A SÍNDROME DO LEITE INSTÁVEL NÃO ÁCIDO NO LEITE DE VACAS DA RAÇA HOLANDÊS NO TERÇO INICIAL DE LACTAÇÃO UTILIZANDO TRÊS NÍVEIS DE SUPLEMENTAÇÃO 1

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1 A SÍNDROME DO LEITE INSTÁVEL NÃO ÁCIDO NO LEITE DE VACAS DA RAÇA HOLANDÊS NO TERÇO INICIAL DE LACTAÇÃO UTILIZANDO TRÊS NÍVEIS DE SUPLEMENTAÇÃO 1 Renata Wolf Suñé Martins da Silva 2 Mylene Müller 3 1 Parte do projeto de pesquisa do primeiro autor, financiado pela EMBRAPA 2 Pesquisadora - EMBRAPA CPPSul, Bagé, RS. renata@cppsul.embrapa.br 3 Prof a. Adj a. do Campus Dom Pedrito/UNIPAMPA/Dom Pedrito, RS. mylenemuller@yahoo.com.br RESUMO O leite instável não ácido (LINA) caracteriza-se pela reação positiva do leite ao teste do álcool sem que haja acidez titulável na amostra acima de 18 graus Dornic ( D). As causas conhecidas de alterações na estabilidade do leite e incidência de LINA estão associadas à estação do ano, alterações na dieta e subnutrição além do estágio da lactação. Na Embrapa Pecuária Sul, vacas da raça Holandesa foram mantidas em pastagens cultivadas de aveia e azevém na oferta diária de 6 kg de matéria seca por dia por 100 kg de peso vivo e dividas em três grupos: um grupo foi mantido totalmente a pasto, e os outros dois grupos receberam diariamente 4 e 8 kg de concentrado respectivamente. Foram realizados os testes de acidez titulável em D e precipitação à prova do álcool em diferentes concentrações. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de F e Dunnett, ao nível de 5% de significância, utilizando-se o SPSS Do total de amostras de leite analisadas, não foram classificadas como LINA (87,9%), mas em 774 amostras houve ocorrência de LINA, representando 12,1% das amostras. As vacas mantidas somente em pastagens apresentaram 491 (18%) de LINA e os animais alimentados com concentrado apresentaram 227 amostras (9,4%) e 56 (4,5%) respectivamente de resultado positivo no álcool sem estarem ácidas para os níveis de 4 e 8 kg. Houve diferença significativa (P<0,01) entre os níveis de concentrado e os resultados obtidos para a incidência de LINA. Os animais mantidos somente a pasto apresentaram os maiores valores (P<0,01) de LINA em relação aos suplementados. Palavras-chave: LINA, teste do álcool, estabilidade térmica ABSTRACT The acid-unstable milk (LINA) is a positive reaction to milk alcohol test without the acidity in the sample above 18 degrees Dornic ( D). Known causes of changes in the stability of milk are associated with the different seasons, changes in diet and malnutrition beyond the stage of lactation. In Embrapa Pecuária Sul, Holstein cows were kept in pastures of oats and ryegrass grazing a daily supply of 6 kg of dry matter per day per 100 kg live weight and divided into three groups: one group was

