ENCAPSULAMENTO DE ANTOCIANINAS DO RESÍDUO DE UVA NIÁGARA BORDÔ USANDO A TÉCNICA SEDS
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1 ENCAPSULAMENTO DE ANTOCIANINAS DO RESÍDUO DE UVA NIÁGARA BORDÔ USANDO A TÉCNICA SEDS G.O. De Carvalho¹, G.P.S. Aguiar¹, A.E. dos Santos¹, C. Dal Magro¹, J. Vladimir Oliveira¹, M. Lanza¹ 1- Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos Centro Tecnológico Universidade Federal de Santa Catarina CEP Florianópolis Santa Catarina SC Brasil, Telefone: (048) (g.oliveira.eqa@gmail.com). RESUMO As antocianinas pertencem a classe dos flavonoides e compreendem um enorme grupo de corantes naturais, além de poderem trazer benefícios a saúde devido sua capacidade antioxidante. Porém, as antocianinas são instáveis quando estão expostas ao meio ambiente, por isso o encapsulamento surge como uma alternativa. A técnica de Dispersão de Solução Aumentada por Fluidos Supercríticos, conhecida como SEDS (do inglês Solution-Enhanced Dispersion by Supercritical Fluids), foi usada neste trabalho. A influência das concentrações da amostra de antocianina (4, 12 e 20 mg ml-1) e pressão (80, 90 e 100 bar) foi estudada em relação ao tamanho da partícula, percentual real de encapsulamento e a eficiência de encapsulamento de cada um dos ensaios. O ensaio com menor concentração e maior pressão obteve-se a melhor eficiência de encapsulamento (EE). ABSTRACT Anthocyanins belong to the class of flavonoids and comprise a large group of natural colorants, and can bring benefits to health due to its antioxidant capacity. However, anthocyanins are unstable when exposed to the environment, so the encapsulation appears as a solution. The technique of Solution Enhanced Dispersion by Supercritical Fluids, known as SEDS, was used in this work. It was studied the influence of the sample concentrations of anthocyanin (4, 12 and 20 mg ml-1) and pressure (80, 90 and 100 bar) in relation to the particle size and the actual percentage of encapsulation and encapsulation efficiency of each of the tests. The test with lower concentration and higher pressure gave the best efficiency percentage (EE). PALAVRAS-CHAVE: antocianinas, encapsulamento, nanocápsulas KEYWORDS: anthocyanins, encapsulation, nanocapsules 1. INTRODUÇÃO As antocianinas pertencem a classe dos flavonoides e compreendem um grande grupo de corantes naturais e são solúveis em água, podendo ser encontradas em diversos alimentos, como por exemplo o morango, a cereja, a azeitona, a uva e o repolho roxo (Constant, 2003). As antocianinas apresentam uma excelente aplicação como corante natural, pois podem trazer benefícios a saúde devido a sua capacidade antioxidante, sendo assim usadas como uma alternativa para os corantes sintéticos. Quando expostas ao meio ambiente, as antocianinas são altamente instáveis e podem ser destruídas rapidamente (Janna et al. 2007). Este problema é o principal motivo pelo qual, novas técnicas estão sendo desenvolvidas para promover um aumento na estabilidade das antocianinas, sendo o encapsulamento uma das possíveis soluções. Neste estudo, o encapsulamento será realizado utilizando o biopolímero poli(3- hidroxibutirato-co-valerato) (PHBV), que possui uma estrutura química muito similar à dos polímeros
2 sintéticos biodegradáveis, além de apresentar uma taxa de degradação mais lenta e por ser biodegradável, descrito por Pouton e Akntar (1996). Segundo Fages et al (2004), o uso de um fluído supercrítico no processo de encapsulamento é uma alternativa aos métodos convencionais, pois tem como vantagem um maior controle sobre a morfologia e distribuição de tamanho das partículas e alta pureza dos produtos, além de ser uma tecnologia limpa. Sendo um fluído supercrítico aquele que simultaneamente sofre aquecimento e compressão acima da sua temperatura e pressão crítica (Bozbag e Erkey,2012). O uso de CO 2 no método de encapsulamento se dá ao fato deste ser atóxico, não deixar resíduos no produto final, não ser inflamável, ao seu baixo custo e apresenta temperatura e pressão críticas relativamente baixas (Cocero et al, 2009). O objetivo deste trabalho foi avaliar as variáveis pressão e concentração onde obteve-se os melhores percentuais, menores diâmetros de partícula e maior eficiência do método de encapsulamento. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. Materiais A antocianina foi extraída pelo método do ph único, que é descrito por Fuleki e Francis (1968). Baseado neste método, a amostra de uva niágara bordô, foi submetida à extração utilizando como solvente extrator a mistura etanol-água (70:30 v/v) e ácido clorídrico (HCl 1,5 M) suficiente para ajustar o ph do meio para 1,5, e utilizando uma proporção de soluto:solvente de 1:1,5 (m:v). Por fim, obteve-se uma amostra com teor de antocianina de 316,90 mg para cada 100 g de extrato. 2.2.Reagentes O diclorometano (DCM 99,5%) adquirido da Vetec (Sigma-Aldrich), acetona 99,5% adquirido da Vetec (Sigma-Aldrich), PHBV com massa molar de e índice de poli dispersão de 1,85 cedido pela empresa PHB Industrial S/A, e dióxido de carbono fornecido pela White Martins S. A., com pureza de 99,8% Técnica de Dispersão da Solução Melhorada por Fluido Supercrítico (SEDS) A parte experimental da técnica de SEDS, utilizada para a coprecipitação da antocianina utilizando o CO 2 como fluído supercrítico foi descrito por Franceschi et al. (2008), Priamo et al. (2010) e Boschetto et al. (2013). Uma descrição mais detalhada do equipamento pode ser encontrada nos trabalhos de Franceschi et al. (2009), Priamo et al. (2010) e Boschetto et al. (2013) Condições de Precipitação e Coprecipitação Para o encapsulamento da antocianina foram usadas concentrações de 4, 12 e 20 mg.ml -1 da amostra, pressões de 80, 90 e 100 bar, que podem ser vistas na Tabela 1, a temperatura fixa de 35 ºC, taxa de fluxo de solução de 1mL.min -1 e taxa de fluxo de antissolvende de 20 ml.min -1. Com o intuito de verificar a influência das diferentes concentrações e pressões, foi realizado um delineamento composto experimental (DCC) com triplicata no ponto central. O procedimento experimental usado para o encapsulamento da antocianina foi adaptado baseado em trabalhos anteriores de Franceschi et al. (2008) e Priamo et al. (2010) e Boschetto et al. (2013). Todavia, neste trabalho, a amostra foi solubilizada primeiramente em acetona (40%), devido ao fato de a antocianina ser altamente solúvel em acetona, e o polímero foi solubilizado em diclorometano (60%), similar ao trabalho realizado por Aguiar et al. (2016).
3 2.5. Morfologia e Determinação do Diâmetro de Partícula A micrografia de partículas de antocianina foi efetuada num microscópio eletrônico de varredura (SEM - JEOL JSM-6390LV, EUA) para determinar a forma e morfologia das partículas, sendo analisada sob as seguintes condições: ampliações de 10 kvpower. O tamanho das partículas foi determinado através da medida do comprimento e espessura das partículas, utilizando o Medidor de Tamanho de software (versão 1.1) (Machado et al., 2014). A partir do tamanho de partícula médio calculado, o desvio padrão e o coeficiente de variação (CV) foram utilizados como ferramentas estatísticas para expressar a variabilidade dos dados Identificação e Quantificação de Solvente Residual Para identificação foi realizada cromatografia gasosa, CG modelo 5975C Inert MSD marca Agilent Technologies, acoplado a espectrometria de massas (CG-EM) em frasco de Headspace. As condições de operação foram adaptadas de acordo com metodologia descrita por Gudat et al. (2007) com coluna DB m x 0,45 mm x 2,55 µm. A quantificação do solvente residual foi realizada por cromatografia gasosa acoplada ao detector por ionização de chama (CG-FID) utilizando as mesmas condições de operações do CG-EM. 3. RESULTADOS E DISCUSSÕES Os resultados do planejamento estão expostos na Tabela 1, onde é possível encontrar o tamanho médio das partículas para cada ensaio, assim como a sua variância. Onde foi observado que as partículas são caracterizadas como nanopartículas, pois em todos os ensaios foram obtidos valores menores que 300 nm ou 0,3 µm. Tabela 1 - Resultados do planejamento para antocianina Ensaio Concentração (mg ml -1 ) Pressão (bar) Média (micron) ± Desvio Padrão (micron) Variância (CV) ,2460 ± 0,0818 0, ,2807 ± 0,0898 0, ,2844 ± 0,1340 0, ,2226 ± 0,0897 0, ,2490 ± 0,1136 0, ,2778 ± 0,1173 0, ,2969 ± 0,1204 0,4056 Também pode ser observado que as menores partículas foram formadas quando se adotou os maiores valores de concentração de amostra (20 mg ml -1 ) e pressão (100 bar). Além disso, foi observado que em pressões menores o tamanho da partícula aumentou. E segundo Franceschi et al. (2008) e Hong et al. (2009) que também utilizaram a técnica SEDS, observaram que, para certos casos, uma diminuição da pressão pode provocar um aumento no tamanho da partícula, e o aumento da pressão pode acarretar a redução do diâmetro de partícula.
