UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL ASSOCIAÇÃO ENTRE O EXAME CLÍNICO ANDROLÓGICO E TESTES DE VIABILIDADE ESPERMÁTICA, INTEGRIDADE DE ACROSSOMA E FRAGMENTAÇÃO DE CROMATINA PARA DETERMINAR A QUALIDADE SEMINAL DE TOUROS Rogério Orfaly Addad da Silva Orientador: Prof. Dr. Gustavo Eduardo Freneau GOIÂNIA 2006

2 Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e Dissertações Eletrônicas (TE-DE) na Biblioteca Digital da UFG Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás UFG a disponibilizar gratuitamente através da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações BDTD/UFG, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. 1. Identidade do material bibliográfico: (X) Dissertação ( ) Tese. 2. Identificação da Tese ou Dissertação Autor: Rogério Orfaly Addad da Silva rogerioaddad@yahoo.com.br Seu pode ser disponibilizado na página? (X) Sim ( ) Não. Título: Associação entre o exame clínico andrológico e testes de viabilidade espermática, integridade de acrossoma e fragmentação de cromatina para determinar a qualidade seminal de touros. Palavras-chave: acrossoma, cromatina, nelore, reprodução, sêmen, touros. Título em outra língua: Association between clinical andrologic examination and tests of spermatic viability, integrity of acrosome and fragmented chromatin to determine seminal quality of bulls. Palavras-chave em outra língua: Acrosome, bulls, chromatin, nelore, reproduction, semen. Área de concentração: Produção Animal Data de defesa: 08/12/2006. Programa de Pós-Graduação: Ciência Animal. Orientador: Prof. Dr. Gustavo Eduardo Freneau EV/UFG gfreneau@vet.ufg.br Co-orientador (1): Prof. Dr. Milton Luiz Moreira Lima EV/UFG mlmlima2001@yahoo.com.br Co-orientador (2): Prof. Dr. Arcádio de Los Reyes Borjas EV/UFG adreyesb@vet.ufg.br 3. Informações de acesso ao documento: Liberação para disponibilização? (X) Total ( ) Parcial. Goiânia, 22 de dezembro de 2011 Rogério Orfaly Addad da Silva

3 i ROGÉRIO ORFALY ADDAD DA SILVA ASSOCIAÇÃO ENTRE O EXAME CLÍNICO ANDROLÓGICO E TESTES DE VIABILIDADE ESPERMÁTICA, INTEGRIDADE DE ACROSSOMA E FRAGMENTAÇÃO DE CROMATINA PARA DETERMINAR A QUALIDADE SEMINAL DE TOUROS Dissertação apresentada para obtenção do grau de mestre em Ciência Animal junto à Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás. Área de concentração: Produção Animal Orientador: Prof. Dr. Gustavo Eduardo Freneau Comitê de Orientação: Prof. Dr. Milton Luiz Moreira Lima Prof. Dr. Arcádio de Los Reyes Borjas GOIÂNIA 2006

4 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação na (CIP) GPT/BC/UFG S586a Silva, Rogério Orfaly Addad da. Associação entre o exame clínico andrológico e testes de viabilidade espermática, integridade de acrossoma e fragmentação de cromatina para determinar a qualidade seminal de touros [manuscrito] / Rogério Orfaly Addad da Silva xv, 38 f. : il., figs., tabs. Orientador: Prof. Dr. Gustavo Eduardo Freneau; Coorientadores: Prof. Dr. Milton Luiz Moreira Lima, Prof. Dr. Arcádio de Los Reyes Borjas. Dissertação (Mestrado) Universidade Federal de Goiás, Escola de Veterinária e Zootecnia, Bibliografia. 1. Exame clínico andrológico. 2. Testes de viabilidade espermática. 3. Touros Qualidade seminal. I. Título. CDU:

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6 iii A meus pais Adélia Simão Addad da Silva e Levi Francisco da Silva (In memoriam). A minha filha Jordana Vaz Orfaly Addad. Dedico!

7 iv AGRADECIMENTOS A Deus, criador do universo, aquele que traçou as leis da natureza. A meus pais, pelo amor, dedicação e sua luta em prol de nossa família. A minha filha Jordana, pela alegria que trouxe para minha vida. Aos meus irmãos Ronan e Rachel. A Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás, pela oportunidade de poder participar do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Ao Professor Doutor Gustavo Eduardo Freneau, pela orientação neste trabalho e pela compreensão nos momentos difíceis. Aos Professores Doutores Milton Luiz Moreira Lima e Arcádio de Los Reyes Borjas pela orientação e contribuições na realização deste trabalho. A Lorenna Cardoso Rezende pela sua ajuda efetiva no trabalho de campo e de laboratório. Aos colegas de jornada Eurídice, Ana Paula, Raquel, Ipojucan, Rodrigo, Regis, Artur e Cícero, pela amizade. Aos amigos do Projeto Universidades Renovadas pelo companheirismo e convivência sadia.

8 v SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA Exame andrológico Aspectos da membrana plasmática do espermatozóide Aspectos da cromatina espermática Capacitação espermática e reação acrossômica MATERIAL E METODOS Local e período experimental Animais Avaliação andrológica Avaliação da viabilidade espermática e integridade de acrossoma Avaliação da integridade da cromatina espermática Delineamento estatístico RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 30

9 RESUMO Foram utilizados 36 touros da raça Nelore com idade entre 30 e 120 meses, para avaliação da qualidade seminal e da aptidão reprodutiva. Os animais foram mantidos em condições extensivas, com alimentação a pasto, recebendo suplementação mineral e servindo um rebanho com 3782 fêmeas de várias categorias (novilhas, vacas primíparas e pluríparas). Foram realizadas colheitas de dados que abrangiam medidas de circunferência escrotal e avaliação do sêmen colhido por eletroejaculação e avaliadas as características físicas (volume, turbilhonamento, motilidade, vigor), morfológicas (defeitos maiores, menores e totais) e de integridade espermática (integridade de membrana plasmática, de acrossoma e de cromatina) no período que antecedeu três estações de monta consecutivas (2003, 2004 e 2005). Os dados foram submetidos a analise de variância, as médias comparadas pelo teste SNK e o coeficiente de correlação de Pearson foi calculado utilizando o SAS. Os touros apresentaram circunferência escrotal de 33,8 ± 2,8cm, 15,6 ± 8,5% de defeitos espermáticos totais, 40,1 ± 23,1% de gametas com membrana e acrossoma íntegros e 8,8 ± 3,8% de cromatina fragmentada. As relações entre circunferência escrotal, as características físicas, morfológicas e de integridade espermática e o desempenho reprodutivo do rebanho foram baixas e não significativas (P>0,05). Em touros sexualmente maduros a integridade de membrana plasmática, acrossoma e fragmentação de cromatina nuclear não foram os distúrbios mais freqüentes da morfologia espermática. vi Palavras-chave: Acrossoma, cromatina, nelore, reprodução, sêmen, touros.

