INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL

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1 INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL EFICIÊNCIA DE DOIS PROTOCOLOS DE IATF UTILIZANDO BENZOATO DE ESTRADIOL OU GnRH Vinicius Antonio Pelissari Poncio Nova Odessa Fevereiro 2012

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3 GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL EFICIÊNCIA DE DOIS PROTOCOLOS DE IATF UTILIZANDO BENZOATO DE ESTRADIOL OU GnRH Vinicius Antonio Pelissari Poncio Keila Maria Roncato Duarte Rafael Herrera Alvarez Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação do Instituto de Zootecnia, APTA/SAA, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Produção Animal Sustentável. Nova Odessa Fevereiro, 2012 i

4 Ficha elaborada pelo Núcleo de Informação e Documentação do Instituto de Zootecnia Bibliotecária responsável Ana Paula dos Santos Galletta - CRB8/7166 P795e Poncio, Vinicius Antonio Pelissari Eficiência de dois protocolos de Iatf utilizando benzoato de estradiol ou GnRH. / Vinicius Antonio Pelissari Poncio. Nova Odessa - SP, p. : il. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Zootecnia. APTA/SAA. Orientador: Prof. Dra. Keila Maria Roncato Duarte. 1. Bovinos - Inseminação artificial. 2. Fêmeas sincronizadas. 3. Estradiol. I. Duarte, Keila Maria Roncato. II. Título. CDD ii

5 GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL Certificado de aprovação EFICIÊNCIA DE DOIS PROTOCOLOS DE IATF UTILIZANDO BENZOATO DE ESTRADIOL OU GnRH Vinicius Antonio Pelissari Poncio Orientadora: Keila Maria Roncato Duarte Co-orientador: Rafael Herrera Alvarez Aprovado como parte das exigências para obtenção de título de MESTRE em produção Animal sustentável, pela Comissão Examinadora: Profa.Dra. Keila Maria Roncato Duarte Instituto de Zootecnia APTA/SAA Dr. Fabio Morato Monteiro Instituto de Zootecnia APTA/SAA Dr. Daniel Jesus Cardoso de Oliveira Polo de Andradina APTA/SAA Data da realização: 08 de fevereiro de 2012 Presidente da Comissão Examinadora Profa.Dra. Keila Maria Roncato Duarte iii

6 Dedicatória A minha esposa Camila, pelo seu amor, companheirismo e dedicação, sempre vibrando por todas minhas conquistas. Aos meus familiares, pela ajuda no decorrer deste percurso. iv

7 Agradecimentos Ao Instituto de Zootecnia por oferecer o curso, e aos Docentes e Funcionários da Pós-Graduação. A minha orientadora Dra. Keila Maria Roncato Duarte pela dedicação, comprometimento, paciência e companheirismo. Ao meu co-orientador Dr. Rafael Herrera Alvarez pelo experimento e apoio técnico do meu trabalho. As Bancas de Qualificação e Defesa pelas correções e sugestões que enriqueceram meu trabalho. Aos colegas de curso em especial ao Alfredo por todos bons momentos vividos nesses anos todos. A todos os estagiários e funcionários do laboratório. Em fim a todos que de alguma forma colaborou para o termino de mais uma fase da minha vida. Muito Obrigado. v

8 Sumário SUMÁRIO... vi LISTA DE FIGURAS... viii LISTA DE TABELAS... ix EFICIÊNCIA DE DOIS PROTOCOLOS DE IATF UTILIZANDO BENZOATO DE ESTRADIOL OU GNRH... x RESUMO... x PERFORMANCE OF TWO FTAI PROTOCOLS USING OESTRADIOL BENZOATE OR GNRH... xi ABSTRACT... xi CAPÍTULO 1 CONSIDERAÇÕES GERAIS INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA FISIOLOGIA DO CICLO ESTRAL EM BOVINO HORMÔNIOS ENVOLVIDOS NO CICLO ESTRAL INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM TEMPO FIXO (IATF) PROTOCOLOS DE IATF PROTOCOLO UTILIZANDO BENZOATO DE ESTRADIOL PROTOCOLO OVSYNCH PROTOCOLO CO-SYNCH 7 DIA PROTOCOLO CO-SYNCH 5 DIA vi

9 2.4. QUALIDADE DOS PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL SUSTENTABILIDADE E MERCADO IMPORTADOR DA CARNE BRASILEIRA RESÍDUO DE AGENTE ANABÓLICO MÉTODOS PARA DETECÇÃO DE RESÍDUOS DE ANABOLIZANTES REFERÊNCIAS CAPÍTULO 2 EFICIÊNCIA DE DOIS PROTOCOLOS DE IATF UTILIZANDO BENZOATO DE ESTRADIOL OU GNRH RESUMO PERFORMANCE OF TWO FTAI PROTOCOLS USING OESTRADIOL BENZOATE OR GNRH ABSTRACT INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS LOCAL E ANIMAIS TRATAMENTOS VARIÁVEIS ANALISADAS ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS E DISCUSSÃO ANÁLISE DOS RESULTADOS ANÁLISE ESTATÍSTICA CONCLUSÃO REFERÊNCIAS vii

10 Lista de Figuras Figura 1 Controle hormonal do ciclo estral de fêmeas pelo eixo hipotálamo-hipófiseovários. FSH: hormônio folículo estimulante; GnRH: hormônio liberador de gonadotrofinas; LH: hormônio luteinizante (DIB et al, 2008). 8 Figura 2 Representação esquemática das variações, na concentração dos principais hormônios que regulam o ciclo estral em bovinos (CNPGC EMBRAPA, 2011) 10 Figura 3 Protocolo de IATF utilizando Benzoato de Estradiol (Arquivo Pessoal). 14 Figura 4 Protocolo Ovsynch utilizando GnRH (Arquivo Pessoal). 15 Figura 5 Protocolo Co-synch 7 dias utilizando GnRH (Arquivo Pessoal). 17 Figura 6 Protocolo Co-synch 5 dias utilizando GnRH (Arquivo Pessoal). 18 Figura 7 Protocolo de IATF com Benzoato de Estradiol utilizado no experimento (arquivo pessoal). 38 Figura 8 Protocolo de IATF com GnRH utilizado no experimento (arquivo pessoal). 39 Figura 9 Taxa de Concepção dos Grupos Estudados. 46 Figura 10 Comparação da Manifestação do Estro com a Taxa de Concepção. 47 Figura 11 Presença do CL no Inicio do Protocolo, Manifestação do Estro e Taxa de Concepção 48 viii