2 kept entirely on pasture, and the other two groups received daily 4 and 8 kg of concentrate respectively. Tests were performed in D acidity and precipitation-proof alcohol in different concentrations. Data were subjected to analysis of variance and means were compared by F test and Dunnett, at 5%, using SPSS Of a total of 6,391 milk samples analyzed, 5,617 were classified as non-lina (87.9%), and LINA occurred in 774 samples (12.1%). The cows kept on pasture had only 491 (18%) of LINA, and animals fed concentrate had 227 samples (9.4%) and 56 (4.5%) for 4 and 8Kg of concentrate respectively, of positive result in alcohol. There were significant differences (P <0.01) between levels of concentrate and the results obtained for the incidence of LINA. The animals fed only on pasture had higher values (P <0.01) compared to supplemented. Keywords: Lina, alcohol test, thermal stability INTRODUÇÃO A prova do álcool é recomendada pelo Ministério da Agricultura como um método a ser utilizado, na coleta do leite na propriedade, visando estimar a estabilidade das proteínas do leite durante o processamento térmico e ou para verificar se o leite encontra-se ácido. O leite cuja amostra reage positivamente pode ser descartado por não ser considerado apto aos processos de beneficiamento. Existe uma concentração mínima do álcool que deve ser usada para a classificação do leite (72% v/v), porém não há limite para a concentração máxima de etanol que pode ser utilizada pela indústria (BRASIL, 2002). Nesta prova, o álcool atua como um desidratante e simula as condições de aquecimento. A amostra de leite é cuidadosamente misturada a uma solução alcoólica contendo um indicador de ph (alizarina) e observa-se a ocorrência de formação de um precipitado, ou coagulação. Essa precipitação pode ocorrer pela redução do ph, ocasionado pela fermentação da lactose até a produção de ácido lático, o que resulta na instabilidade da proteína. Dentre os fatores que podem desencadear essa fermentação da lactose pode-se destacar a falta de higiene e/ou deficiente refrigeração do leite. Este aumento na acidez do leite, causada pelo crescimento de bactérias e produção de ácido láctico, causará um resultado positivo no teste, embora o ph preciso em que isto ocorra não seja o mesmo para toda amostra de leite. Já na indústria é realizado o teste de Dornic, que titula a acidez do leite, onde amostras com acidez acima de 18 D são consideradas ácidas.

3 Porém autores como Yoshida, (1980) no Japão, Pecorari et al. (1984) na Itália, Sobhani et al. (2002) no Iran, Ponce Ceballo (2001) em Cuba, Barros et al. (1999) no Uruguay e Conceição et al. (2001); Donatele et al. (2001); Marques (2004) e Suñé (2010) no Brasil, relatam o aparecimento de reação positiva na prova do álcool ou na do cozimento, não sendo originário da fermentação da lactose por parte dos microrganismos, ou seja, amostras de leite que reagem positivamente ao teste do álcool sem apresentar acidez titulável acima de 18 D, caracterizando a síndrome do leite instável não ácido (LINA). O LINA caracteriza-se pela perda da estabilidade da proteína do leite sem apresentar acidez elevada, estando a mesma situada dentro dos limites aceitos pela indústria (14-18 D). Embora o complexo que determina o aparecimento do LINA ainda careça de informações, fatores relacionados com sua incidência têm sido as alterações bruscas na dieta (BARROS, 2001), deficiência de energia (PONCE e HERNÁNDEZ, 2001) e subnutrição (ZANELA, 2004). Além de dietas ricas em cálcio, deficiência ou desequilíbrio mineral (BARROS, 2001), e genética (ROBITAILLE et al., 2001). O experimento objetivou avaliar a influência de três níveis de concentrado na incidência do LINA com diferentes concentrações alcoólicas no teste do álcool em vacas da raça holandesa do terço inicial até o final do terço médio de lactação. Material e Métodos O presente trabalho foi desenvolvido na Embrapa Pecuária Sul, no setor de gado leiteiro, durante o período de outono inverno. Foram utilizadas 37 vacas da raça Holandesa paridas no outono e acompanhadas até o início da primavera, do início até o final do terço médio da lactação, de maio a dezembro. As vacas foram alocadas em três grupos segundo o nível do concentrado utilizado (0, 4 e 8 kg diários), sendo todas as vacas mantidas em pastagens de aveia e azevém na oferta diária de 6 kg de matéria seca (MS)/dia por 100 kg de peso vivo.a suplementação dos animais foi realizada com concentrado comercial com 18% de proteína bruta (PB). O leite individual de cada animal foi coletado semanalmente na ordenha da manhã e refrigerado até a tarde para a realização das análises. De cada amostra