10 ABSTRACT Thirty six Nelore bulls with age between 30 and 120 months were used to evaluation of the seminal quality and the reproductive aptitude. The animals had been kept in extensive conditions, with feeding the grass, receiving mineral supplementation and serving a herd with 3,782 females of some categories (heifers and cows). Data enclosed measured of scrotal circumference and evaluation of the semen collected by eletroejaculation and evaluated the physical characteristics (volume, mass activity, motility, strong), morphologic (major, minor and total defects) and spermatic structure integrity (integrity of plasmatic membrane, acrosome and chromatin) in this period had been carried through that preceded three consecutive mating season (2003, 2004 and 2005). The data had been submitted analyze of variance, the averages compared for test SNK and the coefficient of correlation of Pearson was calculated using the SAS. The bulls presented scrotal circumference of 33.8 ± 2.8cm, 15.6 ± 8.5% of total spermatic defects, 40.1 ± 23.1% of gametes with normal membrane and acrosome and 8.8 ± 3.8% of fragmented chromatin. The relations between scrotal circumference, physical and morphologic characteristics, spermatic integrity and the reproductive performance of the herd had been low and not significant (P< 0.05). In sexually mature bulls the integrity of plasmatic membrane, acrosome and nuclear chromatin had not been the most frequent trouble of the spermatic morphology. Keywords: Acrosome, bulls, chromatin, nelore, reproduction, semen. vii

11 1 INTRODUÇÃO O Brasil possui o maior rebanho bovino comercial do planeta com animais (IBGE, 2002), sendo que a sua maioria é composta por raças indianas (Bos indicus) e seus cruzamentos, ou seja, animais azebuados (GUIMARÃES, 1997). Estima-se que o número de fêmeas em idade reprodutiva gira em torno de 65 milhões de cabeças e apenas 7% deste total emprega a inseminação artificial para se reproduzir (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL, 2003), restando ainda quase 60 milhões de fêmeas sendo manejadas em sistema de monta natural com uma demanda de dois milhões de touros e uma reposição anual de 400 mil touros. O principal objetivo do touro em um sistema de acasalamento por monta natural é de emprenhar todas as fêmeas disponíveis, num período de tempo o mais curto possível na estação. Portanto é indispensável que o reprodutor seja capaz de identificar, realizar a cobertura e depositar no trato reprodutivo da fêmea um número suficiente de espermatozóides (FRENEAU et al., 2000). Neste contexto, o exame clínico andrológico tem sido amplamente empregado, como método indicador da aptidão reprodutiva dos touros designados a servir em estação de monta ou doação de sêmen. Entretanto, esta avaliação tem se mostrado aquém do necessário para determinar de maneira segura esta condição (SILVA, 1998). Haja vista que não basta ao touro apresentar padrões seminais aceitáveis para morfologia, motilidade, vigor e percentual de espermatozóides normais. A principal característica a ser avaliada para estimar o potencial fecundante do sêmen, seria a qualidade dos embriões produzidos e se o desenvolvimento posterior dos mesmos ocorre de forma normal (WALTERS et al., 2005a). Portanto, o diagnóstico do potencial fecundante de um ejaculado é essencial para a eficiência reprodutiva, já que o uso de reprodutores sub-férteis ou inférteis trás conseqüências desastrosas para o rebanho (SILVA et al., 1993). Sendo assim, é fundamental o desenvolvimento e aplicação prática de técnicas

12 2 de diagnóstico, que permitam avaliar a qualidade do sêmen, e que ofereçam resultados consistentes (BRAUNDMEIER & MILLER, 2001). Diante disso, os testes laboratoriais que avaliam as características estruturais dos elementos espermáticos envolvidos diretamente na fertilização (membrana plasmática, acrossoma e cromatina nuclear), proporcionam importante contribuição para a análise, interpretação e determinação de padrões, sem que ocorra o comprometimento da qualidade seminal (SILVA, 1998; EVENSON et al., 1999) e do sucesso reprodutivo (YANAGIMASHI, 1994; GOPALKRISHNAN et al., 1999), e atuam como métodos auxiliares na seleção de reprodutores (WATANABE et al., 1999). O objetivo deste experimento foi avaliar a aptidão reprodutiva e a qualidade do sêmen de touros da raça Nelore, através do exame clínico andrológico associado de testes para determinar a viabilidade espermática, a integridade de acrossoma e a fragmentação da cromatina. E as relações entre estas características, com a circunferência escrotal, com as características físicas e morfológicas do sêmen e com o desempenho reprodutivo do rebanho.

13 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Exame Andrológico A avaliação da aptidão reprodutiva de touros utilizados em monta natural consiste de exame clínico geral, enfatizando o sistema músculoesquelético, os aprumos, as articulações e cascos, assim como o estado nutricional (BORGES, 2006) e a condição corporal (RODE et al., 1995). Além do exame dos genitais internos e externos, aferição da circunferência escrotal, coleta do ejaculado e avaliação das características físicas e morfológicas do sêmen (SILVA et al., 1993; COLÉGIO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL (CBRA), 1998; RESENDE, 2001). A circunferência escrotal (CE) é um parâmetro reprodutivo de fácil mensuração e tem sido bastante utilizada na seleção e classificação de touros, por estar associada com o desenvolvimento testicular, a produção espermática diária e a qualidade do sêmen (SALISBURY et al., 1978; FRENEAU, 1991, 1996; FONSECA et al., 1997b; GALVANI, 1998; MARTINEZ et al., 2000; ANDRADE et al., 2001; SILVA et al., 2002). Alguns trabalhos encontraram relações entre CE e motilidade progressiva, percentual de espermatozóides normais e as taxas de fertilidade e de nascimento (FITZPATRICK et al., 2002; HOLROYD et al., 2002), no entanto, em outros trabalhos as relações foram mais modestas (MARTINEZ et al., 2000; SILVA et al., 2002). No tocante às características físicas e morfológicas do sêmen, os padrões estabelecidos para turbilhonamento, motilidade progressiva, concentração, vigor e percentual de espermatozóides normais indicam os valores mínimos que devem ser alcançados para que o touro seja considerado apto à reprodução, servindo tanto na monta natural quanto na doação de sêmen para a inseminação artificial (FONSECA, 1995; CBRA, 1998). As anomalias espermáticas têm sido tradicionalmente classificadas pela sua localização (cabeça, peça intermediária, cauda e gota citoplasmática), ou por sua origem - primárias: testículos; secundárias: epidídimos e terciárias: glândulas acessórias ou durante a ejaculação (MIES FILHO, 1978).

14 4 BLOM (1983) as classificou em defeitos maiores e defeitos menores, conforme seus efeitos sobre a fertilidade do sêmen. Os defeitos maiores abrangem a maioria dos defeitos da cabeça e da peça intermediaria, gota citoplasmática proximal e percentual altos para uma única forma anormal presente no sêmen. Os defeitos menores incluem cabeças decapitadas normais, cabeças curtas e largas, cabeças pequenas, cabeças alongadas, caudas enroladas e gota citoplasmática distal. A cabeça do espermatozóide consiste do núcleo contendo o material genético na forma de cromatina altamente condensada, e no acrossoma (responsável pela passagem na zona pelúcida). Anomalias na cromatina e na morfologia nuclear estão intimamente associadas à sub-fertilidade do touro (WILMINGTON, 1981; SODERQUIST et al., 1991; OSTERMEIER et al., 2000, 2001). THUNDATHIL et al. (2000, 2001, 2002) avaliaram o impacto dos defeitos de acrossoma na fertilidade, concluindo que o sêmen com percentual elevado de gametas com acrossoma anormais ou defeituosos, teria um potencial fecundante abaixo do normal, por serem menos eficazes em se ligar e penetrar a zona pelúcida. MITCHELL et al. (1985) constataram que a proporção de gametas morfologicamente anormais, diminui na medida em que a população espermática se desloca no trato reprodutivo da fêmea, porque as formas anômalas teriam sua hidrodinâmica prejudicada, durante o trajeto até a junção útero-tubária. Os defeitos de peça intermediária e de cauda geralmente surgem durante o processo de espermatogênese e os gametas com estes defeitos são imóveis ou apresentam motilidade anormal e estão associados com a subfertilidade (BLOM, 1983; BARTH & OKO, 1989). Touros sofrendo de degeneração testicular produziram ejaculados com percentual alto de gametas com defeitos grosseiros na peça intermediaria e na cauda, associados com uma vasta gama de cabeças anormais, cabeças decapitadas e gotas proximais (KASTELIC et al., 1997; PARKINSON, 2001). A presença de gotas citoplasmáticas distais não é considerada como uma anomalia grave, embora percentuais elevados destas indique deficiência na maturação espermática, devido a uma disfunção do epidídimo (BARTH, 1997).