11 Lista de Tabelas Tabela 1 Resultados observados no grupo 1 (Benzoato de Estradiol) 42 Tabela 2 Resultados observados no grupo 2 (GnRH) 42 Tabela 3 Comparação da Taxa de Concepção com os animais que apresentaram corpo lúteo (CL) e Estro. BE - tratamento com benzoato de estradiol e GnRh - Hormônimo estimulante de gonadotrofina 46 Tabela 4 Frequência Observada para o Teste Qui-quadrado 49 Tabela 5 Frequência Esperada para o Teste Qui-quadrado 49 ix

12 EFICIÊNCIA DE DOIS PROTOCOLOS DE IATF UTILIZANDO BENZOATO DE ESTRADIOL OU GnRH Resumo A inseminação Artificial (IA) tornou-se uma das principais biotecnologias reprodutivas de impacto econômico na produção de bovinos, aumentando a produção de carne e leite por hectare. O emprego de alguns fármacos disponíveis no mercado possibilitou essa biotecnologia, sem o comprometimento na fertilidade do estro induzido. Assim, inúmeros protocolos hormonais vêm sendo desenvolvidos para realização da inseminação artificial em tempo pré-determinado, ou seja, em tempo fixo com taxas de concepção aceitáveis. O emprego de alguns fármacos, dentre eles o Benzoato de Estradiol, disponíveis no mercado possibilitou essa biotecnologia, sem o comprometimento na fertilidade do estro induzido. A União Européia pela Diretiva 2003/74/CE, proibiram o uso de estradiol e seus derivados para a finalidade de sincronização do cio em animais de produção. Neste trabalho, foram utilizadas 70 novilhas e 20 vacasda raça nelore divididas aleatoriamente em dois grupos utilizando dois protocolos de Inseminação Artificial em tempo fixo (IATF), um com Benzoato de Estradiol e outro com gonadorelina, o GnRH (Hormônio Liberador de Gonadotrofina). Os animais, após a IATF, foram avaliados quanto a presença de Corpo Lúteo, estro, taxa de concepção e em ambos protocolos os resultados foram semelhantes e sem diferença significativa, com a taxa de concepção (prenhez no primeiro serviço) em 32% nas novilhas e 50% nas vacas, sem diferença significativa em teste de chiquadrado a 5 %, com ambos os protocolos de IATF. Estes resultados, do ponto de vista econômico visando o mercado europeu, são bastante vantajosos, uma vez que a Comunidade Européia está restringindo a importação de carnes e co-produtos que tenham utilizado estradiol na sua produção. Palavras chave: IATF, estradiol, União Européia, GnRH x

13 PERFORMANCE OF TWO FTAI PROTOCOLS USING OESTRADIOL BENZOATE OR GNRH Abstract Artificial Insemination (AI) became one of the major biotechnologies with economic impact over the livestock production (cattle and dairy).the use of some products enables such technology, without compromising fertility of induced estrus. In this way, several hormonal protocols are being developed to perform the AI in a pre-determined period of time, at a fixed time with conception rates acceptable. The use of some products, among them oestradiol benzoate, a common product in the veterinary field, enabled this technology, without compromises the induced estrus fertility. Therefore, European Union, throughout Directive 2003/74/CE forbids the use of oestradiol and its derivates products to aim the estrus synchronization in livestock animals, mainly bovine. In this work 70 heifers and 20 cows, all Nellore, randomly divided into two groups were submitted to two Artificial insemination at Fixed Time (AIFT), one group using oestradiol benzoate and another using gonadoreline- the GnRH (Gonadotrofine Hormone inducer). After AIFT, animals were evaluated for presence of Luteous Body, heat, conception rate and for both protocols, results were similar, with no significant differences, presenting a conception rate ( pregnancy at the first service) of 32 % for heifers and 50% for cows, with no significant difference on the chi-squared test at 5 %. Such results present an advantage looking at the economic point of view, aiming the European market, once the European Community is restricting importation of meat and coproducts which had used oestradiol during its production. Key-words: Key-words: European Union, FTAI, GnRH, oestradiol xi

14 CAPÍTULO 1 CONSIDERAÇÕES GERAIS 1. INTRODUÇÃO O rebanho nacional de bovinos em 2010 chegou a 209,5 milhões de cabeças, um aumento de 2,1% em relação a 2009, com maiores concentrações no Centro-Oeste, Norte e Sudeste. A produção de leite bovino chegou a 30,7 bilhões de litros, um acréscimo de 5,5% e foram abatidas 29,265 milhões de cabeças de bovinos, representando um aumento de 4,3% em relação ao ano anterior (IBGE/PPM, 2010). O Brasil possui o maior rebanho bovino comercial do mundo e hoje é o primeiro país no ranking de exportação de carne bovina. Temos as maiores extensões de terras aptas a agricultura. Apesar de todas essas facilidades, a taxa de prenhez dos rebanhos brasileiros, ficam em torno de 60%, e com intervalo de parto de até 2 anos (SILVA, 2007). 1

