DETECÇÃO DE DNA DE Mycobacterium leprae EM PACIENTES COM HANSENÍASE E SEUS CONTATOS DOMICILIARES ASSINTOMÁTICOS

Transcrição

1 1 PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTU SENSU MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS-IMUNOPATOLOGIA DAS DOENÇAS INFECCIOSAS E PARASITÁRIAS RAFAEL SILVA GAMA DETECÇÃO DE DNA DE Mycobacterium leprae EM PACIENTES COM HANSENÍASE E SEUS CONTATOS DOMICILIARES ASSINTOMÁTICOS GOVERNADOR VALADARES-MG ABRIL 2012

2 2 RAFAEL SILVA GAMA DETECÇÃO DE DNA DE Mycobacterium leprae EM PACIENTES COM HANSENÍASE E SEUS CONTATOS DOMICILIARES ASSINTOMÁTICOS Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Ciências Biológicas da Universidade Vale do Rio Doce, para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas na área de Imunopatologia das Doenças Infecciosas e Parasitárias. Orientador: Dr. Nilton Barnabé Rodrigues Co-orientadora: Dra. Lúcia Alves de Oliveira Fraga GOVERNADOR VALADARES-MG

3 3 ABRIL 2012 Gama, Rafael Silva Detecção de DNA de Mycobaterium leprae em pacientes com hanseníase e seus contatos domiciliares assintomáticos / Rafael Silva Gama f. Dissertação (mestrado) Universidade Vale do Rio Doce, Programa de Pós Graduação Stricto Sensu em Ciencias Biológicas, Governador Valadares, MG Orientador: Nilton Barnabé Rodrigues Co-Orientadora: Lucia Alves de Oliveira Fraga 1. Hanseníase. 2. Contatos domiciliares. I. Rodrigues, Nilton Barnabé. II. Fraga, Lucia Alves de Oliveira. III. Universidade Vale do Rio Doce. IV. Título. CDD

4 4 RAFAEL SILVA GAMA DETECÇÃO DE DNA DE Mycobacterium leprae EM PACIENTES COM HANSENÍASE E SEUS CONTATOS DOMICILIARES ASSINTOMÁTICOS Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Ciências Biológicas da Universidade Vale do Rio Doce, para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas na área de Imunopatologia das Doenças Infecciosas e Parasitárias. Governador Valadares, de de. Banca Examinadora: Examinador(a) Examinador(a)

5 5 Dedico este trabalho ao meu bom Deus que tanto me ama e que me faz experimentar a Tua graça todos os dias, em especial estes dois últimos anos de muito esforço e superação.

6 6 O nosso Amor nos fará ir além do que sonhamos, e o melhor, com a Benção de Deus. Chaiana Fróes Magalhães

7 7 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por me sustentar em todos os momentos, principalmente aqueles que exigiam de mim, muito mais do que eu acreditava que seria capaz. Em especial, agradeço por confiar a mim, a missão de evangelizar e tornar realidade o sonho de entronizar o Santíssimo Sacramento na Univale. Á Nossa Senhora agradeço pela constante intercessão e por me ensinar a experimentar o seu filho Jesus. Aos meus pais pelo amor incondicional, e por ensinar a cada dia o Valor de uma família. Por Várias Vezes abrir mão de seus próprios sonhos, para que os meus se tornassem realidade. Ao meu pai, agradeço pela luta diária, pela segurança e dedicação para me oferecer sempre o melhor. Quando criança, lembro que sempre antes do cochilo no horário de almoço, ele dizia a mim e a minha irmã: Não Vem não!, isto só para nos ver correndo e pulando na cama. Pai, agradeço por ser um homem simples, e por ter este grande coração acolhedor. Obrigado Pai, por me ensinar a ser um homem justo. A Você mãe, agradeço pelo carinho, cuidado e proteção mesmo a distância. Suas orações me fazem sempre ir além, mesmo quando não tenho forças para caminhar. Não esqueço como era bom te ver chegando da escola e sair correndo só para te ajudar a carregar os materiais. Obrigado por me ensinar os deveres de casa, isso me fez hoje um mestre. Mãe, tão singela, doce e pura, verdadeira imagem de Nossa Senhora. Aos meus irmãos agradeço pelo carinho, cumplicidade e proteção. Obrigado por nunca deixarem que a distância interferisse no grande amor que sentimos um pelo outro. Como é bom poder contar com vocês sempre! Ao meu sobrinho e afilhado, Rafaelzinho, agradeço por trazer alegria e amor à nossa família. Saiba que sinto sua falta todos os dias. O Pado te ama com todo o amor do mundo. Aos meus cunhados, agradeço pela amizade, em especial a Paula por ter me presenteado com o Gabriel. Ao meu avô Felix (in memória), agradeço por ser o primeiro a me ensinar a escrever o meu nome e por suas histórias de Vida. Ao meu avô Agnelo, agradeço pelo imenso carinho e por ser um exemplo de homem guerreiro. Á Você Vilma, agradeço por me considerar um neto. Agradeço muito a minha namorada Chaiana, pelo grande amor e compreensão. Como Você me faz experimentar o amor de Deus! Você sabe que é um presente de Deus pra mim! Obrigado pela grande cumplicidade que temos um pelo outro. Você foi essencial pra mim,

8 8 nestes últimos meses, ficando ao meu lado, compartilhando minhas alegrias e dificuldades. Obrigado por me fazer um homem melhor. Como é bom sentir o seu amor por mim! Eu te amo, princesa! Agradeço aos meus primos e tios por estarem sempre presentes em minha Vida, em especial á Maurinha, pela dedicação e carinho. Aos amigos do Núcleo de Pesquisa em Imunologia, agradeço por terem sido a minha família em Governador Valadares, por me acolherem e pelos Vários momentos que me fizeram esquecer o quanto estava longe de minha casa. E aos colegas de mestrado e iniciação científica pela ajuda e pelo bom convívio. Ao grupo de Oração Universitário e o Ministério Jovem agradeço por me ensinarem como é bom sentir o grande amor de Deus. Em especial agradeço o meu irmão de caminhada Thalisson, sem ele, talvez não fosse possível realizar a missão que Deus tinha para a Univale. Continue firme na caminhada, Deus ainda tem muito a fazer por Você. Obrigado pela sincera amizade. Agradeço aos meus orientadores, pelos ensinamentos que contribuíram para meu crescimento e formação profissional, em especial a professora Lúcia, que nunca mediu esforços para que eu alcançasse meus objetivos. Obrigado pelas oportunidades dadas ao longo desta caminhada, por me mostrar que em tudo na Vida existe um lado bom e que tudo podemos com a Graça de Deus. Agradeço aos pesquisadores da FIOCRUZ/RJ, em especial a Dra. Euzenir Sarno, Dr. Milton Ozório e Suelen pelo incentivo e oportunidade em desenvolver meu projeto de mestrado. À equipe do CREDEN-PES agradeço pelo compromisso de promover a integração do serviço de saúde e universidade. Ao professor Alexandre Sylvio, deixo o meu muito obrigado pela ajuda nas análises dos meus resultados. Enfim, a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho. Com dedicação, esforço e fé, realizamos qualquer sonho, mesmo que aos olhos de muitos, possa parecer impossível. De uma coisa tenho certeza, Deus realizou coisas grandiosas em minha Vida. E com a Tua benção e a proteção de Nossa Senhora, hoje eu posso dizer que venci.