15 5 Entretanto as gotas proximais são anomalias mais graves e estão associadas à espermiogênese, principalmente se ocorrer associada com outras anomalias espermáticas (BARTH & OKO, 1989). Todas estas análises rotineiras no exame andrológico indicam a aptidão reprodutiva momentânea, necessitando de outros testes que possam contribuir com informações sobre as condições estruturais do acrossoma (SILVA, 1998) e da cromatina nuclear (TEJADA et al., 1984), elementos que são importantes para o sucesso na fecundação (YANAGIMASHI, 1994). Portanto as avaliações de viabilidade espermática, integridade de acrossoma (SILVA, 1998; BRAUNDMEIER & MILLER, 2001; TARTAGLIONE & RITTA, 2004) e cromatina (BALLACHEY et al., 1988; KARABINUS et al., 1990; BOCHENEK et al., 2001; JANUSKAUSKAS et al., 2001; SILVA et al., 2003; BELETTI & MELLO, 2004; PERIS et al., 2004), constituem importantes métodos complementares ao exame andrológico na avaliação da qualidade do sêmen (PARKINSON, 2004). A viabilidade espermática esta diretamente relacionada com a atividade espermática, com a integridade e com a atividade bioquímica da membrana plasmática do espermatozóide (BRAUNDMEIER & MILLER, 2001). Entre os diversos protocolos disponíveis para a avaliação morfofuncional de espermatozóides (GARCIA, 2005), a técnica de coloração dupla por Azul de Tripan e Giemsa (ATG), apresenta resultados satisfatórios para a avaliação da viabilidade espermática, baseando-se na impermeabilidade da membrana dos gametas vivos ao corante ATG e na absorção do Giemsa pelo acrossoma (SILVA, 1998; BRAUNDMEIER & MILLER, 2001). A desnaturação da cromatina espermática pode ser detectada pela técnica de coloração por Laranja de Acridina (LA), este corante possui propriedades metacromáticas que interage com o DNA por intercalação ou atração eletrostática, quando ligado à fita dupla da cromatina (forma natural). O LA emite fluorescência verde, e quando ligado à fita simples (forma desnaturada), emite em laranja ou vermelho (TEJADA et al., 1984; UNANIAM, 2000). A variação de fluorescência do LA em espermatozóides pode ser observada por microscopia de epifluorescência, (TEJADA et al., 1984; KARABINUS et al., 1990) permitindo a visualização dos diferentes graus de

16 6 compactação da cromatina espermática (EVENSON et al., 1994). Portanto, o uso do LA auxilia na identificação de anomalias na estrutura da cromatina espermática, ocorridas durante a espermiogênese (KOSOWER et al., 1992). Sendo aplicado para o controle da qualidade do sêmen, para o estudo da infertilidade masculina e para o diagnóstico de sub-fertilidade (TEJADA et al., 1984). Apesar de terem sido desenvolvidas originalmente para avaliar o potencial fecundante do sêmen congelado e a agressão sofrida pela membrana plasmática, acrossoma e cromatina durante os processos de manipulação, congelamento e descongelamento (DOBRINSKI et al., 1994; HALLAP et al., 2005, 2006), estas técnicas também são importantes na avaliação do sêmen in natura (ROCHA et al., 2002; SHIBAHARA et al., 2003). Portanto o conhecimento das características bioquímica e fisiológica das membranas plasmática e acrossômica e a integridade da cromatina espermática (VALLE & SILVA FILHO, 2001; ROCHA et al., 2002) é fundamental para a avaliação e interpretação dos testes envolvendo a estrutura do acrossoma e da cromatina nuclear.

17 7 2.2 Aspectos da membrana plasmática do espermatozóide A estrutura básica da membrana plasmática de qualquer célula é o mosaico fluido, constituído por dupla camada lipídica entremeada por moléculas de proteína (BANKS, 1996). Os lipídios das membranas são, em sua maioria, fosfolipídios, glicolipídios e colesterol (VOS et al., 1994). Os fosfolipídios e os glicolipídios são moléculas anfipáticas, ou seja, hidrofílicas em uma extremidade e hidrofóbicas na outra, tendendo a formar estruturas micelares ou lamelares quando em meio aquoso e, na membrana plasmática, formam uma estrutura em camada dupla que se fecha em si mesma (BANKS, 1996). Os fosfolipídios podem ser divididos em fosfoglicerolipídios fosfocolineglicerídeos (PC), fosfoetanolaminoglicerídeos (PE); e esfingomielina (SM) e as proporções dos fosfolipídios na composição do espermatozóide são geralmente semelhantes àquela das células somáticas. Os espermatozóides do touro e de outros mamíferos compartilham as propriedades de que PC e PE contêm quase exclusivamente a proporção de 22:5 ou 22:6 de ácidos graxos sendo esta característica única para o espermatozóide e para as células da retina (VOS et al.,1994). Os glicolipídios são encontrados quase que exclusivamente na forma de seminolipídios, estrutura encontrada apenas no espermatozóide dos mamíferos e nas células de Schwann (VOS et al., 1994). Os espermatozóides do touro contêm quantidades similares de seminolipídios às de espermatozóides de outros mamíferos (homem, camundongo e suíno), aproximadamente 8,0 mol% de lipídios totais (GADELLA et al., 2001). Tanto o seminolipídio e seu antagonista desulfatado são considerados como participantes de certos processos de fertilização e para este fim as secreções das glândulas acessórias contêm baixa quantidade de arilsulfatase (GADELLA et al., 2001). As maiores variações na composição lipídica neutra da membrana espermática são encontradas não somente em espécies diferentes, mas também entre diferentes machos da mesma espécie e até entre diferentes ejaculados de um único macho (GADELLA et al., 2001).

18 8 A maior variação é na quantidade de colesterol da membrana plasmática. Por exemplo, o espermatozóide humano contém quantidades mais altas de colesterol (40% de lipídios totais) que o espermatozóide do cachaço (24%) enquanto o espermatozóide bovino tem relativamente alto teor de colesterol (37%). O teor de colesterol parece estar relacionado à taxa de capacitação, possivelmente porque o colesterol deve ser removido da membrana plasmática durante este processo (YANAGIMASHI, 1994). Além disso, o colesterol age como elemento regulador da fluidez das membranas, posicionando-se entre as cadeias dos fosfolipídios e interferindo na interação entre elas, alterando a densidade e a temperatura de fusão (VOS et al., 1994; VALLE & SILVA FILHO, 2001). Os lipídios da membrana formam uma barreira seletiva à passagem de substâncias, estabelecendo os meios intracelular e extracelular, enquanto as proteínas integrais e periféricas exercem quase todas as outras funções dessa estrutura celular, estabelecendo poros de comunicação entre o meio interno e o externo e atuando como pontos de ligação para diversos agentes bioquímicos presentes no trato reprodutivo da fêmea (glicosaminoglicanos, hormônios, íons e fatores protéicos), que desencadeiam os processos de capacitação e reação acrossômica, (MIES FILHO, 1978; SILVA, 1998). Além disso, as concentrações intracelulares e extracelulares adequadas de íons como sódio, potássio, hidrogênio, cálcio e magnésio, são reguladas por bombas iônicas protéicas presentes nas membranas, estas proteínas dependem das reservas energéticas intracelulares para atuarem (BANKS, 1996), e são responsáveis também pela transdução de sinais externos, reações enzimáticas decorrentes destes sinais e fusão de membranas (GADELLA et al., 2001). Os carboidratos da membrana constituem 2% a 10% do seu peso, e são açucares aderidos externamente a lipídios e proteínas, formam uma estrutura conhecida como glicocálice, importante para o reconhecimento celular durante a interação espermatozóide-oócito e remoção de fatores decapacitantes da superfície espermática (BANKS, 1996; GADELLA et al., 2001). Toda a formação da estrutura básica da membrana do espermatozóide ocorre durante a espermatogênese, período em que essas células possuem no

