1º DE SETEMBRO DE

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1 Suplementação com semente de girassol aumenta a taxa de concepção e promove modificações endometriais em fêmeas bovinas de corte Supplementation with sunflower seed increases the conception rate and promotes endometrial changes in beef cattle females Claudia Maria Bertan Membrive¹; Mariângela Bueno Cordeiro²; João Ricardo Scaliante Júnior² ¹ UNESP - Faculdade de Ciências Agrárias e Tecnológicas / FCAT - Dracena/SP; ²UNESP - Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba / FMVA - Araçatuba/SP *joaorscaliante@hotmail.com INTRODUÇÃO Os ácidos graxos poliinsaturados (AGPI) promovem benefícios às funções reprodutivas de fêmeas bovinas através de mecanismos não relacionados à suplementação energética (STAPLES et al., 1998; FUNSTON, 2004; RAES et al., 2004). Os AGPI da família do ômega 3 (n-3) e 6 (n-6), constituem os principais AGPI envolvidos na reprodução. O ácido linolênico e linoléico são os principais representantes da família n-3 e n-6, respectivamente. A suplementação estratégica, especificamente de ácido linolênico (n-3) e linoléico (n-6), aumenta a performance reprodutiva de fêmeas bovinas. Sugere-se que os efeitos dos AGPI na reprodução podem ser parcialmente mediados por alterações na composição destes no fluído folicular e no microambiente que cerca o complexo cumulus-oócitos durante o desenvolvimento e maturação do folículo (CHILDS et al., 2008a; FOULADI- NASHTA et al., 2009). Além disso, relata-se que a suplementação com AGPI altera o número e o tamanho de folículos ovarianos (BILBY et al., 2006; LUCY et al., 1991; ROBINSON et al., 2002), além de incrementar a qualidade oocitária (KOJIMA et al., 1997; KIM et al., 2001; ZERON et al., 2002; CHILDS et al., 2008a; CERRI et al., 2009b). Em relação aos efeitos que os AGPI podem promover no microambiente uterino, relata-se que a utilização de determinados AGPI na dieta promoveria alterações na composição lipídica endometrial, tornando-o menos luteolítico (MATTOS et al., 2000). Os mecanismos pelos quais a suplementação com AGPI promove benefícios nas taxas de concepção não foram suficientemente esclarecidos. 644

2 Existem várias fontes de gordura que podem ser utilizadas na alimentação animal, tais como sementes de oleaginosas, sebo, óleo reciclado de cozinha, óleos vegetais, óleos de peixe e gorduras comercialmente protegidas contra ação dos microorganismos ruminais, como os sais de cálcio de ácidos graxos e gorduras granuladas (WATHES et al., 2007). Cada fonte de gordura é composta de uma mistura de diferentes ácidos graxos (AG) individuais. Os principais AG presentes nas dietas são ácido palmítico (C16:0) e esteárico (C18:0), ambos saturados; ácido oléico (C18:1), este insaturado, e ácido loniléico e linolênico, ambos poliinsaturados (SOARES, 2009). Dentre as sementes oleaginosas, uma das fontes mais ricas em ácido linoléico é a semente de girassol (Helianthus annuus L.). O teor de óleo do girassol varia de 20 a 45% de acordo com o cultivar (DAGHIR et al., 1980; KARUNOJEEWA et al., 1989; SILVA, 1990), caracterizando-se por ter alta relação de AGPI/saturados (65,3%/11,6%). Em tal semente, os AGPI são constituídos por 65% de ácido linoléico e 20% de ácido graxo insaturado oléico. De acordo com a Companhia Nacional de Abastecimento (Conab), em 2015, o estado de Mato Grosso foi responsável por quase 85% do girassol produzido no país. Analisando-se a distribuição geográfica do rebanho de corte nacional, a