Evaluation of the radiographic bone density of rats submitted to the castration using digital images.

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1 AVALIAÇÃO ALIAÇÃO DA A DENSIDADE ÓSSEA RADIOGRÁFICA A DE RATOS OS SUBMETIDOS À CASTRAÇÃO UTILIZANDO IMAGENS DIGITAIS Evaluation of the radiographic bone density of rats submitted to the castration using digital images. Mari Eli Leonelli de MORAES 1, Paula Cristina SERI 2, Carola Gómez ÁGREDA 3, Luiz Cesar de MORAES 4, Edmundo MEDICI FILHO 4, Julio Cezar de Melo CASTILHO 1. 1 Professor(a) Adjunto(a) - Departamento de Diagnóstico e Cirurgia - Faculdade de Odontologia de São José dos Campos - UNESP. 2 Graduanda e estagiária Departamento de Diagnóstico e Cirurgia - Faculdade de Odontologia de São José dos Campos - UNESP. 3 Mestranda Programa em Biopatologia Bucal, Área Radiologia Odontológica - Faculdade de Odontologia de São José dos Campos - UNESP. 4 Professor Titular - Departamento de Diagnóstico e Cirurgia - Faculdade de Odontologia de São José dos Campos - UNESP. RESUMO A proposta nesta pesquisa foi estudar a densidade óssea em ratos submetidos à castração por meio da imagem digital. Foram utilizados 22 ratos adultos jovens divididos em grupos controle e experimental. O grupo controle foi constituído de dez animais, sendo cinco machos e cinco fêmeas. Os demais foram utilizados para o grupo experimental, constituindo seis machos e seis fêmeas submetidos à castração. Todos os animais tiveram suas tíbias esquerdas radiografadas nos períodos inicial, trinta e sessenta dias do início da pesquisa. Foi utilizado o sistema digital direto RVG Trophy acoplado ao aparelho digital Gendex 765 DC, em que a aquisição da imagem foi realizada com 0,032 s de tempo de exposição, distância focal de 40 cm, 65 kvp, 7 ma, com feixe central de raios X incidindo perpendicularmente ao sensor do sistema digital. Posteriormente, as imagens foram analisadas quanto à densidade óptica no programa Adobe Photoshop, mediante a ferramenta histograma em duas regiões selecionadas, correspondente à região de metáfise e diáfise. Os valores obtidos foram submetidos ao teste de análise de variância ANOVA em que foi verificado não existir diferenças estatisticamente significantes entre os grupos avaliados. Concluiu-se que pela metodologia empregada, o sistema de radiografia digital não detectou alterações ósseas perceptíveis nas duas regiões analisadas para ratos com supressão hormonal por meio da castração. PALAVRAS-CHAVE: Densidade óssea; radiografia digital; ratos; castração. INTRODUÇÃO O estudo das alterações ósseas é uma vertente de grande importância na área da saúde como a Medicina e a Odontologia. Isto se baseia no forte impacto das doenças que provocam alterações da fisiologia do tecido ósseo e dos riscos que as mesmas representam à saúde da população. Neste contexto, está englobada a osteoporose, considerada a mais comum das doenças ósseas, que é caracterizada pela redução da massa e deterioração da microarquitetura óssea 1,2. A perda óssea pode ser basicamente resumida como a ocorrência do predomínio da reabsorção sobre a neoformação osteóide 3,4. Esta perda pode ser conseqüência natural do envelhecimento, tanto em homens como em mulheres 5. Sendo assim, medidas preventivas e de tratamento são necessários e estão sendo constantemente estudadas e aprimoradas, tais como a realização de reposição hormonal para mulheres na pré e pós-menopausa, exposição solar, ingestão de alimentos ricos em vitamina D e exercícios regulares, além da utilização de medicamentos como estrógenos sintéticos, raloxifeno, alendronato e risedronato 6,7. Desta maneira, faz-se necessária a utilização de métodos para diagnóstico de doenças ósseas como a osteoporose. Estão relacionados os exames de densitometria por dupla emissão de raios X, o ultrassom, a tomografia óssea quantitativa, ressonância magnética quantitativa, sendo o primeiro, um dos mais utilizados na mensuração da densidade mineral óssea 8. No entanto, apesar dos métodos citados serem de eficácia comprovada na quantificação da DMO (Densidade Mineral Óssea), para o profissional cirurgiãodentista, é de grande valia contribuir com a possibilidade de evidenciação de alterações ósseas por meio de um sistema eminentemente de uso odontológico, associando ao fato do constante aprimoramento e desenvolvimento tecnológico dos

