Variação da estrutura das comunidades de bactérias na filosfera de Euterpe edulis

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1 Variação da estrutura das comunidades de bactérias na filosfera de Euterpe edulis em função da distribuição espacial das plantas e estádio de desenvolvimento das folhas RESUMO As florestas tropicais são ecossistemas que abrigam grande biodiversidade. O Brasil se destaca como um dos países possuidores de relevante concentração da biodiversidade, sendo que a Mata Atlântica comporta grande parte dessa riqueza biológica. A Floresta Atlântica consiste numa floresta tropical plena das mais degradadas pela ação antrópica, cujo maior impacto é a redução da diversidade biológica. Estudos sobre a diversidade microbiana na Mata Atlântica são escassos e poderiam ajudar na identificação de microorganismos com potencial biotecnológico, bem como contribuir para uma melhor compreensão da ecofisiologia de espécies vegetais de interesse científico e econômico. Tem sido observado que a estrutura das comunidades de bactérias na filosfera de plantas filogeneticamente mais relacionadas são mais similares entre si do que de plantas menos relacionadas. No entanto, o nível de variação da estrutura das comunidades de bactérias na filosfera de plantas da mesma espécie em diferentes localizações na floresta não é conhecido. Nesse contexto, o presente trabalho tem por objetivo determinar o nível de variação na estrutura das comunidades de microorganismos do domínio Bactéria da filosfera de Euterpe edulis Martius (Arecaceae), em função de sua distribuição espacial na floresta e do estádio de desenvolvimento das folhas. As amostras serão coletadas de plantas em área de uma parcela permanente no Parque Estadual de Carlos Botelho (SP). A estrutura das comunidades de bactérias será determinada através dos perfis de amplicons da região V3 do rdna 16S, após separação em gel de poliacrilamida com gradiente desnaturante (DGGE). As comparações das estruturas das comunidades serão feitas através de agrupamento hierárquico.

2 1. INTRODUÇÃO As florestas tropicais são ecossistemas que abrigam alta biodiversidade, englobando cerca de dois terços do total de espécies existentes no planeta (MAB UNESCO, 2001). Dentre as florestas tropicais, a Mata Atlântica está entre as mais ameaçadas de extinção. No início do século XVI, época da chegada dos portugueses, apresentava cerca de de km 2 (12% do território nacional), e hoje está reduzida à cerca de 5% da cobertura original (MAB UNESCO, 2001). A Mata Atlântica ocorre no litoral das regiões do Nordeste, Sudeste e Sul do país, avançando para o interior em extensões variadas (ISA, 1998), e é composta de uma série de unidades fitogeográficas, constituindo um mosaico vegetal de grande diversidade. Desde as primeiras etapas da colonização do Brasil, a Mata Atlântica tem passado por uma série de surtos de conversão de florestas naturais em ambientes para os mais diversos usos. O maior impacto do processo de fragmentação florestal é a drástica redução da diversidade biológica. A eliminação de grandes trechos de floresta, causa mudanças no microclima, dentre outras características, afetando as comunidades animais e vegetais e suas relações ecológicas (Rakim de Merona, 1987). Segundo Mori et. al. (1991), o desmatamento da Mata Atlântica é particularmente sério, uma vez que este ecossistema apresenta uma alta diversidade e elevado nível de endemismo, podendo levar à extinção um número incalculável de espécies e populações. Tem sido relatado que a biodiversidade na Mata Atlântica, com base nos atuais níveis de degradação, já está comprometida, pois muitas espécies foram extintas antes mesmo de serem descritas (Reis et. al., 1992). Caracterizações das comunidades microbianas na Mata Atlântica e os efeitos de impactos antrópicos sobre a abundância e diversidade de espécies, bem como estrutura de comunidades, são escassas. Dados sobre a diversidade microbiana associada a rizosfera e filosfera das espécies vegetais da Mata Atlântica, e de como a estrutura das comunidades de grupos microbianos específicos varia em função da espécie vegetal, estádio de desenvolvimento da planta e/ou condições edafoclimáticas são inexistentes. Estimativas globais sugerem que a superfície total de folhas colonizável por microrganismos é de aproximadamente 6,4 x 10 8 km 2 e que a população de bactérias nessa superfície pode chegar a aproximadamente células (Morris & Kinkel, 2002). A superfície das folhas dos vegetais é considerada um ambiente extremamente adverso para a colonização microbiana, devido aos altos níveis de radiação solar que incidem sobre as folhas e às grandes flutuações de temperatura e umidade que ocorrem em suas superfícies, bem como pela limitação de nutrientes (Lindow & Brandl, 2003; Hirano & Upper, 2000). Mais de 85 espécies de microrganismos, em 37 gêneros, têm sido observadas na filosfera de cevada, oliveira, beterraba e trigo, sem efeitos aparentes nas plantas. Bactérias epifíticas têm papel importante no ciclo do nitrogênio, dentre outros nutrientes, e podem contribuir para a nutrição vegetal. Adicionalmente, microrganismos da filosfera podem ter papel fundamental no controle de patógenos oportunistas (Lindow & Brandl, 2003). Os estudos sobre a composição das comunidades bacterianas da filosfera têm sido realizados predominantemente utilizando métodos dependentes de cultivo. Tem sido observado que o número total de bactérias cultiváveis isoladas da filosfera de plantas de folhas largas, como

