UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS DA TERRA E DO MAR CURSO DE CIÊNCIA DA COMPUTAÇÃO

Transcrição

1 UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS DA TERRA E DO MAR CURSO DE CIÊNCIA DA COMPUTAÇÃO SISTEMA WEB PARA PROJETO E ANÁLISE DE PRIMERS Sistemas de Informação Fernanda Scariot Itajaí (SC), junho de 2004.

2 UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS DA TERRA E DO MAR CURSO DE CIÊNCIA DA COMPUTAÇÃO RELATÓRIO DO TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO SISTEMA WEB PARA PROJETO E ANÁLISE DE PRIMERS Sistemas de Informação Fernanda Scariot Relatório apresentado à banca examinadora do trabalho de conclusão do curso de ciência da computação para análise e aprovação. Itajaí (SC), junho de 2004.

3 EQUIPE TÉCNICA Acadêmica Fernanda Scariot Professor Orientador Rafael Luiz Cancian, M.Sc. Professor Co-orientador André Oliveira de Souza Lima, Dr. Coordenador dos Trabalhos de Conclusão de Curso Anita Maria Fernandes da Rocha, Dra. César Albenes Zeferino, Dr. Coordenador do Curso Luís Carlos Martins, Esp. i

4 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho aos meus pais que sempre me incentivaram a seguir em frente e sempre acreditaram no meu potencial. Agradeço pelo amor infinito e pelas palavras de alegria e força que recebi, mesmo estando longe. ii

5 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus pela vida, pela saúde e pela inteligência que me foi concedida, e por ter enviado verdadeiros anjos para me acompanhar e me ajudar durante toda a vida. Agradeço a minha mãe que sempre acreditou em mim e não deixou que eu desistisse em nenhum momento e a meu pai que sempre teve gestos de amor incondicional. A meus irmãos que sempre estiveram do meu lado e mostraram-se grandes amigos. A meus magníficos amigos que sempre me auxiliaram, me fizeram sorrir, e nunca me abandonaram. Em especial a Ariel, grandiosíssimo amigo, Carlos, meu "pai" e amigo de plantão, e às minhas amigas Fernanda e Ana Paula, sempre grandes companheiras. Agradeço a todos àqueles que se mostraram verdadeiros amigos em toda a minha vida acadêmica. Descobri inúmeros novos amigos nessa caminhada... Agradeço a meus mestres que me ensinaram e me auxiliaram em tudo que podiam, em especial a Anita, Elisangela, Rudimar, Adhemar, e César. A meu co-orientador professor André Lima e a pesquisadora Sheila, que contribuíram para que esse trabalho fosse realizado. Muito obrigada! iii

6 SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS...vii LISTA DE FIGURAS...ix LISTA DE TABELAS...xi RESUMO...xii ABSTRACT...xiii I INTRODUÇÃO APRESENTAÇÃO JUSTIFICATIVA IMPORTÂNCIA OBJETIVOS Geral Específicos METODOLOGIA... 7 II REVISÃO BIBLIOGRÁFICA MATERIAL GENÉTICO DNA e RNA Gene Proteínas Replicação Transcrição Tradução Desnaturação e Renaturação do DNA TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR Seqüenciamento e Clonagem PCR iv

7 Primers Eletroforese BIOINFORMÁTICA Bancos de Dados Biológicos Públicos Alinhamento de Seqüências Árvores Filogenéticas Simuladores de Eletroforese SISTEMAS PARA WEB Perl Principais Módulos Perl BioPerl HTML PHP Banco de Dados SQL MySQL PostgreSQL Comparação de Bancos de Dados III. DESENVOLVIMENTO MODELAGEM DO SISTEMA Análise do Sistema Diagrama de Contexto Diagramas de Fluxos de Dados Dicionário de Dados Utilizados na Modelagem do Sistema Diagrama de Casos de Uso Diagrama de Classes Diagramas de Seqüência Diagrama de Navegação do Sistema v

8 Diagrama Entidade-Relacionamento Dicionário de Dados das Tabelas Projeto do Sistema Especificação de Processos Modelo Físico do Banco de Dados DESCRIÇÃO DO SISTEMA PROPOSTO Busca de Seqüências Preparação de Seqüências Projeto de Primers IV CONCLUSÕES...89 BIBLIOGRAFIA...91 GLOSSÁRIO...97 vi

9 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS A AIDS ASP BD BLOSUM C CGI DBI DNA EMBL EST G HIV HTML LWP.pm NCBI NIH PAM pb PCR PDB PDL Perl RNA RNAm RNAr RNAt RPM SGBD SQL T Adenina Síndrome da Imunodeficiência Adquirida Active Server Pages Banco de Dados Blocks Substitution Matrix Citosina Common Gateway Interface Database Interface Ácido Desoxirribonucléico European Molecular Biology Laboratory Expressed Sequence Tags Guanina Human Immunodeficiency Virus HyperText Markup Language Library for Web Programming National Center for Biotechnology Information National Institutes of Health Point Accepted Mutation Pares de bases Polimerase Chain Reaction Protein Data Base Perl Data Language Practical Extraction and Report Language Ácido Ribonucléico RNA mensageiro RNA ribossômico RNA transportador RPM Package Manager Sistema Gerenciador de Banco de Dados Structured Query Language Timina vii

10 Ta Tm U UML Temperatura de Anelamento Temperature Melting Uracila Unified Modeling Language viii

11 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Nucleotídeo Timina...11 Figura 2. A Dupla hélice do DNA...12 Figura 3. Bases nitrogenadas que compõe o DNA...13 Figura 4. Tabela de Tradução de Aminoácidos...15 Figura 5. Replicação de cadeia de DNA...17 Figura 6. Reação em cadeia da polimerase PCR...22 Figura 7. Exemplo de gel de eletroforese...27 Figura 8. Alinhamento par-a-par entre seqüências realizado pelo Blast...30 Figura 9. Alinhamento múltiplo entre seqüências feito pelo ClustalW...31 Figura 10. Árvore Filogenética feita pelo software ClustalW...33 Figura 11. Menu de opções do pacote de programas Phylip...33 Figura 12. Tela do software Gel Electrophoresis Simulator...34 Figura 13. Tela do software Simulation of Electrophoresis & Sequence Building of DNA...35 Figura 14. Diagrama de Contexto Figura 15. Diagrama de Fluxo de Dados, nível Figura 16. Diagrama de Fluxo de Dados decomposto do processo Figura 17. Diagrama de Fluxo de Dados decomposto do processo Figura 18. Diagrama de Fluxo de Dados decomposto do processo Figura 19. Use Cases...54 Figura 20. Diagrama de Classes do Sistema...56 Figura 21. Diagrama de Seqüência com as ações iniciais do sistema...57 Figura 22. Diagrama de Seqüência do método DesignPrimers()...58 Figura 23. Diagrama de Seqüência do método _DesignIndividualPrimers()...58 Figura 24. Diagrama de Seqüência do método _DesignPairedPrimers()...59 Figura 25. Diagrama de Seqüência do método _AnalysePrimers()...60 Figura 26. Diagrama de Navegação do Sistema...61 Figura 27. Diagrama Entidade-Relacionamento, modelo Lógico...62 Figura 28. Diagrama Entidade-Relacionamento, modelo Físico Figura 29. Tela de opções principais do sistema...74 Figura 30. Tela de parâmetros de busca de seqüências...76 ix

12 Figura 31. Tela com o sumário de algumas seqüências encontradas Figura 32. Tela de Digitação de Seqüências...79 Figura 33. Tela com o resultado do alinhamento feito pelo software ClustalW...81 Figura 34. Figura com alinhamento feito pelo software ClustalW...83 Figura 35. Tela com os parâmetros de entrada para o projeto de primers Figura 36. Tela com os parâmetros de entrada internos para o projeto de primers Figura 37. Fitas sense e anti-sense...86 Figura 38. Tela com os resultados do projeto de primers x

13 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Tabela de Degenerações de Bases Nucléicas...26 Tabela 2. Dicionário de Dados da Modelagem do Sistema Tabela 3. Dicionário de Dados dos Fluxos de Dados Tabela 4. Tabela Degeneracao...63 Tabela 5. Tabela Tipo_PCR...63 Tabela 6. Tabela Projeto_PCR...63 Tabela 7. Tabela Primer_Rejeitado...63 Tabela 8. Tabela Produto_Amplificado...64 Tabela 9. Tabela Corte...64 Tabela 10. Tabela Usuario...64 Tabela 11. Tabela Enzima_Usada...65 Tabela 12. Tabela Enzima...65 Tabela 13. Tabela Resultado_Alinhamento...65 Tabela 14. Tabela Organismo...65 Tabela 15. Tabela Região_Similar...66 Tabela 16. Tabela Similaridade...66 Tabela 17. Tabela Posição_Anelamento...66 Tabela 18. Tabela Tipo_Est_Secundaria...66 Tabela 19. Tabela Est_Secundaria...66 Tabela 20. Tabela Primer...67 Tabela 21. Tabela Par_Primer...67 Tabela 22. Tabela Codon...67 Tabela 23. Tabela Conjuntos_Organismos...67 xi

14 RESUMO O presente trabalho descreve o desenvolvimento de um software para web que auxilia o trabalho dos pesquisadores da área de biologia molecular, automatizando algumas das etapas necessárias para o projeto e análise de primers, usados em reações de PCR (Polymerase Chain Reaction). O desenvolvimento do software utilizou a linguagem de programação Perl e o módulo BioPerl, específico para bioinformática, em conjunto com o banco de dados MySQL, e outros softwares, como o ClustalW, executando em ambiente Linux. Por ser baseado em web, este software pode ser acessao a partir de qualquer computador conectado à Internet, e em qualquer plataforma. O software faz a busca de seqüências genômicas em bancos de dados públicos, a preparação dessas sequências e o projeto de primers com base nas restrições impostas pelo pesquiador, apresentando as características dos primers gerados e/ou analisados. Cada etapa é automatizada, mas o software permite ainda a intervenção do pesquisador em cada passo, que pode sempre usar sua experiência para corrigir problemas na automatização desse processo. O mecanismo usado para o projeto de primers permite que se gerem primers confiáveis e específicos. Os resultados apontam para um grande benefício aos pesquisadores dessa área, embora várias características ainda possam ser incorporadas ao software. xii

15 ABSTRACT This work describes the development of a web system that will help the work of molecular biologists, automatizating some steps necessary to the Primer design and analisys, used in PCR (Polymerase Chain Reaction). The development of software used the programming language Perl and the BioPerl module, specific for bioinformatics, in set with the data base MySQL, and others softwares, as the ClustalW, executing in Linux environment. For being based on web, this software can be accessed from any computer conected to the internet, and in any platform. Software makes the search of genomic sequences in public data bases, the preparation of these sequences and the design of primers on the basis of the restrictions imposed for the research, presenting the generated and/or analyzed characteristics of primers. Each stage is automatized, but software still allows the intervention of the researcher in each step, that can always use his experience to correct problems in the automatization of this process. The used mechanism for the design of primers allows that they generate primers trustworthy and specific. The results point with respect to a great benefit the researchers of this area, even so some characteristics still can be incorporated software. xiii

16 I INTRODUÇÃO 1. APRESENTAÇÃO A bioinformática é uma nova ferramenta científica que une a bioquímica com a informática. Criada nas últimas décadas para tratar a imensa massa de dados que vem sendo gerada pelos vários projetos de genoma ao redor do mundo, a bioinformática permite explorar informações nunca antes disponíveis, e pode gerar resultados nunca antes imaginados. O termo bioinformática tem sido utilizado para descrever os processos computacionais usados para dar apoio às pesquisas relacionadas com material genético (DNA, RNA e proteínas). No mesmo sentido vem sendo utilizado o termo Biologia Computacional e, em geral, podem ser considerados como sinônimos. Já o termo Informática Aplicada à Biologia é mais geral, e inclui, além da bioinformática, qualquer sistema (software ou hardware) usado por pesquisadores da área de ciências biológicas. Em relação às pesquisas com material genético, alvo da bioinformática, o trabalho do biólogo e pesquisador de área afim começa geralmente com o seqüenciamento de um trecho de DNA (Ácido Desoxirribonucléico). O seqüenciamento pode ser feito de vários modos, mas, em geral, o processo básico é o seguinte: uma amostra de DNA é retirada do organismo de interesse. Esse DNA é fragmentado utilizando-se enzimas de restrição. Enzimas de restrição são proteínas capazes de cortar a dupla fita de DNA em trechos específicos. Assim, obtêm-se vários pequenos pedaços de DNA, capazes de serem seqüenciados com o equipamento adequado. Como, em geral, a quantidade de DNA é pequena, é necessário amplificar (clonar) esse DNA. Isso pode ser feito através de plasmídeos (técnica in vivo) ou PCR (técnica in vitro). PCR, ou Polimerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase), permite aumentar milhões ou bilhões de vezes a quantidade inicial de DNA. Para isso, são necessários apenas uma pequena amostra de DNA, nucleotídeos livres, uma enzima chamada Taq DNA Polimerase e inicializadores de polimeração, chamados primers.

17 2 Para o seqüenciamento, nucleotídeos especialmente marcados com algum indicador fluorescente também são adicionados à amostra. Esses compostos são colocados num equipamento chamado termociclador que, por simples mudanças de temperatura (aquece a 95 o C e resfria a cerca de 60 o C, várias vezes), faz com que as moléculas de DNA se repliquem, aumentando a quantidade da amostra. Após ter DNA suficiente, é necessário separar essa amostra por peso molecular, e assim obter sua seqüência. Para isso utiliza-se o seqüenciador. A amostra de DNA é colocada num gel de eletroforese, que consiste numa placa de gel ligada a uma fonte que gera corrente elétrica. As amostras tendem, por efeito do campo eletromagnético, a atravessar o gel, e as moléculas menores o fazem mais rapidamente. Na parte de baixo do gel, um feixe de laser do seqüenciador mede a freqüência da luminescência do indicador fluorescente colocado em alguns nucleotídeos. Com isso, cada nucleotídeo terminal é identificado e a seqüência é, posteriormente, determinada. Embora a construção do seqüenciador já necessite do auxílio da informática, é apenas após essa etapa que a bioinformática realmente começa. Inicialmente foram desenvolvidos softwares para avaliar a qualidade das seqüências obtidas, uma vez que, por problemas tecnológicos, as seqüências obtidas pelo seqüenciador não são perfeitas. Também por restrições tecnológicas, esse equipamento é capaz de seqüenciar apenas trechos pequenos de DNA (por isso ele é inicialmente fragmentado). Então, programas que sobrepõe as inúmeras pequenas seqüências (shotguns) obtidas para gerar uma seqüência completa final (contig) foram desenvolvidos. Com a obtenção das seqüências de DNA dos organismos de interesse, o trabalho do pesquisador de biologia está recém começando. Em geral, para saber como o DNA (genótipo) se relaciona com alguma característica física (fenótipo), várias outras etapas que usam bioinformática são necessárias. Inicialmente, é necessário descobrir quais trechos desse DNA correspondem aos genes, pois são os genes que serão transcritos em RNA (Ácido Ribonucléico) e esses então vão para o citoplasma onde são traduzidos em proteínas, e são as proteínas, em primeira instância, as responsáveis pela atividade biológica de um organismo e suas características físicas. Inúmeros algoritmos foram desenvolvidos para a predição de genes, e hoje vários deles podem ser usados através da web. Sabe-se que qualquer gene possui um códon (seqüência de 3 pares de bases) de inicialização de tradução e um códon de terminação. Além disso, eles possuem uma região promotora, anterior ao códon de inicialização, onde a RNA polimerase se ligará para dar início à transcrição do RNA. Como esses códons e região promotora podem variar para cada

18 3 organismo, e sua existência não necessariamente indica um gene real, tais algoritmos apenas são uma indicação que tal trecho pode ser um gene, e é sempre necessária a comprovação em laboratório molhado (biológico). A seqüência de um gene determina a seqüência de aminoácidos da proteína que será gerada, sendo que cada 3 (três) pares de base serão traduzidos para um aminoácido. Programas que fazem essa tradução foram então desenvolvidos. Entretanto, a seqüência de aminoácidos de uma proteína (sua estrutura primária), não é suficiente para caracterizá-la ou obter informações sobre seu funcionamento no organismo. A proteína dobra-se sobre si, criando estruturas secundárias, e essas também possuem uma conformação tridimensional (estrutura terciária). Em geral, é a conformação tridimensional da proteína que determina sua função. Em muitas proteínas, entretanto, várias estruturas terciárias precisam agrupar-se (estrutura quaternária) para que possam exercer sua função (PANDOLFI, 2003). Vários algoritmos e softwares, cada vez mais complexos, foram desenvolvidos para predizer as estruturas de uma proteína. Sempre, após a análise in silico (em computador), é necessário uma comprovação in vitro. As proteínas, após terem sido produzidas, passam por outras transformações, reagindo com outras proteínas e moléculas no ambiente celular. Essas transformações geram as vias metabólicas desse organismo. Estudos e análises do metabolismo estão sendo agora incluídos em programas de bioinformática. Outras técnicas recentes de bioinformática incluem a análise de transcriptoma, que são as moléculas de RNA presentes no citoplasma. Com isso, tem-se certeza de que genes estão ativos e pode-se, através de programas especializados, medir a taxa de expressão desses genes, relacionando-os de diversas formas, principalmente em condições ambientais diferentes. Pode-se, por exemplo, medir a taxa de expressão de centenas de genes numa célula normal e numa célula cancerígena, e verificar quais genes estão relacionados com essa doença. Para isso utilizam-se técnicas de hibridização automatizadas, chamadas micro-arrays. Cada novo software de bioinformática desenvolvido abre caminho para mais pesquisas e novas descobertas. Um dos maiores objetivos a ser alcançado pela bioinformática é a produção de fármacos com base na estrutura das proteínas. Este resultado trará drogas mais eficazes e com menor tempo para a entrada no mercado (PROSDOCIMI, 2003). Para que este e outros objetivos

19 4 sejam alcançados, iniciou-se o estudo de seqüências de DNA e genes (genômica), e atualmente seu foco está na análise de transcritos (ESTs Expressed Sequence Tags) e proteínas (proteômica). E será focado nas vias metabólicas (metabolômica) em pouco tempo. Prevê-se que, num futuro não muito distante, estará focada na fisiologia do organismo (fisiolômica?). O desenvolvimento de algoritmos e softwares para tratar com essas informações é um desafio complexo e constante, mas um desafio não menos importante e às vezes desconhecido do público em geral (inclusive biólogos) é a estruturação desses dados. A criação de bancos de dados, sua estrutura, integridade, tratamento de dados replicados, etc, também faz parte da bioinformática, e é apenas com a representação eficaz e eficiente desses dados, que os algoritmos para seu tratamento podem ser usados. Dada a importância e uso do experimento de PCR em diversas técnicas de biologia molecular e da relativa dificuldade em determinar seus componentes, este trabalho apresenta o desenvolvimento de um sistema de bioinformática para estruturação de dados e automatização de processos biológicos, no que se refere ao projeto de experimentos de PCR, da busca de seqüências genômicas ao projeto e análise dos primers usados no experimento. Com isso espera-se contribuir com pesquisadores da área biológica, médica e farmacêutica, e também contribuir com o aperfeiçoamento da ciência e pesquisa em bioinformática, 2. JUSTIFICATIVA A bioinformática é uma ferramenta recente e em pleno desenvolvimento. Imagina-se que será a nova ciência do século XXI. Embora sirva como ferramenta ao trabalho de biólogos (entre outros profissionais, como médicos, farmacêuticos, veterinários e agrônomos), seu desenvolvimento depende principalmente da atuação de profissionais de Ciência da Computação, capazes de especificar os algoritmos para execução em computador. A participação desse tipo de profissional, incluindo estudantes de graduação, é que permitirá a criação de novos algoritmos e ferramentas. Sob aspectos computacionais, a bioinformática é um grande desafio. Em geral, profissionais de computação são capazes de especificar algoritmos para problemas que tem solução/teoria conhecida. Ou seja, é necessário saber resolver o problema à mão para que se possa ensinar o computador a resolvê-lo. Entretanto, no caso da bioinformática, em geral, não se conhece a teoria

20 5 associada ao problema. Não é conhecido como o DNA, genes e proteínas realmente funcionam, e ainda há variações entre organismos, entre tecidos, entre células e até mesmo numa única célula, ao longo do tempo. Portanto, um trabalho nessa área é tema relevante de pesquisa, até mesmo em nível de graduação. Por não se conhecer exatamente o funcionamento de sistemas biológicos (organismos), os programas de bioinformática geralmente utilizam técnicas de mineração de dados e inteligência artificial. Uma boa modelagem é indispensável, principalmente no que se refere à organização de bancos de dados. Devido à grande quantidade de dados, e à necessidade de muita análise sobre esses dados, a bioinformática é uma aplicação potencial para algoritmos heurísticos e processamento paralelo. Assim, também do ponto de vista computacional, trata-se de uma área realmente interessante. 3. IMPORTÂNCIA A importância de desenvolvimento em bioinformática tem sido amplamente divulgada, e é quase consenso mundial que ela pode ser capaz de resolver inúmeros problemas altamente relevantes, dentre os quais apenas alguns serão mencionados. Em relação à agricultura, a bioinformática e a engenharia genética estão melhorando a qualidade dos alimentos, estão tornando-os mais resistentes a pragas e mais produtivos. Isso tem aumentado, num nível nunca antes visto, a quantidade de alimento produzido no mundo. Como aumento populacional dos últimos séculos, apenas o melhoramento genético é capaz de produzir alimento para todos. O mesmo tem ocorrido à pecuária, onde o melhoramento de animais tem produzido rebanhos mais resistentes e mais adequados ao consumo. Novas proteínas têm sido introduzidas no leite bovino através de modificações genéticas nos animais (BACALTCHUK, 2003). Em relação à espécie humana, a importância da bioinformática é ainda maior. A identificação de problemas genéticos já é uma realidade, e genes responsáveis por inúmeras doenças já foram identificados, como os genes GPRA e AAA1, presentes no cromossomo 7 e responsáveis pela asma (AGENCIA EFE, 2004). Com o avanço da bioinformática, da genômica para a

21 6 proteômica e metabolômica, além da identificação de tais genes, será possível o projeto racional de fármacos, atuando diretamente em nível genético. Com isso, não só a expectativa de vida será maior, mas a própria qualidade de vida do ser humano será melhor. Especificamente em relação a este trabalho, ele é de grande importância para inúmeros pesquisadores que trabalham com biologia molecular, virologia e bioquímica. A idéia de sua realização surgiu da necessidade de dois pesquisadores, um do Laboratório de Biologia Molecular da UNIVALI e outro do Laboratório de Virologia da UEL (Universidade Estadual de Londrina). O trabalho desses profissionais será significativamente facilitado, sendo concluído num intervalo de tempo muito menor e com qualidade muito superior. Este trabalho permitirá que os pesquisadores façam, num único ambiente web, a busca de seqüências genômicas, o alinhamento dessas seqüências e o projeto dos primers que serão usados em experimentos de PCR. Um avanço importante proposto neste trabalho é a análise da especificidade dos primers, garantindo que eles anelarão em certas seqüências e não em outras. Com isso, torna-se significativamemte mais fácil o projeto de primers que amplifiquem apenas certas estirpes ou mutações de organismos de interesse. Como o trabalho está disponível na Web para todos os pesquisadores do mundo, este sistema agilizará o trabalho de muitos biólogos e pesquisadores de áreas afins. 4. OBJETIVOS 4.1. Geral O objetivo geral deste trabalho é desenvolver um sistema baseado em web para busca de seqüências genômicas, projeto e análise de primers para experimentos de PCR Específicos Armazenar e manipular, em banco de dados no servidor, de forma hierárquica, seqüências de DNA, RNA, primers, enzimas de restrição e anotações genômicas.

22 7 Acessar automaticamente, via internet, bancos de dados genômicos públicos, e diversas ferramentas disponíveis (ClustalW, Blastn, Blastp). Acessar várias ferramentas já disponíveis em forma de pipeline ou linha de produção. Comparar as seqüências locais de DNA e RNA com seqüências em bancos de dados públicos: Blastn, par-a-par e alinhamento múltiplo. Analisar um primer, apresentando: tamanho, peso molecular, temperatura de hibridização, complementaridade, estruturas secundárias internas, entropia, entalpia, etc. Avaliar a qualidade de primers segundo parâmetros pré-estabelecidos (restrições do usuário). Definir o trecho da seqüência que o primer deve alinhar e tamanho de amplicon desejado. Permitir a inclusão de sítios de restrição e bases degeneradas nos primers. 5. METODOLOGIA Foram necessárias cinco etapas a fim de executar o projeto: estudo, modelagem, desenvolvimento, validação e divulgação dos resultados. As etapas de estudo e modelagem foram efetivadas no TCC1, sendo que as etapas de desenvolvimento, validação e divulgação científica foram efetivadas no TCC2. Essas são as etapas gerais de trabalhos científicos que usam o método hipotético-dedutivo. A etapa de estudo compreende a definição clara do problema, o escopo do sistema e aquisição do conhecimento prévio sobre o tema e soluções existentes. A etapa de modelagem consiste em definição de nova hipótese ou proposta de nova solução ao problema estudado. A etapa de desenvolvimento trata da experimentação da hipótese ou desenvolvimento da nova solução. A validação visa corroborar a hipótese desenvolvida, além de dar base científica à solução desenvolvida. Por fim, todo trabalho científico deve ser descrito de tal forma que possa ser reproduzido e testado por outros pesquisadores. Etapa 1 Estudo Definição do problema e revisão de soluções/técnicas existentes Nesta etapa buscou-se compreender exatamente os conceitos envolvidos no trabalho, como PCR, primers, eletroforese, alinhamento par-a-par e alinhamento múltiplo, homologia, genes

23 8 ortólogos e parólogos, etc. Esse conhecimento prévio foi necessário para entender o processo de trabalho dos pesquisadores em biologia molecular. Posteriormente, foi necessário estudar as ferramentas de bioinformática já desenvolvidas e que foram necessárias neste trabalho, como o ClustalW e o GeneRunner. Além disso, foi necessário saber utilizar os bancos de dados biológicos públicos, como o GenBank, disponível no site do NCBI (National Center for Biotechnology Information) e o Expasy. Para o desenvolvimento, foi necessário estudar também a criação e manutenção de bancos de dados com MySQL, a linguagem de programação Perl (Practical Extraction and Report Language), amplamente utilizada em bioinformática, e o ambiente Linux, no qual executam as ferramentas de bioinformática que foram usadas neste trabalho. Por fim, também foi necessário ter bom conhecimento do funcionamento do alinhamento múltiplo, bem como de todas as condições para o projeto de primers diversos. Etapa 2 Modelagem Levantamento de hipóteses e Proposta de nova solução A etapa de modelagem compreende a especificação tanto dos bancos de dados quanto da aplicação em si. A estrutura do banco de dados considerou os organismos, as seqüências de DNA, enzimas de restrição, primers e seqüência consenso. A modelagem do sistema deve especificar completamente o funcionamento do mesmo, e inclui tanto a Análise quanto o Projeto do Sistema. Para tanto foi utilizada a Análise Estruturada para as etapas de busca de seqüências e preparação das seqüências para projeto de primers, e análise orientada a objeto, e sua descrição com a linguagem UML (Unified Modeling Language) para a etapa de projeto de primers. Etapa 3 Desenvolvimento Experimentação Implementação da solução proposta O desenvolvimento compreende a implementação do sistema web, seguindo rigorosamente a modelagem da etapa anterior. A implementação foi realizada em forma de componentes (módulos) independentes, de forma a facilitar a depuração, testes, manutenção e reuso dos mesmos. Na implementação do sistema foram utilizadas as classes de objetos da biblioteca BioPerl, já desenvolvida por pesquisadores e disponível para bioinformatas. Todo o sistema foi executado a partir de browsers, o que permite seu uso a qualquer pesquisador em qualquer plataforma de hardware.

24 9 São acessados bancos de dados públicos, como o NCBI (NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION, 2003), através da interface do sistema. Quando é acessada a página do NCBI, tem-se como resposta uma página em HTML (HyperText Markup Language) com os dados da pesquisa. A partir desta página são tiradas as informações que o usuário deseja. Esta tarefa é simplificada quando se utiliza a linguagem Perl, que é excelente para o tratamento de strings (seqüências de caracteres). O objetivo de implementar a etapa de pesquisa em banco de dados públicos é de facilitar tarefas que exigem que dados obtidos de um sistema, como o NCBI sejam enviados para outras ferramentas, como o ClustalW. Assim, em uma única interface, teremos acesso a várias ferramentas e vários processos serão interligados. Quando o usuário acessa a página do sistema, ele fornece dados para que sejam processados pelo servidor. Os dados são então processados no servidor e enviados apenas os resultados para o browser do usuário. Os dados obtidos através de pesquisa em banco de dados públicos e outras ferramentas são armazenados nos bancos do sistema (no servidor) para futuras consultas e para gerar relatórios com estatísticas pertinentes à pesquisa, como por exemplo, o número de determinada base nucléica em algum trecho de DNA. Etapa 4 Validação Teste das hipóteses levantadas Validação da solução implementada A etapa de validação e testes compreendeu a comparação dos resultados obtidos com o sistema com resultados obtidos através de outros softwares existentes no mercado, como o GeneRunner. E quando houver a possibilidade de realizar a experiência em laboratório serão comparados os resultados gerados pelo software aos resultados obtidos na prática. O laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular usado será um laboratório específico da área de ciências biológicas da UNIVALI, que tenha o material necessário para a validação. Etapa 5 Divulgação Corroboração da nova solução desenvolvida A divulgação dos resultados está sendo feita via página web, em servidor Apache. O material sobre o projeto está disponível com o sistema.

25 II REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1. MATERIAL GENÉTICO A evolução do planeta Terra produziu uma imensa diversidade de formas vivas. São aproximadamente quatro milhões de espécies de animais, vegetais, protozoários e bactérias, cujos comportamentos, morfologia e funções diferem um dos outros. As biologias celular e molecular estudam a organização que é comum entre os seres vivos. Elas analisam as moléculas e os componentes celulares com que são construídas todas as formas de vida (DE ROBERTIS e HIB, 2001). A célula é considerada, por muitos autores, a menor unidade de vida, contendo as características morfológicas e fisiológicas de todos os organismos vivos. Atualmente, aceita-se que o gene seja a menor unidade de vida, desde que devidamente definido (DAWKINS, 1979). As propriedades de um organismo vivo dependem de suas células individuais, cuja continuidade ocorre através de seu material genético. As células são divididas em dois grandes grupos: as procarióticas e as eucarióticas. As células procarióticas são estruturalmente mais simplificadas que as células eucarióticas (ZAHA, 1996, p.13) sendo que a principal diferença entre ambos os tipos celulares consiste no fato que os procarióticos não possuem membrana nuclear (DE ROBERTIS e HIB, 2001, p.3). Os componentes químicos das células são classificados em orgânicos (ácidos nucléicos, hidratos de carbono, lipídeos e proteínas) e inorgânicos (água e sais minerais). A maior parte das estruturas celulares contém lipídeos e moléculas muito grandes, denominadas polímeros, integrados por monômeros, que se prendem entre si por ligações covalentes (ibidem). Nos organismos existem três importantes polímeros: polissacarídeos, cujos monômeros são os açúcares, os ácidos nucléicos, formados pelos nucleotídeos (monômeros), e as proteínas, formadas pelos aminoácidos (ZAHA, 1996, p.18). Os polissacarídeos (hidratos de carbono), compostos de carbono, hidrogênio e oxigênio, são a principal fonte de energia da célula (DE

26 11 ROBERTIS e HIB, 2001, p.25). Os ácidos nucléicos serão estudados mais profundamente no decorrer do texto DNA e RNA Ácidos nucléicos são polímeros lineares de nucleotídeos, unidos por ligação fosfodiéster. Existem dois tipos de ácidos nucléicos: ácido desoxirribonucléico (DNA) e ácido ribonucléico (RNA). Cada nucleotídeo é formado de um grupo fosfato, um açúcar (pentose) e uma base nitrogenada (púrica e pirimídica). No DNA existem duas bases purinas (formadas por dois anéis de carbono), adenina (A) e guanina (G), e duas bases pirimidínicas (formadas por um simples anel de carbono), timina (T) e citosina (C). Entre DNA e RNA há duas principais diferenças: no RNA temse a presença da uracila (U) em vez da timina; e a pentose no RNA é a ribose e no DNA, é a desoxirribose (ZAHA, 1996, p 32). A Figura 1 mostra um exemplo de uma base nitrogenada, a timina. Figura 1. Nucleotídeo Timina Fonte: Kaiser (2003) Uma seqüência de nucleotídeos possui uma orientação química de extrema importância. Em uma fita de DNA ou RNA, numa das extremidades há um grupo fosfato ligado ao 5C (carbono 5 ) do açúcar (extremidade 5 ) e na outra há uma hidroxila ligada ao 3C (carbono 3 ) do açúcar (extremidade 3 ). Assim, na extremidade 5 da cadeia, um grupo fosfato está presente e, na extremidade 3, um grupo OH. Convencionou-se escrever e ler a seqüência nucleotídica da

27 12 esquerda para a direita, no sentido 5 3 (ibidem). A representação de uma cadeia polinucleotídica é feita através das letras das bases nitrogenadas: 5 AAAGGCTTCGA 3. O DNA é composto de duas cadeias polinucleotídeas helicoidais que formam uma dupla hélice em torno de um eixo central (ZAHA, 1996) Uma fita se une à outra por meio de pontes de hidrogênio. As pontes de hidrogênio são formadas entre pares de nucleotídeos. A ilustração da dupla hélice do DNA pode ser vista na Figura 2. Os pares de bases são: adenina que se une à timina, e a citosina que se une à guanina. Entre A e T há a formação de duas pontes de hidrogênio e entre C e G há três pontes de hidrogênio, o que faz com que sua ligação seja mais forte. As bases nucléicas que compõem o DNA são exibidas na Figura 3. Geralmente, o comprimento de uma seqüência de DNA é descrito em pares de bases (pb), quilobases (1000 pb), megabases (1 milhão pb) etc (GIBAS e JAMBECK, 2001). Figura 2. A Dupla hélice do DNA Fonte: Access (2003)

28 13 Figura 3. Bases nitrogenadas que compõe o DNA. Fonte: Kaiser (2003) O RNA é uma molécula de ácido nucléico formada por uma só cadeia polimérica. Ele é sintetizado a partir do molde de DNA e é utilizado na expressão da informação genética. A seqüência de bases (estrutura primária) é similar à do DNA, exceto pela substituição da desoxirribose por ribose e da timina por uracila (ZAHA, 1996). O RNA se divide em 3 tipos: RNA ribossômico (RNAr), RNA transportador (RNAt) e RNA mensageiro (RNAm) Gene Cada molécula de DNA contém vários genes dispostos ao longo do seu comprimento. Segundo De Robertis e Hib (2001), o gene é a seqüência de DNA que contém a informação necessária para sintetizar uma molécula de RNA e, se esta corresponde a um RNA mensageiro, a partir dele construir uma proteína. Segundo Zaha (1996), o gene corresponde a uma seqüência particular de DNA, codificadora de uma informação (proteína ou RNA). Os genes são segmentos individualizados de uma molécula de DNA separados uns dos outros por DNA intergênico (ou interveniente) (BROWN, 1999). Os genes constituem entidades biológicas por meio das quais as características físicas dos pais são transmitidas aos filhos. As

29 14 mutações que ocorrem nos genes podem ser benéficas ou não para a adaptação da espécie (DE ROBERTIS e HIB, 2001). Uma definição interessante e abrangente é dada por Dawkins (1979): um gene é definido como qualquer porção do material cromossômico que dura potencialmente por um número suficiente de gerações para servir como unidade da seleção natural e ainda um gene é um replicador com alta fidelidade de cópia. Há três tipos de genes: os codificadores de proteína (que são modelos para gerar as moléculas de proteína), os especificadores de RNA (que são modelos para as máquinas químicas), e os genes não transcritos (que são regiões do DNA que possuem algum propósito funcional, mas não alcançam esse propósito, sendo transcritos para criar outra molécula) (GIBAS e JAMBECK, 2001). A informação biológica que um gene transporta é o conjunto de instruções para a síntese de uma molécula de RNA que poderá, conseqüentemente, ser traduzida em proteína ou ainda orientar a síntese de uma enzima. Em organismos complexos as seqüências dos genes codificantes interrompidos são chamados de exons, e as seqüências intergênicas são chamadas de introns (ZAHA,1996). A expressão gênica é o processo pelo qual a informação biológica contida no gene se torna disponível à célula. Esse processo é relativamente constante. A expressão gênica é composta de várias fases: transcrição, tradução e a síntese da molécula de RNA ou de um polipeptídio (BROWN, 1999) Proteínas As proteínas constituem mais da metade do peso seco de uma célula. São polímeros que desempenham inúmeras funções biológicas e também determinam a forma e a estrutura da célula. Os monômeros que compõem as proteínas são os aminoácidos. Os aminoácidos são ácidos orgânicos que possuem um grupo amina e um grupo carboxila. A união entre os vários aminoácidos é feita através de ligações peptídicas (ZAHA, 1996).

30 15 A constituição da proteína sintetizada depende diretamente do código genético, revelado no RNA pela seqüência de códons. O número de códons na fita de RNAm determina o tamanho da proteína. Existem, ao todo, 64 códons, que são resultantes das quatro letras (A, U, G e C) dispostas em trincas de nucleotídeos (4 3 = 64). Como existem mais códons (64) que aminoácidos (20), quase todos os aminoácidos podem ser reconhecidos por mais de um códon, isto porque algumas trincas de nucleotídeos atuam como sinônimos. Esta situação resulta na degeneração do código genético (DE ROBERTIS e HIB, 2001). Pode-se ver a tabela de aminoácidos e as proteínas que são codificadas por cada trinca na Figura 4. Figura 4. Tabela de Tradução de Aminoácidos Fonte: Hilbers (2003) Existem dois códons especiais: um é códon iniciador (AUG) que é aquele que inicia a síntese protéica e o outro é códon de terminação (UAA, UAG e UGA), que sinaliza onde o ribossomo deve finalisar a síntese protéica e a liberação da nova cadeia de polipeptídios. A Figura 4 mostra a tabela de tradução para a maioria dos organismos. No entanto, para as mitocôndrias e alguns organismos, a tabela é diferente. Por exemplo, no DNA da mitocôndria humana, o códon UGA do RNAm em vez de ser um códon finalizador, codifica o triptofano.

31 16 Quatro níveis estruturais são encontrados nas moléculas de proteínas: a estrutura primária, secundária, terciária e quaternária. A estrutura primária é a seqüência de aminoácidos (BROWN, 1999, p 83). É ela que determina os demais níveis de organização da molécula de proteína. A estrutura secundária se refere à forma espacial da proteína (sendo constituída, principalmente, por α-helices, β-folhas e laços). A estrutura terciária é a formação de novos dobramentos originados de ligações entre trechos da própria molécula. A estrutura quaternária resulta da combinação de dois ou mais polipeptídios (DE ROBERTIS e HIB, 2001) Replicação A replicação é o processo pelo qual uma molécula de DNA se duplica, dando origem a duas moléculas idênticas à molécula inicial. Para que esse processo ocorra, há a necessidade de um conjunto de proteínas específicas (SILVA, 2001a). A seguir é descrito o processo básico simplificado de replicação, do DNA, uma vez que o processo completo é demasiado complexo para ser abordado totalmente neste trabalho. Para que ocorra a replicação de uma molécula de DNA faz-se necessário separar as duas fitas de nucleotídeos da molécula, através da enzima helicase. Durante esse processo, apenas uma região limitada de bases está não-pareada. A separação de bases ocorre em regiões chamadas de origem de replicação, e progridem ao longo da molécula na direção 3 (BROWN, 1999). Essa etapa resulta uma nova fita contínua e vários trechos de DNA que formam uma segunda nova fita simples, então chamados de fragmentos de Okazaki. A replicação de uma fita de DNA e os fragmentos de Okazaki podem ser vistos na Figura 5.

32 17 Figura 5. Replicação de cadeia de DNA Fonte: Classic (2003) A síntese de novas fitas é feita pela enzima DNA-polimerase. Essa enzima tem a função de unir nucleotídeos soltos aos fragmentos de Okazaki. Como a enzima DNA-polimerase não pode sintetizar outra fita a partir de nucleotídeos livres, ela necessita de um molde de fita dupla para iniciar a síntese completa de uma fita dupla (SILVA, 2001a). Este molde, chamado de primer (iniciador) nada mais é do que uma pequena cadeia de RNA de fita simples, onde, a partir da posição 3, a enzima DNA polimerase iniciará a incorporação de nucleotídeos, formando a fita dupla do DNA. Logo após a síntese da fita dupla de DNA, a enzima ligase une os vários fragmentos de Okazaki. Dessa forma, as duas fitas de DNA já estão terminadas e naturalmente se enrolam formando a dupla hélice (SILVA, 2001a) Transcrição A transcrição é a síntese de moléculas de RNA usando moléculas de DNA como molde. A síntese ocorre pela união entre si dos nucleotídeos de RNA que seguem a ordem dos nucleotídeos da molécula de DNA (DE ROBERTIS, 2001). A enzima responsável pela transcrição é a RNA polimerase (SILVA, 2001a). Através da transcrição são sintetizados todos os RNAs da célula. O RNAm será usado para transferir a informação genética do DNA para a síntese protéica. Os demais RNAs têm funções finais na célula, tanto estruturais como catalíticas. Durante a transcrição ocorre o controle da

33 18 expressão gênica, que estabelece quais os genes são transcritos e quantos deles são necessários (ZAHA, 1996). A ligação inicial do DNA à RNA polimerase deve ocorrer em uma posição específica, um pouco antes do gene a ser transcrito. Isso é importante porque em geral uma grande parte do DNA não é gene e não deverá ser transcrito. O ponto inicial onde deve se unir a RNA polimerase é chamado de promotor. Um promotor é uma pequena seqüência de nucleotídeos reconhecida por uma RNA polimerase como o ponto ao qual deve-se ligar ao DNA a fim de começar a transcrição. Durante a etapa de alongamento da transcrição, a RNA polimerase migra ao longo da molécula de DNA desenrolando a dupla fita à medida que progride, enquanto que, seqüencialmente, une ribonucleotídeos à extremidade 3 da molécula crescente de RNA. A fita de DNA que foi desenrolada volta ao seu estado normal. A finalização da transcrição ocorre, como na inicialização, em um ponto especifico da molécula de DNAm chamado de códon de terminação. (BROWN, 1999) Tradução A síntese, ou tradução protéica é um processo que requer um filamento de RNAm, RNAt e subunidades ribossômicas. No ribossomo, o RNAm é traduzido em uma proteína, processo no qual também é necessária a intervenção dos RNAt. Os RNAt captam os aminoácidos do citosol e conduzem-os até o ribossomo na ordem estabelecida pelos nucleotídeos do RNAm, que são os moldes do sistema (DE ROBERTIS e HIB, 2001). Cada RNAt pode ser distinguido por sua especificidade por um dos 20 aminoácidos existentes. Por exemplo, o RNAt gli é específico para glicina, o RNAt yr é específico para tirosina. Uma molécula de RNAt forma uma ligação com seu aminoácido (e com nenhum outro) e pode reconhecer e se ligar a um códon que especifica aquele aminoácido. Pode haver mais de um RNAt para um único aminoácido, o que reflete o fato de que o código genético é redundante, e que a maioria dos aminoácidos é codificada por mais de um códon (BROWN, 1999).

34 19 Geralmente os códons que representam um mesmo aminoácido são parecidos entre si, e é freqüente que sejam diferentes no terceiro nucleotídeo. Devido à pouca especificidade deste nucleotídeo, diz-se que existe uma degeneração na terceira base da maioria dos códons (DE ROBERTIS e HIB, 2001) Desnaturação e Renaturação do DNA Os termos desnaturação e renaturação são sinônimos de separação das fitas e reanelamento das fitas, respectivamente. A desnaturação ocorre quando as pontes de hidrogênio entre as cadeias complementares do DNA são rompidas e as fitas se separam. O processo inverso ocorre na renaturação. Esses processos ocorrem normalmente na natureza e podem ser desencadeados in vitro. A temperatura na qual 50% das moléculas de DNA se encontra desnaturado é chamado de Tm (Temperature Melting) (ZAHA, 1996). Para desencadear as reações acima citadas, uma das técnicas usadas é variação da temperatura. Para o rompimento de um par CG são necessárias temperaturas mais elevadas, porque entre a ligação das bases C e G há três pontes de hidrogênio, enquanto entre A e T há apenas duas pontes. É possível calcular o valor de Tm de um dado DNA a partir do conteúdo de GC, usando a fórmula: Tm ( C) = 69,3 + 0,41 (%GC) 500 / tamanho (ibidem). A renaturação pode ocorrer mesmo quando as moléculas de DNA estão completamente separadas. Se uma solução contendo DNA desnaturado for lentamente resfriada, as fitas reassociam-se. Esse anelamento ocorre geralmente a uma temperatura 25 C abaixo da Tm. Se um resfriamento abrupto ocorre, a renaturação pode não ocorrer (ibidem). Essas características do DNA são importantes também para os experimentos de PCR, que realizam a replicação de DNA in vitro e baseiam-se justamente na desnaturação e renaturação do DNA. A PCR é explicada na seção 2.2.

35 20 2. TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR 2.1. Seqüenciamento e Clonagem Provavelmente, a técnica mais importante disponível aos pesquisadores é o seqüenciamento de DNA, processo através do qual se pode determinar a ordem exata de nucleotídeos de um trecho de DNA. Os métodos de seqüenciamento de DNA mais rápidos e eficientes estão disponíveis desde a década de 70. A primeira molécula de DNA a ser totalmente seqüenciada foi o genoma do bacteriófago X 174 com nucleotídeos que foi completado em 1975 (BROWN, 1999). Um dos requisitos para o seqüenciamento do DNA é a habilidade para obter fragmentos definidos de DNA. Qualquer método de seqüenciamento de DNA começa com uma população de um fragmento definido de DNA. A partir dessa população, são polimerizados conjuntos de moléculas que diferem em tamanho devido à incorporação na extremidade 3 de uma base modificada, a qual interrompe o processo de síntese da cadeia complementar (nucleotídeo de terminação). Essas moléculas são separadas por eletroforese de acordo com seu tamanho e por meio do reconhecimento de qual base modificada está na extremidade 3 é possível determinar a seqüência original do DNA. Existem vários motivos que levam ao seqüenciamento de um genoma completo, entre eles: a descoberta das funções dos genes; a utilização de genes já conhecidos na produção de fármacos ou outros produtos de interesse biotecnológico; a identificação de genes que causam doenças, possibilitando a criação de terapias e uso em seres que ainda não desenvolveram os sintomas; e a descoberta da função (se houver) dos trechos de DNA que ainda são ditos como extragênicos (sem função alguma) (BROWN, 1999). A clonagem de genes pode ser feita através da técnica de DNA recombinante. Nesta técnica é inserido um pequeno trecho de DNA em uma molécula replicante. Esta se replicará, e junto com ela, o trecho inserido será multiplicado também (GRIFFITHS et al, 2002).

36 PCR A Polimerase Chain Reaction (PCR) é uma técnica que possibilita a reprodução de milhares, milhões ou mesmo bilhões de cópias de um determinado fragmento de DNA. Através dessa técnica, uma seqüência particular de interesse pode ser amplificada (clonada), tornando-se majoritária na amostra de DNA, e assim a seqüência amplificada pode ser utilizada para outros fins (TRIUNFOL, 2003). PCR é útil em diagnósticos para verificar a presença de um gene ou um estado mutacional de um gene específico, ou simplesmente na amplificação de um segmento específico (GRIFFITHS et al, 2002). Depois que uma seqüência é amplificada, ela pode ser separada em um experimento de eletroforese, por exemplo. O processo de PCR utiliza múltiplos ciclos de desnaturação, anelamento com primers e alongamento da seqüência por ação da polimerase (LIFE TECHNOLOGY, CA. 2000). Esses primers são pequenos fragmentos de DNA complementares a cada uma das extremidades da seqüência de DNA de interesse. Cada ciclo se inicia com a desnaturação da dupla-hélice do DNA, elevado a altas temperaturas (95 C), por aproximadamente 1 minuto. Esta etapa é seguida da etapa de anelamento dos primers ao DNA molde, a temperaturas que variam de 55 ºC por 1 a 2 minutos. Posteriormente ocorre a elongação de cadeia por ação da polimerase, em geral entre temperaturas de 72 C durante 2 a 5 minutos. Então cada cadeia sofre a desnaturação novamente e se tornam moldes para mais um ciclo. O número de ciclos, a temperatura de anelamento, o tempo de cada ciclo e outros componentes de PCR variam de acordo com o objetivo e condições utilizadas (SILVA, 2001a). A Figura 6 mostra uma representação da técnica de PCR. Ao final do primeiro ciclo, há duas fitas da molécula original de DNA, mais duas cópias da região de interesse. Esses ciclos são repetidos várias vezes, tipicamente 30 vezes, num aparelho chamado termocirculador. Ao final desses ciclos de amplificação existem, tipicamente, mais que 1 milhão de cópias do segmento de DNA de interesse para cada molécula molde original da amostra inicial. (TRIUNFOL, 2003).