COMPOSIÇÃO MONOMÉRICA DE CANA-DE-AÇÚCAR TRATADA COM INIBIDORES ENZIMÁTICOS DA LIGNIFICAÇÃO

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1 COMPOSIÇÃO MONOMÉRICA DE CANA-DE-AÇÚCAR TRATADA COM INIBIDORES ENZIMÁTICOS DA LIGNIFICAÇÃO Victor Hugo Salvador 1 ; Dyoni Matias de Oliveira 2 ; Osvaldo Ferrarese-Filho 3, Wanderley Dantas dos Santos 4 RESUMO: A utilização da biomassa lignocelulósica como fonte de energia renovável apresenta uma importante contribuição para o desenvolvimento de uma sociedade industrial sustentável. A biomassa lignocelulósica é formada principalmente pelos polissacarídeos e fenilpropenoides que compõem a parede celular. Os polímeros de fenilpropanóides como a lignina inibem a atividade de hidrolases reduzindo a eficiência da sacarificação. Para avaliar o efeito de inibidores enzimáticos da via dos fenilpropanoides, plantas de cana-de-açúcar foram submetidas por 30 dias a tratamentos in vivo com inibidores de duas enzimas da via dos fenilpropenoides, 100 -cinamil hidroxilase e 120 µm de ácido metilenodioxicinâmico (MDCA), inibidor da 4-coenzima A ligase. As plantas foram colhidas e pesadas para obtenção da biomassa fresca e comprimento do colmo. Raízes, colmos e folhas foram secos em estufa com circulação de ar a 60 C até peso constante e considerado como biomassa seca. De acordo com os resultados, a concentração do monômero H não sofreu alteração estatisticamente significativa em relação ao controle em nenhum dos tratamentos. Os monômeros G e S sofreram reduções significativas apenas no tratamento com PIP 100 não foi significativamente afetado em nenhum dos tratamentos. Não houve uma relação direta entre a composição monomérica e o conteúdo de lignina. PALAVRAS-CHAVE: Ácido ferúlico; Monolignóis; Lignina. 1. INTRODUÇÃO O sistema energético da civilização contemporânea baseado na extração de petróleo é insustentável no longo prazo. Deste modo, surge a necessidade de desenvolvermos tecnologias que nos permitam explorar fontes sustentáveis de energia e assim assegurar um contínuo desenvolvimento econômico (Escobar et al., 2009). Dentre as fontes renováveis de energia, a biomassa lignocelulósica é a matéria-prima renovável mais abundante disponível e a que possui o maior potencial para substituir o petróleo em um panorama tecnológico e econômico razoável (Buaban et al., 2010). A biomassa lignocelulósica é constituída, principalmente, de celulose, hemicelulose e lignina (Pauly & Keegstra, 2010). E a presença de ácidos hidroxicinâmicos, como ácido ferúlico e p-cumárico, além de outros compostos fenólicos esterificados a pectinas, hemiceluloses, lignina e proteínas estruturais, restringem o crescimento celular e dificultam o ataque de hidrolases sobre estes polissacarídeos (Lygin et al., 2011). 1 Doutorando em Ciências Biológicas área de concentração Biologia Celular e Molecular da Universidade Estadual de Maringá UEM, Maringá Paraná. victorhsalvador@hotmail.com 2 Acadêmico do curso de Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Maringá UEM, Maringá Paraná. 3 Professor Doutor do Departamento de Bioquímica da Universidade Estadual de Maringá UEM, Maringá Paraná. 4 Professor Doutor do Departamento de Ciências Agrárias da Universidade Estadual de Maringá UEM, Umuarama Paraná.

2 ISBN A lignina é formada pela ligação covalente de monolignóis, hidroxicinamil alcoóis (monolignóis): p-cumaril, coniferil e sinapil, correspondendo às unidades monoméricas H, G e S, respectivamente, formados na via dos fenilpropenoides. Ela envolve as microfibrilas celulósicas, conferindo proteção à degradação química e/ou biológica, e pode formar ligações covalentes com a hemicelulose (Chiang, 2006). O ácido ferúlico é um componente-chave na digestibilidade da parede celular, com papel estrutural interligando os polímeros da parede inibindo a atividade de hidrolases ou como intermediário na síntese dos monômeros da lignina (dos Santos et al., 2008). Estudos de digestão in vitro sugerem que a digestibilidade da parede celular e o grau de interligação da parede pelo ácido ferúlico são negativamente correlacionados (Grabber et al., 1998). Desta forma, reduzir a disponibilidade do ácido ferúlico na parede celular utilizando inibidores químicos específicos da via dos fenilpropenoides pode contribuir para a melhoria da digestibilidade da biomassa lignocelulósica. O objetivo deste trabalho foi avaliar alterações do conteúdo de lignina e sua composição monomérica de plantas de cana-de-açúcar submetidas ao tratamento in vivo com inibidores de duas enzimas da via dos fenilpropenoides, o ácido piperonílico (PIP), inibidor pelo mecanismo da 3-cumarato hidroxilase e o ácido metilenodioxicinâmico (MDCA), inibidor competitivo da 4-coenzima A ligase. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. PROCEDIMENTOS GERAIS Colmos de cana-de-açúcar (variedade RB966928) foram seccionados, homogeneizados e colocados em bandejas com areia e água por 15 dias para enraizamento. Em seguida, foram plantados em vasos de 14 litros e cultivados por 60 dias em casa de vegetação. Após os 60 dias, foi obtido o comprimento inicial das plantas (da transição raiz-caule até a ponta da folha mais longa) e iniciado o tratamento por 30 dias com 120 µm de MDCA, 100 M e 250 M de PIP, controles foram irrigados com água destilada. Ao final deste período, as plantas foram novamente medidas (comprimento final) e a diferença entre o comprimento inicial e final foi expresso como variação do comprimento. As plantas foram colhidas, separadas em suas diferentes partes e pesadas para obtenção da biomassa fresca e comprimento do colmo. Raízes, colmos e folhas foram secos em estufa com circulação de ar a 60 C até peso constante e considerado como biomassa seca. Os colmos, após secos, foram triturados em moinho de esfera por 5 minutos. Este material triturado foi utilizado para a determinação monomérica de lignina e da lignina DETERMINAÇÃO MONOMÉRICA DE LIGNINA Para determinar a composição monomérica da lignina foi usada a oxidação com nitrobenzeno. Uma fração da parede celular, do tegumento ou do bagaço de cana, livre de proteínas (50 mg) foi colocada em uma ampola contendo 1 ml de NaOH 2 M e 100 μl de nitrobenzeno. A ampola foi selada e aquecida a 170 C por 2,5 h, com agitação na metade do tempo de reação. Após oxidação, a amostra foi resfriada, lavada duas vezes com clorofórmio, acidificada com HCl 5 M e extraída duas vezes com clorofórmio. Os extratos orgânicos foram combinados, secos e ressuspendidos em metanol. Todas as amostras foram filtradas em filtro de 0,45 μm e analisadas por HPLC. A fase móvel foi metanol/ácido acético 4% em água (20/80, v/v), com fluxo de 1,2 ml min -1. As quantificações de p-hidroxibenzaldeído (monômero H) vanilina (monômero G) e siringaldeído (monômero S) foram realizadas a 290 nm utilizando os padrões

3 correspondentes. Os resultados foram expressos como miligrama do monômero por grama de parede celular QUANTIFICAÇÃO DA LIGNINA PELO MÉTODO ACETILBROMIDA (AB) Para a determinação da lignina pelo método acetilbromida, 20 mg da parede celular do bagaço de cana foram colocadas em tubos de vidro com rosca. Posteriormente, foram adicionados 0,5 ml do reagente acetilbromida 25%, preparado em ácido acético. Os tubos foram tampados, agitados e levados ao banho-maria por 30 minutos a 70º C. Em seguida, as amostras foram resfriadas em banho de gelo e adicionou-se 0,9 ml de NaOH 2M, 0,1 ml de hidroxilamina HCl 7,5M e 2 ml de ácido acético. As amostras foram centrifugadas por 5 minutos a 2400 RPM. O sobrenadante foi diluído em ácido acético e a leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro a 280 nm. A concentração de lignina foi determinada de acordo com uma curva padrão e foi expressa em miligrama de lignina por grama de parede celular. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO A determinação monomérica de lignina pode ser vista na figura 1. A concentração do monômero H, não sofreu alteração significativa em nenhum dos tratamentos em relação ao controle. Já os monômeros G e S sofreram reduções significativas no tratamento com PIP 100 M. Mostrando que mesmo em concentrações pequenas o PIP altera a composição monomérica da lignina pela inibição da 3-cumarato hidroxilase. Figura 1. Determinação monomérica de lignina de colmos de cana. H) Monômero p-hidroxifenil; G) monômero guaiacil; S) monômero siringil. Valores médios (N=6 ± erro padrão da média) marcados com * diferem significativamente (p 0,05, teste t Student) A quantificação da lignina pelo método AB (Figura 2.), não mostrou diferença significativa em nenhum dos tratamentos.

4 Figura 2. Quantificação dos teores de lignina a partir do método Acetilbromida em colmos de cana. Valores médios (N=6 ± erro padrão da média) analisados com teste t-student a 5% de significância. 4. CONCLUSÃO As plantas de cana-de-açúcar tratadas apenas com PIP 100 M apresentaram reduções significativas nos monômeros G e S sem afetar significativamente o conteúdo de lignina. Esta metodologia pode ser utilizada como ferramenta para estudar o metabolismo e controle da lignificação bem como seus efeitos sobre as propriedades da biomassa e da estrutura da planta. 5. REFERÊNCIAS BUABAN, B., INOUE, H., YANO, S., TANAPONGPIPAT, S., RUANGLEK, V., CHAMPREDA, V., PICHYANGKURA, R., RENGPIPAT, S., EURWILAICHITR, L. Bioethanol production from ball milled bagasse using a non-site produced fungal enzyme cocktail and xylose-fermenting Pichias tipitis. Journal of Bioscience and Bioengineering, 10(1), 18-25, CHIANG, V.L. Monolignol biosynthesis and genetic engineering of ligninin trees, a review. Environmental Chemistry Letters, 4, s, DOS SANTOS, W.D., FERRARESE, M.L.L., FERRARESE-FILHO, O. Ferulic Acid: An Allelochemical Troublemaker. Functional Plant Science and Biotechnology, 2(1), 47-55, ESCOBAR, J.C., LORA, E.S., VENTURINI, O.J., YÁÑEZ, E.E., EDGAR F. CASTILLO, ALMAZAN, O. Biofuels Environment, technology and food security. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 13, , GRABBER, J.H., RALPH, J., HATFIELD, R.D. Ferulate cross-links limit the enzymatic degradation of synthetically lignified primary walls of maize. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46, , 1998.

5 LYGIN, A.V., UPTON, J., DOHLEMAN, F.G., JUVIK, J., ZABOTINA, O.A., WIDHOLM, J.M., LOZOVAYA, V.V. Composition of cell wall phenolics and polysaccharides of the potential bioenergy crop - Miscanthus. GCB Bioenergy, 3, , PAULY, M., KEEGSTRA, K. Plant cell wall polymers as precursors for biofuels. Current Opinion in Plant Biology, 13, , 2010.