3 pepino e feijoeiro, é maior do que de gramíneas e plantas de folhas largas contendo alta concentração de ceras (Kinkel et al., 2000; O Brien et al., 1989). Um estudo detalhado das bactérias aeróbias cultiváveis que ocorrem na filosfera de oliveiras mostrou que a estrutura dessas comunidades varia em função do tempo e da idade das folhas (Ercolani, 1991). De uma maneira geral, a diversidade bacteriana na filosfera é maior durante os meses com temperaturas menores e mais chuvosos, quando comparado com meses com mais secos e com temperaturas mais elevadas. Foi observado também que a diversidade bacteriana (maior número de espécies) é maior nas folhas novas do que nas folhas velhas (Ercolani, 1991). Estudos mais recentes, utilizando métodos independentes de cultivo, mostram que a complexidade da comunidade bacteriana da filosfera é maior do que aquela observada utilizando métodos dependentes de cultivo (Yang et al., 2001). O seqüenciamento de fragmentos do rdna 16S da comunidade de bactérias da filosfera de diferentes espécies vegetais revelou a presença de bactérias ainda não detectadas na filosfera por meio de cultivo, além de bactérias ainda não descritas (Yang et al., 2001). Essa diversidade não descrita poderia conter bactérias de interesse biotecnológico, as quais poderiam ser utilizadas como agentes de controle biológico de doenças ou como fontes de genes para processos biotecnológicos de interesse, por exemplo. Em estudo realizado no Laboratório de Microbiologia Molecular da ESALQ, foi observado que as comunidades bacterianas, avaliadas por PCR-DGGE de fragmentos da região V3 do rdna 16S, das filosferas de espécies vegetais da Mata Atlântica mais próximas filogeneticamente são mais similares entre si do que de plantas mais distantes filogeneticamente (Cury, Crowley & Lambais, dados não-publicados), sugerindo que as bactérias que habitam a filosfera co-evoluem com as espécies vegetais. Assim, o uso sustentável de espécies vegetais da Mata Atlântica pode depender em parte dessas comunidades microbianas. Adicionalmente, a caracterização das comunidades microbianas associadas à filosfera de espécies da Mata Atlântica poderia auxiliar na identificação de microrganismos com potencial biotecnológico, bem como contribuir para uma melhor compreensão da ecofisiologia de espécies vegetais de interesse científico e econômico. 2. Objetivos O presente trabalho tem por objetivo determinar o nível de variação na estrutura das comunidades de microorganismos do domínio Bacteria da filosfera de Euterpe edulis Martius (Arecaceae), em função de sua distribuição espacial na floresta e do estádio de desenvolvimento das folhas.