19 9 citoplasma organelas essenciais à síntese, tais como o reticulo endoplasmático e o aparelho de Golgi (BARTH & OKO, 1989). Durante a passagem do espermatozóide pelo epidídimo, o gameta adquire a capacidade de se mover progressivamente, ocorre a condensação final da cromatina nuclear, mudanças na forma do acrossoma e na composição bioquímica de sua membrana plasmática, devido ao ácido siálico aderido na superfície, o que o torna carregado negativamente, atraindo e adsorvendo proteínas (fatores de proteção ou decapacitantes) do plasma seminal durante a ejaculação (MIES FILHO, 1978; BARTH & OKO, 1989; SILVA, 1998; VALLE & SILVA FILHO, 2001). As mudanças funcionais mais importantes ocorrem no canal eferente e na cabeça do epidídimo, gametas coletados nestas áreas ainda não são capazes de fertilizar o oócito (BARTH & OKO, 1989), diferentemente daqueles retirados da porção distal do corpo e da cauda do epidídimo que apresentam potencial fecundante (SILVA et al., 2003).

20 Aspectos da cromatina espermática A espermiogênese é um fenômeno de diferenciação celular onde a espermátide ao final deste processo torna-se um espermatozóide. As espermátides produzidas durante a segunda divisão meiótica apresentam forma celular e núcleos esféricos. Durante este período estas células passam por modificações que terminam quando adquirem formas aerodinâmicas, núcleos condensados e caudas capazes de se moverem (BARTH & OKO, 1989). Durante a espermiogênese dos mamíferos, as histonas, proteínas nucleares básicas, são substituídas parcial ou totalmente por nucleoproteínas específicas dos espermatozóides (FIGURA 1), denominadas protaminas, as quais possuem caráter básico, ricas em arginina e cisteína (KOSOWER et al., 1992). NUCLEOSSOMO curva menor protamina Histona (octâmero) curva maior Nucleossomo Fita de cromatina Fita de cromatina Fita de cromatina 30 nm Solenóide Núcleo somático 30 nm Arranjo linear e lateral Núcleo espermático FIGURA 1 - Diferenças no mecanismo de condensação do DNA em células somáticas (esquerda) e nos espermatozóides (direita). Fonte: Ward & Coffey, (1991).

21 11 Essas proteínas são responsáveis pela forma condensada e inerte da cromatina, devido à neutralização do esqueleto fosfodiéster do DNA pela interação dos resíduos de amina protéica com grupos fosfatados das fitas de DNA (EVENSON et al., 1980; COURTENS & LOIR, 1981; BELETTI & MELLO, 1996), está condensação nada mais é do que um mecanismo de proteção da cromatina nuclear, do estresse ambiental e de mutações (WARD & COFFEY, 1991). As alterações na estrutura da cromatina (fragmentação da molécula de DNA, caracterizada pela presença de uma fita simples, quando a forma esperada seria uma fita dupla), podem afetar o percentual de descondensação do DNA espermático, provocando distúrbios no processo de fertilização (GOPALKRISHNAN et al., 1992, 1999; COLENBRANDER et al., 2003; WALTERS et al., 2006). Normalmente, as agressões leves sofridas pela cromatina podem ser reparadas pelo oócito, no entanto quando a desnaturação é acentuada, ela persiste durante o desenvolvimento embrionário, induzindo a mortalidade embrionária precoce (TWIGG et al., 1998, WALTERS et al., 2005b). Este aumento na desnaturação do DNA espermático está associado à infertilidade ou sub-fertilidade, e de fato, no homem a instabilidade da cromatina tem sido relacionada com casos de aborto recorrente, sendo possível que o mesmo ocorra em outros mamíferos como o garanhão e o touro (IBRAHIM et al., 1988; DURAN et al., 1998, BELETTI & MELLO, 1996).

22 Capacitação espermática e reação acrossômica Os espermatozóides dos mamíferos não possuem a habilidade de fertilizar os oócitos imediatamente após a ejaculação, pois mesmo dotados de motilidade e morfologicamente maduros, requerem um período de permanência no trato reprodutivo da fêmea para se tornarem competentes quanto à fertilização, processo denominado de capacitação espermática por CHANG (1951) e AUSTIN (1952), citados por ALMEIDA et al. (1999). Várias mudanças intracelulares ocorrem durante este processo, por exemplo, o aumento da fluidez da membrana plasmática, remoção do colesterol da membrana, elevação progressiva das concentrações intracelulares de cálcio (Ca 2+ ) e adenosina monofosfáto cíclico (camp), fosforilação tirosínica das proteínas da membrana celular, mudanças na hidrodinâmica e motilidade espermática (BREITBART & NAOR, 1999). Tudo isso contribui para o aumento da afinidade com a ZP (PUKAZHENTHI et al., 1998), hiperatividade flagelar (NASSAR et al., 1999) e posteriormente a indução da reação acrossômica (BENOFF, 1998). No trato reprodutivo da fêmea, os gametas masculinos estão expostos a vários agentes bioquímicos, entre eles podemos citar o fator de crescimento epitelial (EGF). Este ao entrar em contato com receptores de superfície específicos (EGFR), promove o aumento gradual de fosfolipases C γ (PLC γ ) aderidas nas proteínas da membrana plasmática do espermatozóide (ALBERTS et al., 2002; GABALDI et al., 2002). As albuminas presentes no ambiente uterino causam o efluxo de colesterol da membrana plasmática dos gametas, provocando o transporte ativo de Ca 2+, de bicarbonato (HCO - 3) e peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ), para o meio intracelular, resultando na ativação da adenilato ciclase (AC) para produzir camp (GADELLA et al., 2001). O camp ativa a proteína kinase A (PKA), responsável pela fosforilação dos resíduos de serina e posteriormente dos resíduos de tirosina das proteínas de membrana da cabeça e da cauda do espermatozóide (BREITBART & NAOR, 1999; BREITBART, 2003).

23 13 Possivelmente a PKA ativa canais de Ca 2+ localizados na membrana externa do acrossoma (OAMCh), levando a um aumento parcial da concentração intracelular ([Ca 2+ ] i ), e a ativação gradual das PLC γ ligadas ao EGFR (BREITBART & NAOR, 1999). Como a [Ca 2+ ] i ao final do processo de capacitação é relativamente baixa (160 ± 40 ηmol L -1 ) acredita-se que os canais de entrada capacitativa (CCE) e os canais de Ca 2+ dependentes do inositol tri-fosfáto (IP 3 ), duas classes de receptores ligados à membrana plasmática e a membrana externa do acrossoma respectivamente, só serão ativados completamente durante a ligação do espermatozóide à ZP do oócito (MIYAZAKI et al., 1993). Nesta etapa, a glicoproteína ZP3 da zona pelúcida, se liga a pelo menos duas classes diferentes de receptores de membrana, a primeira classe (R) apresenta proteínas G associadas e são responsáveis pela ativação de fosfolipases C β1 (PLC β1 ). A outra classe de receptores é de proteínas tirosina kinase (PTK) ligadas à PLC γ (GABALDI et al., 2002; BREITBART, 2003). Os receptores R regulam também a atividade da AC, levando consequentemente ao aumento da produção de camp, ativação da PKA, ativação dos OAMCh, mobilização e transporte de Ca 2+ do interior do acrossoma para o espaço entre a membrana plasmática e a membrana externa do acrossoma, e ao primeiro aumento parcial da [Ca 2+ ] i (BREITBART & NAOR, 1999; BREITBART, 2003). O diacilglicerol (DAG) e o IP 3 produzidos a partir da hidrólise do fosfatidil inositol 4,5-bifosfato (PIP 2 ) pela PLC γ, provocam a translocação da proteína kinase C (PKC) para a membrana plasmática e sua ativação. A PKC promove então a abertura de canais de Ca 2+ da membrana plasmática, levando ao segundo aumento parcial da [Ca 2+ ] i. A atividade da PKA e do IP 3 causa depleção da [Ca 2+ ] no interior do acrossoma e ativação completa do CCE (MIYAZAKI et al., 1993; BREITBART & NAOR, 1999; BREITBART, 2003). Paralelamente a isso as proteínas G ou as PTK ativam bombas de sódio (Na + ) e hidrogênio (H + ) presentes na membrana plasmática, responsáveis pela alcalinização do citosol (GADELLA et al., 2001). O aumento da [Ca 2+ ] i associado com a elevação do ph intracelular, promove mudanças conformacionais das proteínas de fusão da membrana

24 14 plasmática com a membrana externa do acrossoma em pontos múltiplos e a liberação do conteúdo enzimático (BARTH & OKO, 1989; GABALDI et al., 2002). Todo este processo é controlado por pelas GTPases: sinaptogamina I e sinaptobrevina (GADELLA et al., 2001). As enzimas hidrolíticas dissolvem a zona pelúcida envolta do espermatozóide penetrante e permite que o gameta entre no espaço perivitelínico fertilizando o oócito (YANAGIMASHI, 1994). A penetração do espermatozóide (FIGURA 2), ativa o oócito e provoca exocitose dos grânulos corticais bloqueando a polispermia (penetração de dois ou mais espermatozóides no oócito) e garantindo um desenvolvimento embrionário normal (GABALDI et al., 2002). FIGURA 2 - Representação esquemática da interação entre o espermatozóide e o oócito necessária para a fertilização: (1) Ligação do espermatozóide à zona pelúcida; (2) Reação Acrossômica; (3) Penetração do espermatozóide através da zona pelúcida; (4) Ligação e fusão do espermatozóide com a oolemma (fertilização); (5) Ativação do oócito por fatores do citosol e bloqueio da poliespermia; (6) Liberação dos grânulos corticais provocando o bloqueio definitivo da poliespermia. Fonte: Gadella et al. (2001).

25 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Local e período experimental Este estudo foi realizado durante as estações de monta 2003, 2004 e 2005 nas dependências de uma propriedade, localizada no município de Cristalina, região Leste do Estado de Goiás (990 metros de altitude, 16º latitude sul e 47º longitude oeste). A área total da fazenda é de ha, sendo 1940 ha formados por pastagem de Andropogon gayanus e Brachiaria brizantha, divididas e manejadas sob orientação técnica. O clima da região pode ser classificado como Tropical de Altitude, com uma estação chuvosa (outubro a março) e outra seca (abril a setembro), sendo que no inverno a temperatura média fica abaixo de 18ºC e o verão é caracterizado, na sua maior parte por temperaturas mais brandas. A precipitação pluviométrica anual média de Cristalina é em torno de mm (110,0 mm 100,9 mm), com 70% do total da precipitação ocorrendo entre novembro e março. O município também se caracteriza por baixos índices de umidade relativa do ar nos meses de julho a setembro, podendo chegar abaixo de 15% nesse período, em contraponto tem umidade elevada nos meses de dezembro e janeiro podendo chegar em média a 95%. 3.2 Animais Foram utilizados 36 touros da raça Nelore com idade média entre 60,0 ±15,1 meses (início) e 74,5 ± 23,3 meses (fim do experimento), submetidos à avaliação da aptidão reprodutiva, anterior ao início do período de acasalamento, durante três estações de monta consecutivas (ano de 2003, 2004 e 2005), produzindo 108 amostras de sêmen. Posteriormente os touros entraram em uma estação de monta de 120 dias, servindo 1270 fêmeas (202 novilhas, 372 vacas primíparas, 627 vacas pluríparas e 69 vacas solteiras) agrupadas em dez lotes de acasalamento com 35

26 16 touros, no ano de 2003; 1248 fêmeas (190 novilhas, 358 vacas primíparas, 617 vacas pluríparas e 83 vacas solteiras) agrupadas em três lotes de acasalamento com 38 touros, no ano de 2004 e 1264 fêmeas (209 novilhas, 307 vacas primíparas, 652 vacas pluríparas e 96 vacas solteiras) agrupadas em três lotes de acasalamento com 35 touros em Ao final das estações de 2003 e 2004 obteve-se o percentual de prenhez através de palpação retal. Para a estação de 2005, o diagnóstico de gestação não foi realizado. Os animais foram mantidos em pastagem durante todo o período experimental, recebendo suplementação mineral ad libitum. 3.3 Avaliação Andrológica Foi mensurada a circunferência escrotal e o sêmen foi colhido pelo método de eletroejaculação, seguindo-se das análises das características físicas do ejaculado movimento em massa ou turbilhão (escore: 1-5), motilidade progressiva (%) e vigor (escore: 1-5). Amostras fixadas em solução de formolsalina foram enviadas para o Laboratório de Andrologia e Tecnologia do Sêmen Escola de Veterinária-UFG, para a avaliação morfológica. As preparações úmidas foram avaliadas em microscopia de contraste de fase sob imersão (aumento de 1000x). Foram contados 200 espermatozóides por lâmina, sendo classificados conforme o percentual de gametas normais, defeitos maiores, defeitos menores e defeitos totais. 3.4 Avaliação da viabilidade espermática e integridade de acrossoma Na avaliação da viabilidade espermática e integridade do acrossoma, foram analisadas amostras de sêmen coletadas nos anos de 2003 (35 touros avaliados), 2004 (38 touros avaliados) e 2005 (35 touros avaliados), totalizando 108 análises a partir de amostras de sêmen fresco. Em tubo tipo eppendorf adiciona-se 20 L de sêmen e 20 L de solução corante de Azul de Tripano 0,4%. Após incubação a 37ºC/20 minutos, a amostra

27 17 foi centrifugada a 700G durante seis minutos e o processo de centrifugação foi repetido até que a solução apresentasse cor azul pálido (SILVA, 1998). Posteriormente, foram feitos dois esfregaços e após a secagem das lâminas, estas foram fixadas em metanol por cinco minutos e imersas em Giemsa por 24 horas. Após a lavagem e secagem das lâminas, o esfregaço foi avaliado em microscopia de campo claro sob imersão. Contou-se 200 células e estimou-se o percentual de espermatozóides vivos ou mortos com acrossoma integro ou acrossoma reagido. 3.5 Avaliação da cromatina espermática Na avaliação da integridade de cromatina foi aplicada a técnica proposta por TEJADA et al. (1984), nos anos de 2003 (35 touros avaliados), 2004 (38 touros avaliados) e 2005 (35 touros avaliados), totalizando 108 análises a partir de amostras de sêmen fixado em formol salino. Foram utilizados 20 L de sêmen acondicionado em eppendorf com solução salina para centrifugação por dois minutos a 37ºC em 200G, repetindo o processo duas vezes. Após cada lavagem o sobrenadante era retirado e no final foi feito o esfregaço em uma lâmina. Após a secagem, o esfregaço foi fixado em solução de metanol-ácido acético (3:1) por 24 horas. Após este período, foi empregada a coloração de LA por cinco minutos, seguida pela lavagem com água destilada, após a secagem a lâmina foi observada em microscopia de epifluorescência seguida de contagem de 200 células. 3.6 Delineamento estatístico Foram calculados os valores médios e o desvio padrão da CE, das características físicas, morfologia espermática, viabilidade espermática, integridade de acrossoma e de cromatina. Os dados resultantes foram submetidos à análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste SNK

