIL.

52 Capítulo 2 Revisão de Literatura 39 O princípio da técnica consiste, na excitação da amostra com um laser de argônio sintonizado na linha de 458 nm com uma potência de 300 mw, onde em seguida a fluorescência emitida é coletada com uma lente convergente com foco sobre um monocromador da marca CVI (1200 g mm -1 e blaze em 500 nm). A detecção é realizada com uma fotomultiplicadora Hamamatsu com pico de resposta espectral em 530 nm. O sinal da fotomultiplicadora é amplificado e retificado por um amplificador lock-in e em seguida enviado para um sistema de aquisição controlada por um computador. A resolução espectral deste sistema para fluorescência de solos é em torno de 4 nm (Figura 2.15). 10 Fonte -800 V osciloscópio 2 3 amostra Laser de argônio 2- Prisma 3,4,5- Espelhos planos 6- Lente convergente 7- Modulador (optical chopper) 8- Filtro 9- Monocromador 10- Fotomultiplicadora 11- Amplificador Lock-in 12- Sistema de aquisição (Micro) Figura Sistema para medida de FIL. 2.3 Contaminação do solo por metais pesados Como conseqüência do crescimento tecnológico e demográfico mundial, nas últimas décadas, intensificaram-se as atividades industriais e agrícolas, bem como o extrativismo mineral e a urbanização, os quais causaram considerável aumento dos níveis de contaminantes no ambiente, especialmente no solo. A contaminação do solo é crescente no mundo, já existindo grande extensão de áreas contaminadas por agentes diversos, tais como: sais, elementos metálicos, compostos orgânicos, organometálicos e elementos radioativos, que freqüentemente ocorrem em faixas de concentrações que representam perigo ambiental, com

53 Capítulo 2 Revisão de Literatura 40 impactos na vegetação, nos organismos do solo, nas águas superficiais e subterrâneas (Accioly; Siqueira, 2000). A contaminação do solo pode ser oriunda de contaminantes inorgânicos e orgânicos. Os contaminantes inorgânicos mais freqüentemente encontrados no solo são os metais pesados e os radionuclídeos. Embora amplamente utilizado, o termo metal pesado, não possui uma definição única, variando de acordo com o ramo da ciência que o aborda. Nesse, adotamos a definição mais comumente encontrada na literatura, onde metais pesados são elementos químicos com densidade maior que 5 g cm 3 (Berton, 2000; Marques, 1999; Malavolta, 1994). A expressão engloba metais, semi metais e até não metais como o selênio, portanto, trata-se de um conjunto heterogêneo de elementos. Toda a preocupação que se tem com os metais pesados é devido à sua capacidade de estabelecer ligações com grupos orgânicos em geral, em especial, com o grupo sulfidrila presente em proteínas. Essa característica é que os torna potencialmente tóxicos. Os metais pesados comumente associados com toxidez ou poluição são: Ar, Cd, Co, Cr, Cu, Pb, Hg, Mo, Ni, Se e Zn (Nellessen; Fletcher, 1993). Esses metais atingem o solo por meio de rotas diversas. Rejeitos com altas concentrações de diversos metais são gerados nas indústrias, especialmente na metalúrgica, na indústria coureira, de tintas e pigmentos, e de artefatos galvanizados. Resíduos urbanos, como compostos de lixo, lodo de esgoto e águas residuárias, também são ricos em metais pesados. A maioria desses rejeitos possuem, geralmente, como destino final aterros sanitários ou o solo, onde sofrem transformações químicas que resultam na biodisponibilização de formas anteriormente imobilizadas de metais presentes nos resíduos (Finnecy; Pearce, 1986; Stevenson, 1986; Sheppard et al., 1992). Uma vez liberados para a solução, os metais pesados podem ser lixiviados para o subsolo, atingindo o lençol freático, com sérias conseqüências. Podem ainda causar toxidez às plantas e organismos do solo ou ser adsorvidos nas argilas e complexados à matéria orgânica,

54 Capítulo 2 Revisão de Literatura 41 representando uma potencial fonte poluidora (Mattigod; Sposito; Page, 1981). Com isso, torna-se importante avaliar os conteúdos de metais pesados nos solos submetidos à adição de lodo de esgoto Caracterização espectrométrica ICP OES A técnica ICP OES é baseada na medida da intensidade da radiação emitida, quando um átomo ou íon excitado pelo plasma retorna ao seu estado fundamental. A excitação da espécie ocorre quando seus elétrons mais externos têm seu nível de energia aumentado, passando do estado fundamental para o excitado, devido a colisão com elétrons ou íons de argônio existentes no plasma. O elétron não é estável em níveis mais altos de energia, portanto retorna a seu estado fundamental, emitindo a energia que foi absorvida, sob a forma de energia luminosa (Skoog; Holler; Nieman, 2002). Os elétrons da espécie emitem linhas espectrais, tantas quantas forem suas possíveis transições; as linhas espectrais é que vão determinar o espectro de cada elemento, a intensidade de cada linha vai depender da probabilidade de transição, e do número de átomos que atinge um determinado estado excitado. A luz emitida é focalizada para uma lente que tem a função de ampliar e focalizar a zona de descarga luminosa do plasma quando projetada sobre a fenda de entrada, promovendo melhor iluminação da rede de difração. Uma vez tendo passado pela lente, a luz emitida vai em direção à fenda de entrada do separador de linhas e chega ao monocromador, onde um prisma ou uma rede de difração isola a linha medida. Em amostras com matrizes complexas, a escolha da linha isenta de sobreposições é necessária para funcionamento ideal da técnica. Essa é uma das razões pelas quais a linha de maior intensidade nem sempre seja a escolhida (Skoog, Holler; Nieman, 2002). A vantagem da ICP OES sobre espectrometria de absorção atômica, é a possibilidade simultânea de medir vários elementos como: P, C, Mg, Ca, Fe, Mn, Al, Si, Cu, Mo, B, Hg, Au