2 sistemas digitais, desde seu surgimento da década de 70 até a atualidade. Os sistemas digitais podem ser classificados em direto, semi-direto e indireto. Este último refere-se à aquisição da imagem na tela do computador mediante a digitalização de radiografias por scanner ou ainda por captação de câmeras fotográficas. Com relação ao sistema de radiografia digital direto, ele possui como componentes básicos um sensor intra-oral de plástico podendo ser rígido ou não, com dimensões normalmente aproximadas a de um filme radiográfico periapical convencional. Neste sensor, o feixe de raios X incide e ocorre a transformação da energia ionizante em energia elétrica que será transmitida até o conversor análogo-digital, responsável pela transformação dos sinais elétricos em sinais digitais. Posteriormente, estes sinais serão estabilizados, potencializados e direcionados a um programa específico para a tela do computador 9,10,11. É no estágio da conversão digital que as informações contidas nos sinais serão decompostas em pixels, menor unidade formadora da imagem. Cada pixel da imagem representa um valor de cinza, que corresponde a um nível de escurecimento ou claridade da área. Os tons de cinza do sistema digital direto alcançam 256 tons de cinza, numa escala que se inicia do 0 (preto) ao 255 (branco) 12, porém, na atualidade existem sistemas digitais diretos que podem alcançar até 2 16 tons de cinza 13. Mediante estes tons de cinza, pode-se realizar a análise da densidade óptica utilizando ferramentas que o próprio sistema digital oferece ou ainda utilizando outros programas de edição de imagem, como o Adobe Photoshop 14. A densidade óptica pode oferecer valores que permitem a interpretação da variação dos tons de cinza, como no trabalho de Moraes et al. 15 (2005). Os autores objetivaram avaliar influência do estresse na reparação óssea em tíbias de ratos por meio da avaliação da densidade óptica em radiografias digitais diretas. Para isso utilizaram vinte ratos, em que foi realizado um defeito ósseo com broca esférica carbide e radiografados pelo sistema digital direto Visualix Gx-S HDI nos tempos 7, 14 e 21 dias pós-operatórios. Foi realizada a avaliação da densidade óptica utilizando a ferramenta histograma do próprio sistema digital referido. Os resultados foram submetidos à análise de variância e teste Tukey ao nível de 5% de significância. Com isso, concluíram que não houve diferenças estatisticamente significantes entre os grupos. Apesar disso, observaram que as médias de densidade óptica do grupo de ratos estressados foi sempre menor que a do grupo controle, denotando a influência do estresse no processo de reparação óssea. Diante das considerações expostas, justifica-se o presente estudo, a possibilidade de observar sinais de alterações ósseas decorrentes da supressão hormonal induzida pela castração, mediante a análise da densidade óptica radiográfica, em imagens de tíbias de ratos captadas por um sistema digital direto. MATERIAL E MÉTODOS Esta pesquisa foi realizada de acordo com os Princípios Éticos para a Experimentação Animal, adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos - Unesp, sob o protocolo nº 032/ 2005-PA/CEP. Grupos Estudados Foram utilizados 22 ratos adultos jovens, sendo 11 machos e 11 fêmeas (Rattus novergicus, variação albinus, Wistar) com três meses de vida e peso aproximado de 350 g, os quais foram fornecidos pelo Biotério da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos -Unesp e mantidos em gaiolas em temperatura ambiente, alimentados com ração e água ad libitum. Tais animais foram divididos em grupo experimental e grupo controle. O grupo controle foi constituído de cinco machos e cinco fêmeas. Os demais foram utilizados no grupo experimental, que foram constituídos de seis fêmeas e seis machos submetidos à cirurgia de castração. Procedimento Cirúrgico Para a anestesia geral do grupo experimental foi utilizada a associação de 1,0 ml de cloridrato de tiazina (Anasedan- Vetbrands), substância sedativa analgésica, além de relaxante muscular para 0,5 ml de ketamina (Dopalen-Vetbrands), por via intramuscular. Para as fêmeas, foi realizada a tricotomia e antissepsia com álcool iodado e, logo abaixo da costela, foi feita uma incisão de 1 cm na pele e seqüencialmente na camada muscular, possibilitando a visualização do ovário. Com o auxílio de uma pinça clínica, o ovário foi tracionado para fora da cavidade abdominal e, após amarria da vasculatura local, foi realizada a excisão. Em seguida, a camada muscular e a pele foram suturadas, sendo este processo realizado bilateralmente. Para os machos, o procedimento consistiu em desinfecção das bolsas escrotais com álcool iodado. Foi realizada uma incisão longitudinal ao longo da linha média, expondo um dos testículos. Em seguida, foi feita a interrupção do fluxo sanguíneo por amarria do pedículo vascular, para que este pudesse ser seccionado. O mesmo procedimento foi repetido do lado oposto e a ferida foi suturada com fio de sutura de algodão. Obtenção das Imagens Todos os animais foram radiografados nos períodos inicial (antes do procedimento cirúrgico), trinta e sessenta dias do início do experimento. Para tanto, foi utilizado o sistema Radiovisiography, RVG, (Trophy, vicennes, França) com o auxílio do software Trophy Windows versão Este sistema utiliza um sensor intrabucal CCD (Charge Coupled Device) com dimensões de 22,2 mm de largura por 33 mm de comprimento e área ativa de 17 mm de largura por 26 mm de comprimento, acoplado a um computador Pentium III 128 Mb

3 memória RAM (Random Acces Memory), disco rígido de 40 Gb. O aparelho de raios X utilizado para aquisição das radiografias foi o 765 DC (Gendex Dental Systems, Dentsply International, IL, USA), operando com 65 kvp, corrente de 7 ma, área focal efetiva de 6 cm, distância foco-sensor de 40 cm e 0,032 s de tempo de exposição, com o feixe central de raios X incidindo perpendicularmente ao sensor. Para proceder as incidências radiográficas, os animais estavam devidamente anestesiados na dosagem já descrita anteriormente e apoiados sobre uma tábua de madeira que possuía um espaço específico para a colocação do sensor do sistema digital. Os ratos foram acomodados em decúbito ventral, de forma que as tíbias do lado esquerdo ocupassem toda a extensão do sensor, mantendo assim, um mesmo padrão de posicionamento para a aquisição da imagem radiográfica digital. As imagens foram capturadas e armazenadas no formato TIFF (Tagged Image File Format). Posteriormente, para análise da densidade óptica radiográfica, foi utilizado o programa de edição de imagens Adobe Photoshop 7.0 (Adobe systems incorporated, 345 Park Avenue, San Jose, California 95110, USA). Em cada imagem da tíbia dos animais foi selecionada uma área pré-determinada e padronizada de tamanho fixo de 20 x 20 pixels, a qual foi posicionada em campo da região central, sem abranger as corticais laterais, na transição entre a porção condilar e diáfise, denominada de metáfise e a outra área correspondeu à diáfise da peça em questão. Desta forma foi utilizada a ferramenta histograma, a qual forneceu a média da densidade óptica em pixels, da região selecionada (Figura 1). Fig. 1 Imagem da tíbia no programa Adobe Photoshop, mostrando a área da diáfise selecionada para mensuração e o gráfico em histograma fornecendo a média da densidade óptica radiográfica da região analisada. Os dados obtidos por meio da análise da densidade óptica foram submetidos à análise estatística descritiva seguida da Análise de Variância (ANOVA), com nível de significância de 5% mediante a utilização do programa Excel 2003 para Windows. RESULTADOS Os dados foram analisados quanto às variáveis de sexo (macho e fêmea), ao tratamento (grupo controle e grupo experimental), períodos de observação experimental (zero, trinta e sessenta dias) e áreas ósseas delimitadas de análise (metáfise e diáfise). Os dados referentes à estatística foram submetidos à análise de variância (ANOVA) com intervalo de confiança de 95%. O objetivo deste teste consistiu em verificar se as diferenças observadas entre as médias das amostras foram estatisticamente significantes, sem, entretanto, especificar quais grupos que podiam diferir estatisticamente. Nas tabelas 1 e 2 podemos observar as médias, erros das médias em todas as variáveis analisadas na presente pesquisa em machos e fêmeas, respectivamente. A representação das letras (Vieira 13, 2002) evidencia uma homogeneidade em todos os grupos avaliados no trabalho, já que pelo teste ANOVA (5%) não houve diferenças estatisticamente significantes. DISCUSSÃO A necessidade de constantes pesquisas para o estudo de alterações ósseas, como a osteoporose, insere a importância do mecanismo a que esta enfermidade está envolvida. O seu desenvolvimento se relaciona a uma combinação multifatorial, sendo descrita por autores como Manolagas & Jilka 17 (1995), Compston 1 (2001). Pode-se constatar, de forma geral, que esta anormalidade óssea está intimamente relacionada com a diminuição ou mesmo eliminação da produção hormonal, tanto em homens quanto em mulheres. Tal fato pode ser explicado devido aos hormônios sexuais atuarem na modulação de mecanismos de regeneração e remodelação óssea, influindo diretamente na atividade