28 18 (entre grupos de acasalamento, entre estações de monta e entre faixas etárias diferentes). O coeficiente de correlação de Pearson entre as variáveis dependentes: CE, características físicas e morfológicas do ejaculado, viabilidade espermática, integridade de acrossoma e de cromatina e taxa de prenhez, foi calculado utilizando o Sistema de Analises Estatísticas SAS (1997), segundo o modelo matemático: Y I j k = μ + T + F i + E j + e i j k Onde: Y I j k = variáveis dependentes; μ= média de todas as observações; T= efeito do touro; F= efeito da categoria de fêmea servida pelos touros de índice i, sendo i= 1(novilhas), 2 (primíparas) e 3 (vacas); E j = efeito do período de coleta do sêmen de índice j, sendo j= 1(estação de monta 2003), 2 (estação de monta 2004) e 3 (estação de monta 2005); e i j k = erro aleatório residual.

29 19 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Na TABELA 1 estão representadas as médias da circunferência escrotal (CE), dos aspectos físicos e morfológicos, distribuídas por lotes de acasalamento contendo diferentes categorias de fêmeas (novilhas, vacas primíparas, pluríparas e solteiras) e a taxa de prenhez da propriedade. Observando-se os valores médios de espermatozóides normais, de cromatina normal, de acrossoma integro e de espermatozóides viáveis com acrossoma integro, por grupos de acasalamento, os percentuais apresentaram variações de 78,0 ± 12,1 a 91,5 ± 4,3; 88,0 ± 1,5 a 94,8 ± 4,6; 44,0 ± 26,1 a 73,5 ± 8,5 e 30,7 ± 16,8 a 51,9 ± 24,0; respectivamente, porém estas variações não foram consideradas significativas (P> 0,05). Os grupos de acasalamento (TABELA 1) formados com vacas primíparas alcançaram a menor média aritmética para taxa de prenhez (53,3%), quando comparados com os grupos formados por vacas pluríparas (79,6%) e grupos formados por novilhas (90,0%). Embora o perfil andrológico dos touros destes grupos não tenha sido diferente, estes resultados demonstram a possível influência da categoria de fêmeas sobre o desempenho reprodutivo do rebanho (RESENDE, 2001). Haja vista que a eficiência reprodutiva de vacas primíparas é um entrave para os sistemas de produção, já que apresentam maiores períodos de serviço e intervalo de partos, principalmente quando manejadas com baixo escore corporal, indicando que esta categoria requer maior atenção, uma vez que o efeito aditivo da amamentação mais as exigências de crescimento e produção intensificam o balanço energético negativo, prejudicando a função reprodutiva (BORGES, 2006). Neste experimento as causas e os efeitos da categoria de fêmeas sobre o desempenho reprodutivo do rebanho não tiveram sua origem determinada.

30 TABELA 1- Características andrológicas, viabilidade espermática, integridade de acrossoma e cromatina, proporção touro:fêmea, por grupos de acasalamento em uma propriedade de Cristalina-GO Grupos Variáveis CE 35,8 ± 3,3ª 33,3 ± 2,5ª 34,0 ± 0,0ª 36,3 ± 3,1ª 37,3 ± 2,1ª 35,0 ± 2,0ª 32,5 ± 2,1ª VOL 3,8 ± 1,0ª 4,0 ± 1,0ª 3,0 ± 0,0ª 3,3 ± 0,6ª 6,3 ± 2,9ª 5,7 ± 1,2ª 4,5 ± 0,7ª TURB 3,5 ± 0,6ª 4,0 ± 1,8ª 1,5 ± 1,0ª 3,0 ± 1,0ª 1,7 ± 2,1ª 4,0 ± 1,7ª 4,5 ± 0,7ª MOT 66,3 ± 7,5ª 76,7 ± 14,4ª 82,5 ± 3,5ª 70,0 ± 13,2ª 61,7 ± 10,4ª 78,3 ± 7,6ª 85,0 ± 7,1ª VIGOR 3,8 ± 0,5ª 4,3 ± 1,1ª 3,0 ± 1,4ª 4,0 ± 1,0ª 3,3 ± 0,6ª 5,0 ± 0,0ª 4,0 ± 0,0ª NORMSP 86,9 ± 6,7ª 91,5 ± 4,3ª 78,0 ± 12,1ª 78,3 ± 3,3ª 87,2 ± 6,0ª 81,3 ± 14,0ª 87,8 ± 2,5ª DT 13,1 ± 6,7ª 8,5 ± 4,4ª 22,0 ± 2,1ª 21,7 ± 3,3ª 12,8 ± 6,0ª 18,7 ± 14,0ª 12,2 ± 2,5ª DMA 10,0 ± 6,4ª 5,2 ± 3,0ª 17,8 ± 3,1ª 9,3 ± 2,6ª 7,3 ± 5,6ª 8,5 ± 3,0ª 7,0 ± 0,0ª DME 3,1 ± 2,2ª 3,3 ± 1,4ª 4,2 ± 1,1ª 12,4 ± 5,1ª 5,5 ± 3,0ª 10,2 ± 12,0ª 5,2 ± 2,5ª CRONAT 93,1 ± 5,9ª 91,8 ± 3,1ª 89,8 ± 5,3ª 89,0 ± 0,9ª 94,8 ± 4,6ª 90,0 ± 2,5ª 89,3 ± 1,8ª CRODES 6,9 ± 5,9ª 8,2 ± 3,1ª 10,2 ± 5,3ª 11,0 ± 0,9ª 5,2 ± 4,6ª 10,0 ± 2,5ª 10,7 ± 1,8ª EVAI * * * * * * * EVAR * * * * * * * EMAI * * * * * * * EMAR * * * * * * * Re Fe/T 45/1 43/1 43/1 43/1 41/1 40/1 35/1 CatFe none vane vane vane vane vane vane Prenhez 89,00 85,00 88,50 73,40 74,00 82,00 78,00 CE: circunferência escrotal, Vol: volume, Turb: turbilhão, Mot: motilidade progressiva, Vigor, Normsp: espermatozóides normais, DT: defeitos totais, Dma: defeitos maiores, Dme: defeitos menores, Cronat:cromatina normal, Crodes: cromatina fragmentada, ain: acrossoma integro, ainj: acrossoma injuriado, EVAI: espermatozóides vivos com acrossoma integro, EVAR: espermatozóides vivos com acrossoma reagido, EMAI: espermatozóides mortos com acrossoma integro, EMAR: espermatozóides mortos com acrossoma reagido, Re. T/F: relação touro/fêmea, Cat-Fem: categoria de fêmeas (None: Novilhas Nelore, Prine: Primíparas nelore, Vane: Vacas Nelore). *: dados não disponíveis; Letras diferentes entre colunas P< 0,05 (SNK). 20

