ESTUDO DA MICROARQUITETURA DO FÊMUR DE RATAS OVARIECTOMIZADAS SUBMETIDAS AO EXERCÍCIO DE NATAÇÃO

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1 ESTUDO DA MICROARQUITETURA DO FÊMUR DE RATAS OVARIECTOMIZADAS SUBMETIDAS AO EXERCÍCIO DE NATAÇÃO Carlos Alberto Anaruma 1 ; Bruna Carvalho 1 ; Francisco Pereira Santi 1, Patricia Pereira Alfredo 2 ; Raquel Aparecida Casaroto 2 1 Departamento de Educação Física - IB - UNESP - Rio Claro. 2 Departamento de Fisioterapia da FMUSP São Paulo Resumo: A osteoporose é um distúrbio metabólico que atinge ambos os sexos sendo agravada na menopausa. A prática de atividade física tende a prevenir ou retardar seus efeitos. O objetivo do trabalho foi avaliar se o exercício de natação pode ser indicado no controle da osteoporose. Para tal, 20 ratas Winstar, separadas em grupos: Sedentário, Treinado, Sedentário Ovariectomizado e Treinado Ovariectomizado foram avaliadas. Após 8 semanas de treinamento o terço médio foi submetido à análise morfo-quantitativa da sua microarquitetura em Microscópio Eletrônico. A espessura da diáfise do fêmur nas ratas do grupo TO diminuiu significativamente (P<0,05), quando comparado às do grupos S, T e SO. O osso esponjoso do grupo TO e S apresentou diminuição da quantidade de trabéculas quando comparadas ao grupo T. O osso esponjoso do grupo AS estava ausente. Concluímos que a natação promove a manutenção da micro-arquitetura do osso, podendo ser preconizada para a prevenção de fratura em indivíduos osteoporóticos. Palavras Chave: Osteoporose, Natação, Menopausa. Abstract: The osteoporosis is as a metabolic disorder that achieves both genders and is intensified by menopause. The pratictice of physical activity tend to prevent or delay it s effects. These work objectivies is to evaluate if the swimming exercise can be indicated in osteoporosis control. For this,20 Winstar rats were separated in the groups: Sedentary, Trained, Ovarictomized Sedentary and Ovarictomized Trained were evaluated. After 8 weeks of training, third-half was submitted a morphoquantitative analisis its microarchitecture in electronic microscopy. Femur diaphysis thickness average from OT group rats had a meaning diminution (p<0,05), when compared with the bone thickness from control rats group T, S and with OS. The spongy bone the group OT and S shows notable thickness reduction and the trabeculas quantity that when compared to group T. In group OS bones, the spongy bone was completely absent. We inferred that swimming foster the bone micro architecture maintenance, it is being a exercise that may be commend to fracture prevention in osteoporotic peoples. Keywords:Osteoporosis,Swimming,Menopause INTRODUÇÃO A osteoporose é uma doença óssea que atinge ambos os sexos, especificamente as mulheres, onde a perda óssea é mais intensa devido á fatores de risco característicos como falta de atividade física, alimentação não balanceada, falta de exposição ao sol, entre outras [1].Tudo isso, agravado com a chegada da menopausa, onde os níveis do hormônio estrógeno se reduzem, sendo eles importantes para a fixação de cálcio nos ossos. Para homens a perda óssea começa aos 45 anos e é cerca de 0,5 % ao ano, muito menor se comparados às mulheres na menopausa que chegam a perder inicialmente, de 2 à 4 % ao ano e depois estabilizam essa perda em 1 % ao ano. Quando essa perda de massa óssea ultrapassa o limite crítico, determina a ocorrência de fraturas, principalmente do colo do fêmur, punhos, costelas e vértebras [2]. Na maioria das vezes o diagnóstico se baseia em achados radiológicos, ou ainda, quando tarde demais, em fraturas resultante de traumas mínimos, uma vez que a instalação da osteoporose é silenciosa e assintomática. Essa diminuição progressiva da