9 9 RESUMO Métodos bacteriológicos clássicos para identificação de bactérias patogênicas não podem ser aplicados para o diagnóstico de hanseníase, sobretudo pela impossibilidade de cultivo in vitro do M. leprae. O exame histopatológico e a baciloscopia tem sido utilizados como métodos auxiliares para a classificação clínica dos casos. O advento de técnicas de biologia molecular com boa especificidade e alta sensibilidade tem sido avaliada como ferramentas de diagnóstico precoce na hanseníase. O objetivo deste trabalho foi avaliar a qpcr como ferramenta para identificar o DNA de M. leprae, bem como comparar os níveis de DNA bacilar em amostras de raspado dérmico e sangue de pacientes com hanseníase e seus contatos domiciliares. Um total de 156 indivíduos participaram deste estudo, sendo 43 casos índices e 113 contatos domiciliares. A qpcr foi realizada para amplificar fragmentos 16S rrna, específicos para o M. leprae. Em nossos resultados a PCR foi positiva com o primer 16S rrna em 21 (48,84%) dos 43 pacientes diagnosticados com hanseníase enquanto a baciloscopia foi positiva em apenas 13 (30,23%) pacientes. Em relação aos contatos domiciliares 27 (23,89%) dos 113 indivíduos apresentaram DNA bacilar. A carga bacilar dos contatos estava semelhantes a carga bacilar dos casos PB. A qpcr foi capaz de detectar DNA bacilar em amostras biológicas nas quais a baciloscopia foi negativa. Além disso, a positividade da qpcr foi maior que a baciloscopia, nos casos índices com menos de 5 lesões. Verificamos que 23,89% dos contatos apresentaram DNA M. leprae na qpcr e que o nível de DNA bacilar nestes indivíduos foi semelhante ao nível dos grupos PB, DM 1 e DM 2. Ao contrário, o nível de DNA bacilar foi significativamente maior no grupo VV. A incorporação desta técnica no sistema de saúde se faz necessária, bem como o acompanhamento e o tratamento dos contatos positivos na qpcr como estratégias para o controle da hanseníase em áreas endêmicas. Palavras-chave: Hanseníase. qpcr. 16S rrna. Contatos assintomáticos.

10 10 ABSTRACT Classical bacteriological methods for identification of pathogenic bacteria can not be applied to the diagnosis of leprosy, especially the inability of in vitro cultivation of M. leprae. The histopathology and smear microscopy has been used as auxiliary methods for the clinical classification of cases. The advent of molecular biology techniques with good specificity and high sensitivity has been evaluated as tools for early diagnosis of leprosy. The objective of this study was to evaluate the qpcr as a tool to identify DNA of M. leprae, and to compare the levels of bacterial DNA in samples of dermal scrapings and blood of patients with leprosy and their household contacts. A total of 156 individuals participated in this study, 43 index cases and 113 household contacts. The qpcr was performed to amplify 16S rrna fragments, specific for the M. leprae. In our PCR results were positive with 16S rrna primer in 21 (48.84%) of 43 patients diagnosed with leprosy while the smear was positive in only 13 (30.23%) patients. In relation to household contacts 27 (23.89%) of 113 subjects had bacterial DNA. The bacterial load of the contacts was similar to the bacterial load of PB. The qpcr was able to detect bacterial DNA in biological samples in which the smear was negative. Furthermore, a positive qpcr smear was higher than in index cases under 5 lesions. We found that 23.89% of the contacts showed DNA M. leprae qpcr and in that the level of bacterial DNA in these subjects was similar to the group level CP, DM and a second MD. Rather, the level of bacterial DNA was significantly higher in the VV. The incorporation of this technique in the health system is needed, as well as the monitoring and treatment of positive contacts in qpcr as strategies for the control of leprosy in endemic areas. Keywords: Leprosy. qpcr. 16S rrna. Asymptomatic contacts.

11 11 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO JUSTIFICATIVA OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS METODOLOGIA LOCAL DE ESTUDO IDENTIFICAÇÃO E PERFIL DOS PACIENTES PARTICIPANTES COLETA DAS AMOSTRAS BIOLÓGICAS BACILOSCOPIA COMITÊ DE ÉTICA E TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO EXTRAÇÃO DE DNA EM AMOSTRAS DE RASPADO DÉRMICO EXTRAÇÃO DE DNA EM AMOSTRAS DE SANGUE ENSAIO DE PCR EM TEMPO REAL - QPCR ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS DETECÇÃO DE DNA DE M. LEPRAE NOS CASOS ÍNDICES DE HANSENÍASE DETECÇÃO DE DNA DE M. LEPRAE NOS CONTATOS DOMICILIARES DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS ANEXOS COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA NA UNIVALE TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO TABELAS DAS ANÁLISES ESTATÍSTICAS... 53

12 12 1 INTRODUÇÃO A hanseníase é uma infecção granulomatosa crônica que acomete pele e nervos periféricos, com possibilidade de desenvolvimento de neuropatia periférica e consequente perda sensorial e motora de membros. A forma de transmissão mais provável ocorre por via aérea superior através do convívio entre pacientes infectados com a forma contagiante e suscetíveis. O período de incubação da patologia varia entre 2 a 5 anos (TALHARI; NEVES, 1997; NOORDEEN, 1985). O agente causador da hanseníase, o Mycobacterium leprae, foi descrito em 1873 por Gerhard Henrik Armauer Hansen, como um bacilo reto ou ligeiramente encurvado que se cora em vermelho pela fucsina e não se descora pela lavagem em solução álcool-ácido, sendo, portanto classificado como um bacilo álcool-ácido resistente (BAAR) (SAMPAIO; RIVITTI, 1998). Este bacilo apresenta tropismo pelas extremidades do corpo, onde a temperatura é menor que 37ºC favorecendo o seu metabolismo (HASTINGS et al., 1988). O M. leprae é uma bactéria de replicação lenta, com divisão binária a cada 12 a 21 dias e não cultivável. Trata-se de um bacilo de localização intracelular obrigatória, que tem tropismo por macrófagos na pele e por células de Schwann nos nervos periféricos (GOULART et al., 2002). Uma notável característica do genoma do M. leprae é a grande quantidade de pseudogenes, que ocupa quase a metade de seu cromossomo. A excessiva perda da função gênica é apontada como a principal causa da taxa de replicação lenta do bacilo e impossibilidade de coletivo in-vitro (MONOT et al., 2009). A infecção dos macrófagos pelo M. leprae, gera lesões na pele com aspecto de placa, pápula, infiltração difusa e mais raramente como nódulos. As lesões podem ser hipopigmentadas ou como infiltrado com bordas elevadas, ambas com perda de sensibilidade (AZULAY; AZULAY, 1997). O tropismo específico pelas células de Schwann pode ser explicado pela ligação à laminina 2 que compõe a lâmina basal destas células, sendo esta forma de laminina restrita aos nervos periféricos (RAVUKKANA et al., 1997). Os nervos periféricos são afetados no túnel fibro-ósseo próximo à superfície da pele, incluindo o nervo auricular, ulnar, radial cutâneo, nervo mediano, poplíteo lateral e tibial posterior. O acometimento destes nervos gera espessamento e, como característica, a perda sensorial e motora. Além disso, os nervos sensoriais e autonômicos também são afetados