31 TABELA 1- Características andrológicas, viabilidade espermática, integridade de acrossoma e cromatina, proporção touro:fêmea, por grupos de acasalamento em uma propriedade de Cristalina-GO (continuação) Variáveis Grupos GERAL CE 32,7 ± 0,6ª 32,7 ± 0,6ª 33,3 ± 0,6ª 35,0 ± 2,7ª 33,7 ± 3,3ª 33,5 ± 4,9ª 33,1 ± 3,2ª 33,8 ± 2,8 VOL 7,7 ± 6,4ª 3,3 ± 0,6ª 6,0 ± 2,6ª 5,0 ± 1,0ª 6,0 ± 2,1ª 5,0 ± 0,0ª 7,9 ± 2,2ª 5,9 ± 2,5 TURB 3,7 ± 1,5ª 3,7 ± 0,6ª 3,0 ± 1,7ª 3,7 ± 1,0ª 2,6 ± 1,3ª 1,0 ± 0,0ª 1,6 ± 1,6ª 2,7 ± 1,7 MOT 70,0 ± 17,3ª 76,7 ± 11,5ª 65,0 ± 22,9ª 79,2 ± 8,4ª 72,9 ± 12,2ª 60,0 ± 7,1ª 71,4 ± 16,1ª 73,6 ± 13,7 VIGOR 4,0 ± 1,0ª 3,7 ± 0,6ª 4,0 ± 1,0ª 3,6 ± 1,3ª 2,9 ± 1,2ª 2,5 ± 0,7ª 2,6 ± 1,0ª 3,3 ± 1,2 NORMSP 83,0 ± 11,7ª 87,3 ± 4,5ª 87,5 ± 1,8ª 83,0 ± 7,4ª 79,4 ± 9,5ª 82,5 ± 10,6ª 87,9 ± 6,9ª 84,4 ± 8,5 DT 17,0 ± 11,7ª 12,7 ± 4,5ª 12,5 ± 1,8ª 17,0 ± 7,4ª 20,6 ± 9,5ª 17,5 ± 10,6ª 12,1 ± 6,9ª 15,6 ± 8,5 DMA 8,7 ± 4,8ª 7,2 ± 2,8ª 8,2 ± 1,9ª 10,0 ± 4,4ª 14,3 ± 8,4ª 14,0 ± 9,9ª 7,9 ± 5,5ª 10,1 ± 6,7 DME 8,3 ± 7,5ª 5,5 ± 1,7ª 4,3 ± 2,1ª 7,0 ± 5,3ª 6,3 ± 5,6ª 3,5 ± 0,7ª 4,2 ± 2,8ª 5,6 ± 4,5 CRONAT 92,8 ± 6,2ª 88,0 ± 1,5ª 91,7 ± 2,1ª 92,0 ± 4,2ª 90,0 ± 2,6ª 92,0 ± 2,1ª 91,4 ± 3,9ª 91,2 ± 3,8 CRODES 7,2 ± 6,2ª 12,0 ± 1,5ª 8,3 ± 2,1ª 8,0 ± 4,2ª 10,0 ± 2,6ª 8,0 ± 2,1ª 8,6 ± 3,9ª 8,8 ± 3,8 EVAI * * * 51,9 ± 24,0ª 30,7 ± 16,8ª 49,8 ± 46,3ª * 40,1 ± 23,1 EVAR * * * 16,1 ± 13,1ª 24,9 ± 13,7ª 13,8 ± 10,2ª * 20,6 ± 14,6 EMAI * * * 7,5 ± 5,9ª 8,9 ± 5,8ª 5,8 ± 6,7ª * 7,4 ± 5,7 EMAR * * * 24,6 ± 24,1ª 35,5 ± 18,7ª 30,8 ± 42,8ª * 31,8 ± 23,0 Re Fe/T 39/1 45/1 39/1 31/1 39/1 11/1 * 34/1 CatFe prine prine vane vane prine none * * Prenhez 63,00 48,00 79,00 77,00 49,00 91,00 * 67,83 CE: circunferência escrotal, Vol: volume, Turb: turbilhão, Mot: motilidade progressiva, Vigor, Normsp: espermatozóides normais, DT: defeitos totais, Dma: defeitos maiores, Dme: defeitos menores, Cronat:cromatina normal, Crodes: cromatina fragmentada, ain: acrossoma integro, ainj: acrossoma injuriado, EVAI: espermatozóides vivos com acrossoma integro, EVAR: espermatozóides vivos com acrossoma reagido, EMAI: espermatozóides mortos com acrossoma integro, EMAR: espermatozóides mortos com acrossoma reagido, Re. T/F: relação touro/fêmea, Cat-Fem: categoria de fêmeas (None: Novilhas Nelore, Prine: Primíparas nelore, Vane: Vacas Nelore). *: dados não disponíveis; Letras diferentes entre colunas P< 0,05 (SNK). 21

32 22 Analisando os dados das estações de monta (TABELA 2), notou-se que a CE não apresentou diferença ao longo dos anos, por outro lado no último ano (2005), o turbilhonamento sofreu redução, a motilidade apresentou valores equivalentes ao longo das estações, o vigor iniciou em 2003 uma trajetória de queda que se estendeu até a estação do ano de 2005, entretanto os valores destas características seminais permaneceram dentro dos padrões de normalidade (CBRA, 1998). Durante a estação de monta de 2004 houve escassez de pastagens, conseqüentemente os animais foram afetados pela redução na oferta e na qualidade alimentar (RESENDE, 2001). O número relativo de espermatozóides normais sofreu redução significativa (P<0,05), quando comparado com os resultados do ano anterior (2003). TABELA 2- Características andrológicas, viabilidade espermática, integridade de acrossoma e cromatina, por estação de monta em uma propriedade de Cristalina-GO Variáveis Estação de Monta CE 34.3 ± 2,4ª 34,1 ± 2,9ª 33,1 ± 3,2ª TURB 3,2 ± 1,5ª 3,2 ± 1,4ª 1,6 ± 1,6 b MOT 72,9 ± 13,3ª 76,5 ± 11,4ª 71,4 ± 16,1ª VIGOR 3,9 ± 0,8ª 3,3 ± 1,2 b 2,6 ± 1,0 c NORMSP 85,4 ± 7,0ª 79,8 ± 9,5 b 87,8 ± 7,0ª DT 14,6 ± 7,0 b 20,2 ± 9,5ª 12,1 ± 7,0 b DMA 9,1 ± 5,0 b 13,6 ± 8,7ª 7,8 ± 5,5 b DME 5,6 ± 4,8 ab 7,0 ± 5,2ª 4,3 ± 2,8 b CRONAT 91,4 ± 4,1ª 90,8 ± 3,4ª 91,4 ± 3,9ª CRODES 9,5 ± 4,1ª 9,2 ± 3,4ª 8,6 ± 3,9ª EVAI * 40,1 ± 23,1 * EVAR * 20,6 ± 14,6 * EMAI * 7,4 ± 5,7 * EMAR * 31,8 ± 23,0 * Prenhez 75,7 64,4 * CE: circunferência escrotal, Vol: volume, Turb: turbilhão, Mot: motilidade progressiva, Vigor, Normsp: espermatozóides normais, DT: defeitos totais, Dma: defeitos maiores, Dme: defeitos menores, Cronat:cromatina normal, Crodes: cromatina fragmentada. EVAI: espermatozóides vivos com acrossoma integro, EVAR: espermatozóides vivos com acrossoma reagido, EMAI: espermatozóides mortos com acrossoma integro, EMAR: espermatozóides mortos com acrossoma reagido. *: dados não disponíveis. Letras diferentes entre colunas P< 0,05 (SNK).