2 massa óssea é agravada com a idade, fazendo dos idosos a população alvo mais importante da osteoporose. No Brasil, segundo dados do IBGE, a população propensa a osteoporose aumentou de 7,5 milhões em 1980 para 15 milhões no ano 2000, e em apenas um ano ocorreram 1,2 milhões de fraturas por osteoporose nos 10 milhões de indivíduos com 60 anos ou mais de idade. Não somente pela alta incidência em idosos, mas também pela incapacidade gerada pela doença, os gastos aos sistemas de previdência social promovem pesadas cargas financeiras sociais, familiares e psicológicas. A osteoporose se instala através de dois mecanismos principais: aumento da atividade dos osteoclastos (células que absorvem o osso), resultando em uma reabsorção óssea acelerada, ou na diminuição de osteoblastos (células repositivas) levando a uma remodelação óssea inadequada. Dentre esses fatores de neoformação óssea, encontra se a atividade física, entre outros, responsável pelas alterações locais e gerais dos tecidos orgânicos, que irão influenciar a formação dos ossos. Assim, seu papel tanto para o controle como para a prevenção da osteoporose é defendida por diversos autores, devido a sua participação na gênese e mineralização dos ossos, bem como na distribuição do fluxo sanguíneo ósseo e muscular e sua ação mecânica provocada pelo exercício sobre a densidade e formação óssea. Acredita-se que exercícios que produzam forças de tração, compressão e torção são os mais eficazes para a prevenção da osteoporose em indivíduos idosos, sendo o mais preconizado para isto a musculação, porem pouco se sabe sobre o poder dos exercícios, após a instalação de um quadro de osteoporose, sobre a manutenção da integridade óssea. Assim, nosso objetivo foi o de verificar se após instalado a menopausa através da ovariectomia, um protocolo de exercícios seria suficiente para controlar ou minimizar a perda da densidade óssea ou a manutenção da micro-arquitetura do osso esponjo e do osso compacto que compõe um osso longo. MATERIAIS E MÉTODOS Animais e seu tratamento Para a execução deste projeto, serão utilizadas 20 ratas Wistar (Rattus Norvegicus Albinus Wistar), com idade de 60 dias. Esses animais são provenientes do Biotério Central da UNESP Campus de Botucatu e serão mantidos em gaiolas coletivas no Biotério do Laboratório de Biodinâmica do Departamento de Educação Física do Instituto de Biociências da UNESP Campus Rio Claro. Serão todas alimentadas com ração balanceada padrão (Purina) e água ad libitum, distribuídas, 5 ratas em cada gaiola, à temperatura ambiente controlada a 25º C e fotoperíodo de 12h claro/ 12h escuro. Grupos Experimentais As ratas foram distribuídas aleatoriamente em oito grupos

3 denominados: -Sedentário Controle (S): Ratas não submetidas ao protocolo de treinamento, não ovariectomizadas (extração dos ovários); -Sedentário Castrado (SC): Ratas ovariectomizadas não submetidas ao protocolo de treinamento; -Treinado Controle (T): Treinadas apenas; -Treinado Castrado (TC): Realizaram o protocolo de treinamento, ovariectomizadas; Castração das ratas As ratas foram anestesiadas com pentobarbital de sódio a 2% via intraperitoneal, a seguir procedeu-se à tricotomia e a desinfecção da pele da região ventral do abdomem (Fig 1). Com auxílio de um bisturi a parede abdominal foi seccionada (Fig 2) para que fosse localizado o útero bicornulado e os ovários aderidos à sua extremidade. Estes foram retirados (Fig 3) e a abertura da parede abdominal suturada em camadas, a partir do peritônio e parede muscular e depois a pele (Fig 4). Após nova assepsia do local da cirurgia, as ratas foram colocadas em gaiola limpa com Dipirona sódica dissolvida na água durante os primeiros dois dias após a cirurgia. Protocolo de Treinamento O protocolo de treinamento consistirá de natação, cinco vezes por semana, no decorrer de nove semanas. Na primeira semana as ratas passaram por um período de adaptação ao meio líquido por um período de 20 minutos durante cinco dias, nadando sem sobrecarga; após esse período, passaram a utilizar uma sobrecarga equivalente a 5% de seus respectivos pesos corporais, acoplada com elástico a seu tronco. Nas semanas seguintes á adaptação o tempo de treinamento foi aumentado em 5 minutos por semana, terminando na nona semana com o tempo de 60 minutos. A temperatura da água foi mantida entre 31º e 32º graus, considerada termicamente neutra em relação à temperatura corporal do rato. Avaliação do peso corporal dos animais e determinação da carga Os animais foram pesados para a avaliação da massa corporal, uma vez por semana durante todo o experimento por uma balança semi analítica. Este procedimento foi realizado sempre no último dia da semana. Para a obtenção das sobrecargas de treinamento, foram utilizados pesos de chumbo equivalentes a 5 % da massa corporal colocados nos animais imediatamente antes do exercício com uma cinta elástica amarrada ao tórax. Estes pesos foram aferidos e corrigidos semanalmente. Sacrifício e coleta de dados Após o período de 9 semanas de treinamento, os animais foram sacrificados por decapitação em guilhotina para posteriormente ter, do fêmur extraído. Este foi imediatamente fixado por imersão em solução de formol a 10% durante 48 horas. Técnicas histológicas