15 Com uma demanda crescente de carne e leite e pelo mercado mais competitivo e globalizado, os produtores estão sendo forçados a buscar novas tecnologias para tornar a pecuária mais eficiente. A eficiência econômica da pecuária de leite ou corte, esta vinculada a produção de bezerros. Neste contexto, a eficiência reprodutiva desempenha um papel de grande importância, pois sem a reprodução não temos a produção, tornando assim a atividade inviável. Durante os últimos anos, novas tecnologias aplicadas à reprodução animal vêm contribuindo de maneira importante para o melhoramento genético. A inseminação artificial (IA) se tornou uma das principais biotecnologias reprodutivas de impacto econômico na produção de bovinos, apesar de ser a mais utilizada, apenas 10% das fêmeas em idade reprodutiva são inseminadas no Brasil (ASBIA, 2011). O Brasil é um dos países que mais utiliza a IA, com grande expansão a partir da década de 70. No Brasil, a IA, cresce anualmente: de 2000 a 2004, houve um crescimento da utilização da técnica de IA de 42,7%, em gado de corte, e de 10,5%, em gado de leite (DIB et al, 2008). Como toda metodologia, a IA possui algumas limitações. Apesar de sua simplicidade, a IA necessita de rígido controle nas diferentes etapas, desde o monitoramento do rebanho (livre de doenças transmissíveis, sem animais subférteis e com registros de vacinações, nascimentos, abortos e estros) e a seleção do reprodutor doador do sêmen, com observação das características de raça, produção, estado sanitário (livre de doenças), defeitos genéticos e cromossômicos (cariótipo), até o processamento tecnológico do sêmen e a 2

16 necessidade de um inseminador bem treinado para a realização da técnica (DUARTE, 2008). No Brasil, um dos fatores que prejudica o desempenho reprodutivo é a baixa taxa de serviço, provocada principalmente, pela ausência de ciclicidade de fêmeas (anestro) e por falhas de detecção de estro. A detecção de estro desprende tempo e requer pessoal treinado. Além disso, fêmeas zebuínas apresentam estro de curta duração (cerca de horas) e que, geralmente, é manifestado durante à noite, dificultando, ainda mais, a detecção e a utilização da IA tradicional (NICIURA, 2008). Devido a essas limitações, tornou-se de grande interesse econômico, o desenvolvimento de tratamentos que tem por objetivo a indução e/ou sincronização do ciclo estral. O emprego de alguns fármacos disponíveis no mercado, possibilitou essa biotecnologia sem o comprometimento na fertilidade do estro induzido. Assim, inúmeros protocolos hormonais vêm sendo desenvolvidos para realização da inseminação artificial em tempo prédeterminado, ou seja, em tempo fixo (IATF) com taxas de concepção aceitáveis. Na IATF, são utilizados tratamentos hormonais que controlam o momento da ovulação e possibilitam que a inseminação seja realizada num momento pré-determinado (tempo fixo), sem a necessidade de observação de cio (NICIURA, 2008). Segundo Machado et al. (2006) aumentar a taxa de serviço é uma meta imperativa quando se objetiva elevar a eficiência reprodutiva, uma vez que a 3

17 taxa de prenhez é o produto da taxa de serviço e da taxa de concepção. Neste cenário, a indução da ovulação apresenta grande importância, a qual permite efetuar a inseminação artificial em tempo fixo e aumentar a taxa de serviço para 100%. Uma vez obtidas altas taxas de serviço, é importante assegurar a fecundação do ovócito. Caso a inseminação ocorra em perfeita sincronização com a ovulação, verificam-se elevadas taxas de concepção. Os métodos de sincronização compreendem o uso de drogas que agem ao nível hipotalâmico-hipofisário e/ou gonadal, Os protocolos de IATF hoje mais utilizados em bovinos são os com o uso do estradiol (Benzoato de Estradiol), embora outros países utilizem o GnRH em substituição ao estradiol, este hormônio ainda tem um custo elevado para os padrões brasileiros. Do ponto de vista do mercado de exportações, a União Européia tem se mostrado mais preocupada com as questões de saúde e sustentabilidade, impondo assim uma série de restrições aos produtos cárneos. A sincronização da ovulação é uma estratégia importante para melhorar a eficiência reprodutiva em bovinos. Dentre alguns hormônios utilizados nos protocolos de IATF está o estradiol e/ou seus derivados. A União Européia (UE) e outros países, pela Diretiva 2003/74/CE, proibiram o uso de estradiol e seus derivados para a finalidade de sincronização do cio em animais de produção a partir de 14 de outubro de 2006 (LANE et al., 2008). Já o Mercado Norte Americano não impõe nenhuma restrição, incluindo a liberação do uso de anabolizantes para a produção de carnes. Desta forma, a avaliação de protocolos de IATF (Inseminação Artificial em Tempo Fixo) 4

18 utilizando diferentes hormônios pode nos direcionar para o mercado almejado, obedecendo a quaisquer restrições impostas. Tendo em vista a restrição da hormonioterapia pelos países da União Européia, os hormônios usados nos protocolos de IATF deverão ser revistos, ou seja, devemos elaborar outros protocolos eficazes, estes sem o uso do estradiol (em especial o 17β estradiol), para podermos continuar utilizando esta ferramenta reprodutiva importante, sem causar restrições comerciais e riscos à saúde humana. Este trabalho visa a comparação de dois protocolos de IATF usando Benzoato de Estradiol e GnRH e avaliando a eficiência reprodutiva desses animais (Taxa de Concepção). Portanto, avaliar uma fonte alternativa para a substituição do estradiol nos protocolos de IATF, hormônio este que é proibido pela UE, devido a relatos de contaminação de carne e leite. 5

19 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Fisiologia do Ciclo Estral em Bovino Ciclo estral é o período compreendido entre dois estros, de duração variável, porém em torno de 17 a 21 dias, apresentando fases bastante evidentes e caracterizadas por modificações na genitália tanto interna como externa, assim como no comportamento da fêmea. Quanto ao desenvolvimento do ciclo estral as vacas são classificadas como poliéstricas anuais. As fases do ciclo podem ser didaticamente divididas em pró-estro, estro, metaestro ep diestro (REECE, 1996). Estro é o período em que a fêmea aceita ser montada pelo macho. As glândulas uterinas, cervicais e vaginais secretam grande quantidade de muco de consistência viscosa. A vagina e a vulva tornam-se edemaciadas e dilatadas 6