33 23 Estes resultados concordam com os de RODE et al. (1995), que verificaram redução na motilidade progressiva e o aumento no percentual de defeitos morfológicos, em touros submetidos a dietas deficientes em vitamina A, confirmando os efeitos deletérios, porém reversíveis da carência nutricional sobre as características seminais (SILVA et al., 1993; RODE et al., 1995). Uma vez removida esta restrição nutricional no ano seguinte (2005), o percentual de gametas normais voltou a valores equivalentes aos do primeiro ano do experimento. Quanto à faixa etária, os animais mais jovens ( 36 meses) apresentaram as menores médias para CE (P<0,05), as características físicas e morfológicas do sêmen foram semelhantes (P>0,05) entre todos os touros, independente da faixa etária (TABELA 3). Estes resultados se mostraram abaixo dos relatados por ANDRADE et al. (2001) para touros com idade semelhante aos deste experimento. Os touros das demais faixas etárias apresentaram médias de CE e de espermatozóides morfologicamente normais, inferiores aos relatados por GALVANI (1998), 37,93cm e 92,84%, respectivamente. TABELA 3- Características andrológicas, integridade de acrossoma e de cromatina por faixa etária em uma propriedade em Cristalina- GO Variáveis Jovem1 ( 36 meses) Jovem2 (37-61 meses) Faixa Etária Maturo1 (62-84 meses) Maturo2 ( 85 meses) CE 29,9 ± 1,6 b 33,8 ± 2,2ª 34,1 ± 3,3ª 34,0 ± 2,5ª TURB 0,4 ± 0,5 b 3,2 ± 1,6ª 2,6 ± 1,6ª 2,9 ± 1,9ª MOT 63,0 ± 13,5 b 72,6 ± 13,6 ab 73,8 ± 14,1ª b 78,3 ± 11,3ª VIGOR 1,8 ± 0,4 b 3,9 ± 0,9ª 3,1 ± 1,2ª 3,4 ± 1,0ª NORMSP 83,5 ± 7,4ª 85,0 ± 7,6ª 84,0 ± 9,2ª 86,5 ± 6,8ª DT 16,5 ± 7,4ª 15,0 ± 7,6ª 16,1 ± 9,2ª 13,5 ± 6,8ª DMA 9,6 ± 5,6ª 9,6 ± 5,5ª 10,5 ± 7,9ª 9,5 ± 4,2ª DME 6,9 ± 2,7ª 5,7 ± 5,2ª 5,8 ± 4,6ª 4,0 ± 2,8ª CRONAT 91,5 ± 4,5ª 91,4 ± 4,2ª 91,3 ± 3,7ª 90,5 ± 3,7ª CRODES 8,5 ± 4,5ª 8,7 ± 4,2ª 8,7 ± 3,7ª 9,5 ± 3,7ª CE: circunferência escrotal, Turb: turbilhão, Mot: motilidade progressiva, Vigor, Normsp: espermatozóides normais, DT: defeitos totais, Dma: defeitos maiores, Dme: defeitos menores, Cronat:cromatina normal, Crodes: cromatina fragmentada. Letras diferentes entre colunas P< 0,05 (SNK).

34 24 Atribuiu-se como provável causa destes resultados, a inexistência de um programa de seleção intensivo para características reprodutivas (ANDRADE et al., 2001) nos rebanhos de origem dos reprodutores deste experimento e a fatores externos, notadamente as restrições nutricionais (RESENDE, 2001). Considerando a tabela proposta para classificação dos animais zebuínos quanto à circunferência escrotal, os touros foram considerados como bons (FONSECA et al., 1997b). Com relação ao volume do ejaculado, vale salientar que a metodologia adotada para a coleta do sêmen foi a eletroejaculação, em virtude da maior facilidade na sua aplicação. O valor médio geral obtido neste experimento foi maior do que aqueles reportados por GALVANI (1998) e MARTINEZ et al. (2000) 4,12 ml e 5,16 ml, respectivamente. O turbilhonamento, a motilidade, o vigor e a concentração espermática e suas avaliações dependem de fatores extrínsecos, como o método da coleta, repouso sexual e as condições ambientais onde o sêmen está sendo analisado (FONSECA, 1995). Os touros que participaram deste estudo foram considerados aptos para monta natural segundo os padrões estabelecidos pelo CBRA (1998) para estas características. Os percentuais médios gerais de todos os grupos (TABELA 1) para defeitos maiores (10,1%); menores (5,6%) e totais (15,6%), foram semelhantes aos encontrados por MARTINEZ et al. (2000) para touros da raça Gir (7,86%, 5,09% e 12,95%, respectivamente); por FITZPATRICK et al. (2002) para touros da raça Brahman (defeitos totais: 11,9%) e por SILVA et al. (2002) para touros da raça Nelore (9,5%, 3,1% e 12,6%, respectivamente). Porém, foram maiores que os relatados por GALVANI (1998) em touros da raça Nelore (4,04%, 3,12% e 7,16%, respectivamente), que atribuiu como causa para estes resultados às condições de manejo e nutrição dos rebanhos. Os touros tiveram sua aptidão reprodutiva avaliada nas sucessivas estações de monta (TABELA 2) e conforme os padrões propostos pelo CBRA (1998), foram classificados em aptos, questionáveis ou inaptos para a reprodução.

35 25 Na primeira avaliação (ano 2003), apenas um touro foi considerado inapto, já em 2004 foi recomendado o afastamento de cinco animais e na estação de 2005 todos os reprodutores foram considerados aptos para a reprodução. O exame clínico andrológico diagnosticou a condição reprodutiva individual dos touros, indicando o descarte de 16,6% dos animais utilizados neste experimento. As patologias espermáticas encontradas mais freqüentemente foram defeitos de acrossoma (achatado no ápice, pequeno, destacados, diademas e crateras), cabeças subdesenvolvidas, estreitas, curtas, largas e decapitadas defeitos de peça intermediária (peça disforme, grossa, delgada), caudas enrolada na cabeça e na peça intermediária, gotas citoplasmáticas proximais e distais. Estes defeitos estão comumente associados a distúrbios do mecanismo de termorregulação testicular, sendo também observado em touros que foram tratados com dexametasona, indicando que o estresse provocado pelo calor ou por práticas de manejo, são as formas mais comuns de injurias interferindo na espermatogênese (BARTH & OKO, 1989; KASTELIC et al., 1997). Neste experimento as causas dos defeitos espermáticos não tiveram sua origem determinada. As relações entre volume (r= 0,23; P>0,05), turbilhonamento (r= 0,20; P<0,05), motilidade (r= 0,13; P>0,05), vigor (r= 0,16; P>0,05) defeitos maiores (r= 0,035; P>0,05) e defeitos menores (r= 0,16; P>0,05), com a CE foram baixas e próximas de zero, e foram semelhantes às obtidas por MARTINEZ et al. (2000) e por SILVA et al. (2002), para touros da raça Gir e Nelore, respectivamente. Estas baixas relações demonstram que estes touros já atingiram a maturidade sexual (SALISBURY et al., 1978), caracterizada pela desaceleração no crescimento testicular (FRENEAU, 1991, 1996), e o estabelecimento de melhor qualidade seminal em função da idade dos animais (HALLAP et al., 2006). Além da estimativa dos elementos tradicionais do exame andrológico foram realizadas provas para avaliar a viabilidade espermática, a integridade do acrossoma, a integridade da cromatina, e seus efeitos no desempenho reprodutivo dos touros. Em duas avaliações andrológicas pré-estação de monta (2003 e 2005), possivelmente devido ao aumento da acidez do corante Giemsa, a técnica de coloração dupla não apresentou resultados satisfatórios. Entretanto, no exame

36 26 pré-estação de monta 2004, foi possível à aplicação da coloração dupla para viabilidade espermática e integridade de acrossoma. A qualidade dos esfregaços permitiu visualizar também vários defeitos espermáticos (FIGURA 3). FIGURA 3 - Espermatozoides bovinos, de cima para baixo e da esquerda para a direita. Gametas vivos (rosa) e mortos (azul), Acrossoma achatado no ápice, acrossoma curto, cabela curta e larga, dupla peça intermediária, cabeças decapitadas. Fotomicrografia feita a partir de lâminas coradas por Trypan Blue e Giemsa, microscopia óptica (1000x).