osteoclástica e osteoblástica. Apesar da literatura 1,18 apontar a necessidade de outras pesquisas que expliquem o mecanismo fisiopatológico da osteoporose, acredita-se que este processo esteja relacionado à interação entre uma molécula ligante e seu receptor, como por exemplo, a atuação de receptores estrogênicos em osteoblastos. Uma das formas de estudar tais alterações é mediante a utilização de modelos de animais de experimentação, incluindo, principalmente, o amplo uso de ratos. Para tanto, os animais devem ser privados da produção hormonal mediante o procedimento cirúrgico de ovariectomia ou orquiectomia, tal como realizado nesta pesquisa. O uso de modelos de experimentação animal também é eficaz na avaliação de testes farmacológicos para o tratamento deste processo patológico, como evidenciado no trabalho de Pytlik et al. 19 (2004), que teve como objetivo a avaliação do fármaco doxiciclina, já que este poderia ter influência na inibição da reabsorção e intensificação na formação óssea, nas propriedades mecânicas de ossos de ratos ovariectomizados e induzidos à osteopenia. Mosekilde 20 (1995) enfatizou as vantagens da utilização de ratos em pesquisas, já que estes apresentam características similares à perda óssea em humanos, além da facilidade de um estudo

4 Tabela 1 Médias e erros das médias dos valores das densidades ópticas do grupo controle e experimental, nos três períodos de observação de machos, na metáfise e na diáfise. Metáfise Diáfise Grupos Controle Orquidectomizados Controle Orquidectomizados Dias Média Erro Média Erro Média Erro Média Erro 191,8 2, , ,7 189,7 2, ,9 3,1 181,2 5,8 179,6 4,9 186, ,9 1,9 179, ,8 2,1 184,7 3,4 60 Médias seguidas de letras distintas (maiúsculas na vertical e minúsculas na horizontal) diferem entre si. (Vieira 13, em 2002) Tabela 2 Médias e erros das médias dos valores das densidades ópticas do grupo controle e experimental, nos três períodos de observação de fêmeas, na metáfise e na diáfise. Metáfise Diáfise Grupos Controle Ovariectomizados Controle Ovariectomizados Dias Média Erro Média Erro Média Erro Média Erro 184,2 2,5 178,5 4,9 174,3 2,2 173,4 2, ,3 181,8 2,7 179,5 3,6 177,6 4, ,4 4,2 174,7 2,6 174,5 3,1 175,9 2,5 60 Médias seguidas de letras distintas (maiúsculas na vertical e minúsculas na horizontal) diferentes entre si. (Vieira 13, em 2002) com condições padronizadas, propiciando um tempo relativamente menor para a pesquisa e obtenção de resultados. O modelo experimental de castração que leva a supressão hormonal, acarretando na condição osteopênica, é amplamente consagrado na literatura e foi utilizado por diversos autores, tais como Akyama et al , Tanaka et al. 23, Yang et al , entre outros. Como demonstrado por tais autores, a ocorrência da diminuição da massa óssea pode ser evidenciada já no período de 30 dias decorrido o procedimento de ovariectomia ou orquiectomia. Deve-se enfatizar que tais autores utilizaram animais adultos jovens, assim como na presente pesquisa, uma vez que a resposta diante a tal procedimento cirúrgico acontece mais rapidamente pelo intenso metabolismo do animal. Levandose este fato em consideração, Tanaka et al. 23 ainda ressaltaram que é possível verificar a perda óssea em animais com seis meses de vida, mesmo decorrido um ano ao procedimento de orquiectomia ou ovariectomia. Nesta pesquisa, foi utilizado o sistema Trophy, uma vez que este oferece capacidade de auxílio ao diagnóstico com imagens radiográficas que podem ser observadas em monitor de alta resolução com boa qualidade. Os sistemas digitais oferecem definição e balanço entre contraste e brilho equilibrados em todas as imagens observadas, ou seja, permite a manipulação com o intuito da melhoria da análise e

5 observação do objeto de estudo. Esta vantagem proveniente deste sistema e associado a fatores como a velocidade em que as imagens são adquiridas, a redução da dose de radiação ionizante ao paciente, a ausência de processamento efetuado na câmara escura, propiciam a preservação do meio ambiente e, ainda, o benefício de arquivamento da imagem digital na memória do computador sem perda da qualidade 26. O arquivamento desta imagem permite a transferência para programas de fácil acesso e de domínio público, como é o caso do Adobe Photoshop aplicado neste trabalho. A utilização deste programa tornou possível avaliar numericamente a densidade óptica do tecido ósseo, possibilitando uma melhor interpretação da imagem. No presente trabalho, para efetuar uma análise da densidade óptica mais fidedigna, procurouse