região centro-oeste concentrava no mesmo ano, 31,8% do rebanho nacional e 31,51% do total de matrizes, havendo no estado do Mato Grosso a maior concentração de matrizes do rebanho de corte nacional. Considerando o contexto geográfico, a semente de girassol constitui uma alternativa na suplementação de AGPI em matrizes de corte. Diante deste contexto, foi realizado um conjunto de estudos com o intuito de avaliar os efeitos da suplementação com semente de girassol na taxa de concepção de fêmeas bovinas. Em estudos prévios realizados por este grupo constatou-se que o uso de tal suplemento incrementa as taxas de concepção. Posteriormente foram realizados estudos que objetivaram identificar por quais mecanismos a semente de girassol incrementa as taxas de concepção. A seguir será apresentada uma sumarização dos principais resultados encontrados. A hipótese é que a suplementação com semente de girassol promove um incremento na taxa de concepção de fêmeas bovinas de corte e que tal efeito decorra de modificações promovidas no endométrio e corpo lúteo. Assim, objetivou-se avaliar o efeito da suplementação com semente de girassol na taxa de concepção de vacas Nelore submetidas à IATF (Experimento 1); na taxa de concepção de novilhas cruzadas de corte, receptoras de embriões produzidos in vitro, submetidas à TETF (Experimento 2); nas concentrações 645

3 plasmáticas de colesterol total, triglicerídeos, lipoproteína de alta densidade (HDL), lipoproteína de baixa densidade (LDL) e progesterona (P4); assim como no diâmetro, perímetro e área total do corpo lúteo; e ainda a porcentagem de células luteais grandes (LLC) e pequenas (SLC) em relação ao total de células esteroidogênicas existentes no corpo lúteo (Experimento 3); no perfil de ácidos graxos existentes no tecido endometrial (Experimento 4); na abundância relativa nos transcritos dos genes envolvidos na biossíntese de eicosanóides no endométrio (Experimento 5) e seus efeitos no número, diâmetro, perímetro e área total das glândulas endometriais (Experimento 6). MATERIAL E MÉTODOS No Experimento 1, vacas Nelore, pluríparas, entre 40 e 130 dias pós-parto, foram submetidas à IATF e divididas em dois grupos para receberem 1,7Kg/animal/dia dos seguintes tratamentos: 40% de farelo de soja com 44% de proteína bruta (PB) e 60% de semente de girassol (Grupo Girassol; n = 66) ou 53% de farelo de soja com 44% de PB e 47% de milho (Grupo Controle; n = 67), ambos os suplementos balanceados com 72% de NDT e 24% de PB. Considerou-se o D0 como o dia da IATF. Os suplementos foram fornecidos durante 22 dias a partir da IATF. O diagnóstico de prenhez foi realizado por ultrassonografia no D30. Os dados foram analisados pelo proc GLIMMIX do SAS. No Experimento 2, novilhas mestiças zebuínas foram submetidas a um protocolo de sincronização dos estros e da ovulação idêntico ao utilizado no Experimento 1. Dois dias após a remoção do dispositivo, considerou-se o dia esperado para o estro (D0). No dia da remoção do dispositivo (D-2), as novilhas foram divididas em dois grupos (Grupo Girassol; n = 106 e Grupo Controle; n = 111) para receberem os mesmos tratamentos utilizados no Experimento 1, fornecidos durante 22 dias, do D-2 ao D19. No D7, embriões produzidos in vitro foram transferidos às receptoras por TETF. O diagnóstico de prenhez foi realizado por ultrassonografia no D30. Os dados foram analisados pelo proc GLIMMIX do SAS. No Experimento 3, foram utilizadas 60 vacas Nelore (Bos taurus indicus), pluríparas, não lactantes, foram submetidas a um protocolo de sincronização das ovulações, onde o dia esperado para o estro (D0) foi estimado 48 horas após a retirada do implante. No D0, de acordo com o tratamento (Controle ou Girassol) e período de suplementação (durante 6, 14 ou 22 dias), os animais foram divididos em seis grupos: suplementação sem semente de girassol por 6 dias (Grupo Controle D6; n = 10), 14 dias (Grupo Controle D14; n = 10) ou 22 dias 646

4 (Grupo Controle D22; n = 10); ou suplementação com semente de girassol por 6 dias (Grupo Girassol D6; n = 10), 14 dias (Grupo Girassol D14; n = 10) ou 22 dias (Grupo Girassol D22; n = 10). Amostras de sangue foram colhidas no D0, D7, D11, D15, D19 e D22 dias para os animais suplementados por 22 dias; no D0, D7, D11 e D14 para os animais suplementados por 14 dias e no D0 e D6 para os animais suplementados por 6 dias. As concentrações plasmáticas de P4, colesterol total, triglicerídeos, HDL e LDL foram mensuradas. A morfologia do corpo lúteo (diâmetro, área total) foram mensuradas no último dia de suplementação. Ao término da suplementação parte das fêmeas foram abatidas no dia seguinte ao término do tratamento, sendo Grupo Controle D7 (n = 4), Grupo Controle D15 (n = 5), Grupo Controle D23 (n = 6), Grupo Girassol D7 (n = 6), Grupo Girassol D15 (n = 6) e Grupo Girassol D23 (n = 6). Após o abate destas fêmeas, o corpo lúteo foi isolado e acondicionado em formol tamponado. Posteriormente preparado para a avaliação da porcentagem de células luteais grandes (LLC) e pequenas (SLC) em relação ao total de células esteroidogênicas existentes no corpo lúteo. No Experimento 4, foram utilizadas as fêmeas abatidas no Experimento 3. Vacas Nelore (n=30), dois dias após a remoção do dispositivo as fêmeas foram divididas em seis grupos e receberam 1,7 kg/animal/dia de suplemento contendo 40% farelo de soja com 44% de proteína bruta (PB) + 60% de semente de girassol por 6 (n = 4), 14 (n = 5) e 22 dias (n = 6), ou suplemento contendo 53% farelo de soja com 44% de proteína bruta (PB) + 47% de milho por 6 (n = 4), 14 (n = 5) e 22 dias (n = 6). Ambos os suplementos foram formulados com 72% NDT e 24% PB. Ao término da suplementação parte das fêmeas foram abatidas no dia seguinte ao término do tratamento, sendo Grupo Controle D7 (n = 4), Grupo Controle D15 (n = 5), Grupo Controle D23 (n = 6), Grupo Girassol D7 (n = 6), Grupo Girassol D15 (n = 6) e Grupo Girassol D23 (n = 6). O tecido endometrial foi isolado e armazenado a -196 o C. Posteriormente, os ácidos graxos do tecido endometrial foram avaliados por cromatografia gasosa. Analisou-se o perfil de 54 ácidos graxos: C4:0, C6:0, C8:0, C10:0, C10:1, C11:0, C12:0, C12:1, C13:0 ISO, C13:0 ANTEISO, C13:0, C14:0 ISO, C14:0, C15:0 ISO, C15:0 ANTEISO, C14:1 C9, C15:0, C16:0 ISO, C15:1, C16:0, C17:0 ISO, C16:1 C9, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1 T6-T7-T8-T9, C18:1 T10-T11-T12, C18:1 C9, C18:1 C11, C18:1 C12, C18:1 C13, C18:1 T16, C18:1 C15, C18:2 C9-C12, C20:0, C18:3 n6, C18:3 n3, C20:1, C18:2 C9- T11, C18:2 T10 C12, C21:0, C20:2, C20:3n6, C22:0, C22:1, C20:4, C20:3n3, C23:0, C22:2, C20:5, C24:0, C24:1, C22:5 e C22:6. Os dados foram analisados pelo SAS Proc GLIMMIX. 647

5 No Experimento 5, foram utilizadas as fêmeas tratadas no Experimento 3. Desta forma, os grupos foram formados para este estudo foram: Grupo Controle D6 (n = 9), Grupo Controle D14 (n = 9), Grupo Controle D22 (n = 10); Grupo Girassol D6 (n = 8), Grupo Girassol D14 (n = 7) e Grupo Girassol D22 (n = 6). No último dia de suplementação, foram coletados explantes endometriais, no terço médio do corno uterino ipsolateral ao corpo lúteo. Os explantes foram coletados por biópsia via transcervical. As amostras foram submetidas à extração de RNA para avaliar a abundância relativa dos transcritos dos genes de PTGES1, PTGES2, AKR1B1, AKR1C4, PTGS2, PTGER2, PTGER4 e PLA2G10, todos envolvidos na biossíntese de eicosanóides no endométrio. No Experimento 6, foram utilizadas as mesmas fêmeas abatidas no Experimento 3. Ao término da suplementação parte das fêmeas foram abatidas 24 horas após, sendo Grupo Controle D7 (n = 4), Grupo Controle D15 (n = 5), Grupo Controle D23 (n = 6), Grupo Girassol D7 (n = 6), Grupo Girassol D15 (n = 6) e Grupo Girassol D23 (n = 6). Após o abate destas fêmeas, o sistema genital foi isolado e o corno uterino ipsolateral ao corpo lúteo foi seccionado longitudinalmente de modo a expor o tecido endometrial. Foi realizada uma secção do corno uterino em todo o seu diâmetro, no terço médio do corno contralateral ao corpo lúteo. O tecido foi imediatamente acondicionado em solução fixadora de formol tampando. Posteriormente procedeu-se a o avaliação morfométrica das glândulas endometriais onde foram mensuradas as áreas (μm 2 ), perímetros (μm) e diâmetros (μm) das glândulas endometriais. RESULTADOS E DISCUSSÃO No Experimento 1, observou-se que a taxa de concepção foi aumentada em vacas Nelore suplementadas com semente de girassol durante 22 dias a partir da Inseminação artificial em tempo fixo- IATF (47,8% vs. 66,7%; P < 0,01), onde verificou-se um incremento de 18,9% nas taxas de concepção quando tal suplementação foi aliada a IATF (CORDEIRO et al., 2015). No Experimento 2, observou-se que a taxa de concepção foi aumentada nas novilhas suplementadas com semente de girassol durante 22 dias a partir da TETF (55,66% vs. 36,94%; P < 0,01), onde verificou-se um incremento de 18,72% nas taxas de concepção quando tal suplementação foi aliada a TETF (CORDEIRO et al., 2015). 648

6 No Experimento 3, verificou-se que vacas suplementadas com semente de girassol apresentaram maiores concentrações plasmáticas de colesterol total e HDL, maior área total do corpo lúteo no D15 (D0 = dia esperado para o estro) e maior porcentagem de LLC no corpo lúteo no D7 e D15, entretanto, tais características não foram correlacionadas ao aumento das concentrações plasmáticas de progesterona, que permaneceu semelhante em ambos os grupos. No Experimento 4, dos ácidos graxos analizados (54 compostos) verificou-se a presença de 43 ácidos graxos no tecido endometrial. Os ácidos graxos ausentes no tecido endometrial foram C4:0, C11:0, C12:1, C: 13:0, C13:0 iso, C13:0 antiiso, C14:0 iso, C15:1, C18:1 T16, C18: 2 C12 T10 e C21:0. Os ácidos graxos presentes em maior porcentagem comparado ao Grupo Controle foram C18:1 T10-T11-T12 e C10:1. Os ácidos graxos presentes em menor menor porcentagem comparado ao Grupo Controle foram C15:0 iso, C20:5, C20:3N3, C23:0, C24:0 e C22:5. A suplementação com semente de girassol altera a composição lipídica do endométrio. No Experimento 5, verificou-se que a suplementação com semente de girassol não alterou a transcrição de genes envolvidos na biossíntese de eicosanóides em vacas Nelore suplementadas. No Experimento 6, não verificou-se o efeito de tal suplementação em nenhum dos parâmetros avaliados, pertinentes as glândulas endometriais. CONCLUSÃO Diante dos estudos realizados, conclui-se que a suplementação com semente de girassol promove um incremento na taxa de concepção de fêmeas bovinas de corte e que tal efeito decorra de modificações promovidas na composição lipídica do endométrio. REFERÊNCIAS BILBY, T. R. et al. Effects of dietary unsaturated fatty acids on oocyte quality and follicular development in lactating dairy cows in summer. Journal of Dairy Science, v. 89, n.10, p ,