13 13 produzindo hipoestesia. Desta forma, a sensibilidade das mãos e pés deve ser monitorada com auxílio da técnica de monofilamento de Semmes-Weins (BELL-KROTOSKI; TOMANCIK, 1987). Segundo a Organização Mundial de Saúde, o diagnóstico da hanseníase é realizado pela avaliação clínica e é confirmado quando o indivíduo apresenta um ou mais dos seguintes critérios: lesões com alterações de sensibilidade, espessamento de nervos ou baciloscopia positiva (WHO, 1998). O Sexto (6º) Congresso Internacional de Hanseníase em 1963 recomendou uma forma de classificação para a hanseníase (mais conhecida como classificação de MADRID) que distingue as formas clínicas em lepromatosa (L) ou virchowiana (VV), tuberculoide (T), indeterminada (I) e dimorfa (D) ou borderline (B). Sendo a forma lepromatosa e tuberculóide os pólos estáveis da patologia (WHO, 1988). Em 1966, Ridley; Jopling também desenvolveram um sistema de classificação estruturada em aspectos clínico-evolutivos, imunológicos, baciloscópicos e histológicos (Figura 1). O princípio básico dessa classificação sustenta-se na resposta imune ao M. leprae (medida pelo teste cutâneo de lepromina) e na avaliação histopatológica e bacteriológica. FIGURA 1: Espectro clínico da hanseníase: a imunidade celular (IC) medida pelo teste de Mitsuda é inversalmente proporcional a carga bacilar, medida pelo índice baciloscópico (IB). TT = forma tuberculóide; LL = forma lepromatosa; BT = borderline tuberculóide; BB = borderline borderline; BL = borderline lepromatosa. Adaptado de: GOULART et al., A classificação de Ridley; Jopling permitiu uma melhor compreensão da característica espectral da hanseníase. Desse modo, em um pólo encontram-se os casos que melhor

14 14 respondem à infecção, apresentando lesões do tipo tuberculóide (TT), raramente punitivas à baciloscopia, com reação positiva à lepromina. Já o pólo oposto lepromatoso (LL), é caracterizado por lesões altamente bacilíferas, do tipo lepromas e reação negativa à lepromina. Além disso, os três grupos intermediários, denominados borderline, são definidos de acordo com a proximidade ao pólo resistente ( borderline tuberculóide, BT) ou susceptível ( borderline lepromatoso, BL). O terceiro grupo borderline borderline (BB) situa-se entre esses dois grupos intermediários. A forma indeterminada (I) foi também proposta como sendo um estágio inicial e transitório, que evolui para uma das cinco formas clinicamente estáveis (RIDLEY; JOPLING, 1966). No entanto, a Organização Mundial da Saúde (OMS) estabeleceu uma classificação simplificada, com fins operacionais e terapêuticos. Dessa forma, dois grandes grupos de pacientes foram definidos: os Virchowianos (VV) e os paucibacilares (PB). Assim, pacientes com 1 a 5 lesões são classificados como PB e pacientes com mais de 5 lesões VV. Além disso, ficou estabelecido que o índice baciloscópico (IB) também deve ser usado para auxiliar na classificação. Os pacientes com IB positivo (geralmente BB, BL e LL) foram considerados VV, enquanto os pacientes com IB negativo (geralmente TT e BT) foram classificados no grupo PB (BRASIL, 2002). Baseando-se nas formas clínicas operacionais e na possível resistência aos antimicrobianos, a OMS estabeleceu a poliquimioterapia para o tratamento da hanseníase. O esquema terapêutico para pacientes que apresentam a forma clínica PB consiste na administração de seis doses de Dapsona e Rifampicina, enquanto para os pacientes que apresentam a forma VV o indicado é a associação de Dapsona, Rifampicina e Clofazimina (BRASIL, 2009). Apesar do sucesso no tratamento a hanseníase persiste como um problema de saúde pública no mundo. Considerada doença endêmica em diversos países com baixos índices de desenvolvimento social e econômico, destacando-se a Índia e Brasil, que vem apresentando os maiores números absolutos de casos. Em 2010, um total de novos casos de hanseníase foram registrados no mundo. A índia foi responsável por (55,50%) casos de hanseníase e o Brasil apresentando-se em segundo lugar com (15,27%) casos novos (WHO, 2011). Recentemente, foi realizado pelo grupo do Programa Nacional de Controle de Hanseníase (PNCH) do Ministério da Saúde um estudo dos casos de hanseníase de 2005 a 2007, que foram alocados espacialmente nas coordenadas geográficas, das sedes dos municípios, para delimitação de clusters correspondentes às áreas de maior risco (Figura 2).

15 15 Segundo dados disponibilizados pela Coordenação do PNCH, os 10 clusters mais prováveis, incluíram 1173 municípios, correspondendo a 53,50% dos casos novos detectados que representa 17,50% da população do país (BRASIL, 2008). FIGURA 2 Os 10 primeiros clusters de casos de hanseníase, identificados por meio do coeficiente de detecção de casos novos no período de 2005 a 2007 no Brasil. Adaptado de: BRASIL, O cluster número 4 abrange o sul da Bahia, o norte do Espírito Santo e o nordeste de Minas Gerais, onde está localizado o município de Governador Valadares, uma área hiperendêmica de hanseníase (> 4 casos/ habitantes/ano) e local de estudo deste projeto (BRASIL, 2008). Por se tratar de uma doença com um período de incubação prolongado, cujo diagnóstico é essencialmente clínico, pressupõe-se que o controle da transmissão da hanseníase levaria à redução da prevalência oculta, o que tem relação com a capacidade dos serviços em diagnosticar com agilidade e tratar os casos existentes. Desta forma, o conhecimento e o acompanhamento de casos assintomáticos são fundamentais para a avaliação do comportamento real da doença e, consequentemente, para o seu controle. Do ponto de vista epidemiológico, uma das atividades fundamentais para evitar o aumento da transmissão da doença é o exame de comunicantes, o qual poderia aumentar a oportunidade de diagnosticar e curar casos de hanseníase de maneira precoce (BRASIL, 2002). No entanto, devido a problemas operacionais, como carência de recursos humanos e ausência de infra-estrutura mínima nas unidades de saúde, o exame dos contatos domiciliares de pacientes não é praticado de forma efetiva na maioria dos estados brasileiros (BRASIL, 2008).

