Estudos citogenéticos em três espécies do gênero Astyanax, com ênfase no DNA ribossomal

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Estudos citogenéticos em três espécies do gênero Astyanax, com ênfase no DNA ribossomal CARLOS ALEXANDRE FERNANDES MARINGÁ 2006

2 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Estudos citogenéticos em três espécies do gênero Astyanax, com ênfase no DNA ribossomal CARLOS ALEXANDRE FERNANDES Tese de Doutorado apresentada ao Programa de pós-graduação em Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Maringá, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração Biologia Celular. MARINGÁ 2006

3 Professora Dra. Isabel Cristina Martins dos Santos (ORIENTADORA)

4 Dedico ao meu pai, minha mãe e a Day que sempre me apoiaram.

5 Agradecimentos Agradeço a todos a pessoas que direta e indiretamente contribuíram para a realização desta Tese de Doutorado, principalmente: A Universidade Estadual de Maringá por ter-me dado a formação acadêmica e propiciado a chance de fazer pós-graduação na área de Biologia Celular para que eu possa melhorar meus conhecimentos nesta área, a fim de alcançar meus objetivos futuros. A Professora Doutora Isabel Cristina Martins-Santos por ter me aceitado como orientando e de ter dado todo atendimento necessário para o desenvolvimento da pesquisa na área de Citogenética de Peixes e a CAPES por ter financiado a pesquisa. A graduanda Ana Paula de Santi por ter me ajudado e dado toda a atenção no início da pesquisa, quando eu ainda estava no Mestrado, ajudando-me a aprender e desenvolver as técnicas experimentais. A todos os amigos do laboratório que sempre estiveram dispostos a ajudar e participar das coletas de peixes. Aos Professores Doutores, Horácio e Ana Luiza por sempre estarem dispostos a tirar dúvidas, dar dicas e opiniões referentes ao trabalho. A todos sem exceção do laboratório de Citogenenética de Peixes que sempre estavam dispostos a ajudar de alguma forma. A Ana Cristina Petry e Fernando Pelicice pela valorosa ajuda na revisão dos manuscritos em inglês. Em especial a minha namorada Dayani Bailly que sempre esteve a disposição para ajudar no que fosse preciso, dando conselhos e opiniões, participando das pescarias, da revisão do manuscrito e mesmo nos momentos mais difíceis dando apoio para não desistir e continuar na pesquisa. Ao meu pai e minha mãe por sempre me apoiarem durante os anos de pósgraduação. A Deus por ter me dado saúde e disposição para a realização desta Tese.

6 Sumário 1 Introdução geral e objetivos Revisão bibliográfica Considerações gerais sobre citogenética de peixes, com ênfase no gênero Astyanax DNA ribossomal: uma pequena revisão Material e métodos Espécies estudadas e locais de coleta Preparação dos cromossomos mitóticos Identificação dos cromossomos Banda C Regiões organizadoras de nucléolo Cromomicina A 3 (GC-específico) Extração do DNA genômico Amplificação do DNAr 18S por PCR Amplificação do DNAr 5S por PCR Marcação das sondas 18S e 5S Hibridação in situ por fluorescência (FISH) Método para localização seqüencial das NORs em lâminas previamente tratadas por FISH Processamento das imagens Referências bibliográficas Artigos Capítulo I - Mapeamento dos genes RNA ribossomais 18S e 5S em Astyanax altiparanae Garutti & Britski, 2000 (Teleostei, Characidae) da bacia do alto rio Paraná Capítulo II - Localização cromossômica dos genes RNAr 18S e 5S em três citótipos simpátricos de Astyanax scabripinnis (Characiformes, Characidae) da bacia do rio Ivaí, Estado do Paraná, Brasil Capítulo III - Caracterização citogenética em Astyanax fasciatus (Teleostei, Characiformes) da bacia do alto rio Paraná por Giemsa, Ag-NOR, banda-c e FISH Conclusões... 66

7 Resumo A localização cromossômica do DNAr 18S e 5S tem contribuído no entendimento da organização do genoma em peixes. Os sítios ativos de DNAr 45S mostram uma coincidência posicional com as regiões organizadoras de nucléolo (NORs) nos cromossomos, enquanto os cistrons de DNAr 5S não estão presentes nas NORs. Além disso, o DNAr 18S tem revelado variações numéricas e posicionais intrae inter-populacionais, enquanto o DNAr 5S tem-se mostrado extremamente conservado mesmo entre organismos filogeneticamente distantes. Buscando melhor compreender as NORs, assim como, o padrão de distribuição dos sítios de DNAr 18S e 5S, foram investigadas espécies do gênero Astyanax, com ênfase em A. scabripinnis, A. altiparanae e A. fasciatus, espécies relativamente comuns de pequenos peixes amplamente distribuídos em rios neotropicais. Para alcançar tal objetivo, foram empregadas técnicas de coloração por nitrato de prata, cromomicina e hibridação fluorescente in situ. Para os espécimes de A. fasciatus também foram realizados estudos do cariótipo e da heterocromatina constitutiva. No total, seis populações foram analisadas, sendo quatro para A. altiparanae, uma para A. fasciatus e uma para A. scabripinnis, sendo que esta última revelou três citótipos diferentes. O DNAr 18S revelou variações numéricas e posicionais entre os indivíduos da mesma espécie e entre as espécies diferentes, enquanto o DNAr 5S mostrou o mesmo padrão de distribuição entre os indivíduos da mesma espécie e entre os espécimes de A. fasciatus e A. scabripinnis. A localização cromossômica variável do DNAr 18S e a conservada do DNAr 5S foram atribuídas a posição destes sítios no cromossomo. Alguns autores descrevem que a proximidade das regiões teloméricas dentro do núcleo interfásico facilitaria transferência de material genético. Portanto, a localização terminal dos sítios de DNAr 18S das espécies analisadas poderia facilitar eventos de transferência, enquanto a localização intersticial dos sítios de DNAr 5S poderia não sofrer esta influência. As técnicas de nitrato de prata, cromomicina e hibridação fluorescente in situ com sonda de DNAr 18S revelaram presença de NOR múltipla para as espécies de Astyanax analisadas, indicando ser uma característica comum do grupo. A constituição cariotípica e o padrão de distribuição de heterocromatina constitutiva dos espécimes de A. fasciatus corroboram com os dados descritos para esta espécie na bacia do alto rio Paraná.

8 Abstract Chromosomal location of the 18S and 5S rdna have contribute toward a better understanding of fish genome organization. 45S rdna active sites show a positional coincident with NORs in chromosomes, while 5S rdna not be present in the NORs. Moreover, 18S rdna have shown intra and interpopulation numerical and positional variations, while the 5S rdna have shown to be extremely conserved even among organism phylogenetically distants. In order to better understand the NORs, as well the distributional pattern of 18S e 5S rdna sites, species of the genus Astyanax were investigated, with emphasis in A. scabripinnis, A. altiparanae and A. fasciatus, smallsize fish species widely distributed in neotropical rivers. To reach such objective, techniques of coloration with silver nitrate, chromomycin and fluorescence hybridization in situ were employed. For A. fasciatus specimens, studies of karyotype and constitutive heterochromatin also were carried out. A total of six populations were analyzed, being four of A. altiparanae, one of A. fasciatus and one of A. scabripinnis, being the latter revealing three different cytotypes. The 18S rdna revealed numerical and positional variations among individuals of the same species and among species, while the 5S rdna showed the same distributional pattern between A. fasciatus and A. scabripinnis specimens and among the studied species. Variable chromosomal location of 18S rdna and conserved of 5S rdna were attributed to location of these sites in the chromosome. Some authors describe that the proximity among telomeric regions within interphase nucleus would facilitate the transference of genetic material. Therefore, terminal location of 18S rdna sites of the analyzed species could facilitate transference events, while interstitial location of 5S rdna sites could not suffer this influence. The techniques of silver nitrate, chromomicin and fluorescence hybridization in situ with 18S rdna probe revealed presence of multiple NOR for the analyzed species of Astyanax, indicating a common group characteristic. The karyotypic constitution and the distribution pattern of constitutive heterochromatin of A. fasciatus specimens corroborated other findings for this species in the upper Paraná River basin.

9 Introdução geral e objetivos 1 Introdução geral e objetivos Os peixes representam o maior grupo dos vertebrados e incluem muitas espécies de significativo valor comercial. Estima-se que existam mais de espécies de peixes de água doce na América do Sul (Schaefer, 1998). Segundo Böhlke et al. (1978) foram descritas cerca de espécies na América do Sul e os resultados recentes determinam aproximadamente espécies de peixes de água doce para o Brasil (Abilhoa e Duboc, 2004). O Brasil é um país de proporções continentais, que além de possuir acima de km de regiões costeiras, também apresenta um grande número de bacias hidrográficas. Desta forma, não é surpreendente que também possua uma enorme diversidade ictiofaunística. Um grande número de espécies ainda precisa ser descrito, porém através da interferência antrópica no meio ambiente, muitas espécies encontram-se ameaçadas de extinção. Uma boa parte dos trabalhos em ictiologia no Brasil tange à sistemática, em função da enorme quantidade de espécies sendo descritas, principalmente em água doce, uma vez que a fauna de peixes continentais da América do Sul pode representar sozinha cerca de 24% de todas as espécies de peixes do planeta (Vari e Malabarba, 1998). Entretanto, no sentido do conhecimento a respeito do status das espécies, são fundamentais os estudos de sua biologia e ecologia, ainda incipientes para a grande maioria dos peixes, principalmente daqueles sem importância econômica. Dentro deste contexto está o gênero Astyanax, o qual consiste de pequenos peixes conhecidos no Brasil como lambaris ou piabas, muito importantes no equilíbrio ecológico existente nos sistemas aquáticos. Neste grupo a maioria das informações disponíveis tem se concentrado em sistemática e análises citogenéticas e somente poucos trabalhos têm realizado inferências acerca da organização genômica de genes e seqüências repetitivas. Dentre estas seqüências repetitivas, destacam-se os genes ribossomais, o DNAr 45S e o DNAr 5S. O primeiro codifica os RNAr 18S, 5,8S e 28S, enquanto o DNAr 5S codifica o RNAr 5S. Sítios ativos de DNAr 45S correspondem as NORs nos cromossomos. As NORs têm sido extensivamente estudadas em peixes e constituem bons marcadores genéticos, ajudando estudos citotaxonômicos de espécies relacionadas. Sítios de DNAr 5S não estão presentes na NOR, mas o RNAr 5S faz parte da subunidade maior dos ribossomos. A evolução do DNA repetitivo é governada por mecanismos particulares que induzem uma segregação não-mendeliana destas seqüências, desempenhando um significativo impacto na diferenciação das populações. Diante do exposto o objetivo do presente trabalho foi:

10 Organização do DNAr em Astyanax 2 - Identificar o número e a posição das NORs em relação ao padrão de distribuição dos sítios de DNAr 18S e 5S em espécies do gênero Astyanax, com ênfase em A. scabripinnis, A. altiparanae e A. fasciatus. Para alcançar tal objetivo, foram empregadas técnicas de coloração por nitrato de prata, cromomicina e hibridação fluorescente in situ. Para os espécimes de A. fasciatus também foram realizados estudos do cariótipo e da heterocromatina constitutiva.

11 Revisão bibliográfica 3 2 Revisão bibliográfica 2.1 Considerações gerais sobre citogenética de peixes, com ênfase no gênero Astyanax A citogenética compreende o estudo dos cromossomos quanto à morfologia, organização, função, variação e evolução. Os primeiros estudos citogenéticos em peixes foram publicados por Retzius e Kateschenko em 1890 (apud Denton, 1973). Contudo, somente a partir de 1960 os trabalhos de citogenética puderam apresentar dados precisos a respeito do número e forma dos cromossomos após a descoberta e aplicação dos tratamentos hipotonizantes para o estudo das células em divisão. Os peixes neotropicais apresentam uma grande variabilidade cariotípica, tanto inter quanto intra-específica. Seus números cromossômicos diplóides variam de 2n=20 cromossomos em Pterolebias longipinnis à 2n=132 cromossomos em Corydoras aeneus (Oliveira et. al., 1988). No Brasil o primeiro trabalho de citogenética de peixes descreveu o número de cromossomos em Synbranchus marmoratus (Andrea, 1971). Atualmente são conhecidos os números diplóides e/ou haplóides para aproximadamente 920 espécies neotropicais (Oliveira et. al., 2000). Astyanax é um gênero relativamente comum, o qual consiste de pequenos peixes conhecidos no Brasil como lambaris ou piabas, com ampla distribuição geográfica, compreendendo mais do que cem espécies e subespécies em rios neotropicais (Garutti e Britski, 1997). Este gênero revela várias formas quase similares, formando um grupo altamente complexo e sua precisa identificação tem sido difícil (Melo, 2001). Entre as espécies do gênero Astyanax tem sido observada extensa diversidade cariotípica com número diplóide variando de 2n = 36 (A. schubarti) a 2n = 50 (A. altiparanae, A. taeniatus, A. scabripinnis) cromossomos. A diversidade cariotípica também ocorre entre indivíduos da mesma espécie, com variações numéricas e estruturais. Estas espécies têm sido tratadas como complexo de espécies, tais como A. scabripinnis, A. fasciatus e A. altiparanae: no complexo scabripinnis, o número diplóide varia de 2n = 46, 2n = 48 e 2n = 50 cromossomos (Moreira-Filho e Bertollo, 1991; Fernandes e Martins-Santos, 2005); no complexo fasciatus, o número diplóide varia de 2n = 45 a 2n = 50 cromossomos (Centofante et al., 2003a) e no complexo altiparanae apesar do número diplóide constante (2n =50

12 Organização do DNAr em Astyanax 4 cromossomos), são relatadas diferenças na constituição cariotípica, com número fundamental (NF) variando de 76 a 100 (Fernandes e Martins-Santos, 2004). Em A. scabripinnis os diferentes números diplóides têm sido relatados em populações distintas, mas também foram descritos para populações simpátricas e sintópicas (Souza et al. 1995; Maistro et al., 2000; Fernandes e Martins-Santos, 2005). As espécies do gênero Astyanax podem sofrer outras variações de número, devido à presença de cromossomos B. Em A. scabripinnis os cromossomos B aparecem com maior freqüência, descritos como macrocromossomos (Salvador e Moreira-Filho 1992; Maistro et al. 1992; Mizoguchi e Martins-Santos 1997; Moreira-Filho et al. 2001; Fernandes e Martins-Santos, 2005) e microcromossomos (Rocon-Stange e Almeida- Toledo, 1993; Mizoguchi e Martins-Santos, 1997; Alves e Martins-Santos, 2002). Outras espécies do gênero Astyanax, como A. fasciatus e A. schubarti (Moreira-Filho et al. 2001) também apresentam macrocromossomo B. O tipo de cromossomo B que tem predominado nestas espécies é o metacêntrico macrocromossomo, similar em tamanho ao primeiro par do complemento, porém em A. scabripinnis outros tipos de macrocromossomos B têm sido relatados (Néo et al., 2000; Ferro et al., 2003; Fernandes e Martins-Santos, 2005). Casos de triploidia natural também têm sido identificados em algumas espécies de Astyanax, como em A. schubarti (Morelli et al., 1983) e A. scabripinnis (Fauaz et al., 1994; Maistro et al., 1994). A constatação de variações envolvendo tanto o número quanto à estrutura dos cromossomos de peixes vem aumentando à medida que se ampliam os estudos citogenéticos nesses animais. No entanto, já se percebe a necessidade do desenvolvimento e da aplicação de novas tecnologias voltadas ao estudo cromossômico de peixes, para auxiliar, juntamente com as técnicas convencionais da citogenética, na compreensão dos mecanismos de especiação que atuaram e atuam nesse grupo. 2.2 DNA ribossomal: uma pequena revisão Em eucariotos superiores, o DNAr apresenta genes organizados dentro de duas famílias multigênicas distintas, compostas de segmentos repetidos em tandem que são definidos com DNAr 45S e DNAr 5S. O DNAr 45S compreende os genes que codificam os RNAr 18S, 5.8S e 28S, os quais estão separados por espaçadores transcritos internos (ITS) e externos (IGS ou ETS) (Figura 1). O IGS é um dos principais responsáveis pelas diferenças encontradas no tamanho dos cístrons entre

13 Revisão bibliográfica 5 espécies distintas. Os ITSs são geralmente ricos em GC (Torres et al., 1990) compostos de seqüências repetitivas (King, 1991), o que justifica a detecção das regiões organizadoras de nucléolos através do emprego de fluorocromos GC-específicos e pela técnica de banda C, respectivamente. Os sítios ativos de DNAr 45S mostram uma coincidência posicional com as NORs nos cromossomos. IGS DNAr 45S IGS DNAr 45S IGS DNAr 45S IGS IGS 18S ITS1 5,8S ITS2 28S IGS Figura 1. Representação da organização em tandem do DNAr 45S para os RNAr (18S, 5,8S e 28S) e seus espaçadores transcritos internos (ITS) e externos (IGS). Ao contrário do DNA ribossomal 45S, o DNAr 5S transcreve o RNAr 5S que migra para o nucléolo e se junta ao RNAr 5,8S e 28S, este DNA é composto de unidades repetitivas em tandem de aproximadamente 120 pares de bases, intercaladas por um espaçador não-transcrito (NTS) (Figura 2). A região codificante do DNAr 5S é extremamente conservada mesmo entre organismos filogeneticamente distantes, enquanto os NTSs apresentam-se muito heterogêneos, variando de tamanho entre as espécies (Pendas et al., 1994). Gene 5S NTS Gene 5S NTS Gene 5S NTS Gene 5S Figura 2. Representação da organização em tandem do DNAr 5S com seus respectivos genes codificantes (5S) e regiões não transcritas (NTS). Os clusters do DNAr 45S são usualmente identificados citogeneticamente como NORs (Long e Dawid, 1980). A análise das NORs representa uma importante ferramenta para o estudo do cariótipo em peixes. Essas regiões cromossômicas têm mostrado um comportamento altamente variável nos diferentes grupos de peixes, não somente em termos de número, localização e tamanho dos cistrons ribossômicos, mas também em relação a sua atividade gênica.

14 Organização do DNAr em Astyanax 6 Em peixes, estudos das NORs têm sido realizados mais freqüentemente com coloração de nitrato de prata (AgNO 3 ) devido à simplicidade desta técnica, embora esta metodologia está limitada a detectar apenas as regiões nucleolares que foram ativas na intérfase precedente (Miller et al. 1976), sendo mais apropriada para estudos de atividade gênica. Fluorocromos GC-específicos são usados para evidenciar NORs ativas e inativas em vertebrados inferiores, principalmente em anfíbios e peixes, uma vez que, sítios ativos de NOR têm mostrado coincidência com bandas cromomicina positivas (fluorocromo GC-específico), por outro lado estes fluorocromos podem também revelar outras regiões ricas em GC (Mayr et al., 1986; Schimid e Guttenbach, 1988). Recentemente a técnica de FISH tem sido empregada para o mapeamento das NORs através de sondas ribossomais, principalmente através da sonda de DNAr 18S e tem provado ser a mais eficiente técnica para investigar genes ribossômicos (Long e Dawid, 1980), quase sempre permitindo detectar um maior número de NORs do que por coloração de prata ou bandeamento por fluorocromo GC-específico. A localização cromossômica dos genes DNAr 45S e/ou 5S foi descrita para 71 espécies de peixes representando grupos distintos, tais como Acipenseriformes, Anguilliformes, Characiformes, Cypriniformes, Salmoniformes, Siluriformes, Perciformes e Tetraodontiformes (Tabela 1). Estes resultados revelam que os genes DNAr 5S estão localizados em regiões intersticiais dos cromossomos da maioria destas espécies analisadas, enquanto que o DNAr 45S em regiões teloméricas. A localização intersticial dos genes DNAr 5S parece representar algum significado relacionado a distribuição destes genes nos cromossomos de peixes. Segundo Schweizer e Loidl (1987) a disposição dos cromossomos no núcleo interfásico promove uma proximidade das regiões teloméricas o que facilitaria transferência de material genético presente nestas regiões. Portanto, o fato do DNAr 5S não estar localizado em regiões terminais facilitaria sua conservação dentro do genoma. Ao contrário do DNAr 5S, o DNAr 45S foi localizado em regiões terminais na maioria dos cromossomos, daí a variabilidade encontrada tanto intra quanto inter-populacional (Ferro et al., 2001; Souza et al., 2001; Fontana et al., 2003; Centofante et al., 2003; Jesus e Moreira-Filho, 2003; Hatanaka e Galetti, 2004; Mantovani et al., 2005).

15 Revisão bibliográfica 7 Tabela 1. Dados de localização cromossômica dos DNAr 5S e 45S (dados principalmente de sondas de 18S) em cromossomos de peixes Ordens e espécies Nº locus de DNAr 5S Nº locus de DNAr 45S Refêrencias Acipenseriformes Acipenser baerii Fontana et al., 2003 Acipenser naccarii Fontana et al., 1999 Acipenser ruthenus 2 6 Fontana et al., 1999 Acipenser ruthenus Fontana et al., 2003 Acipenser stellatus Fontana et al., 2003 Acipenser sturio 2 Tagliavini et al., 1999 Acipenser sturio Fontana et al., 2003 Acipenser transmontanus Fontana et al., 2003 Huso huso 2 6 Fontana et al., 1998 Huso huso Fontana et al., 2003 Anguilliformes Anguilla anguilla 2 2 Martinez et al., 1996 Anguilla rostrata 2 2 Nieddu et al., 1998 Salmoniformes Coregonus artedti 2 Sajdak et al., 1998 Coregonus zenithicus 2 Sajdak et al., 1998 Hucho peri 8 3 Fugiwara et al., 1998 Oncorhynchus masou 6 2 Fugiwara et al., 1998 Oncorhynchus mykis Móran et al., 1996 Salmo salar 2 2 Pendás et al., 1994 Salmo trutta 2 2 Móran et al., 1996 Salvelinus fontinalis 8 42 Fugiwara et al., 1998 Cypriniformes Acheilognathus tabira 4 Inafuku et al., 2000 Carassius auratus auratus 2 Murakami e Fugitani, 1998 Carassius auratus langsdorfi 8-12 Murakami e Fugitani, 1998 Cyprinus carpio 4 Inafuku et al., 2000 Danio rerio 2 6 Phillips e Reed, 2000 Rhodeos ocellatus 2 Kikuma et al., 2000 Characiformes Astyanax altiparanae 2 4 Almeida-Toledo et al., 2002 Astyanax lacustris 2 4 Almeida-Toledo et al., 2002 Astyanax fasciatus 4 6 Almeida-Toledo et al., 2002 Astyanax giton 10 Kavalco et al., 2004 Astyanax intermedius 10 Kavalco et al., 2004 Astyanax parahybae 4 Kavalco et al., 2004 Astyanax scabripinnis 6 Kavalco et al., 2004 Astyanax scabripinnis 6 8 Souza et al., 2001 Astyanax scabripinnis 4 4 Almeida-Toledo et al., 2002 Astyanax scabripinnis Mantovani et al., 2005 Astyanax scabripinnis Ferro et al., 2001 Astyanax schubarti 4 4 Almeida-Toledo et al., 2002

16 Organização do DNAr em Astyanax 8 Tabela 1. (continuação) Ordens e espécies Nº locus de Nº locus de Refêrencias DNAr 5S DNAr 45S Brycon brevicauda 4 Wasko et al, 2001 Brycon cephalus 4 Wasko et al, 2001 Brycon insignis 4 Wasko et al, 2001 Brycon lundii 4 Wasko et al, 2001 Brycon microlepis 4 Wasko et al, 2001 Brycon orbignyanus 4 Wasko et al, 2001 Brycon sp. 4 Wasko et al, 2001 Bryconamericus aff. exodon 8 Paintner-Marquez et al., 2002 Bryconamericus aff. iheringii 2 Paintner-Marquez et al., 2003 Hoplias malabaricus 2 10 Born e Bertollo, 2000 Hyphessobrycon anisitsi Centofante et al., 2003b Leporinus cf. elongates 4 Martins e Galetti, 2001 Leporinus elongatus 4 Martins e Galetti, 1999 Leporinus friderici 4 Martins e Galetti, 1999 Leporinus obtusidens 4 Martins e Galetti, 1999 Leporinus reinhardti 4 Martins e Galetti, 2001 Oligosarcus hepsetus 4 4 Kavalco et al., 2005 Parodon hilarii 4 2 Vicente et al., 2001 Parodon sp. 4 2 Vicente et al., 2001 Parodon tortuosus 4 2 Vicente et al., 2001 Prochilodus argenteus Hatanaka e Galetti, 2004 Prochilodus lineatus Jesus e Moreira-Filho, 2003 Schizodon altoparanae 4 Martins e Galetti, 2000 Schizodon borelli 4 Martins e Galetti, 2000 Schizodon isognathum 4 Martins e Galetti, 2000 Schizodon knerii 4 Martins e Galetti, 2000 Schizodon nasutus 4 Martins e Galetti, 2000 Schizodon vittatus 4 Martins e Galetti, 2000 Siluriformes Harttia loricariformis 2 Kavalco et al., 2004 Hypostomus affinis 8 Kavalco et al., 2004 Neoplecostomus microps 2 Kavalco et al., 2004 Pinirampus pirinampu 2 Swarça et al., 2001 Rhamdia quelen 2 Fenocchio et al., 2003 Upsilodus sp. 4 Kavalco et al., 2004 Perciformes Centropyge aurantonotus 18 2 Affonso e Galetti, 2005 Centropyge ferrugatus 4 2 Affonso e Galetti, 2005 Coris julis 4 Mandrioli et al., 2000 Chromis insolata 4 Molina e Galetti, 2002 Chromis flavicauda 4 Molina e Galetti, 2002 Ephinephelus marginatus 2 Sola et al., 2000 Micropterus salmoides 2 Deiana et al., 2000 Oreochromis niloticus 4 Martins et al., 2000 Tetraodontiformes Tetraodon fluviatilis 2 Mandrioli e Manacardi, 2001 Tetraodon nigroviridis 2 Fischer et al., 2000

17 Revisão bibliográfica 9 Na maioria dos eucariotos, os genes de DNAr 45S estão organizados separadamente dos genes de DNAr 5S. Em peixes não é diferente, porém locus 45S e 5S sintênicos foram descritos para algumas espécies (Pendas et al., 1994; Móran et al., 1996; Fugiwara et al., 1998; Inafuku et al., 2000; Phillips e Reed, 2000; Mandrioli et al., 2000; Almeida-Toledo et al., 2002; Mantovani et al., 2005). Os genes RNAr 45S são transcritos pela enzima RNA polimerase I, enquanto os genes 5S são transcritos longe do nucléolo pela enzima RNA polimerase III. Sugere-se que tais divergências funcionais requereriam posições físicas diferentes entre o DNA 45S e o 5S (Amarasinghe e Carlson, 1998). Além disso, a conversão gênica e o crossing-over desigual são mecanismos comuns agindo nos processos de evolução de seqüências múltiplas em tandem (Dover, 1986). Estes mecanismos poderiam ser mais eficientes quando os clusters 45S e 5S permanecessem separados em vez de uma configuração ligada, evitando a desordem, tal como translocação indesejada das seqüências 5S dentro das seqüências 45S (Martins e Galetti, 1999). Isto poderia explicar porque a maioria de vertebrados tem estes conjuntos em cromossomos distintos.

18 Material e métodos 10 3 Material e métodos 3.1 Espécies estudadas e locais de coleta - Astyanax fasciatus: Os espécimes foram coletados no córrego das Rosas, um tributário do rio Pirapó, pertencente a bacia do alto rio Paraná. Localizado próximo a cidade de Maringá, Paraná. - Astyanax scabripinnis: Os espécimes foram coletados no córrego Tatupeba (23º S e 52º W), um tributário do rio Ivaí, pertencente a bacia do alto rio Paraná. Localizado próximo a cidade de Maringá, Paraná. - Astyanax altiparanae: Os espécimes foram coletados no rio Paraná (região de Porto Rico), córrego Tatupeba (tributário do rio Ivaí), córrego Keçaba e ribeirão Maringá (tributários do rio Pirapó), todos pertencentes a bacia do alto rio Paraná. Estes três tributários estão localizados próximo a cidade de Maringá, Paraná. 3.2 Preparação dos cromossomos mitóticos Os cromossomos mitóticos foram obtidos de células extraídas do rim, segundo a metodologia descrita por Bertollo et al (1978), descrito abaixo: 1) Injetar intraperitoniamente colchicina (0,05%) na proporção de 1ml para cada 100g do peso do animal. 2) Deixar o peixe em aquário bem aerado, por 50 minutos. 3) Sacrificar o animal com tesoura, retirando o rim, e quando necessário às brânquias. 4) Colocar os tecidos retirados em placa de Petri contendo10ml de solução hipotônica de cloreto de potássio (KCl) a 0,075M. 5) Fragmentar bem o material com o auxilio de pinças de dissecação, completando-se esse processo com uma seringa hipodérmica desprovida de agulha, para se obter uma suspensão celular homogênea. 6) Colocar a suspensão obtida a C, em estufa, durante minutos. 7) Retirar da estufa, ressuspender o material com o auxilio de pipeta Pasteur, e transferir a solução para um tubo de centrifuga, adicionar 5 a 6 gotas de fixador (Metanol-Acído Acético, 3:1).

19 Organização do DNAr em Astyanax 11 8) Centrifugar durante 9 minutos a 900 rpm, descartando o sobrenadante com pipeta Pasteur. 9) Adicionar, cuidadosamente, 6ml de fixador deixando-o escorrer através da parede do tubo. 10) Ressuspender o material, cuidadosamente, com o auxilio de pipeta Pasteur, centrifugar por 10 minutos a 900rpm. 11) Repetir os itens 9 e 10 por mais três vezes. 12) Após a última centrifugação, retira-se o sobrenadante e adiciona 2ml de fixador, levando a solução para um frasco plástico do tipo Ependorff. 13) Pingar o material em lamina quente ou gelada e aquece-la a 70 C e deixar secar ao ar. 14) Corar com Giemsa 5%, por minutos. 15) Lavar em água corrente e deixar secar ao ar, analisar a lâmina em microscópio. 3.3 Identificação dos cromossomos A classificação dos cromossomos foi feita mediante medidas cromossômicas, com o auxílio de paquímetro, determinando-se o comprimento do braço menor, do braço maior e o comprimento total de cada cromossomo, calculando os valores médios para cada par. As medidas cromossômicas serão realizadas apenas nas metáfases escolhidas para montagem final dos cariótipos. Os cromossomos serão identificados de acordo com os critérios de relação de braços (RB), propostos por Levan et al (1964), e classificados como metacêntricos (M: RB = 1.00 a 1.70), submetacêntricos (ST: RB = 1.71 a 3.00), subtelocêntricos (ST : RB = 3.01 a 7.00) e acrocêntricos (A : RB = maior que 7.01). 3.4 Banda C Para o estudo da heterocromatina constitutiva foi utilizada a técnica de Sumner (1972) através do bandeamento C, seguindo os procedimentos abaixo: 1) Tratar a lâmina já contendo as gotas do material para análise, com HCl em temperatura ambiente em estufa, por 15 minutos. 2) Lavar a lâmina em água corrente e secar ao ar. 3) Incubar em solução salina de 2xSSC, a 60 C em banho-maria por 15 minutos. 4) Lavar em água corrente e secar ao ar.

20 Material e métodos 12 5) Incubar a lâmina por 30 segundos em solução de hidróxido de bário (BaOH), em banho-maria a 42 C, com o BaOH sendo recém preparado e filtrado. 6) Lavar a lâmina rapidamente em solução de HCl, e depois em água deionizável, deixar secar ao ar. 7) Incubar a lâmina em solução salina de 2xSSC a 60 C, por 1 hora. 8) Lavar em água corrente e secar ao ar. 9) Corar com Giemsa 5% durante 5-10 minutos. 10) Lavar em água corrente e secar ao ar, analisar a lâmina em microscópio. 3.5 Regiões organizadoras de nucléolo A metodologia usada para detecção das regiões organizadoras de nucléolo com uso de nitrato de prata (AgNO 3 ) foi a técnica de Howell e Black (1980), abaixo descrita: 1) De posse da lâmina já contendo o material para análise, hidrolisá-la por 3 minutos em HCl 1N a 60 C, em estufa. 2) Lavar em água corrente e secar ao ar. 3) Pingar uma gota de solução aquosa de gelatina em dois pontos distintos da lâmina, sobre estas gotas adicionar uma gota de água deionizada. 4) Adicionar sobre as gotas anteriores, duas gotas de solução de nitrato de prata (AgNO 3 ), e cobrir a lâmina com lamínula. 5) Incubar em estufa a 60 C por um período de 3-5 minutos, ou até que a solução adquira uma coloração caramelada. 6) Lavar em água corrente e secar ao ar, analisar em microscópio. 3.6 Cromomicina A 3 (GC-específico) Foi empregado o método descrito por Schweizer (1980) e modificado por Schmid (1980), resumido abaixo: 1. Sobre a lâmina, preparada segundo a técnica descrita para cromossomos mitóticos, colocar 150µl de solução de distamicina A recém preparada, utilizando-se uma micropipeta. 2. Cobrir com uma lamínula e deixar agindo por 15 minutos em temperatura ambiente. 3. Lavar a lâmina com tampão McIlvaine (ou água corrente) de modo que a lamínula deslise e saia da lâmina e deixar secar por poucos minutos.

21 Organização do DNAr em Astyanax Colocar sobre a lâmina 150 µl da solução de cromomicina A 3 ou mitramicina A, com o auxílio de uma micropipeta, sobre a lâmina. Cobri-la novamente com uma lamínula e deixar corando por 60 minutos, no escuro, a temperatura ambiente. 5. Repetir o item Montá-la com uma lamínula, utilizando duas gotas de solução de glicerol (Dabco 2%). 7. Estocar a lâmina à temperatura ambiente ou na geladeira, no escuro, por no mínimo 15 dias antes de analisá-la (para prolongar o tempo de emissão de fluorescência desses corantes). 8. Analisar em fotomicroscópio de fluorescência, com filtro de nm (zona de excitação do azul). 3.7 Extração do DNA genômico. A extração do DNA genômico foi realizada seguindo o protocolo descrito por Sambrook et al. (1989). 1. Colocar 400µl de tampão pk e 5µl de proteinase K (20 µg/µl) sobre cada amostra de tecido em um tubo de ependorff. 2. Deixar em banho-maria com agitação com agitação a 42 O C por 24 horas. 3. Adicionar fenol/tris (200 µl) ph=8,0 e agitar o extrato vigorosamente por 20 seg. com posterior agitação lenta por 10 min. 4. Adicionar igual volume de clorofórmio/isoamílico (24:1) seguida pela agitação mencionada anteriormente. 5. Centrifugar a rpm por 3 min. 6. Retirar o sobrenadante e colocar em um novo tubo e acrescentar clorofórmio/isoamílico. Agitar e centrifugar como descrito anteriormente. 7. Retirar o sobrenadante, colocar em um tubo novo e acrescentar o dobro de volume de etanol 100% gelado. 8. Incubar a C por 12 horas. 9. Centrifugar a rpm por 10 min. 10. Descartar o etanol e deixar secar em temperatura ambiente. 11. Ressuspender em 20-50µl de 1/10 de TE + RNAse (2µl de RNAse (10 mg/ml) p/ 1 ml de 1/10 de TE diluído 10x). Deixar em banho-maria 37 0 C por 30 min-1h. 12. Deixar em geladeira até o uso.

22 Material e métodos 14 Antes da amplificação das sondas de DNAr, o DNA genômico extraído foi quantificado utilizando um DNA lambda de peso molecular conhecido. 3.8 Amplificação do DNAr 18S por PCR A sonda 18S foi produzida através de PCR usando DNA genômico de Astyanax scabripinnis e primers específicos (NS1= 5 -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3 e NS8= 5 -TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3 ) para amplificação de genes RNAr 18S. A amplificação de DNA por PCR foi realizada em um termociclador (GeneAmp PCR system 2400, Perkin Elmer) usando-se os procedimentos descritos por White et al. 1990). A mistura para a amplificação segue abaixo: COMPONENTES [ ] INICIAL VOL (µl) [ ] FINAL DNA 100 ng/µl 1 2 ng/µl BUFFER 10X Tampão 15 mm 3,5 1,5 mm MgCl 2 1,5 PRIMERS NS1 NS8 10 ng/µl 10 ng/µl 3 3 0,6 ng/µl 0,6 ng/µl DNTPs 1,2 mm cada 8 0,2 mm cada Taq POLIMERASE 5000 U/ml 1 0,1 U/µl AGUA 29 Volume total 50 µl O programa do termociclador foi o seguinte: (1) 5 min 94ºC (2) 1 min 94ºC (3) 1 min 50ºC (4) 2,5 min 72ºC (5) voltar ao passo (2) 30 vezes (6) 10 min 72ºC (7) 1h 4ºC O produto da amplificação foi analisado pela eletroforese em gel de agarose 0,8 % e detectado pela coloração com brometo de etídio (Figura 3).

23 Organização do DNAr em Astyanax 15 Figura 3. Gel de agarose com os RNAr 18S amplificados por PCR. M = Hind III, os fragmentos de sonda 18S possuem cerca de 1800 pb. 3.9 Amplificação do DNAr 5S por PCR A sonda 5S foi produzida através de PCR usando DNA genômico de Astyanax scabripinnis e primers específicos (A= 5 -TACGCCCGATCTCGTCCGATC-3 e B=5 -CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC-3 ) descritos por Martins e Galetti (1999) para amplificação dos genes RNAr 5S e seus espaçadores (NTS). A amplificação de DNA por PCR foi realizada em um termociclador (GeneAmp PCR system 2400, Perkin Elmer) usando-se os procedimentos descritos por Pendás et. al. (1994), com ligeiras modificações. A mistura para a amplificação segue abaixo:

24 Material e métodos 16 COMPONENTES [ ] INICIAL VOL (µl) [ ] FINAL DNA 5 ng/µl 4 0,4 ng/µl BUFFER 10X Tampão 15 mm 3,5 1,5 mm MgCl 2 1,5 PRIMERS A B 10 ng/µl 10 ng/µl 2,5 2,5 0,5 ng/µl 0,5ng/µl DNTPs 1,2 mm cada 8 0,2 mm cada Taq POLIMERASE 5000 U/ml 1 0,1 U/µl AGUA 27 Volume total 50 µl O programa do termociclador foi o seguinte: (1) 5 min 94ºC (2) 1 min 95ºC (3) 30 seg 63ºC (4) 1 min 72ºC (5) voltar ao passo (2) 30 vezes (6) 7 min 72ºC (7) 1h 4ºC O produto da amplificação foi analisado pela eletroforese em gel de agarose 1,5% e detectado pela coloração com brometo de etídio (Figura 4). Figura 4. Gel de agarose com os RNAr 5S amplificados por PCR. M = Hind III, os fragmentos de sonda 5S possuem cerca de 120 pb.

25 Organização do DNAr em Astyanax Marcação das sondas 18S e 5S As sondas foram marcadas com Biotina-11-dATP por nick translation conforme especificações do Kit Bionick, Labelling System (Gibco BRL). 1. Em um ependorff adicionar: - 5 µl dntp 10X - 5 µl de mix da enzima 10X - * µl (1µg) de DNA da sua amostra - completar até 45 µl com água destilada. * quantos µl que você deve pegar para dar 1 µg de DNA. Ex: sua amostra tem 100 ng/µl você deverá pegar 10 µl de sua amostra. 2. Centrifugar por 5 seg. (14000 rpm). 3. Incube a 16ºC por 1 a 2 horas no termociclador. 4. Precipitar com acetato de sódio 3M 1:10, portanto para 45 µl de solução de reação contendo o DNA colocar 4,5 µl de acetato. etanol. 5. Homogeneizar manualmente para não perder sonda antes de colocar o 6. Adicionar 2 volumes de etanol 100% gelado. 7. Homogeneizar levemente e colocar no gelo. 8. Precipitar em freezer 80ºC por 15 min. ou 20ºC por 2 horas. 9. Centrifugar por 10 min. a rpm. 10. Retirar o sobrenadante e deixar o pellet secar. 11. Adicionar 50µl de TE e deixar na geladeira overnight. 12. Repetir os passos 5 a 10 e depois de algumas horas quantificar, ressuspender em TE e estocar a 20ºC Hibridação in situ por fluorescência (FISH) A hibridação in situ fluorescente (FISH) foi realizada conforme Heslop-Harrison et al. (1991) e Cuadrado e Jouve (1994), com algumas modificações. 1 a ETAPA: Tratamento das lâminas e hibridação in situ 1. Colocar 50µl de RNAse (1:100) em cada lâmina, cobrir com lamínula plástica e levar para a estufa 37ºC por 1 hora. 2. Lavar as lâminas em 2xSSC por 10 minutos a temperatura ambiente no agitador (depois de 1-2 min. retirar as lamínulas que estarão boiando).

26 Material e métodos Descartar o 2xSSC na pia e, na mesma cubeta, colocar o paraformaldeído 4% a temperatura ambiente, por 10 min. no agitador. 4. Descartar o paraformaldeído no vidro de descarte apropriado e colocar novamente 2xSSC, por 10 minutos, no agitador. 5. Descartar o 2xSSC e colocar álcool etílico 70% por 5 minutos, no agitador. 6. Descartar o álcool 70% e colocar 100% por 5 minutos, não precisa agitar. 7. Descartar o álcool 100% e deixar as lâminas secando por 1 a 3 horas. 8. Neste intervalo preparar a mistura de HIBRIDAÇÃO por lâmina: Formamida 100% 15µl Dextran 50% 0,6µl 20xSSC 0,3µl DNA de bloqueio (timo de bezerro ou placenta) 0,1µl SDS 10% 0,1µl Sonda até 0,5µl Água Até completar 30-31µl 9. Desnaturar a mistura de hibridação (HIS) a 70 C por 10 minutos em banhomaria. 10. Incubar no gelo ao menos 5 minutos e no máximo por 2 horas. 11. Colocar 30µl da mistura de HIS por lâmina e cobrir com lamínulas plásticas e levar para o termociclador: 90 C por 10 minutos; 48 C por 10 min.; 38 C - 5 min. e 37 C até infinito. 12. Colocar as lâminas na câmara úmida a 37 C durante a noite. 13. Colocar as soluções de 2xSSC, 0,1xSSC e 4xSSC 0,2% tween no banhomaria a 42ºC, durante a noite. 2 a ETAPA: Banhos pós-hibridização (Sonda DNAr 18S) 1. Tirar as lâminas da estufa, deixando a câmara úmida, e fazer os banhos póshibridação. Preparar a formamida deionizada 20%. 2. Lavar em 2xSSC a 42º C por 5 minutos no agitador e assim que as lamínulas boiarem, retirá-las da cubeta. 3. Descartar 2xSSC na pia e na mesma cubeta colocar formamida 20% a 42º C, por 10 min. no agitador. 4. Descartar a formamida em vidro apropriado e colocar na mesma cubeta 0,1xSSC a 42º C por 5 min., no agitador.

27 Organização do DNAr em Astyanax Descartar o 0,1xSSC na pia e na mesma cubeta colocar o 2xSSC a 42º C por 5 min. no agitador. 6. Descartar o 2xSSC na pia e colocar o 4xSSC 0,2% tween a 42º C por 5 min. no agitador. 7. Descartar o 4xSSC 0,2% tween na pia e colocar o 4xSSC 0,2% tween por 5 min. no agitador, à temperatura ambiente. 2 a ETAPA: Banhos pós-hibridização (Sonda DNAr 5S) 1. Tirar as lâminas da estufa, deixando a câmara úmida lá, e fazer os banhos pós-hibridação. 2. Lavar em 6xSSC a temperatura ambiente por 10 (15) minutos no agitador, assim que as lamínulas boiarem, retirá-las da cubeta. 3. Descartar 6xSSC na pia e na mesma cubeta colocar 6xSSC a temperatura ambiente, por 10 (15) minutos no agitador. 4. Descartar a solução de 6xSSC e colocar na mesma cubeta 6xSSC a 42º C por 3 minutos, sem agitar. 5. Descartar o 6xSSC na pia e na mesma cubeta colocar o 4xSSC/Tween a temperatura ambiente por 5 minu. no agitador (OPTATIVO) 3 a ETAPA: Detecção da hibridação 1. Retirar a lâmina, e bater cuidadosamente no papel de filtro, e com elas ainda molhadas pingar 50 µl de BSA 5% por 5 minutos, e cobrir com lamínulas de plástico. 2. Retirar a lamínula sacolejando a lâmina para baixo, se necessário pode ajudar com a pinça. 3. Colocar a solução de detecção, Avidina-FITC cobrir com lamínula plástica e incubar a 37º C por 1 hora em câmara úmida. 4. Lavar as lâminas em 4xSSC 0,2% tween por 10 minutos à temperatura ambiente no agitador, no escuro. Retirar as lamínulas após alguns minutos. 5. Descartar a solução e repetir a mesma lavagem por mais uma vez. 4 a ETAPA: Coloração 1. Retirada as lâminas do 4xSSC 0,2% tween, bater cuidadosamente no papel de filtro, enxugar em baixo e colocar 25 µl de solução de iodeto de propídio e cobrir com lamínula de vidro. Retirar o excesso entre papel de filtro. 2. As análises serão feitas em microscópio de epifluorescência, com filtro nm (Zona de excitação do azul).

28 Material e métodos Método para localização seqüencial das NORs em lâminas previamente tratadas por FISH Lâminas previamente tratadas por FISH com sondas de DNAr 18S e 5S foram desmontadas, lavadas com jatos de água para retirada do meio de montagem e secadas ao ar. Em seguida foram submetidas ao tratamento para localização das Ag-NORs, como descrito por Howell e Black (1980), metodologia descrita no item Processamento das imagens Os cromossomos metafásicos foram analisados e fotografados em um microscópio de fluorescência Zeiss Axioskop 2 Plus. As imagens foram capturadas através de uma câmera digital acoplada ao microscópio pelo software Axiovision. Os PCRs em gel de agarose foram visualizados e fotografados pelo capturador de imagens Vilber Lourmat. As pranchas finais com cromossomos metafásicos foram montadas com o auxílio do programa Adobe Photoshop CS2 e impressas no laboratório fotográfico Fanny Cine Foto.

29 Referências bibliográficas 21 4 Referências bibliográficas Abilhoa V e Duboc LF (2004) Livro Vermelho da Fauna Ameaçada no Estado do Paraná. Capítulo Peixes Água doce. p Affonso PR e Galetti PM Jr. (2005) Chromosomal diversification of reef fishes from genus Centropyge (Perciformes, Pomacanthidae). Genetica 123 (3): Almeida-Toledo LF, Ozouf-Costaz C, Foresti F, Bonillo C, Porto-Foresti F e Daniel- Silva MFZ (2002) Conservation of the 5S-bearing chromosome pair and colocalization with major rdna clusters in five species of Astyanax (Pisces, Characidae). Cytogenetic. Genome Res. 97 (3-4): Alves AL e Martins-Santos IC (2002) Cytogenetics studies in two populations of Astyanax scabripinnis with 2n = 48 chromosomes (Teleostei, Characidae). Cytologia 67: Amarasinghe V e Carlson JE (1998) Physical mapping and characterization of 5S rrna genes in douglas-fir. Amer. Gen. Assoc. 89: Andrea M (1971) Contribuição ao estudo da biologia e do cariótipo do muçum (Synbranchus marmoratus). Ciência e Cultura 23: Bertollo LAC, Takahashi CS e Moreira-Filho O (1978) Cytotaxonomic considerations on Hoplias lacerdae (Pisces, Erythrinidae). Brazil. J. Genet. 1(2): Böhlke JE, Weitzman SH e Menezes NA (1978) Estado atual da sistemática dos peixes de água doce da América do Sul. Acta Amazon. 8 (4): Born GG e Bertollo LAC (2000) An XX/XY sex chromosome system in a fish species, Hoplias malabaricus with a polymorphic NOR bearing X chromosome. Chrom. Res. 8: Centofante L, Bertollo LAC, Justi AJ e Moreira-Filho O (2003a) Correlation of chromosomal and morphologic characters in two Astyanax species (Teleostei: Characidae). Ichthyol. Explor. Freswaters 14(4): Centofante L, Bertollo LAC, Miyazawa CS e Moreira-Filho O (2003b) Chromosomal differentiation among allopatric populations of Hyphessobrycon anisitsi (Pisces, Tetragonopterinae). Cytologia 68(3): Cuadrado AE e Jouve N (1994) Mapping and organization of highly-repeated DNA sequences by means of simultaneous and sequencial FISH and C-banding in 6Xtricale. Chrom. Res. 2:

30 Organização do DNAr em Astyanax 22 Deiana AM, Cau A, Salvadori S, Coluccia E, Cannas R, Milia A e Tagliavini J (2000) Major and 5S ribosomal sequences of the largemouth bass Micropterus salmoides (Perciformes, Centrarchidae) are localized in GC-rich regions of the genome. Chrom. Res. 8: Denton TE (1973) Fish chromosome methodology. Charles C. Thomas Publisher, Springfield, Illinois. Dover GA (1986) Molecular drive in multigene families: how biological novelties arise, spread and are assimilated. Trends Genet. 2: Fauaz G, Vicente VE e Moreira-Filho O (1994) Natural triploidy and B chromosomes in the neotropical fish genus Astyanax (Characidae). Braz. J. Genetics 17 (2): Fenocchio AS, Swarça AC, Cestari MM e Dias AL (2003) Karyotypic characterization and NOR analysis by different banding techniques of Rhamdia quelen (Pisces, Pimelodidae) from the first plateau of the Iguaçu river (Brazil). Folia Biologica (Kraków) 51(3-4) Fernandes CA e Martins-Santos IC (2004) Cytogenetic studies in two populations of the Astyanax altiparanae (Pisces, Characiformes). Hereditas 141 (3): Fernandes CA e Martins-Santos IC (2005) Sympatric occurrence of three cytotypes and four morphological types of B chromosomes of Astyanax scabripinnis (Pisces, Characiformes) in the River Ivaí Basin, state of Paraná, Brazil. Genetica 124: Ferro DAM, Néo DM, Moreira-Filho O e Bertollo LAC (2001) Nucleolar organizing regions, 18S and 5S rdna in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): populations distribution and functional diversity. Genetica 110: Ferro DAM, Moreira-Filho O e Bertollo LAC (2003) B chromosome polymorphism in the fish, Astyanax scabripinnis. Genetica 119: Fischer C, Ozouf-Costaz C, Crollius HR, Dasilva C, Jaillon O, Bouneau L, Bonillo C, Weissenbach J e Bernot A (2000) Karyotype and chromosomal location of characteristic tandem repeats in the pufferfish Tetraodon nigroviridis. Cytogenet. Cell Genet. 88: Fontana F, Tagliavini J, Congiu L, Lanfredi M, Chicca M, Laurente C e Rossi R (1998) Karyotypic characterization of the great sturgeon, Huso huso, by multiple staining techniques and fluorescent in situ hybridization. Marine Biol. 132:

31 Referências bibliográficas 23 Fontana F, Lanfredi M, Chicca M, Congiu L, Tagliavini J e Rossi R (1999) Fluorescent in situ hybridization with rdna probes on chromosomes of Acipenser ruthenus and Acipenser naccarii (Osteichthyes, Acipenserifomes). Genome 42: Fontana F, Lanfredi M, Congiu L, Leis M, Chicca M e Rossi R (2003) Chromosomal mapping of 18S-28S and 5S rrna genes by two-colour fluorescent in situ hybridization in six sturgeon species. Genome 46 (3): Fujiwara A, Abe S, Yamaha E, Yamazaki F e Yoshida MC (1998) Chromosomal localization and heterochromatin association of ribosomal RNA genes loci and silver stained nucleolar organizer regions in salmonid fishes. Chrom. Res. 6: Garutti V e Britski HA (1997) Descrição de uma espécie nova de Astyanax (Teleostei, Characidae) com mancha umeral horizontalmente ovalada, da bacia do rio Guapore, Amazonia. Pap. Avul. Depto. Zool. 40: Hatanaka T e Galetti PM Jr. (2004) Mapping of the 18 S and 5 S ribosomal RNA genes in the fish Prochilodus argenteus Agassiz, 1829 (Characiformes, Prochilodontidae) Genetica 122: Heslop-Harrison JS, Schwarzacher T, Anamthaw-Jónsson K, Leitch AR, Schi M e Leitch IJ (1991) In situ hybridization with automated chromosome denaturation technique. J. Meth Cell Mol. Biol. 3: Howell WM e Black DA (1980) Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: as 1-step method. Experientia 36: Inafuku J, Nabeyama M, Kikuma Y, Saitoh J, Kibota S e Kohno S (2000) Chromosomal location and nucleotide sequences of 5S ribosomal DNA of two cyprinid species (Osteichthyes, Pisces). Chrom. Res. 8: Jesus CM e Moreira-Filho O (2003) Chromosomal location of 5S and 18S rrna genes in Prochilodus lineatus (Characiformes, Prochilodontidae). Caryologia 56(3): Kavalco KF, Pazza R, Bertollo LAC e Moreira-Filho O (2004) Gene mapping of 5S rdna sites in eight fish species from the Paraíba do Sul river basin, Brazil. Cytogenetic. Genome Res. 106: Kavalco KF, Pazza R, Bertollo LAC e Moreira-Filho O (2005) Molecular cytogenetics of Oligosarcus hepsetus (Teleostei, Characiformes) from two Brazilian locations. Genetica 124(1):85-91.

32 Organização do DNAr em Astyanax 24 Kikuma Y, Inafuku J, Kubota S e Kohno S (2000) Banding karyotype and 5S ribosomal DNA loci in the Japanese bitterling, Rhodeus ocellatus (Cyprinidae). Chrom. Sci. 3: King M (1991) The evolution of the heterochromatin in the amphibian genome. In: D.M. Green and S.K. Amphibian Cytog. and Evol. Sessions eds., p , Academic Press, San Diego. Levan A, Fredga K e Sandberg AA (1964) Nomenclature for centromeric position on chromosomes. Hereditas 52: Long EO e Dawid ID (1980) Repeated genes in eukaryotes. Ann. Rev. Biochem. 49: Maistro EL, Foresti F, Oliveira C e Almeida-Toledo LF (1992) Occurrence of macro B chromosome in Astyanax scabripinnis paranae (Pisces, Characiformes, Characidae). Genetica 87: Maistro EL, Dias AL, Foresti F, Oliveira C e Moreira-Filho O (1994) Natural triploidy in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae) and simultaneous occurrence of macro B chromosomes. Caryologia 47(3-4): Maistro EL, Foresti F, Oliveira C e Almeida-Toledo LF (2000) Sympatric occurrence of two cytotypes of Astyanax scabripinnis paranae (Characiformes, Characidae). Genet. Mol. Biol. 23: Mandrioli M, Colomba MS e Vitturi R (2000) Chromosomal analysis of repeated DNAs in the rainbow wrasse Coris julis (Pisces, Labridae). Genetica 108: Mandrioli M e Manicardi, GC (2001) Cytogenetics and molecular analysis of the pufferfish Tetraodon fluviatilis (Osteichthyes). Genetica 111: Mantovani M, Abel LDS e Moreira-Filho O (2005) Conserved 5S and variable 45S rdna chromosomal localisation revealed by FISH in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae). Genetica 123: Martinez JL, Moran P, Garcia-Vasquez E e Pendas AM (1996) Chromosomal localization of the major and 5s rrna genes in the European eel (Anguilla anguilla). Cytogenet. Cell Genet. 73: Martins C e Galetti PM Jr. (1999) Chromosomal localization of 5S rdna genes in Leporinus fish (Anostomidae, Characiformes). Chrom. Res. 7: Martins C, Wasko AP, Oliveira C e Wright JM (2000) Nucleotide sequence of 5s rdna and localization of the ribosomal RNA genes to metaphase chromosomes of the Tilapiine cichlid fish, Oreochromis niloticus. Hereditas 133:

33 Referências bibliográficas 25 Martins C e Galetti PM Jr. (2001) Two 5S rdna arrays in Neotropical fish species: Is it a rule for fishes? Genetica 111: Mayr B, Kalat M e Rab P (1986) Localization of NORs and counter-stain-enhanced fluorescence studies in Salmo gairdneri and Salmo trutta. The or. Appl. Genet., 71: Melo FAG (2001) Revisão taxonômica das espécies do gênero Astyanax Baird e Girard, 1854 (Teleostei, Characiformes, Characidae) da região da Serra dos Órgãos. Arq. Mus. Nac. Rio de Janeiro. 59:1-46. Miller DA, Dev VG, Tantravashi R e Miller OJ (1976) Supression of human nucleolus organizer activity in mouse-human somatic hybrid cells. Expl. Cell Res., 101: Mizoguchi SMHN e Martins-Santos IC (1997) Macro- and microchromosomes B in females of Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae). Hereditas 127: Molina, WF e Galetti Jr. PM (2002) Robertsonian rearrangements in the reef fish Chromis (Perciformes, Pomacentridae) involving chromosomes bearing 5S rrna genes. Genet. Mol. Biol. 25: Moran P, Martinez JL, Garcia-Vasquez E e Pendas AM (1996) Sex linkage of 5s rdna in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cytogenet. Cell Genet. 75: Moreira-Filho O e Bertollo LAC (1991) Astyanax scabripinnis (Pisces;Characidae): a species complex. Brazil. J. Genet. 14: Moreira-Filho O, Fenocchio AS, Pastori MC e Bertollo LAC (2001) Occurrence of a metacentric macrochromosome B in different species of the genus Astyanax (Pisces, Characidae, Tetragonopterinae). Cytologia 66: Morelli S, Bertollo LAC e Moreira Filho O (1983) Citogenetics Considerations on the genus Astyanax (Pisces, Characidae). II. Occurrence of the natural triploidy. Caryologia 36 (3): Murakami M e Fujitani H (1998) Characterization of repetitive DNA sequences carrying 5S rdna of the triploid ginbuna (Japanese silver crucian carp, Carassius auratus langsdorfi). Genes Genet. Syst. 73: Néo DM, Bertollo LAC e Moreira-Filho O (2000) Morphological differentiation and possible origin of B chromosomes in natural Brazilian population of Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae). Genetica 108: Nieddu M, Pichiri G, Coni P, Salvadori S, Deiana AM e Mezzanotte R (1998) A comparative analysis of European and American eel (Anguilla anguilla and Anguilla

34 Organização do DNAr em Astyanax 26 rostrata) genomic DNA: 5S rdna polymorphism permits the distinction between the two populations. Genome 41: Oliveira C, Almeida-Toledo LF, Foresti F, Britski HA e Toledo-Filho AS (1988) Chromosome formulae of Newotropical freshwater fishes. Rev. Bras. Genét. 11: Oliveira C, Almeida-Toledo LF e Foresti F (2000) Revisão dos estudos citogenéticos em peixes neotropicais de águas continentais. In: VIII Simpósio de Citogenética e Genética de Peixes, 2000, Manaus, Resumos. Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia. p. 24. Paintner-Marques TR, Giuliano-Caetano L e Dias AL (2002) Multiple NORs in Bryconamericus aff. exodon (Osteichthyes, Characidae, Tetragonopterinae). Hereditas 137: Paintner-Marques TR, Giuliano-Caetano L e Dias AL (2003) Cytogenetic characterization of a population of Bryconamericus aff. Iheringii (Characidae, Tetragonopterinae). Genet. Mol. Biol. 26 (2): Pendás AM, Móran P, Freije JP e Garcia-Vásquez E (1994) Chromosomal location and nucleotide sequence of two tandem repeats of the Atlantic salmon 5S rdna. Cytogenet. Cell Genet. 67: Philips RB e Reed KM (2000) Localization of repetitive DNAs to zebrafish (Danio rerio) chromosomes by fluorescence in situ hybridization (FISH). Chrom. Res. 8: Rocon-Stange EA e Almeida-Toledo LF (1993) Supernumerary B chromosome restricted to males in Astyanax scabripinnis (Pisces, characidae). Brazil. J. Genet. 16: Sajdak SL, Reed KM e Phillips RB (1998) Intraindividual and interspecies variation in the 5S rdna of coregonid fish. J. Mol. Evol. 46: Salvador LB e Moreira-Filho O (1992) B chromosome in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae). Heredity 69: Sambrook J, Fritsch EE e ManiatisT (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. 2 ed. CHS Press: Cold Spring Harbor. Schaefer SA (1998) Conflict and resolution: impact of new taxa on phylogenetic studies of the Neotropical cascudinhos (Siluroidei: Loricariidae). In: Malabarba, L.R.; Reis, R.; Vari, R. P., Lucena, Z. M. S., Lucena, C. A. Phylogeny and Classification of Neotropical Fishes, Porto Alegre, EDIPUCRS.

35 Referências bibliográficas 27 Schmid M (1980) Chromosome banding in Amphibian. IV. Differentiation of GC- and AT-rich chromosome region in Anura. Chromosoma 77: Schmid M e Guttenbach M (1988) Evolutionary diversity of reverse (R) fluorescent chromosome bands in vertebrates. Chromosoma 97: Schweizer D (1980) Simultaneous fluorescent staining of R bands and specific heterochromatin regions (DA-DAPI bands) in human chromosomes Citog. Cell Genet. 27 : ,. Schweizer D e Loidl J (1987) A model for heterochromatin dispersion and the evolution of C-band pattern. In : Chromosome Today. 1 st ed. Vol. 9. (Eds: Stahl, A., Luciani, J.M., Vagner-Capodano, A.M.) Allen e Unwin, Sola L, De Innocentiis S, Gornung E, Papalia S, Rossi AR, Marino G, De Marco P e Cataudella S (2000) Cytogenetic analisis of Epinephelus marginatus (Pisces: Serranidae), with the chromosome localization of the 18S and 5S rrna genes and of the (TTAGGG)n telomeric sequence. Marine Biol. 137: Souza IL, Moreira-Filho O e Bertollo LAC (1995) Cytogenetic diversity in the Astyanax scabripinnis species complex (Pisces, Characidae). II Different cytotypes living in sympatry. Cytologia 60: Souza IL, Galian J, De La Ru a P, Bertollo LAC e Moreira-Filho O (2001) Non-radom distribuition of the GC-rich heterochromatin and nucleolar rdna sites on Astyanax scabripinnis chromosomes. Cytologia 66: Sumner AT (1972) A simple technique for demonstrating centromeric heterocromatin. Exp. Cell Res. 75: Swarça AC, Giuliano-Caetano L, Vanzela ALL e Dias AL (2001) Heteromorphism of rdna size in Pinirampus pirinampu (Pisces, Pimelodidae) detected by in situ hybridization. Cytologia 66: Tagliavini J, Williot P, Congiu L, Chicca M, Lanfredi M, Rossi R e Fontana F (1999) Molecular cytogenetic analysis of the karyotype of the European Atlantic sturgeon, Acipenser sturio. Heredity 83: Torres RA, Ganal M e Hemleben V (1990) GC balance in the internal transcibed spacer ITS1 and ITS2 of nuclear ribossomal RNA genes. J. Mol. Evol. 30: Vari RP e Malabarba LR (1998) Neotropical Ichthyology: An Overview. In: Malabarba, L.R.; Reis, R.; Vari, R. P., Lucena, Z. M. S., Lucena, C. A. Phylogeny and Classification of Neotropical Fishes, Porto Alegre, EDIPUCRS. p

36 Organização do DNAr em Astyanax 28 Vicente VE, Jesus CM e Moreira-Filho O (2001) Chromosomal localization of 5S and 18S rrna genes in three Parodon species (Pisces, Parodontidae). Caryologia 54(4): Wasko AP, Martins C, Wright JM e Galetti PM Jr. (2001) Molecular organization of 5S rdna in fishes of the genus Brycon. Genome 44: White TJ, Bruns T, Lee S e Taylor J (1990) Ampli.cation and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications. Academic Press Inc., pp

37 Artigos 29 5 Artigos 5.1 Capítulo I Mapeamento dos genes RNA ribossomais 18S e 5S em Astyanax altiparanae Garutti & Britski, 2000 (Teleostei, Characidae) da bacia do alto rio Paraná Fernandes CA and Martins-Santos IC (aceito para publicação) Mapping of the 18S and 5S ribosomal RNA genes in Astyanax altiparanae Garutti & Britski, 2000 (Teleostei, Characidae) from the upper Paraná river basin. Genetics and Molecular Biology.

38 Organização do DNAr em Astyanax 30 Resumo A hibridação fluorescente in situ (FISH) foi realizada a fim de determinar o padrão de distribuição cromossômica dos DNAs ribossomais (DNAr) 18S e 5S em quatro populações do peixe caracídeo Astyanax altiparanae da bacia do alto rio Paraná. A FISH com sonda de DNAr 18S revelou variações numéricas e posicionais entre os espécimes do córrego Keçaba comparados aos espécimes das outras populações. Em contraste a variabilidade detectada em relação ao padrão de distribuição do DNAr 18S, um posicionamento cromossômico altamente estável dos sítios de DNAr 5S foi observado nas quatro populações de A. altiparanae. Divergências entre o padrão de distribuição dos sítios de DNAr 18S e 5S são discutidos.

39 Capítulo I 31 Abstract Fluorescence in situ hybridization (FISH) was undertaken in order to determinate the chromosomal distribution pattern of 18S and 5S ribosomal DNAs (rdna) in four populations of the characid fish Astyanax altiparanae from the upper Paraná river basin. The FISH with 18S rdna probe revealed numerical and positional variations among specimens from Keçaba stream compared to specimens of the other populations. In contrast to the detected variability regarding to 18S rdna distribution pattern, a highly stable chromosomal positioning of the 5S rdna sites was observed in the four A. altiparanae populations. Divergences among distribution pattern of sites 18S and 5S rdna are discussed. Key words: Astyanax altiparanae, Fluorescence in situ hybridization (FISH), 18S rdna, 5S rdna, Sequential Ag-NOR Running title: 18S and 5S rdna in Astyanax altiparanae

40 Organização do DNAr em Astyanax 32 Introdução Em peixes, as regiões organizadoras de nucléolo (NORs) têm sido extensivamente analisadas por coloração de nitrato de prata (Ag-NOR) devido a simplicidade desta técnica. Segundo Miller et al. (1976) esta metodologia detecta somente as regiões nucleolares que foram ativas na intérfase precedente, sendo mais apropriada para estudos de expressão da NOR. As NORs têm sido melhor caracterizadas pela hibridação fluorescente in situ (FISH) por determinar a posição do DNA ribossomal (DNAr) independentemente de sua atividade. Esta metodologia quase sempre permite detectar um maior número de NORs do que pelo bandeamento Ag- NOR, demonstrando ser mais precisa para identificação da NOR. O DNAr é organizado em eucariotos superiores dentro de duas distintas classes gênicas: a classe maior (DNAr 45S) que transcreve os RNA ribossomais (RNAr) 18S, 5.8S, e 28S e a classe menor (DNAr 5S) que transcreve o RNAr 5S. Sítios ativos de DNAr 45S correspondem as NORs nos cromossomos, enquanto DNAr 5S não estão presentes na NOR. Em Astyanax altiparanae (Garutti e Britski, 2000), previamente identificados como Astyanax bimaculatus para o alto rio Paraná, estudos citogenéticos em diferentes populações têm mostrado número diplóide constante de 2n = 50 cromossomos, embora com diferenças na sua fórmula cariotípica e também em relação ao número e posição das NORs (Daniel-Silva e Almeida-Toledo, 2001; Pacheco et al., 2001; Fernandes e Martins-Santos, 2004). Múltiplas Ag-NORs têm sido uma característica comum em A. altiparanae, chegando a alcançar até 10 cromossomos portadores da NOR para um espécime do rio dos Índios (Fernandes e Martins-Santos, 2004). No presente estudo, a FISH foi usada com o objetivo de determinar a posição cromossômica dos sítios de DNAr 18S e 5S em quatro populações de A. altiparanae, a fim de contribuir para um melhor entendimento da organização do genoma desta espécie. Material e métodos Trinta e um espécimes de A. altiparanae foram coletados na bacia do alto rio Paraná, sendo 9 no rio principal, 10 no córrego Tatupeba, 4 no córrego Keçaba e 8 no ribeirão Maringá. Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de células do rim seguindo a metodologia descrita por Bertollo et al. (1978). Os cistrons ribossomais foram detectados pela técnica de FISH, usando sondas de DNAr 18S e 5S, seguindo o procedimento descrito por Pinkel et al. (1986), com ligeiras modificações. As sondas

41 Capítulo I 33 18S e 5S foram obtidas por PCR de Astyanax scabripinnis usando primers NS1 (5 - GTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ) e NS8 (5 -TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3 ), segundo White (1990), e primers A (5 -TACGCCCGATCTCGTCCGATC-3 ) e B (5 - CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC-3 ), segundo Martins e Galetti (1999), respectivamente. A coloração seqüencial com nitrato de prata (Ag-) (Howell e Black, 1980) foi realizada após lavagem da lâmina de FISH na água da torneira. Ao menos 20 metáfases por indivíduo foram examinadas em um microscópio de fluorescência Zeiss Axioskop 2 Plus. As imagens foram capturadas através de uma câmera digital acoplada ao microscópio pelo software Axiovision e as pranchas finais com cromossomos metafásicos foram montadas com o auxílio do programa Adobe Photoshop CS2 e impressas no laboratório fotográfico Fanny Cine Foto. Resultados e discussão As quatro populações revelaram uma constituição macrocariotípica monomórfica, com 2n = 50 cromossomos (6M, 26SM, 6ST e 12A). Assim, os espécimes de A. altiparanae dos córregos Keçaba, Tatupeba e ribeirão Maringá apresentaram idêntica fórmula cariotípica dos espécimes de A. altiparanae do rio Paraná, previamente estudados por Fernandes e Martins-Santos (2004). A 18S-FISH revelou sinais fluorescentes espalhados sobre a região telomérica de 7 cromossomos (no braço curto de 2A e em 5 outros cromossomos) para os espécimes do córrego Keçaba e na região telomérica de 4 cromossomos (no braço curto de 2A e em 2 outros cromossomos) para os espécimes do rio Paraná, ribeirão Maringá e córrego Tatupeba (Figura 1). Almeida-Toledo et al. (2002) também relataram 4 cromossomos marcados (2A e 2M) com sonda de DNAr 28S em espécimes de A. altiparanae, sendo que nos 2 cromossomos metacêntricos as marcações foram pericentroméricas. A mesma posição cromossômica do DNAr 45S (18S ou 28S) no braço curto de 2 cromossomos acrocêntricos de A. altiparanae verificada no presente estudo e no rio Mogi-Guaçu (Almeida-Toledo et al., 2002) indicam um cromossomo marcador para esta espécie. Por outro lado, os outros sítios parecem não ter nenhum grau de conservação entre as populações de A. altiparanae, os quais diferem na posição (telomérica ou pericentromérica) e nos tipos de cromossomos. As variações numéricas e posicionais dos sítios de DNAr 18S nos espécimes de A. altiparanae do córrego Keçaba em comparação com as demais populações aqui analisadas, também têm sido relatadas em outras espécies, incluindo A. scabripinnis

42 Organização do DNAr em Astyanax 34 (Ferro et al., 2001; Souza et al., 2001; Mantovani et al., 2005; Fernandes e Martins- Santos, em preparação) e Prochilodus lineatus (Jesus e Moreira-Filho, 2003). Segundo Schweizer e Loidl (1987), a proximidade das regiões teloméricas dentro do núcleo interfásico facilitaria transferência de material genético, de acordo ao modelo de Rabl s. Em distintas populações de A. scabripinnis este modelo é sugerido para explicar a dispersão da heterocromatina em regiões teloméricas (Souza et al., 1996; Mantovani et al., 2000; Fernandes e Martins-Santos, 2003). Portanto, a posição telomérica dos sítios de DNAr 18S nas quatro populações de A. altiparanae facilitaria eventos de transferência, os quais parecem ter ocorrido no caso dos exemplares do córrego Keçaba. Figura 1 Metáfases de FISH em Astyanax altiparanae, evidenciando a posição cromossômica dos sítios de DNAr 18S nas populações do córrego Keçaba (a), rio Paraná (b), córrego Tatupeba (c), ribeirão Maringá (d). As setas indicam os cromossomos portadores dos cistrons ribossomais. As cabeças de seta indicam cistrons ribossomais no braço curto de 2 cromossomos acrocêntricos para as quatro populações. A coloração seqüencial da lâmina de 18S-FISH de um espécime do córrego Tatupeba revelou que dentre os 4 cromossomos marcados, 3 foram Ag-NOR + (Figura

43 Capítulo I 35 3a, b). Nem todos os cistrons de DNAr existentes são ativos no sistema de NOR múltipla (Paintner-Marques et al., 2002), portanto esta variação observada no presente estudo e descrita também em outros trabalhos, provavelmente ocorreu como resultado da regulação da atividade gênica. Além disso, o heteromorfismo de tamanho da NOR entre os cromossomos homólogos revelado por 18S-FISH e seqüencial Ag-NOR no braço curto de 2 cromossomos acrocêntricos (Figura 3a, b) sugerem variação no número de copias deste DNAr entre os cromossomos homólogos. Este heteromorfismo de tamanho da NOR pode ter ocorrido por meio de eventos de transposição ou crossingover desigual e não devido a expressão diferencial da NOR. Em contraste a variabilidade detectada em relação ao padrão de distribuição do DNAr 18S, uma posição cromossômica altamente conservada dos sítios de DNAr 5S foi observada nas quatro populações de A. altiparanae. A 5S-FISH revelou sinais brilhantes fluorescentes espalhados sobre regiões intersticiais de um único par cromossômico, provavelmente um cromossomo submetacêntrico (Figura 2). Considerando que no presente estudo as seqüências de DNAr 5S não estão localizadas em regiões terminais dos cromossomos, os eventos que dispersaram o DNAr 18S não poderia estar agindo sobre os sítios de DNAr 5S. Além disso, a posição intersticial do DNAr 5S tem sido encontrada na maioria das espécies de várias ordens. Por esta razão, a posição cromossômica altamente conservada dos sítios de DNAr 5S nas quatro populações de A. altiparanae pode ter derivado da localização intersticial destes sítios nos cromossomos. Os genes DNAr 5S situados em um par cromossômico têm sido identificados em A. altiparanae e A. lacustris (Almeida-Toledo et al., 2002) e outras espécies, incluindo o Atlantic salmon (Pendás et al. 1994), Anguilla anguilla (Martinez et al. 1996), Prochilodus lineatus (Jesus e Moreira-Filho, 2003), Neoplecostomus microps e Harttia loricariformis (Kavalco et al. 2004), possivelmente correspondendo a uma condição ancestral em peixes.

44 Organização do DNAr em Astyanax 36 Figura 2 Metáfases de FISH em Astyanax altiparanae, evidenciando a posição cromossômica dos sítios de DNAr 5S nas populações do ribeirão Maringá (a), rio Paraná (b), córrego Keçaba (c), córrego Tatupeba (d). As setas indicam os cromossomos portadores dos cistrons ribossomais. A coloração seqüencial das lâminas de 5S-FISH nos espécimes de A. altiparanae do ribeirão Maringá (Figura 3c, d) e córrego Keçaba (Figura 3e, f) revelaram que os DNAr 5S não estão localizados nos mesmos cromossomos Ag-NORs. Portanto, investigações utilizando duplo FISH com duas sondas DNAr deverão ser realizadas a fim de comprovar a posição cromossômica diferente do DNAr 18S e 5S nestes espécimes. Diferentes sítios cromossômicos para NOR e 5S também têm sido relatados para Anguilla anguilla (Martinez et al. 1996), Salmo trutta (Moran et al. 1996), Leporinus elongatus, Leporinus obtusidens e Leporinus friderici (Martins e Galetti 1999), Oreochromis niloticus (Martins et. al. 2000) e A. scabripinnis (Fernandes e Martins-Santos, em preparação). Segundo vários autores (Lucchini et al., 1993; Suzuki et al., 1996), este é um arranjo freqüentemente observado em vertebrados. Entretanto, Almeida-Toledo et al. (2002) detectaram sinais in situ para o DNAr maior (DNAr 28S) co-localizado com clusters de DNAr 5S na região pericentromérica de um

45 Capítulo I 37 cromossomo marcador em cinco espécies do gênero Astyanax. Mantovani et al. (2005) também revelaram que os loci de DNAr 45S e 5S foram sintênicos em um cromossomo de A. scabripinnis através de duplo FISH. Figura 3 Coloração seqüencial das lâminas de 18S-FISH e AgNO 3 (a, b) e 5S-FISH e AgNO 3 (c-f). Espécimes do córrego Tatupeba (a, b), ribeirão Maringá (c, d) e córrego Keçaba (e, f). Note que o loci de DNAr 5S não estão nos cromossomos AgNO 3 +. Há ainda poucos estudos usando FISH no gênero Astyanax, sendo a maioria limitada a A. scabripinnis (Souza et al., 2001; Ferro et al., 2001; Mantovani et al., 2005; Fernandes e Martins-Santos, em preparação). Em A. altiparanae, somente uma população do rio Mogi-Guaçu (Almeida-Toledo et al., 2002) e as populações analisadas

46 Organização do DNAr em Astyanax 38 foram relatadas utilizando a técnica de FISH com sondas de DNAr. Estes resultados têm sido importantes para melhor caracterizar a posição cromossômica do DNAr 5S e 28S ou 18S, ajudando em estudo citotaxonômicos de espécies relacionadas. Agradecimentos Os autores agradecem a CAPES pelo seu suporte financeiro. Referências Almeida-Toledo LF, Ozouf-Costaz C, Foresti F, Bonillo C, Porto-Foresti F e Daniel- Silva MFZ (2002) Conservation of the 5S-bearing chromosome pair and colocalization with major rdna clusters in five species of Astyanax (Pisces, Characidae). Cytogenetic. Genome Res. 97 (3-4): Bertollo LAC, Takahashi CS e Moreira-Filho O (1978) Cytotaxonomic considerations on Hoplias lacerdae (Pisces, Erythrinidae). Brazil. J. Genet. 1(2): Daniel-Silva MFZ e Almeida-Toledo LF (2001) Chromosome R-banding pattern and conservation of a marker chromosome in four species, genus Astyanax (Characidae, Tetragonopterinae). Caryologia 54(3): Fernandes CA e Martins-Santos IC (2003) Cytogenetic characterization of two populations of Astyanax scabripinnis (Pisces, Characiformes) of the Ivaí Basin PR Brazil. Cytologia 68 (3) Fernandes CA e Martins-Santos IC (2004) Cytogenetic studies in two populations of the Astyanax altiparanae (Pisces, Characiformes). Hereditas 141 (3): Ferro DAM, Néo DM, Moreira-Filho O e Bertollo LAC (2001) Nucleolar organizing regions, 18S and 5S rdna in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): populations distribution and functional diversity. Genetica 110: Garutti V e Britski HA (2000) Descrição de espécie nova de Astyanax (Teleostei: Characidae) da bacia do alto rio Paraná e considerações sobre as demais espécies do gênero na bacia. Comn. Mus. Ciênc. Tecnol. 13: Howell WM e Black DA (1980) Controlled silver staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: as 1-step method. Experientia 36: Jesus CM e Moreira-Filho O (2003) Chromosomal location of 5S and 18S rrna genes in Prochilodus lineatus (Characiformes, Prochilodontidae). Caryologia 56(3):

47 Capítulo I 39 Kavalco KF, Pazza R, Bertollo LAC e Moreira-Filho O (2004) Gene mapping of 5S rdna sites in eight fish species from the Paraíba do Sul river basin, Brazil. Cytogenetic. Genome Res. 106: Lucchini S, Nardi I, Barsacchi G, Batistoni R e Andronico F (1993) Molecular cytogenetics of the ribosomal (18S + 28S and 5S) DNA loci in primitive and advanced urodele amphibians. Genome 36: Mantovani M, Abel LDS, Mestriner CA e Moreira-Filho O (2000) Accentuated polymorphism of heterochromatin and nucleolar organizer regions in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): tools for understanding Karyotypic evolution. Genetica 109: Mantovani M, Abel LDS e Moreira-Filho O (2005) Conserved 5S and variable 45S rdna chromosomal localisation revealed by FISH in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae). Genetica 123: Martinez JL, Moran P, Garcia-Vasquez E e Pendas AM (1996) Chromosomal localization of the major and 5s rrna genes in the European eel (Anguilla anguilla). Cytogenet. Cell Genet. 73: Martins C e Galetti Jr. PM (1999) Chromosomal localization of 5S rdna genes in Leporinus fish (Anostomidae, Characiformes). Chrom. Res. 7: Martins C, Wasko AP, Oliveira C e Wright JM (2000) Nucleotide sequence of 5s rdna and localization of the ribosomal RNA genes to metaphase chromosomes of the Tilapiine cichlid fish, Oreochromis niloticus. Hereditas 133: Miller DA, Dev VG, Tantravashi R e Miller OJ (1976) Supression of human nucleolus organizer activity in mouse-human somatic hybrid cells. Expl. Cell Res., 101: Moran P, Martinez JL, Garcia-Vasquez E e Pendas AM (1996) Sex linkage of 5s rdna in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cytogenet. Cell Genet. 75: Pacheco RB, Giuliano-Caetano L e Dias AL (2001) Cytotypes and Multiple NORs in an Astyanax altiparanae population (Pisces, Tetragonopterinae). Chromosome Science 5: Paintner-Marques TR, Giuliano-Caetano L e Dias AL (2002) Multiple NORs in Bryconamericus aff. exodon (Osteichthyes, Characidae, Tetragonopterinae). Hereditas 137:

48 Organização do DNAr em Astyanax 40 Pendás AM, Móran P, Freije JP e Garcia-Vásquez E (1994) Chromosomal location and nucleotide sequence of two tandem repeats of the Atlantic salmon 5S rdna. Cytogenet. Cell Genet. 67: Pinkel D, Straume T e Gray JW (1986) Cytogenetic analysis using quantitative, highsensitivity, fluorescence hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: Schweizer D e Loidl J (1987) A model for heterochromatin dispersion and the evolution of C-band pattern. In : Chromosome Today. 1 st ed. Vol. 9. (Eds: Stahl, A., Luciani, J.M., Vagner-Capodano, A.M.) Allen & Unwin, Souza IL, Moreira-Filho O e Galetti Jr. PM (1996) Heterochromatin differentiation in the characid fish Astyanax scabripinnis. Brazil. J. Genet., 19(3): Souza IL, Galian J, De La Ru a P, Bertollo LAC e Moreira-Filho O (2001) Non-random distribution of the GC-rich heterochromatin and nucleolar rdna sites on Astyanax scabripinnis chromosomes. Cytologia 66: Suzuki H, Sakurai S e Matsuda Y (1996). Rat rdna spacer sequences and chromosomal assignment of the genes to the extreme terminal region of chromosome 19. Cytogenet. Cell Genet. 72: 1 4. Wasko AP, Martins C, Wright JM e Galetti Jr. PM (2001) Molecular organization of 5S rdna in fishes of the genus Brycon. Genome 44: White TJ, Bruns T, Lee S e Taylor J (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. in PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications. Academic Press Inc., pp

49 Organização do DNAr em Astyanax Capítulo II Localização cromossômica dos genes RNAr 18S e 5S em três citótipos simpátricos de Astyanax scabripinnis (Characiformes, Characidae) da bacia do rio Ivaí, Estado do Paraná, Brasil Fernandes CA and Martins-Santos (enviado para publicação). - Chromosomal location of 5S and 18S rrna genes in three sympatric cytotypes of Astyanax scabripinnis (Characiformes, Characidae) from the Ivaí river basin, state of Paraná, Brazil. Caryologia.

50 Capítulo II 42 Resumo Análises da distribuição dos genes DNAr (18S e 5S) usando técnicas clássicas, tais como coloração por prata, CMA3 e FISH foram realizadas em espécimes de Astyanax scabripinnis do córrego Tatupeba (bacia do rio Ivaí). Os três citótipos identificados para esta população apresentaram sistema de NOR múltipla, com variações numéricas e posicionais detectadas por Ag-NOR, CMA 3 e 18S-FISH. Em contraste, os dados obtidos do DNAr 5S revelaram um padrão de distribuição altamente conservado em cada citótipo. Aspectos em relação ao padrão de distribuição dos sítios de DNAr 18S e 5S são discutidos.

51 Organização do DNAr em Astyanax 43 Abstract Analyses of the distribution of rdna genes (both 18S and 5S) using classical techniques, such as silver and CMA 3 staining and FISH were carried out in specimens of Astyanax scabripinnis from Tatupeba stream (Ivaí river basin). The three cytotypes identified for this population presented multiple NOR system, with intra-populational numerical and positional variations, detected for Ag-NOR, CMA 3 and 18S-FISH. In contrast, data obtained from rdna-5s revealed a highly conserved chromosomal distribution pattern in each cytotype. Aspects on divergences among distribution pattern of sites 18S and 5S rdna are discussed. Key words: Astyanax scabripinnis, Fluorescence in situ hybridization (FISH), ribosomal DNAs, sympatric cytotypes, Characidae Running title: 18S and 5S rdna in A. scabripinnis

52 Capítulo II 44 Introdução Embora estudos sobre as regiões organizadoras de nucléolo (NORs) tenham sido realizados mais freqüentemente por coloração com nitrato de prata (Ag-NOR), esta metodologia é mais apropriada para estudos de expressão da NOR. Verdadeiramente, esta detecta somente as regiões nucleolares transcricionalmente ativas na intérfase anterior (Miller et al., 1976; Howell e Black, 1980). Um relacionamento próximo entre sítios Ag-NOR e bandas CMA 3 (fluorocromo GC-específico) positivas tem sido documentado em peixes (Amemiya e Gold, 1986; Mayr et al., 1986), embora CMA 3 possa também revelar outras regiões cromossômicas com alto conteúdo GC (Mayr et al., 1986; Schmid e Guttenbach, 1988). Recentemente a fluorescente hibridação in situ (FISH) tem sido empregada para o mapeamento das NORs através de sondas ribossomais. O DNA ribossomal (DNAr) é organizado em eucariotos superiores dentro de duas distintas classes gênicas: a classe maior (DNAr 45S) que transcreve os RNA ribossomais (RNAr) 18S, 5.8S, e 28S e a classe menor (DNAr 5S) que transcreve o RNAr 5S. Sítios ativos de DNAr 45S têm-se mostrado coincidentes as NORs nos cromossomos, enquanto DNAr 5S não estão associados com a NOR. Análises em populações de Astyanax scabripinnis de diferentes bacias hidrográficas brasileiras mostram grande diversidade cariotípica no número e morfologia dos cromossomos (Moreira Filho e Bertollo, 1991; Salvador e Moreira- Filho, 1992; Souza et al., 1995; Mizoguchi e Martins-Santos, 1998; Alves e Martins- Santos, 2002; Fernandes e Martins-Santos, 2003). Número diplóide variando de 2n = 50, 48 e 46 cromossomos indicam um complexo de espécies (Moreira-Filho e Bertollo, 1991). Além disso, A. scabripinnis com citótipos simpátricos devido a diferenças no número diplóide tem sido descrito por Souza et al. (1995), Maistro et al. (2000) e Fernandes e Martins-Santos (2005). Múltiplas Ag-NORs é uma característica comum em A. scabripinnis, alcançando até 15 cromossomos portadores da NOR, como observado para um espécime coletado no rio Jucu (Rocon-Stange e Almeida-Toledo, 1993). As NORs têm sido extensivamente estudadas em peixes e constituem marcadores genéticos adequados, contribuindo com os estudos citotaxonômicos de espécies relacionadas (Galetti Jr., 1998). No presente estudo, em três diferentes citótipos a NOR foi caracterizada para uma população de A. scabripinnis usando diferentes tratamentos: AgNO 3, CMA 3 e FISH com sonda de DNAr 18S. O mapeamento do DNAr 5S também foi realizado e

53 Organização do DNAr em Astyanax 45 alguns aspectos com relação a localização cromossômica conservada do DNAr 5S e variável do DNAr 18S são também discutidos. Material e métodos Os espécimes de A. scabripinnis foram coletados no córrego Tatupeba, bacia do rio Ivaí (23º S e 52º W). Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de células do rim seguindo a metodologia descrita por Bertollo et al. (1978). Ag- NORs foram detectadas por coloração de nitrato de prata (AgNO 3 ) seguindo método descrito por Howell e Black (1980). Os cistrons ribossomais foram detectados pela técnica de FISH, usando sondas de DNAr 18S e 5S, seguindo o procedimento descrito por Pinkel et al. (1986), com ligeiras modificações. As sondas 18S e 5S foram obtidas por PCR de Astyanax scabripinnis usando primers NS1 (5 - GTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ) e NS8 (5 -TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3 ), segundo White (1990), e primers A (5 -TACGCCCGATCTCGTCCGATC-3 ) e B (5 - CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC-3 ), segundo Martins e Galetti (1999), respectivamente. As regiões ricas em GC foram detectadas pelo fluorocromo cromomicina A 3 (CMA 3 ) conforme descrito por Schmid (1980). Ao menos 20 metáfases por indivíduo foram examinadas em um microscópio de fluorescência Zeiss Axioskop 2 Plus. As imagens foram capturadas através de uma câmera digital acoplada ao microscópio pelo software Axiovision e as pranchas finais com cromossomos metafásicos foram montadas com o auxílio do programa Adobe Photoshop CS2 e impressas em laboratório fotográfico. Resultados Análises de quarenta e um espécimes (21 machos e 20 fêmeas) de A. scabripinnis do córrego Tatupeba mostraram três diferentes citótipos, denominados como citótipo I (2n = 50), citótipo II (2n = 48) e citótipo III (2n = 46). Ainda foi observada a presença de cromossomos B em cada citótipo, como relatado em um estudo precedente (Fernandes e Martins-Santos, 2005). No presente estudo, foi examinado o padrão de distribuição dos genes DNAr (18S e 5S) para esses três citótipos, usando técnicas clássicas, tais como coloração por prata, CMA 3 e FISH nos indivíduos que apresentaram as melhores e o maior número de metáfases:

54 Capítulo II 46 Citótipo I (2n = 50) Um total de treze indivíduos apresentou este citótipo. A coloração por nitrato de prata revelou até 13 cromossomos portadores da NOR, todos marcados em regiões teloméricas. A figura (1a) mostra uma metáfase com 7 marcações Ag-NOR. Análises de CMA 3 detectaram regiões ricas em GC na região telomérica de 8 cromossomos (Figura 1b). FISH com sonda de DNAr 18S revelou sinais brilhantes fluorescentes espalhados sobre as regiões teloméricas de 14 cromossomos, com 2 cromossomos apresentando marcação bitelomérica (Figura 1c). FISH com sonda de DNAr 5S revelou sinais brilhantes fluorescentes espalhados sobre as regiões pericentroméricas de 4 cromossomos: 2 cromossomos metacêntricos e 2 grandes acrocêntricos (Figura 2a). A coloração seqüencial da lâmina de18s-fish de um espécime revelou 4 sítios ativos dos 14 cromossomos com DNAr 18S (Figura 3c-d). Citótipo II (2n = 48) Um total de vinte e dois indivíduos apresentou este citótipo. A coloração por nitrato de prata revelou até 4 cromossomos portadores da NOR, todos marcados em regiões teloméricas (Figura 1d). Análises de CMA 3 detectaram regiões ricas em GC na região telomérica de 9 cromossomos, incluindo um único cromossomo do primeiro par metacêntrico (Figura 1e). FISH com sonda de DNAr 18S revelou sinais brilhantes fluorescentes espalhados sobre as regiões teloméricas de 16 cromossomos (Figura 1f). FISH com sonda de DNAr 5S revelou sinais brilhantes fluorescentes espalhados sobre as regiões pericentroméricas de 4 cromossomos: 2 cromossomos metacêntricos e 2 grandes acrocêntricos (Figura 2b) A coloração seqüencial da lâmina de 5S-FISH de um espécime revelou que os sítios de DNAr 5S não estão em um dos cromossomos AgNO 3 (Figura 3a-b). Citótipo III (2n = 46) Um total de seis indivíduos apresentou este citótipo. A coloração por nitrato de prata revelou até 4 cromossomos portadores da NOR, todos marcados em regiões teloméricas. A figura (1g) mostra uma metáfase com 2 marcações Ag-NOR, incluindo um único cromossomo do primeiro par de metacêntrico. Análises de CMA 3 detectaram regiões ricas em GC na região telomérica de 5 cromossomos, incluindo um único cromossomo do primeiro par de metacêntrico. Em adição, um cromossomo apresentou

55 Organização do DNAr em Astyanax 47 marcação bitelomérica (Figura 1h). FISH com sonda de DNAr 18S revelou sinais brilhantes fluorescentes espalhados sobre a região telomérica de 14 cromossomos, incluindo um único cromossomo do primeiro par metacêntrico (Figura 1i). FISH com sonda de DNAr 5S revelou sinais brilhantes fluorescentes espalhados sobre as regiões pericentroméricas de 4 cromossomos: 2 cromossomos metacêntricos e 2 grandes acrocêntricos (Figura 2c). Figura 1. Localização das NORs por Ag-NOR (a, d, g), CMA 3 (b, e, h) e FISH com sonda DNAr 18S (c, f, i) nos três citótipos. Citótipo I (a, b, c), Citótipo II (d, e, f) e Citótipo III (g, h, i). As setas indicam os cromossomos marcados pelas três técnicas, as pequenas cabeças de seta indicam cromossomos biteloméricos, as grandes cabeças de seta indicam o primeiro par de cromossomos metacêntricos.

56 Capítulo II 48 Figura 2. Localização cromossômica do DNAr 5S nos três citótipos. a) Citótipo I, b) Citótipo II e c) Citótipo III. As setas indicam os sítios de DNAr 5S. Figura 3. Coloração seqüencial das lâminas de 5S-FISH e AgNO 3 (a, b) e 18S-FISH e AgNO 3 (c, d). Note que os sítios de DNAr 5S não estão em um dos cromossomos AgNO 3. Discussão Estudos citogenéticos em A. scabripinnis realizados em diferentes regiões do Brasil, revelaram grande diversidade cariotípica com relação ao numero diplóide e estrutura cromossômica, envolvendo NOR, padrão de banda-c e diferentes tipos de cromossomos B. No presente estudo, análises com Ag-NOR, CMA 3 e 18S-FISH para os

57 Organização do DNAr em Astyanax 49 três citótipos de A. scabripinnis do córrego Tatupeba revelaram sistema de NOR múltipla, com diferenças que podem caracterizar cada um deles. A hibridação fluorescente in situ com sonda 18S resultou em sinais brilhantes fluorescentes espalhados sobre a região telomérica de 14 cromossomos do citótipo I e III, e em 16 cromossomos para o citótipo II, correspondendo aos cromossomos portadores da NOR. Sem levar em consideração esta variação numérica, sítios de DNAr 18S em um único cromossomo do primeiro par metacêntrico, em concordância com a posição AgNO + 3 /CMA + 3, foram detectados somente no citótipo III. No citótipo II, este cromossomo foi também CMA + 3, mas não apresentou cistrons de DNAr. No citótipo I, marcações de AgNO + 3, CMA + 3 e de DNAr 18S não foram detectadas para este cromossomo. Ferro et al. (2001) também detectaram sítios DNAr-18S/CMA + 3 para um cromossomo do primeiro par de metacêntricos em A. scabripinnis (2n=50) do córrego Carpas. A presença de somente um cromossomo do primeiro par com DNAr pode indicar um rearranjo do tipo translocação, como descrito entre um cromossomo do primeiro par em um único cromossomo do par 17 para a população de A. scabripinnis do córrego Amores (Fernandes e Martins-Santos, 2003). O citótipo I apresentou como característica um par de cromossomos com marcação bitelomérica com 18S-FISH, similar a outras populações de A. scabripinnis com 2n=50 cromossomos (Malacrida et al., 2003; Mantovani et al., 2005), o qual não ocorreu nos outros citótipos. O citótipo III apresentou como característica um único + cromossomo com marcação CMA 3 bitelomérica, mas foi AgNO + 3 /18S-FISH + para apenas um telômero. Assim, os dois telômeros são ricos em GC, mas apenas um apresenta genes de DNAr. A outra região telomérica CMA + 3 deste cromossomo, assim como um único cromossomo do primeiro par metacêntrico CMA + 3 do citótipo II, devem estar revelando outras regiões com alto conteúdo GC. Uma outra diferença detectada entre os citótipos foi em relação à atividade gênica. No citótipo I, dos 14 cromossomos com sítios de DNAr 18S até 13 cromossomos foram AgNO + 3, mostrando que praticamente todos os sítios de DNAr 18S estão ativos para este citótipo. Por outro lado, dos 16 e 14 cromossomos com sítios de DNAr 18S descritos respectivamente para os citótipos II e III, ambos apresentaram somente 4 cromossomos AgNO + 3. Portanto, diferentemente do citótipo I, no citótipo II e III apenas uma parte dos sítios de DNAr 18S estão ativos para estes dois citótipos. A coloração seqüencial da lâmina de 18S-FISH do citótipo I detectou somente quatro sítios AgNO + 3 ativos dos 13 possíveis para este citótipo. Além disso, o

58 Capítulo II 50 cromossomo com marcação 18S-FISH bitelomérica foi AgNO3 + para apenas um telômero, o que ocorreu em todas metáfases AgNO 3 analisadas. Desta maneira, o DNAr 18S de um dos telômeros pode não estar mais se expressando. As variações intra-populacionais, numéricas e posicionais observadas no presente estudo em relação ao DNAr 18S são também relatadas em outras populações de A. scabripinnis (Ferro et al., 2001; Mantovani et al., 2005 Segundo Schweizer e Loidl (1987) a disposição dos cromossomos no núcleo interfásico promove uma proximidade das regiões teloméricas o que facilitaria transferência de material genético presente nestas regiões. Portanto, a localização telomérica dos sítios de DNAr 18S nos três citótipos de A. scabripinnis poderia facilitar transferência de DNAr 18S, originando as variações numéricas e posicionais observadas. Por outro lado, a presença de três citótipos diferentes, com variações no número diplóide (2n = 50 para o I, 2n = 48 para o II e 2n = 46 para o III), presença de marcação bitelomérica com sonda 18S relatada apenas nos espécimes de A. scabripinnis com 2n = 50 cromossomos (citótipo I) e outras populações (Malacrida et al., 2003; Mantovani et al., 2005) e diferenças no número, posicionamento e atividade gênica das NORs, é uma grande evidência da presença de três espécies que vivem em simpatria e sintopia. Conseqüentemente, as variações do número diplóide e da NOR observada entre os citótipos seria uma característica de cada espécie. Em contraste a variabilidade detectada nos três citótipos com relação ao padrão de distribuição do DNAr 18S, uma alta estabilidade no posicionamento e número dos sítios de DNAr 5S foi observado. A localização pericentromérica em dois cromossomos metacêntricos e dois grandes cromossomos acrocêntricos nos três citótipos, também são a mesma, ou muito similar, localização relatada em outras populações do complexo scabripinnis, coletados em diferentes bacias hidrográficas (Mantovani et al., 2005), e também muito similar ao número e posicionamento para o DNAr 5S relatados em outras espécies do gênero Astyanax (Almeida-Toledo et al., 2002; Fernandes e Martins-Santos, em preparação). Este fato sugere que o DNAr 5S é conservado não apenas dentro do complexo scabripinnis, mas também dentro do gênero Astyanax. Segundo Mantovani et al. (2005) esta conservação pode ser devido a localização intersticial destes sítios nos cromossomos, o qual em regiões intersticiais, o DNAr 5S poderia estar protegido dos eventos mencionados para dispersão do DNAr 18S. A coloração seqüencial da lâmina 5S-FISH de um espécime do citótipo II demonstrou que o DNAr 5S não está localizado nos mesmos cromossomos AgNO 3.

59 Organização do DNAr em Astyanax 51 Diferentes sítios cromossômicos para NOR e DNAr 5S foram relatados para Anguilla anguilla (Martinez et al., 1996), Salmo trutta (Moran et al., 1996), Leporinus elongatus, L. obtusidens e L. friderici (Martins e Galetti, 1999), Oreochromis niloticus (Martins et. al., 2000) e A. altiparanae (Fernandes e Martins-Santos, em preparação). Segundo vários autores (Lucchini et al., 1993; Suzuki et al., 1996), este é um arranjo freqüentemente observado em vertebrados. Entretanto, através de análises por duplo FISH, Almeida-Toledo et al. (2002) detectaram sinais in situ para o DNAr maior (28S rdna) co-localizado com clusters de DNAr 5S na região pericentromérica de um cromossomo marcador em cinco espécies do gênero Astyanax. Mantovani et al. (2005) também revelaram que os locus de DNAr 45S e 5S foram sintênicos em um cromossomo de A. scabripinnis. Portanto, investigações utilizando duplo FISH com as duas sondas de DNAr devem ser realizadas a fim de provar a diferente localização do DNAr 18S e 5S no citótipo II, assim como nos outros citótipos. Agradecimentos Os autores agradecem a CAPES pelo suporte financeiro. Referências ALMEIDA-TOLEDO L.F., OZOUF-COSTAZ C., FORESTI F., BONILLO C., PORTO-FORESTI F. e DANIEL-SILVA M.F.Z., Conservation of the 5Sbearing chromosome pair and co-localization with major rdna clusters in five species of Astyanax (Pisces, Characidae). Cytogenetic. Genome Res. 97 (3-4): ALVES A.L. e MARTINS-SANTOS I.C., Cytogenetics studies in two populations of Astyanax scabripinnis with 2n = 48 chromosomes (Teleostei, Characidae). Cytologia 67: AMEMIYA C.T. e GOLD J.R., Chromomycin A 3 stains nucleolus organizer regions of fish chromosomes. Copeia 1: BERTOLLO L.A.C., TAKAHASHI C.S. e MOREIRA-FILHO O., Cytotaxonomic considerations on Hoplias lacerdae (Pisces, Erythrinidae). Brazil. J. Genet. 1(2): FERNANDES C.A. e MARTINS-SANTOS I.C., Cytogenetic characterization of two populations of Astyanax scabripinnis (Pisces, Characiformes) of the Ivaí Basin PR Brazil. Cytologia 68 (3)

60 Capítulo II 52 FERNANDES C.A. e MARTINS-SANTOS I.C., Sympatric occurrence of three cytotypes and four morphological types of B chromosomes of Astyanax scabripinnis (Pisces, Characiformes) in the River Ivaí Basin, state of Paraná, Brazil. Genetica 124: FERRO D.A.M., NÉO D.M., MOREIRA-FILHO O. e BERTOLLO L.A.C., Nucleolar organizing regions, 18S and 5S rdna in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): populations distribution and functional diversity. Genetica 110: GALETTI Jr. P.M., Chromosome diversity in neotropical fishes: NOR studies. Ital. J. Zool., 65: HOWELL W.M. e BLACK D.A., Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: as 1-step method. Experientia 36: LUCCHINI S., NARDI I., BARSACCHI G., BATISTONI R. e ANDRONICO F., Molecular cytogenetics of the ribosomal (18S + 28S and 5S) DNA loci in primitive and advanced urodele amphibians. Genome 36: MAISTRO E.L., FORESTI F., OLIVEIRA C. e ALMEIDA-TOLEDO L.F., Sympatric occurrence of two cytotypes of Astyanax scabripinnis paranae (Characiformes, Characidae). Genet. Mol. Biol. 23: MALACRIDA A.C.P., DIAS A.L. e GIULIANO-CAETANO L., Natural triploidy in Astyanax aff. scabripinnis (Pisces, Characidae) of thetibagi river basin-pr. Cytologia 68(3): MANTOVANI M., ABEL L.D.S. e MOREIRA-FILHO O., Conserved 5S and variable 45S rdna chromosomal localisation revealed by FISH in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae). Genetica 123: MARTINEZ J.L., MORAN P., GARCIA-VASQUEZ E. e PENDAS A.M., Chromosomal localization of the major and 5s rrna genes in the European eel (Anguilla anguilla). Cytogenet. Cell Genet. 73: MARTINS C. e GALETTI Jr. P.M., Chromosomal localization of 5S rdna genes in Leporinus fish (Anostomidae, Characiformes). Chrom. Res. 7: MARTINS C., WASKO A.P., OLIVEIRA C. e WRIGHT J.M., Nucleotide sequence of 5s rdna and localization of the ribosomal RNA genes to metaphase chromosomes of the Tilapiine cichlid fish, Oreochromis niloticus. Hereditas 133:

61 Organização do DNAr em Astyanax 53 MAYR B., KALAT M. e RAB P., Localization of NORs and counter-stainenhanced fluorescence studies in Salmo gairdneri and Salmo trutta. The or. Appl. Genet., 71: MILLER D.A., DEV V.G., TANTRAVASHI R. e MILLER O.J., Suppression of human nucleolus organizer activity in mouse-human somatic hybrid cells. Expl. Cell Res., 101: MIZOGUCHI S.M.H.N. e MARTINS-SANTOS I.C., Cytogenetic and morphometric differences in populations of Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae) from Maringá region, PR, Brazil. Genet. Mol. Biol. 21 (1) MORAN P., MARTINEZ J.L., GARCIA-VASQUEZ E. e PENDAS A.M., Sex linkage of 5S rdna in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cytogenet. Cell Genet. 75: MOREIRA-FILHO O. e BERTOLLO L.A.C., Astyanax scabripinnis (Pisces; Characidae): a species complex. Brazil. J. Genet. 14: PENDÁS A.M., MÓRAN P., FREIJE J.P. e GARCIA-VÁSQUEZ E., Chromosomal location and nucleotide sequence of two tandem repeats of the Atlantic salmon 5S rdna. Cytogenet. Cell Genet. 67: PINKEL D., STRAUME T. e GRAY J.W., Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: ROCON-STANGE E.A. e ALMEIDA-TOLEDO L.F., Supernumerary B chromosome restricted to males in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae). Brazil. J. Genet. 16: SALVADOR L.B. e MOREIRA-FILHO O., B chromosome in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae). Heredity 69: SCHMID M., Chromosome banding in Amphibian. IV. Differentiation of GCand AT-rich chromosome region in Anura. Chromosoma 77: SCHMID M. e GUTTENBACH M., Evolutionary diversity of reverse (R) fluorescent chromosome bands in vertebrates. Chromosoma 97: SCHWEIZER D. e LOIDL J., A model for heterochromatin dispersion and the evolution of C-band pattern. (In : Chromosome Today. 1 st ed. Vol. 9. Eds: Stahl, A., Luciani, J.M., Vagner-Capodano, A.M.) Allen and Unwin,

62 Capítulo II 54 SOUZA I.L., MOREIRA-FILHO O. e BERTOLLO L.A.C., Cytogenetic diversity in the Astyanax scabripinnis species complex (Pisces, Characidae). II Different cytotypes living in sympatry. Cytologia 60: SUZUKI H., SAKURAI S. e MATSUDA Y., Rat rdna spacer sequences and chromosomal assignment of the genes to the extreme terminal region of chromosome 19. Cytogenet. Cell Genet. 72: 1 4. WHITE T.J., BRUNS T., LEE S. e TAYLOR J., Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. (In PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications. Academic Press Inc.) pp

63 Organização do DNAr em Astyanax Capítulo III Caracterização citogenética em Astyanax fasciatus (Teleostei, Characiformes) da bacia do alto rio Paraná por Giemsa, Ag- NOR, banda-c e FISH. Fernandes CA and Martins-Santos IC (em preparação). Cytogenetic characterization in Astyanax fasciatus (Teleostei, Characiformes) from upper Paraná river basin by Giemsa, Ag-NOR, C-Band and FISH.

64 Capítulo III 56 Resumo Espécimes de Astyanax fasciatus da bacia do alto rio Paraná foram analisados citogeneticamente a fim de melhor compreender a variabilidade encontrada dentro desta espécie. Os indivíduos apresentaram número diplóide de 2n = 46 cromossomos, com sistema de NOR múltipla detectada por coloração de nitrato de prata e FISH com sonda de DNAr 18S. Além disso, FISH com DNAr 18S revelou a presença de um par de cromossomos metacêntricos com marcação bitelomérica, similar a marcação encontrada em espécimes de Astyanax scabripinnis. O DNAr 5S foi detectado na região intersticial de dois cromossomos metacêntricos e dois acrocêntricos, similar a marcação detectada para outra população de Astyanax fasciatus descrita para a bacia do alto rio Paraná e também com marcação similar a outras espécies do gênero, indicando uma conservação destes sítios não somente dentro do complexo fasciatus mas também dentro do gênero Astyanax. A heterocromatina constitutiva revelou blocos heterocromáticos nas regiões teloméricas de cromossomos submetacêntricos, subtelocêntricos e acrocêntricos. Aspectos em relação ao padrão de distribuição dos sítios de DNAr 18S e 5S são discutidos.

65 Organização do DNAr em Astyanax 57 Abstract Astyanax fasciatus specimens from upper Paraná river basin were cytogenetically analyzed in order better to understand variability found within this species. The individuals presented diploid number of 2n = 46 chromosomes, with multiple NOR system detected by silver nitrate staining and FISH with rdna 18S probe. Moreover, FISH with rdna 18S revealed presence of one pair metacentric chromosomes with bitelomeric markings, similar the markings detected for Astyanax scabripinnis specimens. The rdna 5S was detected in interstitial region of two metacentric and two acrocentric chromosomes, similar the markins detected for other Astyanax fasciatus population describe to upper Parana river basin and also with markings similar the others species of genus, indicating a conservation of this sites not only within of complex fasciatus, but also within of Astyanax genus. Constitutive heterochromatin revealed heterochromatic blocks in the region telomeric of the submetacêntrico, subtelocentric and acrocentric chromosomes. Aspects on divergences among distribution pattern of sites 18S and 5S rdna are discussed. Key words: Astyanax fasciatus, FISH, 18S rdna, 5S rdna, C-band

66 Capítulo III 58 Introdução Astyanax é um gênero relativamente comum, com ampla distribuição geográfica, o qual consiste de pequenos peixes conhecidos no Brasil como lambaris ou piabas, compreendendo mais de cem espécies e subespécies em rios neotropicais (Garutti e Britski, 1997). Este gênero revela várias formas quase similares, formando um grupo altamente complexo e sua precisa identificação tem sido difícil (Melo, 2001). Ainda, algumas espécies indicam formar um complexo de espécies, tais como Astyanax scabripinnis e Astyanax fasciatus. No complexo scabripinnis, o número diplóide varia de 2n = 46, 2n = 48 e 2n = 50 cromossomos (Moreira-Filho e Bertollo, 1991; Fernandes e Martins-Santos, 2005) e no complexo fasciatus, o número diplóide varia de 2n = 45 a 2n = 50 cromossomos (Centofante et al., 2003). A. fasciatus tem revelado sistema de NOR múltipla, assim como, outras espécies do gênero. Regiões organizadoras de nucléolo (NORs) são extensivamente estudadas em peixes e constituem bons marcadores genéticos, ajudando estudos citotaxonômicos de espécies relacionadas (Galetti Jr., 1998). Estudos das NORs são realizados mais freqüentemente com coloração de nitrato de prata devido a simplicidade desta técnica, embora esta metodologia está limitada a detectar apenas as regiões nucleolares que foram ativas na intérfase precedente (Miller et al. 1976). Recentemente a hibridação in situ fluorescente (FISH) tem sido empregada para o mapeamento das NORs através de sondas ribossomais. O DNA ribossomal (DNAr) é organizado em eucariotos superiores dentro de duas distintas classes gênicas: a classe maior (DNAr 45S) que transcreve os RNA ribossomais (RNAr) 18S, 5.8S, e 28S e a classe menor (DNAr 5S) que transcreve o RNAr 5S. Sítios ativos de DNAr 45S têm-se mostrado coincidente as NORs nos cromossomos. Considerando a complexa variabilidade citogenética em A. fasciatus, nós caracterizamos citogeneticamente uma população de A. fasciatus por meio de cariótipo convencional de giemsa, banda-c, Ag-NOR, FISH com sondas DNAr 18S e 5S afim de melhor compreender o complexo fasciatus. Materiais e métodos Cinco espécimes (3 machos e 2 fêmeas) de A. fasciatus foram coletadas no córrego das Rosas tributário do rio Pirapó (Bacia do alto rio Paraná). Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de células do rim seguindo a metodologia descrita por Bertollo et al. (1978). A identificação dos cromossomos foi feita de acordo ao critério

67 Organização do DNAr em Astyanax 59 de relação de braços (RB), sugerida por Levan et al. (1964). A técnica de banda-c descrita por Sumner (1972) foi empregada para análise da heterocromatina constitutiva. Ag-NORs foram detectadas por coloração de nitrato de prata (AgNO 3 ) seguindo o método descrito por Howell e Black (1980). Os cistrons ribossomais foram detectados pela técnica de FISH, usando sondas de DNAr 18S e 5S, seguindo o procedimento descrito por Pinkel et al. (1986), com ligeiras modificações. As sondas 18S e 5S foram obtidas por PCR de Astyanax scabripinnis usando primers NS1 (5 - GTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ) e NS8 (5 -TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3 ), segundo White (1990), e primers A (5 -TACGCCCGATCTCGTCCGATC-3 ) e B (5 - CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC-3 ), segundo Martins e Galetti (1999), respectivamente. Resultados e Discussão Todos os espécimes apresentaram o mesmo número diplóide, 2n = 46 cromossomos, com a seguinte constituição cromossômica: 12 metacêntricos (M), 22 submetacêntricos (SM), 8 subtelocêntricos (ST) e 4 acrocêntricos (A), com número fundamental (NF) igual a 88, para ambos os sexos (Figura 1a). Os resultados revelaram o mesmo número diplóide 2n = 46 cromossomos da população de A. fasciatus do rio Mogi-Guaçu (Daniel-Silva e Almeida-Toledo, 2001), com a mesma, ou muito similar, fórmula cariotípica, diferindo somente no número de cromossomos submetacêntricos/subtelocêntricos: nos espécimes do rio Mogi-Guaçu, 20SM/10ST e nos espécimes do presente estudo, 22SM/8ST. Segundo Daniel-Silva (1996) populações de A. fasciatus da bacia do rio Paraná apresentaram 2n = 46 cromossomos, enquanto populações de A. fasciatus da bacia do rio São Francisco apresentaram 2n = 48 cromossomos. Os resultados apresentados no presente trabalho corroboram aqueles obtidos por este último autor. A coloração por nitrato de prata revelou uma marcação terminal no braço longo do par 12 em todas metáfases analisadas (Figura 1b). Além deste par, sítios adicionais de NOR foram observados ocasionalmente em outros cromossomos. Múltiplas Ag-NOR têm sido freqüentemente relatadas dentro do gênero Astyanax, incluindo A. altiparanae (Daniel-Silva, 1996; Pacheco et al. 2002; Fernandes e Martins-Santos, 2004), A. scabripinnis (Moreira-Filho e Bertollo, 1991; Rocon-Stange e Almeida-Toledo, 1993; Mizoguchi e Martins-Santos, 1998; Alves e Martins-Santos, 2002; Fernandes e Martins- Santos, 2003; Fernandes e Martins-Santos, 2005), A. schubarti (Daniel-Silva, 1996), A.

68 Capítulo III 60 parahybae (Centofante et al., 2003) e A. fasciatus (Paganelli, 1990; Daniel-Silva, 1996), indicando ser uma característica comum do grupo. Figura 1. Cariótipo convencional de Giemsa (a), metáfases de Ag-NOR (b), 18S-FISH (c) e 5S- FISH (d) dos espécimes de Astyanax fasciatus. Setas pequenas indicam os cromossomos marcadores, setas grandes indicam o par submetacêntrico nº 12 e as cabeças de seta indicam os cromossomos com marcação bitelomérica. A técnica de FISH com sonda 18S revelou sinais brilhantes fluorescentes espalhados sobre a região telomérica de 8 cromossomos, incluindo o par 12, o qual revelou o maior sinal fluorescente. Estes dados confirmam sistema de NOR múltipla para esta população. Além disso, dos 8 cromossomos marcados, um par de cromossomos metacêntricos apresentou marcação bitelomérica (Figura 1c). Almeida-Toledo et al. (2002) detectaram um total de 6 cromossomos portadores da NOR após FISH com sonda de DNAr 28S em A. fasciatus do rio Mogi-Guaçu, com marcações intersticiais e teloméricas.

69 Organização do DNAr em Astyanax 61 Variações numéricas e posicionais dos sítios de DNAr 18S ou 28S entre os espécimes de A. fasciatus do presente estudo e do rio Mogi-Guaçu (Almeida-Toledo et. al., 2002) têm sido também relatadas em outras espécies, como A. scabripinnis (Ferro et. al., 2001; Souza et al., 2001; Mantovani et al., 2005; Fernandes e Martins-Santos, em publicação), A. altiparanae (Fernandes e Martins-Santos, em publicação) e Prochilodus lineatus (Jesus e Moreira-Filho, 2003). Vários autores têm relatado que estas variações podem estar relacionadas ao posicionamento telomérico destes sítios, uma vez que, segundo Schweizer e Loidl (1987) a disposição dos cromossomos no núcleo interfásico promove uma proximidade das regiões teloméricas o que facilitaria transferência de material genético presente nestas regiões. Em contraste com a variabilidade que tem sido detectada entre espécies próximas do gênero Astyanax com relação ao padrão de distribuição do DNAr 18S, uma alta estabilidade no posicionamento e no número de sítios DNAr 5S tem sido observado. No presente estudo, análises de FISH indicaram que o DNAr 5S está localizado nas regiões pericentroméricas de dois cromossomos metacêntricos e dois grandes cromossomos acrocêntricos (Figura 1d). Este padrão de localização é o mesmo, ou muito similar, àquele observado para o DNAr 5S na população de A. fasciatus do rio Mogi-Guaçu (Almeida-Toledo et al., 2002) e em outras espécies de Astyanax, tais como, A. scabripinnis (Almeida-Toledo et al., 2002; Mantovani et al. 2005; Fernandes e Martins- Santos, em publicação) e A. parahybae (Kavalco et al. 2004). Estas constatações sugerem que o DNAr 5S é conservado não somente dentro do complexo fasciatus, mas também dentro do gênero Astyanax. Esta conservação pode estar relacionada ao posicionamento intersticial destes sítios, que não sofrem os eventos de dispersão mencionados para o DNAr 18S. Com relação ao padrão de heterocromatina constitutiva, os espécimes de A. fasciatus analisados apresentaram seis pares de blocos heterocromáticos na região distal do braço longo de cromossomos submetacêntricos, subtelocêntricos e acrocêntricos. O segmento Ag-NOR no par 12 foi também banda-c + (Figura 2). Daniel-Silva e Almeida- Toledo (2001) também detectaram este padrão de blocos heterocromáticos para população de A. fasciatus do rio Mogi-Guaçu. Blocos heterocromáticos na região distal do braço longo de cromossomos subtelocêntricos e acrocêntricos têm sido também freqüentemente detectados em populações de A. scabripinnis (Maistro et al., 1992, Maistro et al., 1998; Mizoguchi e Martins-Santos, 1998; Daniel-Silva e Almeida-Toledo, 2001; Fernandes e Martins-Santos, 2003; Fernandes e Martins-Santos, 2005),

70 Capítulo III 62 diferentemente das populações de A. altiparanae que apresentam blocos de heterocromatina intersticiais (Paganelli, 1990; Daniel-Silva e Almeida-Toledo, 2001; Fernandes e Martins-Santos, 2004). Estes dados mostram que a heterocromatina constitutiva é uma boa ferramenta citotaxonômica mesmo em espécies filogeneticamente relacionadas. Figura 2. Cromossomos metáfasicos de Astyanax fasciatus após banda-c. Há ainda poucos estudos usando FISH no gênero Astyanax e a maioria é limitada aos A. scabripinnis (Souza et al., 2001; Ferro et al., 2001; Mantovani et al., 2005; Fernandes e Martins-Santos, em publicação). Em A. fasciatus, somente uma população do rio Mogi-Guaçu (Almeida-Toledo et al., 2002) e a população aqui analisada foram estudadas empregando-se a técnica de FISH com sondas de DNAr. Estes resultados têmse mostrado importantes para a caracterização da posição cromossômica dos DNAr 18S e 5S, contribuindo para um melhor entendimento dos estudos citotaxônomicos de espécies filogeneticamente relacionadas. Agradecimentos Os autores agradecem a CAPES pelo suporte financeiro. Referências