4 3. Hipóteses de Trabalho A estrutura das comunidades de bactérias nas filosfera de plantas da mesma espécie depende da distribuição espacial, sendo mais similares entre si em plantas espacialmente mais próximas. A estrutura das comunidades de bactérias na filosfera de uma planta varia em função do estádio de desenvolvimento das folhas. 4. Metodologia 4.1. Descrição do Local de Amostragem As amostragens serão realizadas no Parque Estadual de Carlos Botelho (PECB), localizado na região Sul do Estado de São Paulo (24 00 a S, a W). O PECB possui área total de ,63 ha e engloba parte dos Municípios de São Miguel Arcanjo, Capão Bonito e Sete Barras, com altitudes que variam de 30 a 1003 m (Domingues & Silva 1988, Negreiros et. al., 1995). O clima na região, segundo a classificação de Köppen (1948), pode ser quente e úmido sem estiagem (Cfa), nas áreas do Planalto de Guarapiara com altitudes inferiores a 800 m, e nas partes mais baixas da Serra de Paranapiacaba, ou temperado úmido sem estiagem (Cfb), nas partes mais elevadas da Serra de Paranapiacaba (Walter, 1986). No PECB ocorre uma Floresta Ombrófila Densa Submontana/Montana (Veloso & Góes-Filho, 1982), na qual foram feitos levantamentos florísticos (Custódio Filho et. al., 1992; Moraes, 1992 e 1993) e fitossociológicos (Dias, 1993; Negreiros, 1982 e Negreiros et. al., 1995). As amostragens serão realizadas em uma área do Núcleo Sete Barras (Floresta Ombófila Densa Montana ou Floresta Atlântica de Encosta), à aproximadamente 800 m de altitude, na vertente atlântica da Serra de Paranapiacaba. Neste Núcleo foi realizado um levantamento fitossociológico e observado que Euterpe edulis Mart. (Palmito) é uma das espécies mais abundantes na área (Negreiros et. al., 1995). A área a ser amostrada é parte de uma parcela permanente de 10 ha, instalada pelo projeto Diversidade, Dinâmica e Conservação em Florestas do Estado de São Paulo: 40 ha de parcelas permanentes, do Programa Biota/Fapesp, coordenado pelo Prof. Ricardo Ribeiro Rodrigues (ESALQ, USP) Amostragem Amostras de folhas de Euterpe edulis em três estádios de desenvolvimento (jovem, madura e senescente) serão retiradas de 15 plantas localizadas em três sub-áreas distintas, espacialmente não-relacionadas, da parcela de 10 ha (Figura 1). De cada planta, serão retiradas 5 amostras de folhas em cada estádio de desenvolvimento, para a obtenção de uma amostra composta por planta. As amostras serão retiradas com o auxílio de uma tesoura de alta poda, acondicionadas em sacos plásticos devidamente identificados, e mantidas a 4 C em caixas térmicas com gelo, até serem processadas no Laboratório de Microbiologia Molecular do Departamento de Solos e Nutrição de Plantas da ESALQ. As amostras serão manuseadas com luvas de látex e a tesoura de poda será

5 lavada com água destilada esterilizada entre as amostragens, para evitar contaminações. Figura 1. Locais de amostragem na parcela permanente de 10 ha do PECB. Os valores entre parênteses referem-se ao número de indivíduos de E. edulis na quadrícula. A15 (11) K14 (10) A13 (06) B15 (08) B14 (13) B13 (08) C15 (08) C14 (17) C13 (15) H10 (14) H09 (19) I10 (20) I09 (08) J10 (14) J09 (20) I01 (10) J01 (09) K01 (11) L01 (09) I0 (12) J0 (25) K0 (28) L0 (06)