16 16 Segundo o Ministério da Saúde, entre os casos novos de hanseníase diagnosticados no ano de 2006, apenas uma pequena proporção (7,70% do total dos casos), foi detectada pelo serviço de vigilância de contatos domiciliares (BRASIL, 2002). O diagnóstico precoce da hanseníase em infecções subclínicas seria essencial para a rápida interrupção da cadeia de transmissão da doença. Outra Vantagem do diagnóstico precoce seria o impedimento do desenvolvimento de sequelas na hanseníase devido à possibilidade de pronto tratamento resolutivo das pessoas recém-diagnosticadas. Por isso, o desenvolvimento de um teste sensível para o diagnóstico da hanseníase tem sido um dos principais objetivos da pesquisa na doença (BENNETT et al., 2008). O conhecimento prévio da sequência genômica do M. leprae tornou possível a realização do método de amplificação de DNA para identificação do bacilo em amostras clínicas. Assim, a técnica da reação da polimerase em cadeia (PCR) pode vir a ser utilizada como um método de suporte alternativo aos métodos tradicionais de diagnóstico da doença. Ao contrário da baciloscopia, que requer cerca de 10 4 organismos por grama de tecido para detecção real, a PCR é uma técnica de alta especificidade e sensibilidade, capaz de detectar 25 fg (10-15 g) de DNA de M. leprae. Além disso, a possibilidade de sua utilização em quase todos os tipos de amostras clínicas confere a este método um alto potencial para o diagnóstico diferencial (KANG et al., 2003; GOULART; GOULART, 2008). Vários estudos foram realizados envolvendo diferentes sequências e genes alvos para a amplificação do DNA do M. leprae pela PCR. A maioria deles realizados a partir de amostras de biópsia de pele. Assim, sistemas simples e específicos foram utilizados para amplificar regiões gênicas que codificam os antígenos de 36-kDa (KAMPIRAPAP et al., 1998), de 18- kda (SCOLLARD et al., 1998) ou 65-kDa (PLIKAYTIS et al., 1990), bem como, para sequências repetitivas (RLEP) e o gene codificador da subunidade 16S do RNA ribossomal (rrna) do M. leprae (WOODS; COLE, 1989; MARTINEZ et al., 2011). De forma a determinar um método mais sensível e específico para a detecção molecular do M. leprae, dois sistemas de amplificação foram comparados: o do gene de 18-kDa e o da seqüência repetitiva RLEP (KANG et al., 2003). Os resultados mostraram que a PCR para a sequência RLEP é mais sensível se comparada com a PCR para o gene de 18-kDa e mais específica que o índice baciloscópico. Uma explicação para o resultado verificado seria o número de cópias da seqüência de RLEP (Figura 3) no genoma do M. leprae, estimado em pelo menos 28, o que confere a este alvo uma maior sensibilidade em relação aos genes de cópia única (WOODS; COLE, 1989).

17 17 Um estudo realizado por MARTINEZ et al., (2011) comparando a sensibilidade e especificidade da PCR em tempo real (qpcr) na amplificação dos genes soda, 16S rrna, RLEP e Ag 85B para o diagnóstico diferencial na hanseníase, confirmam que o gene RLEP confere maior sensibilidade à técnica. No entanto, o ensaio com o RLEP foi positivo para 4 pacientes com outras doenças dermatológicas. O ensaio com 16S rrna, embora menos sensível, foi específico para o M. leprae. Além disso, MARTINEZ et al., (2009) confirmaram a especificidade do Primer 16S rrna para o M. leprae, utilizando a técnica da qpcr em outras 9 espécies de Mycobacterium incluindo M. tuberculosis H37RVV ATCC 27294, M. marinum ATCC 927, M. bovis BCG ATCC 35734, M. ulcerans ATCC 19423, M. simiae ATCC 25275, M. avium ATCC 25291, M. intracellulare ATCC 13950, M. kansasii ATCC 35775, e M. smegmatis ATCC 14468; alem de bactérias de outro gênero como Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Streptococcus pyogenes ATCC 12345, e Escherichia coli ATCC FIGURA 3- Mapa do genoma circular do M. leprae mostrando a posição e orientações dos prováveis genes funcionais, pseudogenes e seqüências repetitivas em azul. Adaptado de: COLE et al., 2001.

18 18 2 JUSTIFICATIVVA Estudos sobre a transmissão da hanseníase demonstram que as pessoas que convivem com os pacientes estão expostas a um maior risco de adoecer quando comparadas com a população em geral. Os contatos domiciliares de casos VV representam um grupo caracterizado por alta exposição ao bacilo (FINE et al., 1997; VVAN BEERS et al., 1999). Portanto, do ponto de vista epidemiológico, uma das atividades fundamentais para o controle da transmissão da doença é o diagnóstico precoce dos contatos domiciliares (BRASIL, 2002). O diagnóstico precoce da hanseníase em infecções subclínicas seria essencial para a rápida interrupção da cadeia de transmissão da doença. Outra Vantagem do diagnóstico precoce seria o impedimento do desenvolvimento de sequelas na hanseníase devido à possibilidade de pronto tratamento resolutivo das pessoas infectadas. Por isso, a aplicação de um teste rápido e sensível para o diagnóstico da hanseníase é um dos principais objetivos da pesquisa nesta doença (BRASIL, 2002). A disponibilidade de informações genéticas sobre o M. leprae possibilita utilizar a técnica de PCR, ferramenta específica e sensível para a detecção do material genético, em amostras oriundas de pacientes com hanseníase (KANG et al., 2003). Sabendo-se que, os macrófagos teciduais representam ambiente adequado à sobrevivência e replicação do M. leprae e que o lóbulo da orelha por apresentar temperatura ligeiramente menor que a temperatura corpórea, pressupõe-se ser este local adequado para detecção do bacilo (HASTINGS et al., 1988). Além disso, a possibilidade de sua utilização em quase todos os tipos de amostras clínicas confere a este método um alto potencial para o diagnóstico diferencial (KANG et al., 2003; GOULART; GOULART, 2008). A detecção de DNA de M. leprae, especialmente em casos com infecções subclínicas, contribuirá para o maior controle da doença, sobretudo, pela capacidade de diagnosticar e tratar casos de hanseníase precocemente.