55 Capítulo 2 Revisão de Literatura 42 e outros, ou seja, é uma técnica multielementar, além de poder ser aplicada a diferentes concentrações, devido a possibilidade de escolha de linhas (Montaser; Golightly, 1992).

56 CAPÍTULO 3 MATERIAIS E MÉTODOS 2 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 AMOSTRA DE LODO DE ESGOTO O lodo de esgoto é proveniente da ETE da SABESP, em Barueri-SP. Figura Biossólido originado do lodo de esgoto coletado na ETE da SABESP, Barueri-SP. 3.2 AMOSTRAS DE SOLO Área experimental As amostras de solo foram coletadas em setembro de 2004, no 7º ano do experimento em campo, instalado em 1997 em áreas de monocultura de milho sob sistema de cultivo mínimo e adição de lodo de esgoto na área experimental da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Unesp, Jaboticabal-SP, sob a coordenação do Prof. Dr. Wanderley José de Melo. O clima da região é do tipo Cwa, segundo a classificação climática de Köeppen, com precipitação média anual de 1360 mm. As temperaturas máximas e mínimas médias anuais são 21 e 15ºC, respectivamente, e a altitude do local é de 575 m Classificação dos solos Foram estudados dois tipos de solo, classificados conforme o Sistema Brasileiro de Classificação de Solos (Embrapa, 1999), como LVef (ex Latossolo Roxo) e LVd (ex Latossolo Vermelho escuro), solos de grande ocorrência na região e em todo o estado de São

57 Capítulo 3 Materiais e Métodos 44 Paulo. Os solos analisados foram escolhidos em função de suas diferenças texturais. O LVef e LVd, apresentam teores de argila de 59 e 36% e teores de areia de 21 e 59%, respectivamente. (a) (b) Figura Solos Analisados: Perfil dos solos (a) LVef e (b) LVd Tratamentos Estes solos foram submetidos a dois tratamentos distintos, ou seja: Tratamento 1: testemunha, sem adição de lodo de esgoto e sem fertilização mineral no ano agrícola de 1997/98, e submetido à fertilização mineral com base na análise de terra nos anos agrícolas seguintes; Tratamento 2: com adição de lodo de esgoto, provenientes da ETE da SABESP, em Barueri-SP, nas doses 2,5 t ha -1 nos anos agrícolas 1997/98 a 1999/00 e 20,0 t ha -1 nos demais anos agrícolas, perfazendo uma dose acumulada do resíduo de 87,5 t ha -1, base seca. Figura 3.3 Aplicação do lodo de esgoto ao solo Amostragem Os solos foram coletados de parcelas de 6 m de largura e 10 m de comprimento (60 m 2 ), nas profundidades de 0-10; 10-20; e cm.

58 Capítulo 3 Materiais e Métodos 45 As amostras foram coletadas conforme o esquema de amostragem ao acaso, cinco pontos, dispostos em zigue-zague na parcela, intercalando-os na linha e entrelinha da cultura. Este procedimento foi adotado visando maior representativa. Figura Coleta das amostras de solo. Tabela Solos estudados e sua classificação conforme o Sistema Brasileiro de Classificação de Solos da Embrapa (1999), as profundidades coletadas e os tratamentos aos quais foram submetidos os solos. Solos Profundidades Tratamentos (cm) LVef 0-10 Sem adição de lodo de esgoto LVef Sem adição de lodo de esgoto LVef Sem adição de lodo de esgoto LVef Sem adição de lodo de esgoto LVef 0-10 Com adição de lodo de esgoto LVef Com adição de lodo de esgoto LVef Com adição de lodo de esgoto LVef Com adição de lodo de esgoto LVd 0-10 Sem adição de lodo de esgoto LVd Sem adição de lodo de esgoto LVd Sem adição de lodo de esgoto LVd Sem adição de lodo de esgoto LVd 0-10 Com adição de lodo de esgoto LVd Com adição de lodo de esgoto LVd Com adição de lodo de esgoto LVd Com adição de lodo de esgoto 3.3 PREPARO DAS AMOSTRAS DE SOLO E LODO DE ESGOTO PARA A EXTRAÇÃO Após a coleta as amostras foram levadas ao laboratório e colocadas para secar a temperatura ambiente. Em seguida foi realizada uma limpeza manual para a retirada de raízes