4 Figura 1 - Resultados da microscopia eletrônica (MEV) para cada ensaio da amostra Na Figura 1, onde estão apresentadas as análises de MEV, para todos os ensaios, observa-se que as partículas formadas, em sua grande maioria, apresentam uma morfologia esférica porém, ocorre uma tendência a formação de aglomerados de partículas. Segundo Reverchon et al. (2008), a formação de partículas com morfologia esférica é estudada por pesquisadores, pois há uma enorme possibilidade de aplicação industrial para este tipo de partícula. Tabela 2 - Resultados do percentual real de encapsulamento e da eficiência de encapsulamento Ensaio Concentração (mg ml -1 ) Pressão (bar) PRE (%) EE (%) ,84 55, ,63 23, ,54 66, ,50 23, ,30 24, ,26 19, ,08 25,99 Na Tabela 2, percebe-se que um dos maiores valores encontrados para o percentual real de encapsulamento (PRE) e o maior valor encontrado para a eficiência de encapsulamento (EE) foi obtido no ensaio 3, onde foi adotada a maior pressão (100 bar) e a menor concentração de antocianina (4 mg ml-1 sso é explicado por De Paz et al. (2012), que diz que a eficiência de encapsulamento pode estar relacionada com a concentração do agente encapsulante, que no caso deste experimento se
5 manteve constante para todos os ensaios. Se a concentração do agente encapsulante for muito alta quando comparada a concentração da amostra, este pode mais facilmente envolver as partículas do extrato. Quanto a pressão, foi observado que a mesma não influenciou no processo. Figura 2 - Gráfico de Pareto apresentando a influência da concentração e da pressão na eficiência de encapsulamento (1)Concentração [mg/ml](l) -10,97 Pressão [bar](q) 7, Lby2L -1,55418 (2)Pressão [bar](l) 1, p=,05 Efeitos estimados (Valores absolutos) De acordo com a análise da Figura 2, apenas a concentração influenciou na eficiência de encapsulamento, sendo esta influência negativa, o que significa que a medida que a concentração da amostra aumenta, menor vai ser a eficiência de encapsulamento, sendo também observado por Boschetto (2013). A análise residual de solventes realizada mostrou que não houve a presença de resíduo nas nanocápsulas formadas durante o experimento, ou seja, as nanocápsulas obtidas neste trabalho estão adequadas para consumo humano. 4. CONCLUSÃO Os resultados deste trabalho são de importância relevante, pois foram formadas nanopartículas que acarretam uma modificação das propriedades de superfície das partículas e principalmente, proteger a estabilidade do material encapsulado. Neste trabalho, também foram obtidos valores consideráveis de eficiência de encapsulamento, 66,14%, nas condições onde a concentração de amostra é de 4 mg ml -1 e a pressão é de 100 bar. Outro resultado relevante, é que não houve presença de nenhum resíduo de solvente nas cápsulas formadas no processo de SEDS, o que torna viável o seu uso em produtos fármacos e alimentícios. 5. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Projeto Universal N /2013-1) e à CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pelo apoio financeiro e ao laboratório de microscopia eletrônica -UFSC (LCME) pela análise de MEV.
6 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Aguiar, G.P.S., Boschetto, D.L., Chaves, L.M.P.C., Arcari, B.D., Piato, A.L., Oliveira, J.V. & Lanza, M. (2016). Trans-resveratrol micronization by SEDS technique. Industrial Crops and Product, 89, Boschetto, D.L.; Dalmolin, I.; Cesaro, A.M.; Rigo, A.A.; Ferreira, S.R.S.; Meireles, M.A.A. Phase behavior and process parameters effect on grape seed extract encapsulation by SEDS technique, Ind. Crops Prod. v.50, , Bozbag, S.E.; Erkey, C. Review Supercritical fluids in fuel cell reserach and development. Journal of supercritical Fluids, v. 62, p , Carlson, L.H.C.; Bolzan, A. Size Meter, Versão 1.1. Laboratório de controle de processo (LCP). Universidade Federal de Santa Catarina, Cocero, M.J.; Ferrero, S. Crystallization of β-carotene by a GAS process in batch Effect of operating conditions. Journal of Supercritical Fluids, 22 (2002), Cocero, M.J.; Martin, A.; Mattea, F.; Varona, S. Review: Encapsulation and co-preciptation processes with supercritical fluids: Fundamentals and applications. The Journal od Supercritical Flids, v. 47, p , Constant, P.B.L. Extração, Caracterização e aplicação de antocianinas de açaí. Tese de Doutorado, Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa, De Paz, E.; Martin, A.; Duarte, C.M.M; Cocero, M.J. Formulation of β-carotene with poly-(εcaprolactones) by PGSS process. Powder Technology, v. 217, p , Elvassore, N.; Bertucco, A.; Caliceti, P. Production of insulin-loaded poly(ethylene glycol)/poly(l lactide) (PEG/PLA) nanoparticles by gas antisolvent techniques. J. Pharmacol. Sci. 90 (2001), Fages, J.; Lochard, H.; Letorneau, J.J; Sauceau, M.; Rodier, E. Particle generation for pharmaceutical applications using supercritical fluid technology. Powder Technology, 141, , Franceschi, E.; Cesaro, A.M.; Feiten, M.; Ferreira, S.R.S.; Dariva, C.; Kunita, M.H.; Rubira, A. F.; Muniz, E. C.; Corazza, M. L.; Oliveira, J. V. Precipitation of β-carotene and PHBV and coprecipitation from SEDS technique using supercritical CO2. J. of Supercritical Fluids. 47 (2008), Franceschi, E., Cesaro, A.M., Ferreira, S.R.S., Oliveira, J.V. Precipitation of β-carotene microparticles from SEDS technique using supercritical CO 2. Journal of Food Engineering, 95 (2009), Fuleki, T.; Francis, F.J. Quantitative methods for anthocyanins. 1. Extraction and determination of total anthocyanin in Cranberries. Journal Food Science, v. 33, p.72-77, 1968 a. Hong, H.L.; Suo, Q.L.; Han, L.M.; Li, C.P. Study on preciptation of astaxantin in supercritical fluid. Powder Technology, v. 191 (3), p , Janna, O.A.; khairul, A.K.; Maziah, M.; Anthocyanin stability in Tibouchina semidecandra L., Food Chemistry, v. 101, , Machado Jr., F.R.S., Reis, D.F., Boschetto, D.L., Burkert, J.F.M., Ferreira, S.R.S., Oliveira, J.V., Burkert, C.A.V., Encapsulation of astaxanthin from Haematococcus pluvialis in PHBV by means of SEDS technique using supercritical CO2. Ind. Crops Prod. 54, 17 21, Malacrida, C.R., Motta, S., Antocianinas em suco de uva: composição e estabilidade, Boletim do CEPPA, v. 24, n. 1, 59-82, Priamo, W.L.; Cesaro, A.M.; Ferreira, S.R.S.; Oliveira, J.V. Precipitation andencapsulation of β- carotene in PHBV using carbon dioxide as anti-solvent. J. Supercrit. Fluids, 54 (2010), 103. Pouton, C.W; Akhtar, S. Biosynthetic polyhydroxyalkanoates and their potential in drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 18, , Reverchon, E.; Adami, R.; Caputo, G.; De Marco, I. Spherical microparticles production by supercritical antisolvent precipitation: Interpretation of results. Journal of Supercritical Fluids, 47 (2008),
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