20 e a cérvix está relaxada. O tempo de duração de estro é em média de 18 horas. Metaestro é a fase que sucede ao estro. As células epiteliais que revestem o folículo que se rompeu do ovário sofrem rápida hipertrofia, tornando-se luteinizadas e formando o corpo lúteo. Visualmente pode ser perceptível um corrimento hemorrágico junto ao muco do estro. O tempo de duração do metaestro é em torno de 3 a 4 dias. Diestro é o período entre estros sucessivos e é denominado pelo corpo lúteo cíclico. As glândulas uterinas estão ativas, a musculatura uterina esta relaxada, a cérvix contraída e a vagina encontra-se com os lábios enrugados. O tempo de duração do diestro é em torno de 10 a 13 dias. Pró-estro é a fase em que ocorre a regressão do corpo lúteo e o recrutamento folicular para uma nova ovulação, o tempo de duração do pró-estro é de 5 a 7 dias. (ARTHUR, 1979) Hormônios Envolvidos no Ciclo Estral Hormônios são substâncias que produzidas numa célula e são capazes de exercer efeito local ou em órgãos distantes. A remoção do órgão de origem causa a ausência de seu efeito e a reposição via exógena com a mesma substância, no animal cujo órgão de origem foi removido, restabelece seus efeitos. A ação no tecido alvo depende de estruturas conhecidas com receptores, nas quais o hormônio deve se ligar para exercer sua função (ALVES.et.al, 2007) (Figura 1). Receptores geralmente são moléculas glicoprotéicas presentes no interior (citoplasma) ou em membranas plasmáticas das células alvo. São estruturas dinâmicas, ou seja, que podem aumentar ou diminuir de quantidade 7

21 em determinados momentos, ou mesmo estarem presentes ou ausentes em um tecido dependendo da fase reprodutiva na qual o animal se encontra. Muitas vezes, a potência ou atividade de um hormônio, está relacionada mais ao número de receptores para o mesmo, que a sua concentração sanguínea ou estrutura molecular (ALVES.et.al, 2007). Figura 1 - Controle hormonal do ciclo estral de fêmeas pelo eixo hipotálamo-hipófiseovários. FSH: hormônio folículo estimulante; GnRH: hormônio liberador de gonadotrofinas; LH: hormônio luteinizante (DIB et al, 2008). GnRH: hormônio liberador de gonadotrofinas. É produzido no hipotálamo, uma estrutura presente no sistema nervoso central (SNC), e é estimulado pelo aumento do estradiol, atingindo a hipófise pelo sistema porta hipotalomo-hipofisario. Sua função básica é estimular a liberação de 8

22 gonadotrofinas, o FSH de forma constitutiva e o LH de forma pulsátil, pela hipófise, hormônios estes responsáveis pelo crescimento, maturação, ovulação e luteinização folicular (PALHANO, 2008). FSH: hormônio folículo estimulante. É produzido pela hipófise (ou pituitária), sendo secretado em resposta ao GnRH. Atua principalmente ao nível dos ovários onde exerce as seguintes funções principais: desenvolvimento folicular, produção de estrógeno (E2) pelos folículos, produção de inibina por folículos no final do desenvolvimento, aumento dos receptores de LH no folículos (HAFEZ, 2004 ). LH: hormônio luteinizante. É produzido pela hipófise (ou pituitária), sendo secretado em resposta ao GnRH. Atua principalmente ao nível dos ovários onde exerce as seguintes funções principais: promover a ovulação e formação do corpo lúteo e secreção inicial de progesterona (HAFEZ,2004) Ocitocina: promove as contrações uterinas em sinergismo com a PGF2α no trabalho de parto e promove a ejeção ao atuar nas células da glândula mamária (PALHANO, 2008). Estrógeno: denominado também de esteróide ovariano. É produzido pelos folículos em desenvolvimento, tem várias funções dentro e fora do sistema genital. As principais são: indução da manifestação do estro (SNC), aumento da vascularização, contrações e secreções do genital e controle das secreções de GnRH e junto com a inibina bloqueia a secreção de FSH, fazendo um feedback positivo para a secreção do LH (PALHANO, 2008). 9

23 Progesterona (P4): é também um esteróide ovariano, produzido pelo corpo lúteo por ação do LH (em algumas espécies também é produzido pela placenta). A nível de hipotálamo exerce um efeito feedback negativo sobre o controle da atividade tônica da secreção de GnRH. As glândulas são ativamente secretoras, produzindo um líquido formado por proteínas séricas e específicas do útero, glicoproteínas, minerais, dos quais são essenciais para nutrição do zigoto durante a fase de fixação (HAFEZ, 2004) Prostaglandina: é produzida pelo útero e secretada de forma pulsátil, interfere na regulação neuroendócrina do ciclo estral mediante seu efeito luteolítico, provocando a queda da progesterona (PALHANO, 2008). Figura 2 - Representação esquemática das variações, na concentração dos principais hormônios que regulam o cicio estral em bovinos (CNPGC EMBRAPA, 2011) 10

24 2.2. Inseminação Artificial O melhoramento genético em rebanhos bovinos é baseado na seleção de indivíduos com maior desenvolvimento ponderal, rendimento de carcaça, capacidade de conversão alimentar, habilidade materna, fertilidade e precocidade sexual, possibilitando o aumento da produtividade. Assim, uma eficiente disseminação deste material genético proporciona maior retorno econômico para a atividade. Durante os últimos anos, novas tecnologias aplicadas à reprodução animal vêm contribuindo de maneira importante para o melhoramento genético. A inseminação artificial (IA) se tornou uma das principais biotecnologias reprodutivas de impacto econômico na produção de bovinos, embora apresente essas vantagens, apenas 10% das fêmeas em idade reprodutiva são inseminadas no Brasil (ASBIA, 2011). O Brasil é um dos países que mais utiliza a IA, com grande expansão a partir da década de 70. No Brasil, a IA, cresce anualmente: de 2000 a 2004, houve um crescimento da utilização da técnica de IA de 42,7%, em gado de corte, e de 10,5%, em gado de leite (DIB et al, 2008). A Inseminação Artificial nada mais é que a deposição mecânica do sêmen no útero da fêmea. Em bovinos a quantidade de sêmen utilizado varia entre 0,25 a 0,5 ml (de sêmen com diluente). As suas vantagens são: rápida difusão de material genético superior, diminuição de riscos com animais e o homem, uso de animais já mortos, controle sanitário, cruzamento ente raças, etc, e suas desvantagens: mão de obra qualificada, material e detecção do cio (PEREIRA, 2009). 11