seguir uma padronização, eliminando variáveis que pudessem influenciar os resultados, descritos na metodologia. Em relação aos resultados deste trabalho, ao se aplicar o teste ANOVA (5%) ficou evidenciado que não houve diferença estatística entre os grupos avaliados levando em consideração todas as variáveis. Tais valores podem ser observados nas tabelas 1 e 2. Esses resultados permitiram aferir que, pela metodologia empregada, não foi possível observar diferenças no processo de perda de massa óssea em ratos machos e fêmeas. Deve-se levar em conta que, apesar dessa forma de diagnóstico ser utilizada em pesquisas, neste trabalho não foi encontrada alteração nos tons de cinza que permitissem constatação da diminuição da DMO. Podemos concluir que isso pode ter ocorrido devido à supressão hormonal utilizada nesta pesquisa ter sido pelo período de dois meses, fato que, de acordo com autores já citados, já seria possível tal evidenciação. Poucos trabalhos analisaram osso íntegro. Neste contexto, podemos destacar a pesquisa de Silva et al. 27 (2007), que verificaram o efeito do alcoolismo crônico sobre a densidade óssea por meio da avaliação da densidade óptica radiográfica em ratos e no qual foi utilizado um sistema digital como ferramenta de avaliação. O parâmetro ósseo de análise foi o fêmur, por ser um osso longo e amplamente acometido pela osteoporose. Os autores escolheram duas áreas padronizadas deste osso. A região da porção média de tamanho (60 x 20 pixels) e a região condilar (20 x 20 pixels). Tendo a especificação como base, no presente trabalho também foram selecionadas duas áreas padronizadas de mesmo tamanho, abrangendo 20 x 20 pixels, dispostos na região do terço médio da tíbia, correspondente à diáfise, sem o envolvimento das corticais laterais, e na região de transição entre a porção condilar (epífise) e a diáfise, denominado de metáfise. Assim, como no presente trabalho, os autores referidos não encontraram diferenças estatisticamente significantes nos resultados das variáveis estudadas. Estes fatos não invalidam a utilização do sistema digital para o estudo de alterações ósseas, uma vez que nos inserem mais indagações sobre o tempo de supressão necessária para a evidenciação radiográfica por meio da imagem digital. Dessa forma, salienta-se a necessidade de outras pesquisas que acrescentem e corroborem com dados mais elucidativos, além de enfatizar novas formas de complementação mediante outros exames que possibilitem maior integração dos dados em pesquisa. CONCLUSÃO Baseado nas condições experimentais da presente pesquisa e a partir dos resultados obtidos foi possível concluir que: a) não houve diferença estatisticamente significante nos valores de densidade óptica radiográfica do osso avaliado (tíbia) no grupo experimental, nos períodos avaliados e nas regiões delimitadas; b) o sistema digital Trophy não foi eficaz em indicar diminuição de densidade óssea em ratos castrados nos períodos de análise propostos nesta pesquisa. ABSTRACT The purpose of this research was to accomplish the study of the bone density in rats submitted to the castration. It was used 22 young adults rats divided in group control and experimental. The control group constituted of 10 animals, being 5 males and 5 females. The others were used for the experimental group, constituting 6 males and 6 females submitted to the castration. All the animals had their left shinbones x-rayed in the periods initial, thirty and sixty days of the beginning of the research. For this, the direct digital system RVG Trophy was used coupled to the digital apparel Gendex 765 DC, in that the acquisition of the image was accomplished with 0,032s of time of exposition, focal distance of 40cm, 65kVp, 7mA, with central beam of X-rays happening perpendicularly to the sensor of the digital system. Later, the images were analyzed as for the optical density in the program Adobe Photoshop, by the tool histogram in two selected areas, corresponding the metaphysis area and diaphysis. The obtained values were submitted to the test of variance analysis ANOVA in that it was verified differences statistically significant not to exist among the appraised groups. It was ended that in the used methodology, the system of digital x-ray didn t detect perceptible bone alterations in the two areas analyzed for mice with hormonal suppression through the castration. KEYWORDS: Bone density; radiographic image enhancement; rats; castration. REFERÊNCIAS 1. JE Compston. 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