19 19 3 OBJETIVVOS 3.1 Objetivo Geral Utilizar a técnica de qpcr como ferramenta para detecção de DNA de M. leprae, em amostras biológicas de pacientes com hanseníase e seus contatos domiciliares assintomáticos. 3.2 Objetivos Específicos Selecionar grupos de pacientes diagnosticados com hanseníase e seus respectivos contatos domiciliares. Coletar amostras biológicas de raspado dérmico do lóbulo da orelha e sangue dos pacientes e seus respectivos contatos domiciliares. Obter o DNA total das amostras de raspado dérmico do lóbulo da orelha e de sangue dos pacientes com hanseníase e seus respectivos contatos domiciliares. Detectar a presença de DNA de M. leprae em amostras de pacientes com hanseníase utilizando a técnica de qpcr. Comparar a positividade da baciloscopia e da qpcr de pacientes com hanseníase. Correlacionar a carga bacilar de M. leprae em pacientes utilizando a qpcr e a baciloscopia. Verificar a presença de DNA de M. leprae em amostras de sangue e raspado dérmico de contatos domiciliares de pacientes com hanseníase. Comparar a carga bacilar entre pacientes com hanseníase e os contatos domiciliares, utilizando a qpcr como ferramenta de diagnóstico.

20 20 4 METODOLOGIA 4.1 Local de Estudo O estudo foi desenvolvido em Governador Valadares MG, município pertencente ao cluster 4, considerado área hiperendêmica de hanseníase cuja taxa de detecção de casos novos em 2009 foi de 46,72/ habitantes. 4.2 Identificação e perfil dos pacientes participantes Os indivíduos participantes do estudo foram atendidos no Centro de Referência em Doenças Endêmicas e Programas Especiais (CREDEN-PES) Dr. Alexandre Castelo Branco, da Secretaria Municipal de Saúde de Governador Valadares-MG. Estes indivíduos foram selecionados de acordo com o seguinte critério: Caso Índice de hanseníase (pacientes com hanseníase) e seus respectivos contatos domiciliares assintomáticos. Os casos índices de hanseníase foram diagnosticados em 2011 e as amostras biológicas foram coletadas em até 3 meses após o início do tratamento. Os contatos domiciliares eram indivíduos que convivem ou conviveram com pacientes com hanseníase nos últimos 5 anos e não apresentavam sintomas da doença. Todos os contatos foram submetidos à avaliação clínica criteriosa, por médicos especialistas do CREDEN-PES, antes de serem considerados assintomáticos. Além disso, aqueles que não apresentavam duas cicatrizem de BCG, foram encaminhados para uma segunda dose da vacina. Este procedimento é preconizado pela OMS na tentativa de estimular uma resposta imune protetora nos contatos assintomáticos (BRASIL, 2002). Foram incluídos neste estudo, um total de 164 indivíduos, sendo 43 casos índices, 113 contatos domiciliares e 8 indivíduos considerados controles negativos que relataram não ter convívio com pacientes com hanseníase nem tão pouco histórico de hanseníase na família. Os casos índices foram agrupados como Paucibacilar (PB), Dimorfo 1 (DM 1), Dimorfo 2 (DM 2) e virchowiana (VV) (Tabela 1). O grupo PB foi constituído por pacientes que apresentavam a forma clínica Indeterminado ou Tuberculóide, alvos negativos na

21 21 baciloscopia. Já o grupo DM 1 compreende os pacientes clinicamente classificados como Dimorfo e que apresentaram resultado negativo na baciloscopia. O grupo DM 2, constituído de pacientes também da forma clínica Dimorfo, porém que apresentavam resultado positivo na baciloscopia. O grupo VVVV corresponde aos pacientes classificados como virchowiana, positivos na baciloscopia. Este critério de organização dos grupos foi proposto pelo fato de que os pacientes atendidos no CREDEN-PES não são classificados segundo os parâmetros de Hidley e Jopling, devido à impossibilidade da realização de testes complementares que atendam a esta classificação. Tabela 1: Caracterização dos grupos de estudo quanto à forma clínica e baciloscopia. Grupo Forma Clínica Baciloscopia N PB Indeterminada Tuberculóide Negativa Negativa 20 DM 1 Dimorfo Negativa 10 DM 2 Positiva 4 VV virchowiana Positiva 9 Total 43 N = Número de pacientes; PB = Paucibacilar; DM 1 = Dimorfo 1; DM 2 = Dimorfo 2 e VV = virchowiana Os contatos domiciliares foram agrupados e designados da seguinte maneira: Contatos de pacientes Paucibacilar (CPB), Contatos de pacientes Dimorfo 1 (CDM 1), Contatos de pacientes Dimorfo 2 (CDM 2) e Contatos de pacientes virchowiana (CVV) (Tabela 2). Tabela 2: Classificação dos grupos de contatos domiciliares de acordo com a forma clínica do caso índice. Grupos N CPB 52 CDM 1 23 CDM 2 11 CVV 27 Total 113 N = Número de indivíduos; CPB = Contato de Paucibacilar; CDM 1 = Contato de Dimorfo 1; CDM 2 = Contato de Dimorfo 2 e CVV = Contato de virchowiana.

22 22 A tabela 3 apresenta a distribuição dos casos índices de hanseníase de acordo com o grupo, gênero, faixa etária e número de lesões. Nota-se uma distribuição homogênea dos casos quanto ao gênero em todos os grupos, com exceção dos casos VV. Em relação à faixa etária todos os indivíduos menores de 15 anos participantes deste estudo, pertenciam ao grupo PB. O grupo DM 2 foi o único que não apresentou indivíduos na faixa etária de 15 a 30 anos. Os indivíduos das faixas etária 31 a 45 anos e maior de 45 anos, estavam bem distribuídos entres os 4 grupos. Quanto ao número de lesões, todos os pacientes do grupo PB apresentavam menos de 5 lesões na pele. O mesmo ocorreu com 3 pacientes DM 1, enquanto que 4 indivíduos deste mesmo grupo apresentavam mais de 5 lesões. No grupo DM 2 um indivíduo apresentava menos de 5 lesões, enquanto 3 foram notificados com mais de 5 lesões de pele. Além destes, 7 indivíduos do grupo VV foram diagnosticados com mais de 5 lesões. É importante ressaltar que alguns prontuários médicos ou fichas do SINAM não continham a informação quanto ao número de lesões dos casos índices. Portanto nos grupos DM 1, DM 2 e VV o número de indivíduos ficou reduzido para a variável número de lesões. Tabela 3: Distribuição dos casos índices de hanseníase de acordo com o grupo, gênero, faixa etária e número de lesões. PB (N) DM1 (N) DM2 (N) VV (N) Gênero Masculino Feminino Faixa etária < > Nº lesões* < N = Número de pacientes; PB = Paucibacilar; DM 1 = Dimorfo 1; DM 2 = Dimorfo 2 e VV = virchowiana. *Alguns prontuários médicos não continham o número de lesões dos pacientes, por isso o número de indivíduos ficou reduzido para esta variável

23 23 Os grupos de contatos domiciliares dos casos de hanseníase foram distribuídos quanto ao gênero e faixa etária (Tabela 4). Nos grupos CDM 1, CDM 2 e CVV não ocorreram diferenças na distribuição quanto ao gênero. Entretanto, no grupo CPB o número de indivíduos do gênero feminino foi duas vezes maior que o gênero masculino. Quanto à faixa etária os indivíduos contatos domiciliares estavam bem distribuídos em todos os grupos relacionados. Tabela 4: Distribuição dos contatos domiciliares de acordo com os grupos, gênero e faixa etária. CPB (N) CDM 1 (N) CDM 2 (N) CVV (N) Gênero Masculino Feminino Faixa Etária < > N = Número de indivíduos, CPB = Contato de Paucibacilar; CDM 1 = Contato de Dimorfo 1; CDM 2 = Contato de Dimorfo 2 e CVV = Contato de virchowiana Coleta das amostras biológicas Foram coletadas amostras de raspado dérmico do lóbulo da orelha dos pacientes dos diferentes grupos estudados, de acordo com o manual de baciloscopia em hanseníase (BRASIL, 2010). As amostras foram acondicionadas em tubos de microcentrífuga de 1,5mL contendo álcool etílico 70% e armazenadas em freezer -20ºC até o momento da extração de DNA para o ensaio de qpcr. As amostras de sangue foram coletadas por um profissional técnico qualificado, utilizando tubos a vácuo, contendo EDTA. Posteriormente, as amostras de sangue foram aliquotadas em tubos de microcentrífuga de 1,5ml e estocadas em freezer -20ºC até a realização do experimento.

24 24 É importante ressaltar que alguns participantes concordaram em doar apenas amostras de sangue e outros permitiram apenas a coleta do raspado dérmico. A maioria dos indivíduos concordaram em participar com os dois tipos de amostras. 4.4 Baciloscopia Além do material coletado para o ensaio de qpcr, amostras de raspado dérmico dos lóbulos da orelha direita e esquerda, cotovelo direito e lesão foram coletadas dos pacientes diagnosticados com hanseníase para a realização da baciloscopia, dentro da rotina do CREDEN-PES. Naqueles pacientes que não apresentavam lesões, a coleta foi realizada também no cotovelo esquerdo. As amostras foram fixadas e coradas em lâmina pela técnica de Ziehl Neelsen, que permite a identificação de bacilo álcool-ácido resistente (BAAR). Esta técnica foi realizada pela equipe do CREDEN-PES segundo critérios estabelecidos pelo Programa Nacional de Controle da Hanseníase Ministério da Saúde. O índice baciloscópico (IB) foi proposto por Ridley; Jopling (1962). Este índice é obtido a partir da análise microscópica de 100 campos em cada amostra coletada. Baseia-se em uma escala logarítmica com variação entre 0 a 6 (Tabela 5). É o método de avaliação quantitativo mais correto e utilizado na leitura da baciloscopia em hanseníase. Tabela 5: Índice Baciloscópico. Índice Baciloscópico (IB) Leitura 0 Ausência BAAR em 100 campos examinados 1+ 1 a 10 BAAR em 100 campos examinados 2+ 1 a 10 BAAR em cada 10 campos examinados 3+ 1 a 10 BAAR, em média, em cada campo examinado a 100 BAAR, em média, em cada campo examinado a 1000 BAAR, em média, em cada campo examinado 6+ Mais de BAAR, em cada campo examinado BAAR = Bacilo álcool-ácido resistente. Adaptado de RIDLEY; JOPLING (1962).

25 Comitê de Ética e Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Univale (CEP), protocolado sob o nº PQ 022/ (Anexo 1). Todos os indivíduos participantes assinaram o termo de consentimento livre esclarecido (TCLE) antes da participação no estudo. Em caso de menores, a inclusão foi feita após consentimento dos pais ou guardião (Anexo 2). 4.6 Extração de DNA em amostras de raspado dérmico A extração de DNA foi realizada utilizando o kit DNeasy Qiagen. As amostras de raspado dérmico estocadas em álcool etílico a 70 ºGL foram descongeladas em temperatura ambiente e em seguida centrifugadas a 2000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e ao pellet foram adicionados 20 µl de solução de proteinase K (600 mau/ml), 200 µl de PBS 1X e 200 µl de tampão de lise AL (Qiagen). Em seguida, o material foi incubado a 56ºC por uma hora. Após incubação foram adicionados 200 µl de etanol 96ºGL e a solução foi agitada em vórtex por 10 segundos. Todo o material foi transferido para uma coluna DNeasy acoplada a um tubo coletor de 2 ml. Em seguida, centrifugou-se a 6000g por 1 minuto para eliminação do líquido e retenção de moléculas de DNA e eventualmente proteínas na coluna. O tubo coletor com a solução eluída foi descartado. Outro tubo coletor foi acoplado à coluna DNeasy e adicionou-se 500 µl do tampão de lavagem AW1 Quiagen. Novamente a coluna foi centrifugada a 6000g por 1 minuto. O tubo coletor com o material eluído foi descartado. Logo em seguida, foi adicionado o tampão de lavagem AW2 Quiagen e um novo tubo coletor adaptado à coluna DNeasy. Centrifugou-se a g por 3 minutos, descartando-se o tubo coletor. Ao final, a coluna foi acoplada em outro tubo coletor e 100 µl do tampão de eluição AE Quiagen foram adicionados sobre a mesma. O sistema foi incubado por 1 minuto à temperatura ambiente e em seguida foi realizada uma centrifugação à 6000g por 1 minuto. Para maior eficiência na obtenção do DNA esta etapa foi repetida. A coluna DNeasy foi descartada obtendo-se DNA no tubo coletor.

26 26 A determinação da concentração de DNA no material eluído foi obtida por meio do espectrofotômetro NanoDrop 1000 spectrophotometer Thermo Scientific. Após a dosagem do DNA o tubo foi congelado a -20ºC até o momento do ensaio de qpcr. 4.6 Extração de DNA em amostras de sangue A extração de DNA nas amostras de sangue coletado em EDTA foi realizada utilizando o kit DNeasy Qiagen. As amostras estocadas em freezer -20ºC foram descongeladas a temperatura ambiente e em seguida homogeneizadas por inversão. Uma alíquota de 50µL de sangue foi transferida para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e em seguida foram adicionados 20 µl de solução de proteinase K (600 mau/ml), 200 µl de PBS 1X e 200 µl de tampão de lise AL (Qiagen). O material foi incubado a 56ºC por uma hora. Os passos seguintes foram os mesmos realizados no protocolo de extração de DNA em amostras de raspado dérmico, descritos acima. 4.7 Ensaio de PCR em Tempo Real - qpcr A qpcr foi realizada utilizando o sistema de amplificação TaqMan qpcr. O alvo de amplificação foi a região gênica 16S rrna específica do M. leprae. A sequência dos iniciadores (Primers) e a sequência da sonda que foram utilizadas no ensaio foram descritas por Martinez e colaboradores (2009) e estão apresentadas na tabela 6 abaixo: Tabela 6: Sequência dos primers e sonda utilizados na q-pcr. Gene Descrição Primer / Sonda Sequência ML16S rrnataq-f 5`-GCA TGT CTT GTG GTG GAA AGC-3` 16S rrna 16S rrna ML16S rrnataq-f 5`-CAC CCC ACC AAC AAG CTG AT-3` ML16SrRNATaq-Sonda 5`-CAT CCT GCA CCG CA-3` Adaptado de Martinez et al., 2009.