6 4.3. Processamento das folhas e extração de DNA As amostras de folhas serão acondicionadas em tubos de polipropileno e lavadas com o tampão fosfato (ph 7,0). As folhas lavadas serão imersas novamente em tampão e sonicadas por 7 min em um sonicador (Microson TM), para extrair os microogranismos da filosfera. Posteriormente, as amostras serão centrifugadas a g por 15 min (Yang et al., 2001). O pélete formado será ressuspendido em tampão, obtendo-se assim, uma suspensão de células microbianas da filosfera. O DNA das células microbianas será extraído utilizando-se o kit Fast DNA (Bio 101) e o Fast Prep FP120 instrument (Bio 101), à velocidade de 5 m/s por 30 segundos, seguindo as orientações do fabricante Amplificação do rdna 16S e análise dos amplicons por DGGE Para a amplificação de fragmentos específicos de rdna 16S de microrganismos do domínio Bacteria será utilizado o seguinte conjunto de iniciadores: BA338fGC (5 GCCCGCC GCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG3 ) e UN518r (5 ATTACCGCGGCTGCTGG 3 ) (Ovreas et. al, 1997). A amplificação será feita em solução contendo: 2µL de tampão para PCR 10 X; 0,2 mm dntp; 3,0 mm MgCl 2 ; 1 U de Taq DNA polimerase recombinante (Invitrogen); 10ng de DNA total; 5 pmol de cada primer; água Milli-Q esterilizada para um volume final de 25 µl. A amplificação será realizada em um termociclador (Mastercylcler Gradient, Eppendforf) nas seguintes condições: 95ºC por 5 minutos, 30 ciclos de 92ºC por 1 minuto, 55ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto; 72ºC por 10 minutos. O DNA será adicionado após a desnaturação inicial a 95ºC por 10 minutos. A quantificação dos amplicons resultantes será feita por densitometria após eletroforese em gel de agarose 1,5% - 0,51/2X TBE, utilizando-se um densitômetro a lazer Fluorlmager (Molecular Dynamics) e o programa Fragment Analysis (Molecular Dynamics). Como padrão de tamanho e quantidade de DNA, será utilizado o marcador de massa DNA Mass Lader (Invitrogen). Os amplicons do rdna 16S são separados por eletroforese em gel de poliacrilamida (8%) com gradiente desnaturante. Os géis de acrilamida:bisacrilamida (37,5:1; m:m) 40%, serão preparados com gradiente desnaturante variando de 15% a 55%, usando duas soluções: uma solução desnaturante 100%, contendo 7M de uréia e 40% de formamida e uma solução 0% sem uréia e formamida (Ovreas et al., 1997). A eletroforese será feita a 60 o C e 200V constantes, por 3 horas, em um sistema de eletroforese vertical DCode (BioRad), utilizando solução tampão 0,5 X TAE (10mM Tris-acetato, 0,5mM EDTA ph 8,0). Após a eletroforese, o gel será lavado três vezes com água destilada, imerso em solução de metanol 50% por 15 minutos, lavado três vezes com água destilada e imerso em solução de SYBR-Green I (1:10.000; v:v) (Molecular Probes, Eugene, Oregon) por 30 minutos. Após a coloração, o gel será lavado três vezes com água destilada e analisado por densitometria, utilizando-se o densitômetro laser Fluorlmager e o programa Fragment Analysis (Amersham Biosciences).