7 CERRI, R. L. A. et al. Effect of fat source differing in fatty acid profile on metabolic parameters, fertilization, and embryo quality in high-producing dairy cows. Journal of Dairy Science, v. 92, n.4, p , 2009b. CHILDS, S. et al. Embryo yield and quality following dietary supplementation of beef heifers with n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA). Theriogenology, v. 70, n.6, p , 2008a. CORDEIRO, M. B. et al. Supplementation with sunflower seed increases circulating cholesterol concentrations and potentially impacts on the pregnancy rates in Bos indicus beef cattle. Theriogenology, v. 83, n.9, p , DAGHIR, N. J.; RAZ, M. A; UWAYJAN, M. Studies the utilization of full fat sunflower seed in broiler rations. Poultry Science, v. 59, N.10, p , FOULADI-NASHTA, A. A. et al. Oocyte quality in lactating dairy cows fed on high levels of n-3 and n-6 fatty acids. Reproduction, v. 138, n.5, p , FUNSTON, R. N. Fat supplementation and reproduction in beef females. Journal of Animal Science, v. 82, sup., p , KARUNOJEEWA, H.; THAM, S.H.; ABU - SEREWA, S. Sunflower seed meal, sunflower oil and full-fat sunflower seeds, hulls and kernels for laying hens. Animal Feed Science Technology, v. 26, n. 1/2, p , KENNY, D.A.; WATERS, S.M. Effect of dietary n-3 polyunsaturated fatty acids supplementation on bovine uteroendometrial and hepatic gene expression of the insulin-like growth factor system. Theriogenology, v. 75, n.3, p , KIM, J. Y. et al. Lipid and fatty acid analysis of fresh and frozen thawed immature and in vitro matured bovine oocytes. Reproduction, v. 122, n.1, p , KOJIMA, T. et al. Dietary administration of fatty acids-enriched mold dried cell containing ã- linolenic acid to female pigs improves ovulation rate and embryo quality in summer. Journal of Reproduction and Development, v. 43, p , MATTOS, R.; STAPLES, C.R.; THATCHER, W.W. Effects of dietary fatty acids on reproduction in ruminants. Reviews of Reproduction, v. 5, n.1, p , RAES, K.; DE SMET, S.; DEMEYER, D. Effect of dietary fatty acids on incorporation of long chain polyunsaturated fatty acids and conjugated linoleic acid in lamb, beef and pork meat: a review. Animal Feed Science and Technology, v. 113, n.1-4, p ,

8 ROBINSON, R. S. et al. Effects of dietary polyunsaturated fatty acids on ovarian and uterine function in lactating dairy cows. Reproduction, v. 124, n.1, p , SILVA, M. N. A cultura do girassol. Jaboticabal: FUNEP, p. SOARES, S. R. V. Metabolismo e digestão de lipídios em vacas leiteiras f. Monografia (Especialização) - REHAGRO/NEWTON PAIVA, Belo Horizonte-MG, STAPLES, C. R.; BURKE, J.M.; THATCHER, W.W. Influence of supplemental fats on reproductive tissues and performance of lactating cows. Journal of Dairy Science, v. 81, n.3, p , WATHES, D. C.; ABAYASEKARA, D.R.; AITKEN, R.J. Polyunsatured fatty acids in male and female reproduction. Biology of Reproduction, v. 77, n.2, p , ZERON, Y. et al. Effect of polyunsaturated fatty acid supplementation on biophysical parameters and chilling sensitivity of ewe oocytes. Molecular Reproduction and Development, v. 61, n.2, p ,