4 devidamente refrigerada foi retirada uma alíquota para realização do teste do álcool em seis concentrações crescentes, e outra alíquota para realização titulação no acidímetro de Dornic. O teste do álcool foi realizado homogenizando 2mL de leite e 2mL de álcool em placa de petry para observar a formação de grumos. No experimento, para cada amostra coletada foi realizado o teste do álcool com concentrações alcoólicas crescentes de 68, 70, 72, 74, 76, 78 e 80%. Na titulação no acidímetro Dornic, o hidróxido de sódio é usado para neutralizar o ácido do leite. A fenolftaleína é usada como indicador, mostrando a quantidade do álcali necessária para neutralizar o ácido do leite. O indicador permanece incolor quando misturado com uma substância ácida, mas adquire coloração rosa em meio alcalino. Portanto, o álcali é adicionado ao leite até que o mesmo adquirira a coloração rósea. Assim, a leitura do teste por parte do avaliador é feita através da identificação do ponto em que o leite fica rosado. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de F e Dunnett, ao nível de 5% de significância, utilizando-se o SPSS Resultados e Discussão Do total de amostras de leite analisadas, não foram classificadas como LINA (87,9%), mas em 774 amostras houve ocorrência de LINA, representando 12,1% das amostras. Na tabela 1 encontram-se os dados referentes a ocorrência de LINA de acordo com o nível de suplementação sem considerar a concentração do álcool utilizado. Houve diferença significativa (P<0,01) entre os níveis de concentrado e os resultados obtidos para a incidência de LINA. Os animais mantidos somente a pasto apresentaram os maiores valores (P<0,01) de LINA em relação aos suplementados. Zanella et al. (2006), trabalhando com vacas Jersey no meio da lactação submetidas a restrição alimentar observaram que a restrição alimentar aumentou a ocorrência de LINA na maioria dos animais e a reversão do quadro foi possível através da correção da dieta. Já com vacas Holandesas, avaliando os efeitos de dois níveis de oferta de pasto, com 4 e 8 kg de matéria seca por 100 kg de peso vivo, sobre as

5 propriedades físico-químicas e a estabilidade do leite à prova do álcool, Frucalso et al. (2006) encontraram que a oferta mais baixa de pasto diminuiu a estabilidade ao álcool. Oliveira et al. (2011) ao analisarem amostras de leite colhidas na região nordeste do Estado de São Paulo, observaram que o LINA apresentou menores teores de proteína bruta e lactose no período seco quando comparado ao leite estável à prova do álcool a 78% (v/v). Entretanto, apresentou maiores percentuais de gordura e a contagem de células somáticas. Tabela 1 Ocorrência de leite instável não ácido para os diferentes níveis de suplementação LINA 0 kg 4 kg 8 kg N % N % N % Falso ,0% ,6% ,5% Verdadeiro 491 a 18,0% 227 b 9,4% 56 c 4,5% Total ,0% ,0% ,0% a, b, c Médias seguidas por letras distintas, na linha, entre tratamentos, diferem entre si a 5% de probabilidade pelo teste Dunnett. Na figura 1 constam os valores de incidência de LINA de acordo com a concentração do álcool utilizado. Conforme se aumentou a concentração do álcool utilizado, maior foi a incidência de LINA, para os três níveis de concentrado. Marques et al. (2010) utilizando 24 vacas da raça Jersey suplementadas com três níveis nutricionais: baixo nível de energia e proteína; baixo nível de energia e alto de proteína; e altos de energia e proteína, observaram que o leite das vacas que receberam altos níveis de energia e proteína foi mais estável na prova do álcool, sendo necessária maior concentração de álcool na solução alcoólica (74,97% v/v) que o leite produzido pelo baixo nível de energia e proteína (69,23% v/v) e baixo nível de energia e alto de proteína (70,81% v/v).

6 Percentual de Amostras LINA positivas Distribuição das amostras LINA positivas de acordo com a concentração do álcool utilizado e nível de concentrado fornecido 40,00% 35,00% 30,00% 25,00% 20,00% 15,00% 0 kg % 4 kg % 8 kg % 10,00% 5,00% 0,00% Concentração do Alcool Figura 1 Distribuição das amostras LINA positivas de acordo com a concentração do álcool utilizado e nível de concentrado A incidência de LINA para o nível de álcool 72% foi inferior no leite produzido pelos animais suplementados com 8 kg de concentrado, durante todas as semanas, exceto nos períodos (semanas) 8 e 9 (Figura 2). Além disso, nesse mesmo gráfico pode ser observado que a incidência de amostras positivas ao LINA se concentram com o avançar da lactação para ambos os grupos de 0 e 4kg de concentrado. Barros et al. (2006) relacionaram a perda da estabilidade da fração protéica do leite com o teor de cálcio iônico do mesmo. Enquanto Barbosa et al. (2006), buscando avaliar com vacas Jersey em três estágios de lactação e o efeito do momento de lactação no cálcio iônico do leite observaram que o valor médio do cálcio iônico de vacas com 7 a 10 meses em lactação foi superior (0,1202 g/l) àqueles das vacas com 1 a 3 meses ou mais de 10 meses em lactação. Estes resultados corroboram com os obtidos nesse experimento onde a maior incidência de amostras positivas ocorreu com os animais entrando no sétimo mês de lactação. Barros (1999) afirma