27 27 O DNA obtido foi descongelado em temperatura ambiente para realização da qpcr em um volume final de 25 µl, contendo TaqMan 2X Master Mix, 20 ng de DNA purificado, 500 nm de cada primer e 500 nm da sonda. A solução foi preparada em duplicata e submetida à temperatura de 50ºC por 2 minutos. Em seguida, à temperatura de 95ºC por 10 minutos, e posteriormente 40 ciclos compreendendo a temperatura de 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto. Foi utilizado o termociclador 7000 real-time PCR system (Applied BioSystems, Carlsbad, CA, USA). A fluorescência emitida pela sonda foi analisada pelo software ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). O resultado da qpcr foi dado pelo número de ciclos (Ct) em que a curva de fluorescência acumulada ultrapassa a linha de corte e foi considerado positivo os valores de Ct menores que 38,50. O valor de Ct é inversalmente proporcional a quantidade de DNA presente na amostra, portanto neste trabalho foi invertido o valor de Ct (1/Ct) para que a proporção fosse direta. A linha de corte foi determinada automaticamente pelo software. 4.8 Análise Estatística A análise estatística foi realizada com auxílio do software GraphPad Prism versão 5.0. A carga bacilar entre os grupos foram avaliados pelo teste t student. O teste qui quadrado e teste de Fisher, foram utilizados para comparar os resultados da baciloscopia e qpcr quanto as variáveis gênero, faixa etária e número de lesões (Anexo 3).

28 28 5 RESULTADOS 5.1 Detecção de DNA de M. leprae nos casos índices de hanseníase A presença de DNA de M. leprae em amostras de sangue e raspado dérmico do lóbulo da orelha foi avaliada pela qpcr em 164 indivíduos, sendo 43 casos índices de hanseníase e 113 contatos domiciliares, designados em 4 grupos e 8 indivíduos considerados controle negativo. Somente os pacientes com hanseníase foram avaliados pelo exame baciloscópico. Entre os casos índices do grupo PB, 2 pacientes (10%) apresentaram resultados positivos na qpcr realizada em amostras de sangue (qpcr SG) e 4 pacientes (20%) apresentaram resultados positivos utilizando amostras de raspado dérmico (qpcr RD) (Tabela 7). Considerando a positividade da qpcr em qualquer amostra (Q-amostra) realizada, detectamos a presença de DNA de M. leprae em 5 pacientes (25%) do grupo PB. Nota-se que um mesmo paciente foi positivo nas duas amostras avaliadas. Em relação à baciloscopia, todos os pacientes deste grupo apresentaram resultados negativos. O grupo DM 1 apresentou 1 paciente (10%) positivo na qpcr SG e 2 (20%) positivos na qpcr RD. Neste caso, 3 pacientes (30%) apresentaram DNA de M. leprae nas amostras. Entretanto, todos foram negativos na baciloscopia. A qpcr SG do grupo DM 2 foi positiva em apenas 1 paciente (25%), ao passo que a qpcr RD foi positiva em 3 pacientes (75%). Considerando a qpcr em qualquer amostra, os 4 pacientes (100%) foram positivos. Neste grupo, todos apresentaram resultados positivos na baciloscopia. O grupo VV, 2 pacientes (22,22%) foram positivos para a qpcr SG enquanto que na qpcr RD todos os 9 pacientes (100%) apresentaram o DNA bacilar. Portanto todos os pacientes do grupo VV foram positivos considerando qualquer amostra. É importante ressaltar que 2 pacientes foram positivos nas duas amostras avaliadas. Em relação à baciloscopia, todos os pacientes apresentaram resultados positivos. Em resumo, dos 43 casos índices avaliados na qpcr, 6 pacientes (13,95%) apresentaram resultados positivos na qpcr SG e 17 pacientes (38,53%) na qpcr RD. Entretanto, considerando qualquer amostra (Q-amostra), foi possível identificar DNA de M.

29 29 leprae em 21 pacientes (48,84%) enquanto a baciloscopia detectou o bacilo em apenas 13 pacientes (30,23%) (Tabela 7). Tabela 7: Eficiência da baciloscopia e da qpcr para a detecção de Mycobacterium leprae em casos índices de hanseníase. Grupos N Baciloscopia qpcr SG qpcr RD Q-amostra N (%) N (%) N (%) N (%) PB 20 0 (0) 2 (10) 4 (20) 5 (25) DM (0) 1 (10) 2 (20) 3 (30) DM2 4 4 (100) 1 (25) 3 (75) 4 (100) VV 9 9 (100) 2 (22,22) 9(100) 9 (100) Total (30,23) 6 (13,95) 17 (39,53) 21 (48,84) N = número de pacientes; qpcr SG = qpcr sangue; qpcr RD = qpcr raspado dérmico e Q-amostra = qpcr em qualquer amostra. Na tabela 8 encontra-se a distribuição dos casos índices de hanseníase de acordo com o gênero, faixa etária, número de lesões, seguidos dos resultados da baciloscopia e qpcr Q- amostra. Quanto ao gênero e faixa etária não foi observada diferença estatística entre a positividade da qpcr e baciloscopia. Entretanto, verificamos que a qpcr é capaz de detectar a presença de infecção em um número significativamente maior de indivíduos (x 2, p=0,0219) em relação a baciloscopia, considerando pacientes com menos de 5 lesões. Avaliando apenas a positividade da qpcr não houve diferença estatística quanto ao gênero e faixa etária. Entretanto, o número de pacientes positivos na qpcr, foi significativamente maior (x 2, p=0,0013) no grupo de pacientes que apresentava 5 ou mais lesões em relação ao número de pacientes positivos na qpcr com menos de 5 lesões.

30 1/Ct 30 Tabela 8: Distribuição dos casos índices de hanseníase de acordo com o gênero, faixa etária, número de lesões e resultados da baciloscopia e qpcr Q-amostra. Variáveis N Baciloscopia qpcr Q-amostra Gênero Masculino Feminino Positivo N (%) Negativo N (%) Positivo N (%) Negativo N (%) 9 (37,50) 15 (62,50) 14 (58,33) 10 (41,67) 4 (21,05) 15 (78,95) 7 (36,84) 12 (63,16) Faixa Etária < (0) 5 (100) 1 (20) 4 (80) (33,33) 10 (66,67) 8 (53,33) 7 (46,67) (25) 6 (75) 4 (50) 4 (50) > (23,08) 20 (76,92) 7 (26,92) 19 (73,08) Nº de lesões < (0) 24 (100) 6 (25) a 18 (75) (69,23) 4 (30,77) 11 (85,62) b 2 (15,38) a p = 0,0219; b p = 0,0013; N = Número de pacientes O teste de Pearson r foi usado para correlacionar os valores de 1/Ct e o índice baciloscópico dos pacientes VV e DM 2 e uma associação significante foi observada (p = 0,047, r = 0,5823). Conforme esperado, o valor de 1/Ct é diretamente proporcional ao índice baciloscópico (Figura 4) IB Figura 4: Correlação linear de Pearson entre os valores de 1/Ct e índice baciloscópico para pacientes dos grupos VV e DM 2.

31 1/CT 31 Considerando o menor valor de1/ct obtido na qpcr Q-amostra dos casos índices de hanseníase, foi possível observar que o nível de DNA de M. leprae foi significativamente maior no grupo VV quando comparado com o nível de DNA bacilar dos pacientes dos grupos PB (p<0,0001), DM 1 (p = 0,0025) e DM 2 (p = 0,0002) (Figura 5). O valor de 1/Ct da qpcr no grupo VV variou entre 0,0320 e 0,0389 (média de 1/Ct, 0,0355; erro padrão médio [EPM], 0,00074). Por outro lado, o valor de 1/Ct da qpcr no grupo PB variou entre 0,0264 a 0,0309 (média, 0,02766; EPM, 0,00081). No grupo DM 1 os valores de 1/Ct estavam entre 0,0264 e 0,0321 (média, 0,02913; EPM, 0,00165). Entre os pacientes do grupo DM 2 o valor de 1/Ct variou de 0,0270 a 0,0315 (média, 0,02843; EPM, 0,00106). Não houve diferença significativa quanto ao nível de DNA de M. leprae entre os grupos PB, DM 1 e DM p = 0, p = 0,0025 p = 0, CN PB Figura 5: Comparação da carga bacilar em função dos grupos de casos índices de hanseníase. DM1 DM2 MB 5.2 Detecção de DNA de M. leprae nos contatos domiciliares Os 113 contatos domiciliares dos casos índices de hanseníase foram avaliados pela qpcr em amostras de sangue (qpcr SG) e raspado dérmico do lóbulo da orelha direita (qpcr RD), conforme a tabela 9. Entre os contatos domiciliares de casos PB (CPB), 4 indivíduos (7,69%) apresentaram DNA bacilar na qpcr SG e 7 (13,46%) na qpcr RD. Entretanto, analisando a qpcr em qualquer amostra (Q-amostra), 10 (19,23%) dos CPB foram positivos para o DNA de M. leprae.

32 32 A avaliação dos contatos domiciliares de casos DM 1 (CDM 1) pela qpcr SG revelou 4 contatos positivos (17,39%) para o DNA bacilar. Já a qpcr RD foi positiva em 5 indivíduos (21,74%) deste grupo. Considerando a qpcr Q-amostra, 8 (34,78%) indivíduos foram positivos para DNA bacilar. Nenhuma das amostras de sangue dos contatos domiciliares de casos DM 2 (CDM 2) foram positivas. No entanto, 2 indivíduos (18,18%) deste grupo foram positivos na qpcr RD. Já os contatos domiciliares de casos VV (CVV) apresentaram 3 indivíduos (11,11%) positivos na qpcr SG e 4 (14,81%) na qpcr RD. Em relação a qpcr Q-amostra, 7 (25,93%) dos CVV estavam positivos para DNA de M. leprae. Em síntese, entre os 113 contatos avaliados pela qpcr, 11 indivíduos (9,73%) foram positivos no sangue, 18 (15,93%) foram positivos no raspado dérmico. E ainda, considerando a positividade Q-amostra, 27 indivíduos (23,89%) apresentaram DNA de M. leprae (Tabela 9). Destacamos que todos os contatos domiciliares foram submetidos à avaliação clínica por médicos especialistas do CREDEN-PES e não apresentaram sintomas clínicos sugestivo de hanseníase. Tabela 9: Detecção de Mycobacterium leprae em contatos domiciliares de casos índices de hanseníase. Grupos N qpcr SG qpcr RD Q-amostra N (%) N (%) N (%) CPB 52 4 (7,69) 7 (13,46) 10 (19,23) CDM (17,39) 5 (21,74) 8 (34,78) CDM (0) 2 (18,18) 2 (18,18) CVV 27 3 (11,11) 4 (14,81) 7 (25,93) Total (9,73) 18(15,93) 27 (23,89) N = número de pacientes; qpcr SG = qpcr sangue; qpcr RD = qpcr raspado dérmico e Q-amostra = qpcr em qualquer amostra. Os resultados da qpcr em qualquer amostra dos contatos domiciliares, foram distribuídos quanto ao gênero e faixa etária (Tabela 10). Não foi encontrada diferença estatística quanto ao gênero (p=0,3752). Nove indivíduos do gênero masculino foram positivos na qpcr e 38 foram negativos. Enquanto que, dezoito do gênero feminino foram positivas e 48 negativas. Em relação à faixa etária, a qpcr detectou mais indivíduos infectados nos indivíduos entre 15 e 30 anos e maiores de 45 anos.

33 1/CT 33 Tabela 10: Distribuição dos contatos domiciliares de acordo com o gênero, faixa etária e resultados da qpcr Q-amostra. Variáveis N Q-amostra Gênero Masculino Feminino Faixa etária Positivo N (%) 9 (19,15) 18 (27,27) Negativo N (%) 38 (80,85) 48 (72,73) < (14,85) 23 (85,19) (32,26) 21 (67,74) (10,72) 25 (89,28) > (37,04) 17 (62,96) N = número de pacientes; Q-amostra = qpcr em qualquer amostra. A análise do menor valor médio de1/ct dos contatos domiciliares, obtido na qpcr em qualquer amostra, não mostrou diferença estatística entre o nível médio de DNA de M. leprae por grupo (Figura 6). O valor de 1/Ct dos indivíduos do grupo CPB variou entre 0,0269 e 0,0359 (média de 1/Ct, 0,0284; erro padrão médio [EPM], 0,00085). Por outro lado, o valor de 1/Ct dos CDM 1 variou entre 0,0268 a 0,0371 (média, 0,02914; EPM, 0,00118). No grupo CDM 2, os valores de 1/Ct estavam entre 0,0285 e 0,0305 (média, 0,0295; EPM, 0,0010). Entre os indivíduos do grupo CVV o valor de 1/Ct variou de 0,0270 a 0,0297 (média, 0,02861; EPM, 0,00041) CN CPB CDM1 CDM2 CMB Figura 6: Comparação da carga bacilar em função dos grupos de contatos domiciliares.