25 2.3. Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF) No Brasil, um dos fatores que prejudica o desempenho reprodutivo é a baixa taxa de serviço, provocada principalmente, pela ausência de ciclicidade de fêmeas (anestro) e por falhas de detecção de estro. A detecção de estro despende tempo e requer pessoal treinado. Além disso, fêmeas zebuínas apresentam estro de curta duração (cerca de horas) e que, geralmente, é manifestado durante à noite, dificultando ainda mais, a detecção e a utilização da IA tradicional. Entretanto, esses problemas podem ser contornados pela utilização da biotécnica de IATF (DIB et al., 2008). A inseminação artificial é uma ferramenta extremamente importante no processo de melhoramento genético do rebanho. No entanto, uma das grandes limitações à sua expansão tem sido o custo e a falha associados aos trabalhos de observação de cio por longo período de tempo. Como resultado, a eficiência reprodutiva de rebanhos de corte em que se usa inseminação artificial em geral é baixa, pois as taxas de serviço são insatisfatórias (VALLE, 1991; MACHADO et al., 2006). Com o objetivo de concentrar o período de manifestação de cio e ovulação, possibilitando uma melhor utilização da inseminação artificial, diversos métodos de controle foram desenvolvidos. Estes têm também colaborado na implementação de outras tecnologias avançadas em reprodução, como a transferência de embriões. Todavia, o sucesso de um programa de sincronização de cio e ovulação está na dependência do uso correto dessa metodologia (VALLE, 1991). 12

26 Nesse sentido, a indução e/ou sincronização de estro como biotecnologia reprodutiva surge como uma ferramenta de manejo auxiliar, para o aumento da eficiência produtiva e econômica da atividade pecuária. Através da sincronização, o período de inseminação artificial (IA) pode ser reduzido de 21 dias para o mínimo de algumas horas, no caso da inseminação artificial em tempo fixo (IATF), dependendo do método escolhido. Quando aplicada na primeira estação reprodutiva possibilita incrementar o índice de repetição de cria nas primíparas, principalmente por concentrar as parições no início da temporada (BRAGANÇA, 2007). A sincronização do estro pode ser obtida separadamente ou em combinação através da inibição da ovulação, indução da ovulação ou ainda pela indução ou atraso da regressão do corpo lúteo. Os métodos de sincronização incluem a administração de hormônios naturais ou sintéticos via oral, injeção intramuscular, implante subcutâneo/intravaginal, além do manejo adequado dos animais, o qual inclui um correto manejo nutricional e um desmame no período mais apropriado (SANTOS, 2002) Protocolos de IATF Os métodos de sincronização compreendem o uso de drogas que agem ao nível hipotalâmico-hipofisário e/ou gonadal, podendo ser diferenciado neste trabalho pelo uso ou não do estradiol. 13

27 Protocolo Utilizando Benzoato de Estradiol O protocolo mais utilizado na bovinocultura brasileira é o que utiliza o Benzoato de Estradiol (BE) (Figura 3), devido ao seu menor custo, comparado aos que utilizam GnRH. Figura 3 - Protocolo de IATF utilizando Benzoato de Estradiol (Arquivo Pessoal). Este protocolo inicia com a aplicação de uma fonte intravaginal de progesterona (P4) e a aplicação do Benzoato de Estradiol (BE) no dia zero (D0), esse procedimento tem por finalidade a regressão folicular, pois altas concentrações de estradiol na presença de progesterona, promovem a regressão folicular e a emergência de uma nova onda de crescimento dos mesmos. Após oito dias (D8), é removida a fonte de progesterona (P4) e aplicado a prostaglandina (PGF2α), isso vai simular a luteolise, ou seja, a quebra do corpo lúteo (P4) pela prostaglandina (PGF2α). 14

28 No dia nove (D9) é aplicado novamente uma fonte de estradiol (BE) para agora dar aporte ao desenvolvimento e maturação do folículo dominante. No dia dez (D10), ou seja, trinta e seis horas após a aplicação do estradiol, é feita a inseminação artificial (IA). Esse período de 36 horas é o tempo que o folículo dominante leva para acabar sua maturação e ocorre a ovulação Protocolo Ovsynch Foi o primeiro protocolo que substituiu o estradiol pelo GnRH, foi desenvolvido na Universidade da Flórida (WOLFENSON et al., 1994) e de Wisconsin (PURSLEY et al., 1995), desenvolveram um protocolo experimental de sincronização da ovulação (denominado Ovsynch pelo grupo de Wisconsin), o qual permite a inseminação em tempo prefixado, sem necessidade de observação do estro (ALVAREZ, 2003) (Figura 4). Figura 4 - Protocolo Ovsynch utilizando GnRH (Arquivo Pessoal). 15

29 Este protocolo inicia com a aplicação do GnRH (Hormônio Liberador de Gonadotrofina) no dia zero (D0), esse procedimento tem por finalidade a emergência de uma nova onda de crescimento folicular. No protocolo Ovsynch não utiliza uma fonte de progesterona, pois o animal deve ter um corpo lúteo, ou seja, estar ciclando. Após sete dias (D7), é aplicado a prostaglandina (PGF2α), isso vai resultar na luteolise, ou seja, a quebra do corpo lúteo (P4) pela prostaglandina (PGF2α). No dia nove (D9) é aplicado uma fonte de GnRH para estimular a secreção do FSH e do LH e dar aporte ao desenvolvimento, maturação e ovulação do folículo dominante. Após 12 a 16 horas é feita a inseminação artificial (IA) Protocolo Co-synch 7 dia O protocolo Co-synch 7 dia é recomendado para vacas e novilhas, a IA ocorre de 60 a 66 horas após a remoção da progesterona (BEEFREPRO, 2011). Esse protocolo é a variação do Ovsynch que utiliza uma fonte de progesterona, ou seja, simula a presença de um corpo lúteo, e não precisa mais saber se o animal esta ciclando (Figura 5). 16

30 Figura 5 - Protocolo Co-synch 7 dias utilizando GnRH (Arquivo Pessoal). Este protocolo inicia com a aplicação do GnRH (Hormônio Liberador de Gonadotrofina) e a introdução de uma fonte de progesterona (P4) no dia zero (D0), esse procedimento tem por finalidade a regressão e o crescimento de uma nova onda folicular, semelhante ao protocolo BE. Após sete dias (D7), é feita a retirada da fonte de progesterona (P4) e é aplicado a prostaglandina (PGF2α), isso vai resultar na luteolise, ou seja, a quebra do corpo lúteo (P4) pela prostaglandina (PGF2α). No dia oito (D8) é aplicado uma fonte de GnRH para estimular a secreção do FSH e do LH e dar aporte ao desenvolvimento, maturação e ovulação do folículo dominante. Após 36 a 40 horas da ultima aplicação do GnRH é feita a inseminação artificial (IA), dia nove mais 12 horas (D9). 17

31 Protocolo Co-synch 5 dia O protocolo Co-synch 5 dias é baseado no de 7 dias, a diferença básica é que a fonte de progesterona é mantida por apenas 5 dias, ou seja, essa redução de 2 dias pode obter um oócito mais jovem e de melhor qualidade. Segundo Chebel et al. (2008) e Bridges et al. (2008), o protocolo Cosynch 5 dias deve fazer 2 aplicações de prostaglandina (PGF2α), uma na retirada da fonte de progesterona e a outra 12 hora depois, isso ocorre devido ao corpo lúteo, por ser precoce, não ter uma resposta eficiente a uma só dose de prostaglandina, não ocorrendo a luteólise. Figura 6 - Protocolo Co-synch 5 dias utilizando GnRH (Arquivo Pessoal). Este protocolo inicia com a aplicação do GnRH (Hormônio Liberador de Gonadotrofina) e a introdução de uma fonte de progesterona (P4) no dia zero (D0), esse procedimento tem a mesma finalidade do protocolo com 7 dia. 18

32 Após cinco dias (D5), é feita a retirada da fonte de progesterona (P4) e é aplicado a prostaglandina (PGF2α), isso vai resultar na luteolise, ou seja, a quebra do corpo lúteo (P4) pela prostaglandina (PGF2α). (PGF2α). Após doze horas é feita a segunda aplicação da prostaglandina No dia seis (D6) é aplicado uma fonte de GnRH para estimular a secreção do FSH e do LH e dar aporte ao desenvolvimento, maturação e ovulação do folículo dominante. Após 36 a 40 horas da ultima aplicação do GnRH é feita a inseminação artificial (IA), dia sete mais 12 horas (D7) Qualidade dos Produtos de Origem Animal Com os consumidores cada vez mais exigentes com a qualidade dos alimentos, além das características tangíveis como cor, tamanho e ausência de defeitos, outros padrões passaram a ter grande influência no mercado, como as questões ambientais (local do cultivo, praticas culturais, resíduos etc.) e a responsabilidade social (direito, saúde e segurança no trabalho e desenvolvimento rural). Dentre as carnes das diversas espécies de mamíferos e aves mais utilizadas na alimentação humana, a bovina não é a mais consumida, mas é, provavelmente, a mais valorizada e preferida. A suína é a mais consumida devido à enorme produção da China e ao tamanho da população de consumidores daquele país, enquanto a produção de carne de aves, 19

33 basicamente de frangos, cresce continuamente nas estatísticas globais, respondendo rapidamente aos incrementos de demanda por proteína animal de boa qualidade e baixo custo.com uma tradição de quase um século na exportação de carne bovina, o Brasil vem conquistando, nos últimos 10 anos, uma posição de grande destaque no cenário internacional (Instituto FNP. 2005). Para Euclides Filho (2005), o fortalecimento e a ampliação dos mercados com aumento do consumo interno requerem esforços de todos os segmentos na implementação das boas práticas de produção, com a introdução do APPCC (Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle) - Campo, das boas práticas de fabricação na indústria, rastreabilidade e de manuseio adequado pelo setor de distribuição. A rastreabilidade é uma ferramenta que permite identificar dados e fatos referentes a um produto durante o ciclo de sua cadeia produtiva, baseando-se no registro histórico dos acontecimentos que a envolvem (LIRANI, 2005). O Brasil tem um sistema de rastreabilidade que vem sendo implantado pelo MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, a partir da Instrução Normativa (IN) nº 1/2002, de 09/01/2002, que instituiu o SISBOV Sistema Brasileiro de Identificação e Certificação Bovina e Bubalina. O Protocolo EUREPGAP IFA. EUREP (Euro-Retailer Produce Working Group) é a sigla do nome de um grupo formado, em 1997, por atacadistas e varejistas europeus, que desenvolveu, em 2002, o Protocolo EUREPGAP IFA com o objetivo de estimular a implementação de sistemas agrícolas e de produção de animais levando em consideração as boas práticas de produção, 20

34 a segurança alimentar, bem como a minimização dos impactos adversos ao meio-ambiente e a proteção social do trabalhador (Globalgep, 2011) A Comissão do Codex Alimentarius executa o Programa Conjunto da FAO/OMS sobre Normas Alimentares, cujo objetivo é proteger a saúde dos consumidores e garantir práticas eqüitativas no comércio de alimentos. O Codex Alimentarius (do latim Lei ou Código dos Alimentos) é uma coletânea de normas alimentares adotadas internacionalmente e apresentadas de modo uniforme (CARDOSO et al., 1999) Sustentabilidade e Mercado Importador da Carne Brasileira Nas fêmeas bovinas, o estradiol apresenta papel fundamental na fisiologia reprodutiva, particularmente na regulação do ciclo estral e na ovulação. O estradiol é utilizado em biotécnicas como sincronização de cio, superovulação, transferência de embriões, entre outros procedimentos (BARUSELLI et al., 2002), contudo normativas recentes da Comunidade Européia vem colocando o β-estradiol na lista de produtos proibidos para uso em animais criados para produção de carne, por ser uma substância que vai contra as diretrizes de bem estar animal (COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPÉIAS, 2007). O parecer do Comitê Científico das Medidas Veterinárias Relacionadas com a Saúde Pública, de 30 de Abril de 1999, sobre os riscos potenciais para a saúde humana decorrentes dos resíduos de hormonais presentes na carne e nos produtos à base de carne de bovino (revisto em 3 de Maio de 2000 e 21