4 A diáfise do fêmur será dividida em duas porções. Da porção distal colheremos o segmento que será fixado em formol a 10% para posteriormente ser descalcificado em ácido nítrico 5% durante aproximadamente 10 dias. Após a descalcificação, este segmento será então, processado pelo método de rotina, ou seja, desidratação, diafanização e inclusão em parafina. A posição do material a ser incluído em parafina deverá propiciar cortes transversais e cortes longitudinais. Para tal, será utilizado um micrótomo rotativo. Os cortes de 7 µm de espessura serão corados pela técnica H/E, pelo azul de toluidina e pelo Tricrômio de Masson para posterior análise morfológica do tecido ósseo. A segunda porção retirada foi o terço médio da diáfise, e estei fixado em solução de Karnovisk (KARNOVISK, 1965) por 48 horas, quando então, foi dividido longitudinalmente para ter a medula óssea retirada através de jatos, com auxílio de uma seringa, de soro fisiológico. Este procedimento permitirá que o osso esponjoso da parede interna do segmento seja exposta. Posteriormente este material foi desidratado e seco em aparelho de ponto crítico para serem metalizados com ouro e então serem observados em Microscópio Eletrônico de Varredura Philips (Laboratório do Departamento de Biologia- IB- UNESP-RC). Análise estatística A análise estatística foi feita através da análise de variância e teste complementar t de Student, e Bonferroni. RESULTADOS Ao analisarmos a espessura do osso compacto que forma a diáfise do fêmur (Tabela 1), notamos que os grupos treinados possuíam espessura menor que nas ratas sedentárias (Gráfico 1). Tabela 1: Espessura do osso compacto dos grupos experimentais em mm. Grupos S SC T TC Média 0,707 0,574 0,638 0,518* DP 0,07 0,04 0,06 0,09 P<0,05 se comparado aos grupos S, SC e T. Gráfico 1: Gráfico da espessura do osso compacto que forma a diáfise do fêmur das ratas dos grupos experimentais 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Sedentário Controle Sedentário Castrado Treinado Controle Treinado Castrado Média Desvio Padrão O osso compacto de todos os grupos apresentou vários osteócitos isolados em meio à matriz óssea produzida (Fig. 8). A espessura da diáfise do fêmur das ratas TO apresentou uma diminuição significativa (P<0,05) quando comparado à espessura do osso das ratas controle S e T e das ratas do grupo SC (Tab. 1). Os ossos das ratas dos grupos sedentários não