7 Percentual de positivas também que existe uma evidente relação entre o período de lactação e positividade ao LINA, sendo os períodos de maior ocorrência o inicio e o final de lactação Percentual de amostras LINA positivas ao Álcool 72% ao longo das semanas de acordo com o nível de concentrado 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% O kg 4 kg 8 kg 20,00% 10,00% 0,00% Semanas Figura 2 - Incidência de LINA no álcool 72% de acordo com o nível de suplementação ao longo das semanas de lactação. Na figura 3 pode-se observar que a incidência de LINA para o nível de álcool 74% mantem o observado na incidência com álcool 72%, sendo que a incidência de amostras positivas foi inferior no nível 8kg e ocorre concentração de amostras positivas nas últimas semanas para os níveis 0 e 4kg.

8 Percentual de positivas Percentual de amostras LINA positivas ao Álcool 74% ao longo das semanas de acordo com o nível de concentrado 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% O kg 4 kg 8 kg 20,00% 10,00% 0,00% Semanas Figura 3 - Incidência de LINA no álcool 74% de acordo com o nível de suplementação ao longo das semanas de lactação. Na figura 4 encontram-se a incidência de LINA durante as 34 semanas de experimento, com o nível de 76% de álcool. Pode-se observar que as amostras positivas ainda se concentram nos níveis de 0 e 4 kg e aparecem com maior intensidade nas últimas semanas, o mesmo ocorrendo nas concentrações de álcool 76 e 78%, conforme se observa nas figuras 6 e7.

9 Percentual de positivas Percentual de positivas Percentual de amostras LINA positivas ao Álcool 76% ao longo das semanas de acordo com o nível de concentrado 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% O kg 4 kg 8 kg 20,00% 10,00% 0,00% Semanas Figura 4- Incidência de LINA no álcool 76% de acordo com o nível de suplementação ao longo das semanas de lactação. Percentual de amostras LINA positivas ao Álcool 78% ao longo das semanas de acordo com o nível de concentrado 90,00% 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% O kg 4 kg 8 kg 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% Semanas Figura 5 - Incidência de LINA no álcool 78% de acordo com o nível de suplementação ao longo das semanas de lactação.

10 Percentual de positivas Percentual de amostras LINA positivas ao Álcool 80% ao longo das semanas de acordo com o nível de concentrado 90,00% 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% O kg 4 kg 8 kg 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% Semanas Figura 6 - Incidência de LINA no álcool 80% de acordo com o nível de suplementação ao longo das semanas de lactação. A porcentagem de LINA variou durante os meses em estudo, sendo mais elevada no final do verão e início do outono (fevereiro e março). Diversos autores identificaram a ocorrência de variações sazonais na frequência do leite instável. Entretanto, os períodos de maior ocorrência podem variar de acordo com a região em estudo (Zanella et al., 2009). No presente estudo os meses que apresentaram maior incidência foram os meses de final de primavera, início do verão. Podendo estar associado a época da lactação e também a queda da qualidade das pastagens utilizadas com aumento da fibra observada nesta época. CONCLUSÕES Nas condições do experimento a incidência de leite instável não ácido foi crescente conforme o avanço da lactação. O nível de suplementação reduziu a incidência de leite instável ácido do leite de vacas Holandesas em pastagens de aveia e azevém. REFERÊNCIAS

11 BARBOSA, R.S; SILVEIRA, I.D.B; FISCHER, V. et al. Efeitos dos horários de medida, do estádio de lactação e do leite instável não ácido (LINA) sobre alguns atributos físicos do leite bovino. In: CONGRESSO PAN-AMERICANO DO LEITE, 9., 2006, Porto Alegre. Anais... Juiz de Fora: Embrapa Gado de Leite, p BARROS, L. DENIS, N., GONZALEZ, A., NUÑEZ, A. A prueba del alcohol em leche y relacion com cálcio iônico. Revistas Praticas Veterinárias, v.9, n., 315 p BARROS, L. Ionized calcium as responsible of stability of milk. In: CONGRESSO PAN-AMERICANO DO LEITE, 9., 2006, Porto Alegre. Anais... Juiz de Fora: Embrapa Gado de Leite, p BARROS, L. Transtornos metabólicos que afetam a qualidade do leite. In: GONZÁLEZ, F. H. D.; DÜRR, J. W.; FONTANELI, R. S. (Ed.). Uso do leite para monitorar a nutrição e metabolismo de vacas leiteiras. Porto Alegre: Ed. da UFRGS, p BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal. Instrução Normativa nº51 de 18 de setembro de Aprova e oficializa o Regulamento técnico de identidade e qualidade de leite cru e refrigerado. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, setembro de CONCEIÇÃO, R. C. S.; MARQUES, L. T.; GANDRA, E. A. et al. Correlação entre as provas do álcool e da acidez titulável para amostras de leite com síndrome do leite anormal (SILA). In: CONGRESSO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 10., Pelotas. Anais... Pelotas: Universidade Federal de Pelotas, CDROM. DONATELE, D. M.; FOLLY, M. M.; VIEIRA, L. F. P.; TEIXEIRA, G. N. Estudo da relação da prova do álcool 72% (v/v) com ph, grau Dornic e contagem de células somáticas do leite de vacas no município de campos do Goyatacazes, RJ. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINÁRIA, 28., Brasília, DF. Anais... Brasília, DF: SBMV, CD-ROM. FRUCALSO, V. FISHER, V. ZANELLA, M.B. Influência da oferta de pasto sobre as propriedades físico-químicas do leite e a ocorrência de leite instável não ácido (LINA). In: CONGRESSO PAN-AMERICANO DO LEITE, 9., 2006, Porto Alegre. Anais... Juiz de Fora: Embrapa Gado de Leite, p , MARQUES, L.T.; FISCHER, V.; ZANELA, M.B. et al. Fornecimento de suplementos com diferentes níveis de energia e proteína para vacas Jersey e seus efeitos sobre a instabilidade do leite. Revista Brasileira de Zootecnia, v.39, n.12, p , OLIVEIRA, C.A.F.; LOPES, L.C.; FRANCO, R.C. et al. Composição e características físico-químicas do leite instável não ácido recebido em laticínio do Estado de São Paulo, Brasil. Revista Brasileira de Saúde Produção Animal, Salvador, v.12, n.2, p abr/jun, 2011.

12 PECORARI, M.; FOSSA E.; AVANZINI, G.; MARIAN, P. Milk with abnormal coagulation: acidity, chemical composition and observation on the metabolic profile of the cow. Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia, Parma, v. 35, n. 4, p , PONCE CEBALLO, P.; HERNÁNDEZ, R. Propriedades físico-químicas do leite e sua associação com transtornos metabólicos e alterações na glândula mamária. In: GONZÁLEZ, F.H.D.; DÜRR, J.W.; FONTANELI, R.S. (Ed.). Uso do leite para monitorar a nutrição e metabolismo de vacas leiteiras. Porto Alegre: UFRGS, p ROBITAILLE, G.; BRITTEN, M.; PETITCLERC, D. Effect of a differential allelic expression of kappa-casein gene on ethanol stability of bovine milk. Journal of Dairy Research, v. 68, p , SOBHANI, S.; VALIZADEH, R.; NASERIAN, A. Alcohol stability of milk and its relation to milk and blood composition in Holstein dairy cows. Journal of Animal Science, Champaign, v. 80, p. 59, SUÑÉ, R.W. A incidência de amostras de leite com reação positiva ao teste do álcool em diferentes concentrações na região da Campanha do Rio Grande do Sul e a relação com a acidez titulável no acidímetro de Dornic. Bagé: Embrapa Pecuária Sul, Disponível em: Acesso em: 30 dez YOSHIDA, S. Studies on the Utrech abnormality of milk in the Miyuki Dairy Farm. Journal of the Faculty of Applied Biological Science, Hiroshima, v. 19, n. 1, p , ZANELA, M. B.; MARQUES, T. M.; FISCHER, V. et al. Indução e reversão do leite instável não ácido (LINA). In: CONGRESSO PAN-AMERICANO DO LEITE, 9., 2006, Porto Alegre. Anais... Juiz de Fora: Embrapa Gado de Leite, p , ZANELA, M.B. et al. Ocorrência do leite instável não ácido no noroeste do Rio Grande do Sul. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., Belo Horizonte, v. 61, n.4, Aug., 2009.