35 confirmado em 10 de Abril de 2002), concluiu que existe um grande conjunto de provas recentes que sugerem que o estradiol 17β tem de ser considerado como um cancerígeno total, na medida em que tem por efeito estimular o aparecimento e o crescimento de tumores, e que os dados atualmente disponíveis não permitem um cálculo quantitativo do risco para a saúde humana. Consequentemente a Diretiva 96/22/CE foi alterada pela Diretiva 2003/74/CE para, entre outros, proibir permanentemente a utilização de estradiol 17β enquanto promotor de crescimento e a reduzir substancialmente todas as outras circunstâncias em que esta substância pode ser administrada a todos os animais de criação para fins terapêuticos ou zootécnicos, na pendência de um exame mais aprofundado da situação em termos factuais e científicos e das práticas veterinárias nos Estados-Membros (Diretiva, 2008). O artigo 11-A da Diretiva 96/22/CE impunha à Comissão a apresentação, até 14 de Outubro de 2005, de um relatório sobre a disponibilidade de medicamentos veterinários alternativos aqueles contendo estradiol 17β para animais destinados à produção de alimentos, para fins terapêuticos. A Comissão solicitou pareceres periciais e elaborou o relatório científico relevante, que foi enviado ao Parlamento Europeu e ao Conselho em 11 de Outubro de Esse relatório conclui que o estradiol 17β não é essencial na criação de animais para produção de alimentos, visto que a utilização por veterinários das alternativas disponíveis (especialmente as prostaglandinas) já é bastante comum nos Estados-Membros e que a proibição total da utilização de estradiol 17β em animais para produção de alimentos não produziria um impacto na criação e no bem-estar animal, ou este seria apenas insignificante (Diretiva, 2008). 22

36 Foi prevista uma derrogação temporária para a utilização de estradiol 17β para a indução do estro nos bovinos, equinos, ovinos ou caprinos até 14 de Outubro de Dado que existem produtos alternativos eficazes, que já são utilizados, e no sentido de garantir um elevado nível de proteção da saúde humana na Comunidade, aquela derrogação não deverá ser renovada (Diretiva, 2008). É inserido o seguinte artigo: Artigo 11-B. A Comissão, em colaboração com os Estados-Membros, organiza uma campanha de informação e sensibilização sobre a proibição total da utilização de estradiol 17 β nos animais para produção de alimentos, destinada às organizações de agricultores e veterinários na União Européia, bem como às organizações fora do território da União Européia que estejam direta ou indiretamente envolvidas na exportação para esta de alimentos de origem animal abrangidos pelo âmbito de aplicação da presente diretiva (Diretiva, 2008). Atualmente, de acordo com o exposto na Diretiva nº 96/22/CE do Conselho, a UE proíbe a importação, a comercialização e o uso de substâncias naturais ou artificiais com atividade anabolizante, ou mesmo outras dotadas dessa atividade, mas desprovidas de caráter hormonal, para fins de crescimento e ganho de peso em animais de produção, com permissão exclusiva para fins terapêuticos, como a sincronização do estro, transferência de embriões, melhoramento genético e pesquisa experimental em medicina veterinária. Em países como os EUA, Austrália, Nova Zelândia e Argentina, com produtividade de carne elevada e que atendem a mercados exigentes em 23

37 qualidade é permitido o uso de compostos anabolizantes naturais como a testosterona, a progesterona e o 17-β estradiol e de compostos sintéticos tais como o zeranol e o acetato de trembolona. Nesses países, os LMRs dos compostos sintéticos são controlados no fígado e músculos dos animais aos quais se fez a administração. Esses valores foram estabelecidos pela Food and Agriculture Organization FAO e pela World Health Organization - WHO (DUARTE et al., 2002) Resíduo de Agente Anabólico No mundo moderno, grande parte da segurança alimentar repousa no controle de remanescentes residuais nos alimentos, em decorrência do uso de pesticidas, ou drogas veterinárias, ou por acidentes envolvendo contaminantes ambientais. Resíduos de anabolizantes em carnes trazem sérios problemas de saúde pública. De acordo com Epstein (1990), 3000 crianças em Porto Rico tiveram sérios problemas de desenvolvimento sexual prematuro e cistos ovarianos devido à ingestão de produtos cárneos com resíduos de zeranol. Segundo o Comitê Misto do Codex Alimentarius/ FAO/ WHO, a ingestão de alimentos contaminados por anabolizantes pode levar ao aparecimento de distúrbios endócrinos como indução de puberdade precoce em crianças, avanços na idade óssea com repercussões negativas no crescimento, modificação dos caracteres sexuais, bem como cânceres principalmente no fígado e pâncreas (CARDOSO et al., 1999). 24

38 De acordo com Rosa e Dode (1987), a via de administração mais utilizada em bovinos é o implante em parte não comestível da carcaça, como por exemplo, na orelha. A administração oral ou injeção (oleosa ou cristalina) aumenta a possibilidade de abusos e a ocorrência de resíduos em tecidos comestíveis, o que torna um problema de saúde pública Métodos para Detecção de Resíduos de Anabolizantes A determinação de resíduos de agentes anabolizantes em material biológico é uma tarefa difícil. Para tal, os métodos utilizados, para serem considerados satisfatórios, deverão preencher uma série de requisitos entre os quais: ser adequado a uma rotina regular realizada por pessoa qualificada; permitir o manuseio de um grande número de amostras num pequeno espaço de tempo, para poder ser usado como um instrumento de fiscalização; ser seletivo para o composto, de modo a evitar falsos positivos; quantificar, de forma inequívoca, a concentração do composto presente; permitir tanto a quantificação do composto livre quanto seu conjugado; não ser muito oneroso, para não inviabilizar as análises de vigilância sanitária (PLAIZIER, 1993; EECKHOUT et al., 1998). Muitos métodos satisfazem alguns desses itens, mas nenhum satisfaz a todos. É possível, entretanto, conseguir resultados bastante satisfatórios com métodos que preencham a maioria desses requisitos. Geralmente, para a detecção de resíduos de anabolizantes, dois tipos de métodos podem ser usados: (1) os imunoensaios tais como radioimunoensaio 25