5 apresentaram o osso esponjoso preenchendo a cavidade óssea (Fig.1), ou quando apresentavam, este era pouco desenvolvido e de pequena espessura (Fig 2). Já nos ossos das ratas submetidas ao exercício de natação, houve a preservação do osso esponjoso que preenche a cavidade óssea (Fig. 3), sendo que no grupo T (Fig. 4), o trabeculado apresentou-se mais robusto e espesso que o trabeculado visto no grupo TO (Fig. 6) Uma análise mais pormenorizada do tecido ósseo nos mostra que nestas espículas, assim como em toda a superfície endosteal dos ossos dos animais do grupo sedentário (S e SC), osteoclastos eram facilmente encontrados, em evidente atividade fagocítica, tanto das espículas ósseas, como na superfície endosteal (Figs. 5 e 7). Também pode ser observado, principalmente na superfície endosteal inúmeros osteoblastos. Nos animais dos grupos S e SC os canais de Volkman puderam ser facilmente observados, já que nestes animais a ausência do osso esponjoso no canal medular permitia esta observação. Ao compararmos o número de canais e o seu diâmetro, nenhuma diferença foi detectada. DISCUSSÃO Nas imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV), foi observado que existe uma relação entre espessura da parede da diáfise com a presença do osso esponjoso no interior da cavidade óssea. Ou seja, nos animais sedentários onde a espessura da camada de osso compacto é ligeiramente maior que a espessura dos ossos das ratas treinadas, o interior destes ossos estavam ocos ou parcialmente ocos, não apresentando espículas e trabéculas que formam o osso esponjoso. Logo, os resultados encontrados nos ossos das ratas treinadas e treinadas castradas, onde a espessura da diáfise é menor, estes apresentaram o preenchimento da cavidade óssea, evidenciado pela análise qualitativa de número de trabéculas e espículas ósseas. Este aspecto encontrado nos ossos das ratas treinadas nos leva a acreditar que a resistência a traumas está aumentada nestes ossos, já que podem escoar as forças a que o osso são submetidos com maior eficiência do que nos ossos das ratas sedentárias, evidenciado pelas trabéculas e espículas que preenchem o osso esponjoso. O padrão de remodelação das espículas é determinado pelas tensões mecânicas locais, de maneira que a matriz óssea se alinha para resistir as tensões de estiramento e compressão [3]. Essas linhas de força são formados pelas trabéculas e espículas no interior da cavidade óssea. Sendo assim, podemos afirmar que na falta de espículas e trabéculas ósseas, essas forças escoam suas tensões na parede óssea, causando deformações ósseas nas áreas de mais tensão e estiramento, deixando o restante do osso frágil e suscetível á fraturas, casos mais típicos de fraturas por osteoporose. A osteoporose é causada por uma

6 maior proliferação de agentes que absorvem o osso (osteoclastos), e uma baixa no numero de agentes repositivos (osteoblastos), causando um balanço negativo de remodelamento ósseo e consequentemente perda de massa óssea [4]. O baixo número de espículas e trabéculas, evidencia á fragilidade óssea e sua sensibilidade á fraturas, pela falta de linhas de força para suportar pressões mecânicas exercidas pelos músculos. Já nos animais do grupo treinado controle, observa-se um maior número de espículas e trabéculas, e um maior número de osteoblastos, ressaltando a intensa reposição óssea causada pelo estímulo das contrações musculares. Nos animais do grupo treinado castrado as espículas são ligeiramente mais finas, embora se tenha identificado a pequena quantidade de osteoclastos, e maior número de osteoblastos. CONCLUSÃO De acordo com os resultados apresentados, concluímos que o protocolo de natação instituído neste trabalho foi capaz de recuperar a micro-arquitetura do osso, sendo assim, poderá ser indicado na recuperação de ossos onde a osteoporose está instalada, prevenindo a ocorrência de fraturas. AGRADECIMENTOS Ao Laboratório de Microscopia Eletrônica do IB-UNESP-RC. REFERÊNCIAS [1] BURGER, H. G. The endocrinology of the menopause. Maturitas, v. 23, p , [2] ETTINGER, M. MARK, M.D. Aging Bone Osteoporosis: Strategies for Preventing Fractures in the Elderly. American Medical Association. v.163 p , [3] STEVENS, A., LOWE, J. Histologia Humana. 2 ed. São Paulo :Manole, p. [4]GAUMET, N. et al. Influence of Ovariectomy on Bone Metabolism in Very Old Rats. Calcified Tissue Int. 1996, 58: Trabalho aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Biociências- UNESP- Campus Rio Claro

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