7 4.5. Análise da Diversidade Genética A diversidade genética será determinada pela riqueza de amplicons (número de amplicons presentes em cada amostra). A similaridade entre as estruturas das comunidades de bactérias será determinada com base na presença ou ausência de amplicons detectados no gel. A análise de similaridade entre as comunidades de bactérias das amostras será feita através do método da concordância simples ( simple matching ). A análise de agrupamento hierárquico será feita utilizando-se o algoritmo de Ward e porcentagem como medida de distância, através do programa Systat 8.0 (SPSS Inc.), com base em dados binários para presença ou ausência (1 ou 0) das bandas detectadas. 5. Cronograma de execução Atividades Levantamento bibliográfico Coleta de amostras de folhas Remoção das bactérias das folhas Extração de DNA PCR DGGE Análises estatísticas Elaboração de relatório final Meses J J A S O N D J F M A M 6. Literatura citada Custódio Filho, A. ; Franco, G.A.D.C. ; Dias, A.C. & Negreiros, O.C Composição florística do estado árbóreo do Parque Estadual de Carlos Botelho (SP). Revista do Instituto Florestal. 4: Dias, A.C Estrutura e diversidade do componente arbóreo e a regeneração natural do palmito (Euterpe edulis) em um trecho de mata secundária, no Parque Estadual de Carlos Botelho, SP. Dissertação de mestrado, Escola Superor de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba. Domingues, E.N. & Silva, D.A Geomorfologia do Parque Estadual de Carlos Botelho(SP). Boletim Técnico do Instituto Florestal, 42: Ercolani, G.L Distribution of epiphytic bacteria on olive leaves and the influence of leaf age and sampling time. Microb. Ecol. 21:35-48.

8 Hirano, S.S. & Upper, C.D Bacteria in the leaf are ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae a pathogen, ice nucleous and epiphyte. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: Instituto Sócio-Ambiental ISA Restam apenas 7,3% da Mata Atlântica. Parabólicas. 40 Kinkel, L.L., Wilson, M & Lindow, S.E Plant species and plant incubation conditions influence variability in epiphytic bacterial populations size. Microb. Ecol. 39:1-11. Lindow, S.E. & Brandl, M.T Minereview: Microbiology of the phyllosphere. Applied and Environmental Microbyology. DOI: /AEM p MAB Unesco Mori, S.A., Boom, B.M. & France, E.T Distribution patterns and conservation of East Brazilian Coastal Forest Species. Buttoria. 33(2): Moraes, P.L.R Espécies utilizadas na alimentação do mono carvoeiro (Brachyteles arachnoides E. Geofrey, 1806) no Parque Estadual de Carlos Botelho. Revista do Instituto Florestal. 4: Moraes, P.L.R Caracterização morfológica dos frutos,sementes e plântulas de espécies da família Lauraceae, no Parque Estadual de Carlos Botelho, São Paulo. Dissertação de Mestrado, Universidade Estadual Paulista, Rio Claro. 234p. Negreiros, O.C Características fitossociológicas de uma floresta latifoliada pluviosa tropical visando ao manejo do palmito (Euterpe edulis Mart.). Dissertação de mestrado, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba. O Brien, R.D. & Lindow, S.E Effect of plant species and environmental conditions on epiphytic populations sizes of Pseudomonas syringae and other bacteria. Phytopathology 79: Ovreas, L., Forney, L., Daae, F.L. & Torsvik, V Distribution of baterioplankton in meromitic lake saelevannet, as determined by denaturing gel electrophoresis of PCR amplified genes fragments for 16S rrna. Appl. Environ. Microbiol. 63: Raquim de Merona, J.M. & Ackerly, D.D Estudos populacionais de árvores em florestas fragmentadas e as implicações para conservação in situ das mesmas na Floresta Tropical da Amazônia Central. Revista IPEF. 35:47-59 Reis, A.S., Fantini, A.C., Reis, M.S., Gerra, M.P. & Doebeli, G aspectos sobre a conservação de biodiversidade e o manejo da floresta tropical Atlântica. Revista Inst. Flor. São Paulo, 4:

9 Veloso, H.P. & Góes-Filho, L Fitogeografia Brasileira: classificação fisionômico-ecológica da vegetação Neotropical. In Boletim Técnico do Projeto RADAMBRASIL (Série Vegetação) Ministério das Minas e Energia, Salvador, p Yang, C. H., Crowley, D.E., Borneman, J. & Keen, N.T Microbial phyllosphere populations are more complex than previously realized. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: