ANÁLISE CITOGENÉTICA EM DUAS ESPÉCIES DO GÊNERO Astyanax DE DIFERENTES BACIAS HIDROGRÁFICAS: LOCALIZAÇÃO DOS GENES RIBOSSÔMICOS 18S E 5S

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1 ROSILEY BERTON PACHECO ANÁLISE CITOGENÉTICA EM DUAS ESPÉCIES DO GÊNERO Astyanax DE DIFERENTES BACIAS HIDROGRÁFICAS: LOCALIZAÇÃO DOS GENES RIBOSSÔMICOS 18S E 5S Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação, em Ciências Biológicas (área de concentração Biologia Celular e Molecular), da Universidade Estadual de Maringá, para a obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas. MARINGÁ 2008

2 ROSILEY BERTON PACHECO ANÁLISE CITOGENÉTICA EM DUAS ESPÉCIES DO GÊNERO Astyanax DE DIFERENTES BACIAS HIDROGRÁFICAS: LOCALIZAÇÃO DOS GENES RIBOSSÔMICOS 18S E 5S Orientador: Prof. Dr. Horácio Ferreira Júlio Júnior MARINGÁ 2008

3 Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá PR., Brasil) P116a Pacheco, Rosiley Berton Análise citogenética em duas espécies do gênero Astyanax de diferentes bacias hidrográficas : localização dos genes ribossômicos 18S e 5S / Rosiley Berton Pacheco. -- Maringá : [s.n.], f. Orientador : Prof. Dr. Horácio Ferreira Júlio Júnior. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Maringá, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (área de concentração - Biologia Celular e Molecular), Citogenética de peixes. 2. Astyanax jacuhiensis. 3. Astyanax altiparanae. 4. Hibridação in situ com fluorescência (FISH). I. Universidade Estadual de Maringá. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. II. Título. CDD 21.ed

4 BIOGRAFIA Rosiley Berton Pacheco, nascida em Umuarama/PR no dia 24/01/71. É Professora pela SEED há 17 anos no Ensino Médio e 6 anos no Ensino Superior. Possui graduação em Biologia pela Universidade Paranaense (1994), especialização em Biologia pela Universidade Paranaense (1997), Mestrado em Genética e Melhoramento pela Universidade Estadual de Londrina (2001), orientada pela Prof a. Dr a. Ana Lúcia Dias, em 2004 iniciou Doutorado no Programa de Pós Graduação, em Ciências Biológicas (área de concentração Biologia Celular e Molecular), da Universidade Estadual de Maringá, sendo orientada pelo Prof. Dr. Horácio Ferreira Júlio Júnior e tendo como co-orientadora a Prof a. Dr a. Ana Lúcia Dias.

5 AGRADECIMENTOS À Profa. Dr a. Ana Lúcia Dias, a maior responsável pelo meu crescimento, por toda orientação, confiança e principalmente pela compreensão em todos os momentos de dificuldades, muito obrigada e minha eterna gratidão, jamais esquecerei tudo o que fez por mim, você é muito mais do que orientadora. À amiga e companheira Profa. Dr a. Lúcia Giuliano Caetano por toda ajuda desde que me conheceu inclusive pelas coletas e preparação de materiais, pelas dicas, sugestões e críticas para que este trabalho fosse concluído. Ao Prof. Dr. Horácio Ferreira Júlio Júnior por me orientar e por toda a confiança depositada em mim. Ao Dr. Alberto Sergio Fenocchio, Dr a. Ana Cláudia Swarça e ao Dr. Mário Sérgio Mantovani pela amizade e pela ajuda prestada. Ao laboratório do LABRE, principalmente ao Prof. Dr. André Luís Laforga Vanzela, por disponibilizar equipamentos do laboratório. À Profa. Dr a. Isabel Cristina Martins dos Santos, à Profa. Dr a. Ana Luiza Brito Portela Castro e ao Prof. Dr. Carlos Alexandre Fernandes por toda atenção. Ao programa de Mestrado em Genética e Biologia Molecular e ao Laboratório de Citogenética de Peixes da Universidade Estadual de Londrina, pelo apoio e principalmente aos técnicos: Dário, Melissa e Carlos. Ao programa de Pós-graduação da Universidade Estadual de Maringá na área de Biologia Celular, aos professores e ao secretário Nelsino sem o qual não teria sido possível concluir o programa.

6 Aos companheiros de laboratório Renata, Larissa Lacerda, Tatiane, Tamara, Vitor, Gabriel, Tatiana, Larissa Pires, Rafael, Treco, Marceléia, Tatiana, Vivian e Michelli, pelo companheirismo. Aos meus colegas de doutorado, em especial ao meu amigo Rafael e amiga Renata, os quais estavam sempre prontos para me ajudar. Aos meus filhos, Thiago, Thais e Juninho e aos meus sobrinhos José Henrique e Laisa, aos meus amados pais Aparecido e Izabel, minhas irmãs Ivani e Roseli por todo amor. Ao meu cunhado Humberto e ao grande amigo Agnel por todo incentivo e apoio em todas as horas. À minha grande amiga Tânia Aparecida pela hospedagem e principalmente por ouvir e compartilhar as horas difíceis. Aos meus colegas de trabalho e amigos Pedro, Rosana, Maria Olita, Danila, Davis, Edner, Cristina, Tânia Regina, Daniela, Márcia, Raquel e Ricardo e a todos que contribuíram para que eu pudesse concluir este trabalho. Ao Angelo, por tudo que você fez por mim. A Deus, por permitir mais esta vitória em minha vida. Muito obrigada!

7 Dedico aos meus filhos

8 Não é no silêncio que os homens se fazem, mas na palavra, no trabalho, na ação-reflexão Paulo Freire

9 APRESENTAÇÃO Esta Tese é composta de dois artigos científicos, onde foram analisados citogeneticamente exemplares do gênero Astyanax de diferentes localidades e bacias hidrográficas, contribuindo assim com mais informações sobre este grupo de peixes. Em consonância com as regras do Programa de Pós graduação em Ciências Biológicas. Inicia com o artigo Caracterização citogenética de Astyanax jacuhiensis (Characidae) da bacia do lago Guaíba/RS R.B. Pacheco 1,2, L.Giuliano-Caetano 1, L.R. Malabarba 3, A.L. Dias 1 e H.F.Julio Junior 2 1 Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, CCB, Londrina, PR, Brasil 2 Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Estadual de Maringá, DBC, Maringá, PR, Brasil 3 Departamento de Zoologia, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil Revista BIOLOGICAL RESEARCH. Tem continuidade com o artigo Citogenética comparativa entre três diferentes populações de Astyanax altiparanae, com ênfase à localização do DNAr 18S e 5S R.B. Pacheco 1,2, L.Giuliano-Caetano 1, A.L. Dias 1 e H.F.Julio Junior 2 1 Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, CCB, Londrina, PR, Brasil 2 Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Estadual de Maringá, DBC, Maringá, PR, Brasil Revista BIOLOGICAL RESEARCH.

10 PACHECO, Rosiley Berton. Análise citogenética em duas espécies do gênero Astyanax de diferentes bacias hidrográficas: localização dos genes ribossômicos 18S e 5S p. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas Área de Concentração, Biologia Celular e Molecular) Universidade Estadual de Maringá. RESUMO Foram estudados citogeneticamente exemplares de Astyanax jacuhiensis cuja localidade tipo é Jacuhy, Rio Grande do Sul, coletados em três diferentes pontos da bacia do lago Guaíba: Gasômetro, Arroio do Ribeiro e Barra do Ribeiro e Astyanax altiparanae de três diferentes localidades: rio Monjolinho (bacia do rio Monjolinho/SP), Água dos Patos (bacia do Paranapanema/SP) e Lago Igapó (bacia do rio Tibagi/PR). Todos os exemplares de A. jacuhiensis apresentaram número diplóide igual a 50 cromossomos com 8m+30sm+4st+8a (NF=92). Todas as populações de A. altiparanae também apresentaram 2n=50, mas com diferentes fórmulas cariotípicas: a população do rio Monjolinho com 10m+28sm+4st+8a (NF=92), a do rio Água dos Patos com 8m+24sm+6st+12a (NF=88) e a população do Lago Igapó com 8m+28sm+4st+10a (NF=90). Através da técnica de AgNORs nas duas espécies, foi evidenciada uma variação de 1 até 5 cromossomos nucleolares, localizadas em regiões teloméricas do braço curto ou longo de diferentes cromossomos, mostrando também um heteromorfismo de tamanho. Entretanto, através da hibridação in situ com fluorescência (FISH) com sonda de DNAr 18S foi observado nas populações de A. altiparanae do rio Monjolinho, Lago do Igapó e A jacuhiensis do Lago Guaíba apenas um par de cromossomos com marcações fluorescentes, enquanto que a população do rio Água dos Patos apresentou 4 marcações fluorescentes. Através da hibridação fluorescente in situ (FISH) utilizando sonda de DNAr 5S, foi visualizado um par de cromossomos com sinais fluorescentes na posição intersticial em A altiparanae. A coloração com cromomicina A 3 (CMA 3 ) em A. jacuhiensis e A. altiparanae mostrou correspondência com alguns sítios AgNORs, sendo estes ricos em bases GC. A coloração com DAPI não evidenciou nenhuma região rica em bases AT. A técnica de banda C utilizada somente na população A. jacuhiensis do Lago Guaíba, revelou blocos de heterocromatina nas regiões pericentroméricas na maioria dos cromossomos, sendo observadas algumas marcações intersticiais, e um par cromossômico (sm), com marcação heterocromática mais evidente na porção terminal do braço curto. BC+CMA 3 em A. jacuhiensis confirmou que a heterocromatina se encontra associada à NOR, além de outras marcações fluorescentes em regiões pericentroméricas e intersticiais. Estes são os primeiros dados citogenéticos de Astyanax jacuhiensis e os dados obtidos nas 3 populações de A. altiparanae confirmam uma variabilidade cromossômica neste grupo de peixes.

11 PACHECO, Rosiley Berton. Análise citogenética em duas espécies do gênero Astyanax de diferentes bacias hidrográficas: localização dos genes ribossômicos 18S e 5S p. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas Área de Concentração, Biologia Celular e Molecular) Universidade Estadual de Maringá. ABSTRACT A cytogenetic study was conducted on specimens of two species of Astyanax in Brazil. A. jacuhiensis whose type-locality is Jacuhy, RS, was collected at three different points in the Guaíba stream basin: Gasômetro, Arroio do Ribeiro and Barra do Ribeiro. A. altiparanae was obtained from three different localities: Monjolinho river (Monjolinho river basin/sp), Água dos Patos river (Paranapanema river basin/sp) and Igapó stream (Tibagi river basin/pr). All of the specimens of A. jacuhiensis showed a diploid number of 50 chromosomes with a karyotype of 8m+30sm+4st+8a (NF=92). All the populations of A. altiparanae also had a chromosome number of 2n=50, but with different karyotype formulas: the population of the Monjolinho river with 10m, 28sm, 4st and 8a (NF=92), that of the Água dos Patos river with 8m, 24sm, 6st and 12a (NF=88) and the population of Igapó stream with 8m, 28sm, 4st and 10a (NF=90). Using the AgNOR technique in the two species, a variation of 1 to 5 nucleolar chromosomes was demonstrated, showing localization in the telomeric regions of the short arm of different chromosomes along with size heteromorphism. Meanwhile, using fluorescence in situ hybridization (FISH) with an 18S rdna probe, populations of A. altiparanae from the Monjolinho river and Igapó stream and of A. jacuhiensis from Guaíba stream were found to have only one chromosome pair with fluorescent staining, whereas the population from the Água dos Patos river showed 4 fluorescent regions. FISH utilizing 5S rdna showed one chromosome pair with fluorescent signals in the interstitial region in A. altiparanae. Staining with chromomycin A 3 (CMA 3 ) in A. jacuhiensis and A. altiparanae corresponded with some AgNOR sites, these being rich in GC bases. Treatment with DAPI showed negative staining of chromosomes that were CMA 3 positive, where no AT-rich region was observed. C banding was used only in the population of A. jacuhiensis from Guaíba stream, and revealed heterochromatin blocks in the pericentromeric regions in the majority of the chromosomes, where some interstitial staining was observed, and one chromosome pair (sm) with heterochromatic staining more evident in the terminal portion of the short arm. CB+CMA 3 in A. jacuhiensis confirmed that the heterochromatin was associated with NORs besides other fluorescent bands in pericentromeric and intersticial regions. These are the first cytogenetic data for Astyanax jacuhiensis, and findings in three populations of A. altiparanae confirm a chromosome variability in this group of fishes.

12 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - a) Exemplar de Astyanax jacuhiensis; b) Foto satélite do Lago Guaíba mostrando os diferentes pontos de coletas (*); c) Gasômetro; d) Arroio do Ribeiro; e) Barra do Ribeiro Figura 2 - a) Exemplar de Astyanax altiparanae; b) Rio Monjolinho; c) rio Água dos Patos; d) lago Igapó CAPÍTULO I Figura 1 - a) Cariótipo de Astyanax jacuhiensis; b) Cromossomos com AgNORs; c) Metáfases com FISH evidenciando sítios de DNAr 18S (setas); d) Metáfases evidenciando cromossomos com CMA 3 /DAPI (setas) Figura 2 a) Cariótipo de banca C de Astyanax jacuhiensis; b) par cromossômico 8 com AgNORs, C) par cromossômico 8 com banda C; d) metáfase com BC + CMA 3 com as setas indicando o par cromossômico 8 com heteromorfismo de tamanho CAPÍTULO II Figura 1 - Cariótipos de Astyanax altiparanae das populações: a) do rio Monjolinho; b) do rio Água dos Patos; c) do lago Igapó Figura 2 - AgNORs, FISH com sonda de DNAr 18 S e CMA3/DAPI em Astyanax altiparanae, respectivamente: a, d, g) rio Monjolinho; b, e, h) rio Água dos Patos; c, f, i) lago Igapó Figura 3 - Metáfases de Astyanax altiparanae evidenciando os sítios de DNAr 5S nas populações: a) do rio Monjolinho; b) do rio Água dos Patos; c) do lago Igapó... 53

13 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO Considerações Gerais e Citogenéticas sobre o Gênero Astyanax com Ênfase à Localização dos Genes Ribossômicos 18S e 5S OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos Específicos MATERIAL Espécies Estudadas e Locais de Coleta REFERÊNCIAS CAPÍTULO I CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA DE Astyanax jacuhiensis (CHARACIDAE) DO LAGO GUAÍBA/RS Resumo Introdução Material e Métodos Resultados e Discussão Referências CAPÍTULO II CITOGENÉTICA COMPARATIVA ENTRE TRÊS DIFERENTES POPULAÇÕES DE Astyanax altiparanae, COM ÊNFASE À LOCALIZAÇÃO DO DNAR 18S E 5S Resumo Introdução Material e Métodos Resultados Discussão Referências... 54

14 1 INTRODUÇÃO 1.1 Considerações Gerais e Citogenéticas sobre o Gênero Astyanax com Ênfase à Localização dos Genes Ribossômicos 18S e 5S Incertae Sedis é um termo usado para definir um grupo taxonômico em que as suas relações filogenéticas são indefinidas ou desconhecidas. Vários gêneros da família Characidae constituem um grupo heterogêneo de peixes de pequeno a grande porte e têm sido incluídos na subfamília Tetragonopterinae. Entretanto, devido a falta de evidências que esta subfamília constituia um grupo monofilético, Lima et al. (2003) listaram 88 gêneros como Incertae Sedis que incluem 620 espécies. Dentre estas, 399 (64%) são taxonomicamente pouco definidas e constituem, provavelmente, grupos não monofiléticos de Characidae: Hyphessobrycon (97 espécies), Astyanax (86 espécies), Moenkhausia (58 espécies), Bryconamericus (51 espécies) e Hemigrammus (43 espécies). Além disso, mais de 47 gêneros (53%) incluídos como Incertae Sedis são monotípicos e 25 gêneros (26%) contêm somente duas ou três espécies (Lima et al., 2003). O gênero Astyanax é considerado relativamente comum, sendo o mais diversificado da família Characidae, segundo Lima et al. (2003), revelando também várias formas semelhantes, formando um complexo, do ponto de vista taxonômico (Garutti e Britski, 2000), possui ampla distribuição geográfica e seus representantes são facilmente encontrados em rios neotropicais (Britski, 1972). Os representantes deste gênero são popularmente conhecidos como lambaris, tambiús, tetras ou piabas, sendo caracterizados por apresentarem linha lateral completa, dentes pré-maxilares dispostos em duas séries, nadadeira caudal

15 13 nua, com escamas apenas na base (Britski, 1972), e habitam diversos ambientes, inclusive as águas de cabeceiras de rios e riachos. O gênero Astyanax é o que possui maior número de dados citogenéticos dentro da subfamília Tetragonopterinae, onde são relatados alguns aspectos citogenéticos de diferentes espécies, demonstrando uma extensa variabilidade cromossômica. Os Astyanax caracterizam-se por apresentar número diplóide variando de 2n=36 cromossomos em Astyanax schubarti (Morelli et al., 1983; Daniel- Silva e Almeida-Toledo, 2001) à 2n=50 cromossomos em Astyanax altiparanae, A. scabripinnis, A. eigenmanniorum, A. mexicanus, entre outros (Oliveira et al. 1988; Moreira-Filho e Bertollo, 1991; Fauaz e Moreira-Filho, 1991; Fauaz et al., 1994; Daniel-Silva e Almeida-Toledo, 2001; Fernandes e Martins-Santos, 2003). As regiões organizadoras de nucléolos (NORs) têm sido usualmente evidenciadas através da impregnação pelo nitrato de prata para identificar as regiões de atividade gênica, onde foi caracterizado um sistema de NORs múltiplas em diferentes espécies: Astyanax altiparanae (Pacheco et al, 2001; Daniel-Silva e Almeida-Toledo, 2001; Fernandes e Martins-Santos, 2004; 2006a), em Astyanax scabripinnis (Mantovani et al. 2000; Ferro et al. 2001; Mantovani e Moreira-Filho, 2005; Fernandes e Martins, 2005), em Astyanax fasciatus (Daniel-Silva e Almeida- Toledo, 2001; Pazza et al., 2006). Entretanto, a técnica de hibridação in situ com fluorescência (FISH), com sonda de DNAr 18S, têm sido utilizada principalmente em Astyanax scabripinnis (Souza et al., 2001; Mantovani e Moreira-Filho, 2005; Fernandes e Martins-Santos, 2006b) assim como em Astyanax altiparanae (Almeida- Toledo et al, 2002 e Fernandes e Martins-Santos, 2006a), confirmando um padrão de NORs múltiplas neste grupo de peixes, na definição do real número de sítios de rdna independente da sua atividade.

16 14 O gene RNAr 5S possui uma seqüência em torno de 120pb, menor que o gene RNAr 45S (18S, 5,8S e 28S), podendo ser localizado através da técnica de hibridação in situ. Resultados de alguns estudos no gênero Astyanax, têm revelado que os genes de DNAr 5S apresentam uma alta estabilidade no posicionamento e no número dos sítios (Almeida-Toledo et al., 2002; Mantovani e Moreira-Filho, 2005; Fernandes e Martins-Santos, 2006a; 2006b). A localização intersticial pode ser responsável pela conservação destes sítios nos cromossomos (Mantovani e Moreira-Filho, 2005). A utilização de fluorocromo cromomicina A 3 (CMA 3 ) evidencia regiões ricas em bases GC, sendo portanto empregado em diversas espécies de peixes, onde evidenciaram sítios coincidentes com a AgNORs, como por exemplo: Astyanax bimaculatus em Paganelli (1990); A. altiparanae, A. schubarti, A. fasciatus; A. scabripinnis em Daniel-Silva (1996); Bryconamericus, Moenkhausia sanctafilomenae, Moenkhausia intermedia e Hemigrammus marginatus em Castro (1999); Markiana nigripinnis em Myiazawa (1997); Bryconops affinis e Moenkhausia costae em Pfister (1997), A. altiparanae em Pacheco (2001) e Fernandes e Martins- Santos (2004). Ainda são escassas as informações citogenéticas a respeito deste grupo de peixes, em comparação ao grande número de espécies existentes, uma vez que num total de 86 espécies, somente 9 apresentam alguns dados cromossômicos, e devido aos poucos trabalhos apresentados em relação as sequências de DNAr através da técnica de FISH, torna-se importante ampliar estes dados, podendo assim contribuir com os resultados já obtidos, para um melhor entendimento da caracterização cromossômica do Gênero Astyanax.

17 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral O presente trabalho teve como objetivo geral, analisar citogeneticamente exemplares do gênero Astyanax de diferentes bacias hidrográficas, contribuindo na caracterização deste grupo de peixes. 2.2 Objetivos Específicos Estudar a macroestrutura cariotípica de Astyanax altiparanae e Astyanax jacuhiensis de diferentes localidades. Localizar as Regiões Organizadoras de Nucléolos; Analisar o padrão de distribuição da heterocromatina de A. jacuhiensis; Determinar as regiões cromossômicas ricas em pares de bases GC e AT; Comparar os dados obtidos com os da literatura neste do grupo peixes.

18 3 MATERIAL 3.1 Espécies Estudadas e Locais de Coleta Vinte e quatro exemplares de Astyanax jacuhiensis (figura 1a) cuja localidade tipo é Jacuhy, Rio Grande do Sul, foram coletados em três diferentes pontos do lago Guaíba (figura 1b), no Rio Grande do Sul: Gasômetro (três machos e duas fêmeas), Arroio do Ribeiro (três machos e uma fêmea) e na Barra do Ribeiro (nove machos e seis fêmeas), no período de janeiro à setembro de 2006 (figura 1c, d, e respectivamente). Astyanax altiparanae (figura 2a), foram coletados no rio Monjolinho/São Carlos/SP, bacia do rio Monjolinho (dois machos e seis fêmeas), no rio Água dos Patos/Iepê/SP, bacia do rio Paranapanema (três machos e nove fêmeas) e do lago Igapó/Londrina/PR bacia do rio Tibagi (nove machos e sete fêmeas), totalizando 36 exemplares (figura 2b, c, d respectivamente).

19 17 Figura 1: a) Exemplar de Astyanax jacuhiensis; b) Foto satélite do lago Guaíba mostrando os diferentes pontos de coletas (*); c) Foto do ponto de coleta no Gasômetro; d) Foto do ponto de coleta no Arroio do Ribeiro; e) Foto do ponto de coleta na Barra do Ribeiro.

20 18 Figura 2: a) Exemplar de Astyanax altiparanae; b) Foto do ponto de coleta no rio Monjolinho; c) Foto do ponto de coleta no rio Água dos Patos; d) Foto do ponto de coleta no lago Igapó.

21 4 REFERÊNCIAS Almeida-Toledo LF, Ozouf-Costaz C, Foresti F, Bonillo C, Porto-Foresti F e Daniel- Silva MFZ (2002). Conservation of the 5S-bearing chromosome pair and colocalization with major rdna clusters in five species of Astyanax (Pises, Characidae).Cytogenetic. Genome Res. 97 (3-4): Britski HA (1972). Peixes de água doce do Estado de São Paulo: Sistemática. In: Poluição e Psicultura. São Paulo: Faculdade de Saúde Pública da USP-Instituto de Pesca da CPRN da Secretaria de Agricultura Castro ALB (1999). Citogenética de peixes da subfamília Tetragonopterinae (Pisces, Characidae): Aspectos Citotaxonômicos e Evolutivos. Tese de Doutorado. Ecologia de Ambientes Aquáticos Continentais. Univesidade Estadual de Maringá. 76p. Daniel-Silva MFZ (1996). Estudos citogenéticos comparativos em quatro espécies do gênero Astyanax (Pisces, Characidae). Dissertação de Mestrado. Departamento de Biologia do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (SP). 176p. Daniel-Silva MFZ e Almeida-Toledo LF (2001). Chromosome R-banding pattern and conservation of a marker chromosome in four species, genus Astyanax (Characidae, Tetragonopterinae). Caryologia, 54: Fauaz G e Moreira Filho, O. (1991). Triploidia natural em Astyanax eigenmanniorum (Pisces, Characidae). Rev. Bras. Genet. Sup. 14 (3): 56. Fauaz G, Vicente VE e Moreira Filho O. (1994). Natural triploidy and B- chromosomes in the neotropical filh genus Astyanax (Characidae). Rev. Bras. Genet. 17:

22 20 Fernandes CA e Martins-Santos IC (2003). Cytogenetic characterization of two populations of Astyanax scabripinnis (Pisces, Characiformes) of the Ivaí basin PR Brazil. Cytologia, v. 68: Fernandes CA e Martins-Santos IC (2004). Cytogenetic studies in two populations of Astyanax altiparanae (Pisces, Characiformes). Hereditas, v.141: Fernandes CA e Martins-Santos IC (2005). Sympatric occurrence of three cytotypes and four morphological types of B chromosomes of Astyanax scabripinnis (Pisces, Characiformes) in the river Ivaí basin, state of Paraná, Brazil. Genetica, v.124: Fernandes CA e Martins-Santos IC (2006a). Mapping of the 18S and 5S ribosomal RNA genes in Astyanax altiparanae Garutti & Britski, 2000 (Teleostei, Characidae) from the upper Paraná river basin, Brazil. Genetics and Molecular Biology, 29: 1-5. Fernandes CA e Martins-Santos IC (2006b). Chromosomal location of 5S and 18S rrna genes in three sympatric cytotypes of Astyanax scabripinnis (Characiformes, Characidae) from the Ivaí river basin, state of Paraná, Brazil. Caryologia (Firenze), Itália, v. 59, Ferro DAM, Néo DM, Moreira Filho O e Bertollo LAC ( 2001). Nucleolar organizing regions, 18S and 5S rdna in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): population and functional diversity. Genetica, 110: Garutti V e Britski HA (2000). Descrição de uma espécie nova de Astyanax (Teleostei: Characidae) da bacia do alto rio Paraná e considerações sobre as demais espécies do gênero na bacia. Comn. Mus. Ciênc. Tecnol. PUCRS. Sér. Zool. Porto Alegre. v

23 21 Lima FCT, Malabarba LR, Buckup PA, Silva JFP, Vari R P, Harold A, Benine R, Oyakawa OT, Pavanelli CS, Menezes NA, Lucena CAS, Malabarba MCSL, Lucena ZMS, Reis RE, Langeani F, Cassati L, Bertaco VA, Moreira C e Lucinda PHF (2003). Genera Incertae Sedis in Characidae. Pp In: Reis RR, Kullander SO e Feraris Jr.(Eds.). Check list of the freshwater fishes of South and Central America. Porto Alegre, Edipucrs. Mantovani M, Abel LDS, Mestriner CA e Moreira-Filho O (2000). Acentuated polymorfhism of heterochrimatin and nucleolar organizer regions in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): tools understanding karyotypic evolution. Genetica, 109: Mantovani M, Abel LDS e Moreira Filho O (2005). Conserved 5S and variable 45S rdna chromosomal localization revealed by FISH in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae). Genetica, 123: Miyazawa CS (1997). Citogenética de caracídeos da bacia do rio Paraguai: Análises citotaxonômicas evolutivas e considerações biogeográficas. Tese de Doutorado. Universidade de São Carlos (SP). 175p. Moreira-Filho O e Bertollo LAC (1991). Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): a species complex. Rev. Bras. Genet. 14: Morelli, S; Bertollo, LAC; Foresti, F; Moreira-Filho, O e Toledo-Filho, AS (1983) Cytogenetics considerations on the genus Astyanax (Pisces, Characidae), I Karyotypic variability. Caryologia, 36(3): Oliveira C, Almeida-Toledo LF; Foresti F, Britski HA e Toledo-Filho SA (1988). Chromosome formulae of Neotropical freshwarter fishes. Rev. Bras. Genet., 11(3):

24 22 Pacheco RB. (2001). Estudos citogenéticos em diferentes populações de Astyanax altiparanae (Pisces, Tetragonopterinae). Dissertação de Mestrado. Universidade Estadual de Londrina. 97p. Pacheco RB, Giuliano-Caetano L e Dias AL (2001). Occurrence of cytotypes and multiple NORs in an Astyanax altiparanae population (Pisces, Tetragonopterinae). Chromosome Science, 5: Paganelli HH (1990). Diversidade cromossômica no gênero Astyanax, com especial referência a A. bimaculatus. (Linnaeus, 1758). Considerações citotaxonômicas e evolutivas. Dissertação de Mestrado. Departamento de Ciências Biológicas. Universidade Federal de São Carlos. 108p. Pfister SC (1997). Contribuição aos estudos cariotípicos da família Characidae da bacia do rio São Francisco Três Marias (MG). Dissertação Mestrado. Universidade Federal de são Carlos. São Carlos (SP). 109p. Pazza R, Kavalco KF e Bertollo LAC (2006). Chromosome polymorphism in Astyanax fasciatus (Teleostei, Characidae).1. Karyotype analysis, Ag-NORs and mapping of the 18S and 5S ribosomal genes in sympatric karyotypes and their possible hybrid forms. Cytogenet Genome Res.112: Souza IL, Galiann J, Rúa PDL, Bertollo LAC e Moreira-Filho O (2001). Non-radom distribution of the GC-rich heterochromatin and nuclear rdna sites on Astyanax scabripinnis chromosomes. Cytologia 66:85-91.

25 CAPÍTULO I CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA DE Astyanax jacuhiensis (CHARACIDAE) DO LAGO GUAÍBA/RS. * *Este capítulo será enviado para publicação no periódico científico BIOLOGICAL RESEARCH

26 24 CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA DE Astyanax jacuhiensis (CHARACIDAE) DO LAGO GUAÍBA/RS. RESUMO Análises citogenéticas realizadas em 24 exemplares de Astyanax jacuhiensis, mostraram que o número diplóide é igual a 50 cromossomos distribuídos em 8m+30sm+4st+8a, sendo o número fundamental igual a 92. As regiões organizadoras de nucléolos (AgNORs) foram observadas em 2 a 5 cromossomos evidenciando uma variação intra e interindividual nesta espécie, sendo constante a ocorrência do par 8 (sm), com heteromorfismo de tamanho destas regiões entre os homólogos. Através da hibridação in situ com fluorescência (FISH), com sonda de DNAr 18S, cístrons ribossômicos foram localizados em apenas um par de cromossomos sm, na região terminal mostrando também um heteromorfismo de tamanho entre os homólogos. O tratamento com o fluorocromo CMA 3 mostrou vários cromossomos com leves marcações fluorescentes terminais e intersticiais, sendo sempre observado um par com forte marcação terminal, evidenciando o mesmo heteromorfismo encontrado em AgNOR e FISH. A coloração com DAPI não evidenciou nenhuma região rica em bases AT. A técnica de banda C revelou heterocromatina nas regiões pericentroméricas da maioria dos cromossomos, com algumas marcações intersticiais e o par sm 8 apresentou evidente marcação heterocromática terminal no braço curto. A associação de BC+CMA 3 revelou leves marcações fluorescentes em diferentes cromossomos e uma forte marcação terminal no par sm 8 evidenciado, confirmando heterocromatina rica em regiões GC nesta espécie. Os resultados obtidos no presente estudo relatam a primeira

27 25 descrição de Astyanax jacuhiensis contribuindo com a citogenética do gênero Astyanax. Palavras chave: Astyanax jacuhiensis, AgNOR, Banda C, fluorocromos, DNAr 18S. INTRODUÇÃO A bacia do lago Guaíba abrange o maior contingente populacional, sendo um dos mais importantes recursos hídricos do Rio Grande do Sul. Ela é dividida em 8 sub-bacias interligadas por grandes rios como Vacacaí-Jacuí, Caí, Sinos, Gravataí e diversos arroios, possuindo uma área de 500 km 2, com cerca de 50 km de comprimento por 12 km de largura, drenando uma área de km 2. Pela sua extensão, o Guaíba possui profundidades variando de 5 a 6 metros e alguns trechos no canal de navegação de 20 e 50 metros (Lopes 2006). Nos anos de 2002 a 2004 foi realizado um monitoramento deste lago em relação a ictiofauna incluindo seus tributários, onde foram identificadas 66 espécies distribuídas em 21 famílias, sendo Astyanax fasciatus e Cheirodon ibicuihensis, pertencentes a família Characidae, as que ocorreram numa freqüência maior (Lopes 2006). Segundo Reis et al. (2003), a família Characidae apresenta 952 espécies válidas e 400 espécies ainda não descritas, totalizando 1352 espécies. Destas, o gênero Astyanax forma um grupo complexo e sua identificação tem sido difícil por apresentar várias formas similares (Melo 2001).

28 26 Vários gêneros desta família constituem um grupo heterogêneo de peixes de pequeno a grande porte e têm sido incluídos na subfamília Tetragonopterinae. Entretanto, devido a falta de evidências que esta subfamília constitui um grupo monofilético, Lima et al. (2003) listaram 88 gêneros como Incertae Sedis que incluem 620 espécies sendo que, dentre estas, 399 (64%) são taxonomicamente pouco conhecidas e constituem, provavelmente, grupos não monofiléticos de Characidae: Hyphessobrycon (97 espécies), Astyanax (86 espécies), Moenkhausia (58 espécies), Bryconamericus (51 espécies) e Hemigrammus (43 espécies). Além disso, mais de 47 gêneros (53%) incluídos com Incertae Sedis são monotípicos e 25 gêneros (26%) contêm somente duas ou três espécies (Lima et al., 2003). A espécie Astyanax jacuhiensis foi primeiramente descrita como Tetragonopterus jacuhiensis por Cope em 1894, sendo transferida ao gênero Astyanax por Fowler (1906) e considerado sinônimo de Astyanax bimaculatus por Eigenmann (1921). Recentemente, Lima et al. (2003), passaram a nomear tal espécie como Astyanax jacuhiensis conhecida apenas na localidade tipo (rio Jacuí) sendo, portanto, endêmica desta região (Lima et al., 2007). O presente estudo mostra a primeira descrição cariotípica de Astyanax jacuhiensis, através de coloração convencional e diferentes técnicas de bandamento cromossômico: AgNOR, fluorocromos, FISH com sonda DNAr 18S e banda C. MATERIAL E MÉTODOS

29 27 Vinte e quatro exemplares de Astyanax jacuhiensis, foram coletados em três diferentes pontos do lago Guaíba, no Rio Grande do Sul, sendo três machos e duas fêmeas no Gasômetro, três machos e uma fêmea no Arroio do Ribeiro e nove machos e seis fêmeas na Barra do Ribeiro, totalizando quinze machos e nove fêmeas entre janeiro e setembro de As preparações cromossômicas foram obtidas segundo a técnica de preparação direta, a partir do rim anterior, descrita por Bertollo et al. (1978). As análises cariotípicas foram realizadas com coloração convencional e os cromossomos foram classificados em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a), segundo a metodologia proposta por Levan et al. (1964). Os acrocêntricos foram considerados com um braço e os demais com dois braços para cálculo do número fundamental (NF). A detecção da região organizadora de nucléolos foi realizada através da impregnação por nitrato de prata, proposta por Howell e Black (1980). O padrão de distribuição da heterocromatina foi evidenciado segundo a técnica proposta por Sumner (1972). O tratamento com os fluorocromos cromomicina A 3 (GC específico) e DAPI (AT específico), foi realizado de acordo com Schweizer (1980). A localização dos sítios de DNAr 18S foi obitda pela hibridação in situ com fluorescência (FISH), utilizando-se sondas de DNAr 18S obtido do peixe Oreochromis niloticus e clonado no vetor pgem-t, sendo que a bactéria

30 28 recombinante utilizada foi a E. coli JM 109 (Promega), os fragmentos foram isolados através da técnica de mini-prep, e marcados com Biotina-14-dUTP por nick translation conforme especificações do Kit utilizado (Gibco cat N ). A técnica de FISH foi realizada segundo Swarça et al. (2001). RESULTADOS E DISCUSSÃO Esta é a primeira descrição cariotípica de Astyanax jacuhiensis, da bacia do lago Guaíba/RS, que apresentou número diplóide igual a 50 cromossomos distribuídos em 8m+30sm+4st+8a com número fundamental (NF) igual a 92, tanto para machos quanto para fêmeas (figura 1a). Este número diplóide de 2n = 50 cromossomos foi observado em outras espécies do gênero Astyanax, como em Astyanax bimaculatus (Morelli et al.,1983; Paganelli, 1990; Alberdi e Fenocchio, 1997; Jorge e Moreira-Filho, 2001), Astyanax altiparanae (Pacheco et al., 2001; Daniel-Silva e Almeida-Toledo, 2001; Fernandes e Martins-Santos, 2004; 2006a), Astyanax scabripinnis (Mantovani et al., 2000; Ferro et al., 2001; Mantovani e Moreira-Filho, 2005; Fernandes e Martins-Santos, 2005), sendo, portanto, uma característica comum dentro do gênero. A constituição cariotípica observada em Astyanax jacuhiensis é similar a Astyanax altiparanae (citado como A. bimaculatus) do rio Mogi Guaçu analisada por Paganelli (1990) e do ribeirão Três Bocas por Pacheco (2001). Após impregnação pelo nitrato de prata foram observados em Astyanax jacuhiensis entre 2 a 5 cromossomos portadores das regiões organizadoras de nucléolos (AgNORs), evidenciando um sistema de AgNORs múltiplas: par submetacêntrico 8 com marcação no braço curto, mostrando um heteromorfismo de

31 29 tamanho entre os cromossomos homólogos, sendo este o par AgNOR mais freqüente, visualizado em todas as metáfases, um outro par subtelocêntrico 20, com marcação no braço curto e um cromossomo metacêntrico do par 4 com marcação no braço longo (figura 1b). A hibridação in situ com fluorescência (FISH) utilizando-se a sonda de DNAr 18S mostra exatamente a localização e o número de cístrons ribossômicos de uma espécie. Em Astyanax jacuhiensis, apesar da observação de até 5 cromossomos AgNORs, a utilização da sonda de DNAr 18S, através da técnica de FISH, evidenciou apenas um par de cromossomos sm com marcações fluorescentes no braço curto, mostrando também um heteromorfismo de tamanho (Figura 1c), coincidindo com o par 8, frequentemente identificado pelo nitrato de prata caracterizando, portanto, um sistema de NORs simples, com apenas 1 par de cromossomos carregando os genes ribossômicos. As demais marcações observadas após a impregnação pelo nitrato de prata provavelmente são regiões apenas heterocromáticas, com proteínas ácidas que têm afinidade pelo nitrato de prata. O heteromorfismo de AgNOR confirmado pela técnica de FISH, é devido a variação no número de cópias de cístrons ribossômicos entre os homólogos, que pode ter ocorrido por meio de mecanismos de crossing-over desigual, transposição ou rearranjos, como deleções e duplicações (Galetti-Jr et al., 1995). Apesar de ser comum o sistema de NORs mútiplas no gênero Astyanax (Pacheco et al., 2001; Souza et al., 2001; Jorge e Moreira-Filho, 2001; Almeida-

32 30 Toledo et al., 2002; Mantovani e Moreira-Filho, 2005; Fernandes e Martins-Santos, 2006a,b) também já foi evidenciado sistema de NORs simples em Astyanax bimaculatus dos rios São Francisco, Doce e Paraguai (Paganelli,1990) e Astyanax altiparanae do rio Paraná (Fernandes e Martins-Santos, 2004) e rio Monjolinho (Peres et al., 2008). A utilização do fluorocromo CMA 3 nas preparações cromossômicas de Astyanax jacuhiensis (figura 1d) mostrou até 4 cromossomos com marcações terminais provavelmente correspondentes ao par AgNOR e às regiões heterocromáticas com afinidade pela prata, sendo estes portanto, ricos em bases GC. A sobreposição CMA 3 /DAPI não mostrou nenhuma banda DAPI positiva (figura 1d), não sendo observada nenhuma região rica em bases AT em Astyanax jacuhiensis. A técnica de banda C revelou blocos de heterocromatina nas regiões pericentroméricas na maioria dos cromossomos, sendo observadas algumas marcações intersticiais nos pares 6, 9, 11 e 13 e o par cromossômico 8 (sm), com marcação heterocromática mais evidente na porção terminal do braço curto (figuras 2a, c). Este par cromossômico é o mesmo anteriormente evidenciado pelo nitrato de prata (figura 2b), FISH e CMA 3, portanto pode-se dizer que os cístrons ribossômicos em Astyanax jacuhiensis estão intercalados com heterocromatina rica em bases GC. A heterocromatina é um importante marcador citogenético na caracterização e diferenciação de espécies e/ou populações. O padrão de distribuição de heterocromatina evidenciado em Astyanax jacuhiensis se assemelha a algumas

33 31 populações de A. altiparanae (Daniel-Silva e Almeida-Toledo, 2001; Fernandes e Martins-Santos, 2004) e de Astyanax bimaculatus dos rios São Francisco e Paraguai analisadas por Paganelli (1990), onde também foram observados blocos de heterocromatina em regiões intersticiais. Resultado obtido com BC+CMA 3 confirmou que a heterocromatina se encontra associada a NOR, que esteve sempre ativa nas intérfases anteriores, pois foi observado um par de cromossomos submetacêntricos com marcações terminais bem evidente, mostrando o mesmo heteromorfismo evidenciado pelo CMA 3, além de outras marcações fluorescentes em regiões pericentroméricas e intersticiais (figura 2d) mostrando, portanto, que uma classe de heterocromatina neste estudo é composta de bases GC. Os resultados obtidos no presente estudo representam uma importante contribuição à citogenética do gênero Astyanax, uma vez que relata a primeira descrição de Astyanax jacuhiensis, mostrando que esta espécie possui características cromossômicas comuns a algumas populações de A. altiparanae e A. bimaculatus, evidenciando uma maior similaridade com esta última espécie, tornando-se este fato interessante pois Astyanax jacuhiensis já foi definido anteriormente como sinônimo de A. bimaculatus.

34 32 Figura 1 - a) Cariótipo de Astyanax jacuhiensis; b) Cromossomos com AgNORs; c) Metáfases com FISH evidenciando sítios de DNAr 18S (setas); d) Metáfases evidenciando cromossomos com CMA 3 /DAPI (setas).

35 33 Figura 2 - a) Cariótipo de banda C de Astyanax jacuhiensis; b) par cromossômico 8 com AgNORs; c) par cromossômico 8 com banda C; d) metáfase com BC + CMA 3 com as setas indicando o par cromossômico 8 com heteromorfismo de tamanho.

36 34 REFERÊNCIAS ALBERDI AJ e FENOCCHIO AS (1997). Karyotypes of five Tetragonopterinae species (Pisces, Characidae) from Argentina. Cytologia 62(2): ALMEIDA-TOLEDO LF, OZOUF-COSTAZ C, FORESTI F, BONILLO C, PORTO- FORESTI F e DANIEL-SILVA MFZ (2002). Conservation of the 5S-bearing chromosome pair and co-localization with major rdna clusters in five species of Astyanax (Pisces, Characidae).Cytogenetic Genome Res. 97(3-4): BERTOLLO LAC, TAKAHASHI CS e MOREIRA-FILHO O (1978) Cytotaxonomic considerations on Hoplias lacerdae (Pisces, Erythrinidae). Brazilian Journal of Genetics 1(2): DANIEL-SILVA MFZ e ALMEIDA-TOLEDO LF (2001). Chromosome R-banding pattern and conservation of a marker chromosome in four species, genus Astyanax (Characidae, Tetragonopterinae). Caryologia 54: EIGENMANN CH (1921). The American Characidae; III. Memoirs of. Museum of. Conwarative Zoology of Harvard College, Cambridge, Mass. 43: FOWLER HW (1906). Further Knowledge of some heterognathous part 2. Proceedings of the Academy of Natural Sciences of Philadelphia. Philadelphia 58; FERNANDES CA e MARTINS-SANTOS IC (2004). Cytogenetic studies in two populations of Astyanax altiparanae (Pisces, Characiformes). Hereditas.141: FERNANDES CA e MARTINS-SANTOS IC (2005). Sympatric occurrence of three cytotypes and four morphological types of B chromosomes of Astyanax scabripinnis (Pisces, Characiformes) in the river Ivaí basin, state of Paraná, Brazil. Genetica 124:

37 35 FERNANDES CA e MARTINS-SANTOS IC (2006a). Mapping of the 18S and 5S ribosomal RNA genes in Astyanax altiparanae Garutti & Britski, 2000 (Teleostei, Characidae) from the upper Paraná river basin, Brazil. Genetics and Molecular Biology 29: 1-5. FERNANDES CA e MARTINS-SANTOS IC (2006b). Chromosomal location of 5S and 18S rrna genes in three sympatric cytotypes of Astyanax scabripinnis (Characiformes, Characidae) from the Ivaí river basin, state of Paraná, Brazil. Caryologia (Firenze), Itália 59: FERRO DAM, NÉO DM, MOREIRA FILHO O e BERTOLLO LAC (2001). Nucleolar organizing regions, 18S and 5S rdna in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): population and functional diversity. Genetica 110: GALETTI-JR. PM; MESTRINER, CA, MONACO, PJ e RASH, EM (1995), Postzygotic modifications and intra and interindividual nucleolar organizing region variations in fish: report of a case involving Leporinus friderici. Chromosome Research 3: HOWELL WM e BLACK DA (1980). Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with the protective coloidal developer: a 1-step method. Experientia 36: JORGE LC e MOREIRA-FILHO O (2001). Estudios citogenéticos en Astyanax bimaculatus (Pisces, Characidae) del río Paraná, Argentina. Revista de Ictiologia 9 (1/20): LEVAN A, FREDGA K e SANDBERG AA (1964). Nomenclature for centromeric position on chromosome. Hereditas 52: LIMA FCT, MALABARBA LR, BUCKUP PA, SILVA JFP, VARI R P, HAROLD A, BENINE R, OYAKAWA OT, PAVANELLI CS, MENEZES NA, LUCENA CAS,

38 36 MALABARBA MCSL, LUCENA ZMS, REIS RE, LANGEANI F, CASSATI L, BERTACO VA, MOREIRA C e LUCINDA PHF (2003). Genera Incertae Sedis in Characidae. In: REIS RR, KULLANDER SO E FERRARIS JR. (Eds.). Check list of the freshwater fishes of South and Central America. Porto Alegre, Edipucrs LIMA FCT; BUCKUP PA, MENEZES NA; LUCENA CAS; LUCENA ZMS; TOLEDO- PIZA M e ZANATA A (2007). Família Characidae: Gêneros Sedis in Characidae. In: BUCKUP PA; MENEZES NA; GHAZZI MS (Eds.). Catálogo das espécies de peixes de água doce do Brasil. Rio de Janeiro. Museu Nacional LOPES FF (2006). Monitoramento ambiental da bacia hidrográfica do lago Guaíba- RS Brasil, através da utilização de diferentes metodologias aplicadas a taxocenoses de peixes. Tese, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Rio Grande do Sul. 228p. MANTOVANI M, ABEL LDS, MESTRINER CA e MOREIRA-FILHO O (2000). Acentuated polymorfhism of heterochrimatin and nucleolar organizer regions in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): tools understanding karyotypic evolution. Genetica 109: MANTOVANI M, ABEL LDS e MOREIRA FILHO O (2005). Conserved 5S and variable 45S rdna chromosomal localization revealed by FISH in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae). Genetica 123: MELO F (2001). Revisão taxonômica das espécies do gênero Astyanax Baird e Girard,1854 (Teleostei, Characiformes, Characidae) da região da Serra dos Órgãos. Arq. Mus. Nac. Rio de Janeiro. 59:1-46.

39 37 MORELLI, S; BERTOLLO, LAC; FORESTI, F; MOREIRA-FILHO, O e TOLEDO- FILHO, AS (1983) Cytogenetics considerations on the genus Astyanax (Pisces, Characidae), I Karyotypic variability. Caryologia 36(3): PACHECO, RB. (2001). Estudos citogenéticos em diferentes populações de Astyanax altiparanae (Pisces, Tetragonopterinae). Dissertação de Mestrado. Universidade Estadual de Londrina. 97p. PACHECO RB, GIULIANO-CAETANO L e DIAS AL (2001). Occurrence of cytotypes and multiple NORs in an Astyanax altiparanae population (Pisces, Tetragonopterinae). Chromosome Science 5: PAGANELLI, HH, (1990) Diversidade cromossômica no gênero Astyanax, com especial referência a A. bimaculatus. (Linnaeus, 1758). Considerações citotaxonômicas e evolutivas. Dissertação de Mestrado. Departamento de Ciências Biológicas. Universidade Federal de São Carlos. 108 p. PERES WAM, BERTOLLO LAC e MOREIRA-FILHO O (2008). Physical mapping of the 18S and 5S ribosomal genes in nine Characidae species (Teleostei, Characiformes). Genetics and Molecular Biology, 31,1 (suppl), REIS RR, KULLANDER SO E FERARIS JR. (org). (2003). Check list of the freshwater fishes of south and central América. Porto Alegre: Edipucrs. SOUZA IL, GALIANN J, RÚA PDL, BERTOLLO LAC e MOREIRA-FILHO O (2001). Non-radom distribution of the GC-rich heterochromatin and nuclear rdna sites on Astyanax scabripinnis chromosomes. Cytologia 66: SUMNER AT (1972). A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin. Expl. Cell Res. 75:

40 38 SCHWEIZER D (1980). Simultaneous fluorescent staining of R-bands and specific heterochromatic regions (DA-DAPI bands) in human chromosomes. Citogenet. Cell. Genet. 27: SWARÇA AC, GIULIANO-CAETANO L e DIAS AL (2001). Analyses of nucleolus organizer regions and heterocromatin of Pimelodus maculatus (Pisces: Pimelodidae). Genetica 110:

41 CAPÍTULO II CITOGENÉTICA COMPARATIVA ENTRE TRÊS DIFERENTES POPULAÇÕES DE Astyanax altiparanae, COM ÊNFASE À LOCALIZAÇÃO DO DNAR 18S E 5S. * * Este capítulo será enviado para publicação no periódico científico BIOLOGICAL RESEARCH

42 40 CITOGENÉTICA COMPARATIVA ENTRE TRÊS DIFERENTES POPULAÇÕES DE Astyanax altiparanae, COM ÊNFASE À LOCALIZAÇÃO DO DNAR 18S E 5S Palavras-chave: AgNOR, cariótipo, CMA 3, DAPI, DNAr 18S, DNAr 5S, Astyanax altiparanae RESUMO Foram analisadas três populações de Astyanax altiparanae pertencentes aos rios Monjolinho/SP e Água dos Patos/SP e lago Igapó/PR, com todos indivíduos apresentando número diplóide igual 50 cromossomos entretanto, com diferentes fórmulas cariotípicas. A população do rio Monjolinho apresentou 10m, 28sm, 4st e 8a (NF=92), a do rio Água dos Patos 8m, 24sm, 6st e 12a (NF=88) e a população do lago Igapó 8m, 28sm, 4st e 10a (NF=90). As AgNORs foram observadas em regiões terminais do braço curto ou longo de diferentes cromossomos, em todas as populações sendo evidenciada uma variação de 1 até 5 cromossomos, caracterizando um sistema de AgNORs múltiplas nesta espécie. Através da hibridação fluorescente in situ (FISH) utilizando sonda DNAr 18S, foi visualizado apenas um par de cromossomos com sinais fluorescentes na região terminal do braço curto nas populações do rio Monjolinho e lago Igapó, enquanto que, a população do rio Água dos Patos apresentou 4 marcações fluorescentes terminais. Através da hibridação fluorescente in situ (FISH) utilizando sonda DNAr 5S, foi visualizado um par de cromossomos com sinais fluorescentes em posição intersticial nas 3 populações aqui estudadas. O tratamento com cromomicina A 3 (CMA 3 )

43 41 mostrou-se coincidente com alguns sítios da AgNORs, evidenciadas pelo nitrato de prata e não foi observada nenhuma região rica em pares de bases AT. INTRODUÇÃO O gênero Astyanax possui ampla distribuição geográfica na América do Sul e representa um grande grupo de peixes de água doce, sendo o gênero mais comum e diversificado da família Characidae, segundo Lima et al. (2003), revelando estreitamente várias formas semelhantes, formando um complexo, do ponto de vista taxonômico (Garutti e Britski, 2000). Em Astyanax altiparanae da bacia do alto Paraná (Garutti e Britski, 2000), previamente identificados como Astyanax bimaculatus, todos os estudos citogenéticos até o momento, apresentam número diplóide igual a 50 cromossomos, com diferenças na fórmula cariotípica entre as populações analisadas, sendo uma característica da espécie as regiões organizadoras de nucléolos apresentarem-se variáveis em relação ao número e posição das AgNORs (Daniel-Silva e Almeida- Toledo, 2001; Pacheco et al., 2001; Fernandes e Martins, 2004; entre outros). A técnica de hibridação in situ fluorescente (FISH), com sonda de DNAr 18S, foi utilizada em Astyanax altiparanae por Almeida-Toledo et al. (2002) e Fernandes e Martins-Santos (2006a) confirmando a presença e a variabilidade de múltiplos sítios com cístrons ribossômicos nesta espécie. Entretanto, os estudos com sonda de DNAr 5S, apesar de escassos, revelaram uma conservação em relação à localização e número de marcações fluorescentes em diferentes populações de Astyanax altiparanae analisadas por

44 42 Almeida-Toledo et al. (2002) e Fernandes e Martins-Santos (2006a), mostrando um par cromossômico com marcação intersticial. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar e comparar os cariótipos de três populações de Astyanax altiparanae, com ênfase na localização dos genes ribossômicos 18S e 5S. MATERIAL E MÉTODOS Foram analisadas citogeneticamente três populações de Astyanax altiparanae, sendo oito exemplares (dois machos e seis fêmeas) do rio Monjolinho, São Carlos/SP, doze exemplares (três machos e nove fêmeas) do rio Água dos Patos/Iepê/SP e dezesseis exemplares (nove machos e sete fêmeas) do lago Igapó, Londrina/PR. As preparações cromossômicas foram obtidas segundo a técnica de preparação direta, a partir do rim anterior, descrita por Bertollo et al. (1978). As análises cariotípicas foram realizadas com coloração convencional e os cromossomos foram classificados em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a), segundo a metodologia proposta por Levan et al. (1964) com modificações. Os acrocêntricos foram considerados com um braço e os demais com dois braços para cálculo do número fundamental (NF). A detecção da região organizadora de nucléolos foi realizada através da impregnação por nitrato de prata, proposta por Howell e Black (1980). O tratamento