39 (RIA) e método imunoenzimático (ELISA), os quais são rotineiramente usados para detecção e (2) métodos físico-químicos, por cromatografia (CG-EM, CCDAE), os quais são usados para determinações quantitativas e como métodos de referência (HOFFMAN e BLIETZ, 1983; LONE, 1997). Segundo o MAPA no MEMO SCR/DIPOA N 32/2005 descrev e sobre o PNCR (Plano Nacional de Controle de Resíduos), onde os animais suspeitos de contaminação com anabolizantes são submetidos ao exame ante-mortem, observando anormalidades (aumento na glândula mamaria e do tecido adiposo, vestígios de implantes, cicatriz na orelha, etc), é coletado a tireóide desse animais e enviada para análise laboratorial. Atendendo aos requisitos de sustentabilidade, o MAPA descreve que A sustentabilidade envolve desenvolvimento econômico, social e respeito ao equilíbrio e às limitações dos recursos naturais. De acordo com o relatório da Comissão Mundial sobre Meio Ambiente e Desenvolvimento, criada pela ONU em 1983, o desenvolvimento sustentável visa "ao atendimento das necessidades do presente, sem comprometer a possibilidade de as gerações futuras atenderem às próprias necessidades". (MEMO, 2005). 26

40 3. REFERÊNCIAS...Higiene dos Alimentos Textos Básicos / Organização Pan-Americana da Saúde; Agência Nacional de Vigilância Sanitária; Food and Agriculture Organization of the United Nations. Brasília: Organização Pan-Americana da Saúde, p.: il. ALVES, B.G et.al; Curso de Transferência de Embriões, 47p, Uberlandia, 2007 ALVAREZ, R.H. et al. Eficácia do tratamento Ovsynch associado à inseminação artificial prefixada em rebanhos Bos taurus e Bos indicus. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.38, n.2, p.6, ARTHUR, H.G. Reprodução e Obstetrícia em Veterinária. Guanabara, 4 ed., BARUSELLI, P.S. et al. ; Efeito de diferentes protocolos de inseminação artificial em tempo fixo na eficiência reprodutiva de vacas de corte lactantes.revista Brasileira de Reprodução Animal, v.26, n. 3, p ,

41 BRAGANÇA, J.F.M. Estratégias hormonais de indução/sincronização de estro em novilhas de corte entre 12 e 14 meses de idade Tese (doutorado) Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, p. BRIDGES, G.A. et.al. Decreasing the interval between GnRH and PGF2a from 7 to 5 days and lengthening proestrus increases timed-ai pregnancy rates in beef cows. Theriogenology, v.69, p , CARDOSO, O.M.C.; SILVA, T.J.P.; SANTOS, W.L.M. Ocorrência de resíduos de dietilestilbestrol e zeranol em fígado de bovinos abatidos no Brasil. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.19, n.3, p , CHEBEL RC, et al.. Effect of reducing the period of follicle dominance in a timed A.I. protocol on reproduction of dairy cows. Journal of Animal Science, v. 86, (Suppl), COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS, Bruxelas, COM (2007) DIB, C.C, et.al; Boletim Tecnico, 51. Inseminação Artificial, p. DIB, C.C, Manejo sanitário e instalações zootécnicas. In: DIB et al. Boletim Tecnico, 51. Inseminação Artificial, Capitulo 2, p DIRECTIVA 2008/97/CE DO PARLAMENTO EUROPEU E DO CONSELHO de 19 de Novembro de 2008 Jornal Oficial da União Européia. DUARTE,K.M.R et.al. Resíduos de anabolizantes na produção animal: importância e métodos de detecção Ciência Rural, v.32, n.4, p , DUARTE, K.M.R Histórico e aplicações da inseminação artificial. In: DIB et al. Boletim Tecnico, 51. Inseminação Artificial, Capitulo 1, p EECKHOUT, N.J. van, PETEGHEM, C.H. van, HELBO, V.C. New database on hormone and veterinary drug residue determination in animal products. The Analyst, v.123, n.12, p ,

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44 acesso em 20/11/ acesso em 15/11/ acesso em 21/11/ acesso em 29/12/ acesso em 29/12/

45 CAPÍTULO 2 EFICIÊNCIA DE DOIS PROTOCOLOS DE IATF UTILIZANDO BENZOATO DE ESTRADIOL OU GnRH Resumo Neste trabalho, foram utilizadas 70 novilhas e 20 vacas da raça nelore divididas aleatoriamente em dois grupos utilizando dois protocolos de Inseminação Artificial em tempo fixo (IATF), um com Benzoato de Estradiol e outro com gonadorelina, o GnRH (Hormônio Liberador de Gonadotrofina). Os animais, após a IATF, foram avaliados quanto a presença de Corpo Lúteo, estro, taxa de concepção e em ambos protocolos os resultados foram semelhantes e sem diferença significativa, com a taxa de concepção (prenhez no primeiro serviço) em 32% nas novilhas e 50% nas vacas, sem diferença significativa em teste de chi-quadrado a 5 %, com ambos os protocolos de IATF. Estes resultados, do ponto de vista econômico visando o mercado europeu, são bastante vantajosos, uma vez que a Comunidade Européia está restringindo a importação de carnes e co-produtos que tenham utilizado estradiol na sua produção. Palavras-chave: estradiol, IATF, taxa de concepção 32

46 PERFORMANCE OF TWO FTAI PROTOCOLS USING OESTRADIOL BENZOATE OR GNRH Abstract In this work 70 heifers and 10 cows, all Nelore, randomly divided into two groups were submitted to two Artificial insemination at Fixed Time (AIFT), one group using oestradiol benzoate and another using gonadoreline- the GnRH (Gonadotrofine Hormone inducer). After AIFT, animals were evaluated for presence of Luteous Body, heat, conception rate and for both protocols, results were similar, with no significant differences, presenting a conception rate ( pregnancy at the first service) of 32 % for heifers and 50% for cows with no statistical significant difference in a chi-squared test at 5%. Such results represent an advantage looking at the economic point of view, aiming the European market, once the European Community is restricting importation of meat and co-products which had used oestradiol during its production. Key-words: AIFT, conception rate, oestradiol 33