ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA DOS LOCI HLA-A, -B, -DRB1 E DA ESTRUTURA DA POPULAÇÃO HUMANA DO ESTADO DE MINAS GERAIS, BRASIL

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1 ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA DOS LOCI HLA-A, -B, -DRB1 E DA ESTRUTURA DA POPULAÇÃO HUMANA DO ESTADO DE MINAS GERAIS, BRASIL RAQUEL APARECIDA FABRETI DE OLIVEIRA Belo Horizonte 2009

2 RAQUEL APARECIDA FABRETI DE OLIVEIRA ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA DOS LOCI HLA-A, -B, -DRB1 E DA ESTRUTURA DA POPULAÇÃO HUMANA DO ESTADO DE MINAS GERAIS, BRASIL Dissertação apresentada ao Curso de Pós Graduação em Genética do Departamento de Biologia Geral do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como pré-requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Genética. Área de concentração: Genética Evolutiva e de Populações Orientadora: Prof a Dr a Cleusa Graça da Fonseca Belo Horizonte Instituto de Ciências Biológicas da UFMG 2009

3 Oliveira, Raquel Aparecida Fabreti de Análise da diversidade genética dos loci HLA-A, -B, -DRB1 e da estrutura da população humana do Estado de Minas Gerais, Brasil. [manuscrito] / f. : il. ; 29,5 cm. Orientadora: Cleusa Graça da Fonseca Dissertação (mestrado) Universidade Federal de Minas Gerais, Departamento de Biologia Geral. 1. Complexo principal de histocompatibilidade Teses. 2. Antígenos de histocompatibilidade HLA Teses. 3. Seleção natural Teses. 4. Linhagem (Genética) Teses. 5. Mapeamento cromossômico Teses. 6. Desequilíbrio de ligação. I. Fonseca, Cleusa Graça da.ii. Universidade Federal de Minas Gerais. Departamento de Biologia Geral. III. Titulo. CDU: i

4 ii

5 A manutenção na natureza de variantes favoráveis e a eliminação de variantes prejudiciais eu chamo Seleção Natural. Variações que não são nem úteis nem prejudiciais não serão afetadas pela Seleção Natural e são como variantes flutuantes, como talvez observemos nas espécies chamadas polimórficas. (Charles Darwin) iii

6 AGRADECIMENTOS Agradeço a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho. Agradeço de modo especial: À Universidade Federal de Minas Gerais e ao Programa de Pós-Graduação em Genética por permitirem a realização deste estudo. A todos os professores do programa pelos ensinamentos. À Profa. Dra. Cleusa Graça da Fonseca, pela paciência, confiança, compreensão, incentivo, orientação e disponibilidade. Ao Prof. Dr. Evaldo Nascimento por todas as oportunidades que a mim concedeu propiciando sempre o meu aperfeiçoamento profissional e científico, pelas valiosas sugestões, pela confiança e, sobretudo, por compartilhar comigo sua brilhante experiência científica. Enfim, por apoiar inteiramente desde o primeiro dia até hoje a realização deste estudo. Ao Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade de Transplantes IMUNOLABTx pela disponibilização dos dados utilizados nesta dissertação. A toda equipe desse Laboratório, em especial à Roselia e ao pessoal do setor de Biologia Molecular por compreenderem minhas necessidades e ausências. Ao Prof. Dr. Eduardo Tarazona pelos ensinamentos, sugestões e pela significativa colaboração para a realização deste trabalho. À equipe do Laboratório de Genética quantitativa e conservação animal. Aos amigos Leonardo, Gustavo, Pilar e especialmente à Luciene pela disponibilidade para discussões. À minha irmã Renata pela importante ajuda na parte de História de MG. À pessoa por quem tenho um carinho e uma ligação muito especial, minha irmã Cíntia, por tudo que compartilhamos e vivenciamos juntas, por nossas afinidades e diferenças, pela amizade, compreensão e apoio sempre. Aos meus pais, João e Maria, por terem direcionado meus primeiros passos na caminhada educacional e me apoiado durante todas as etapas da minha vida. Ao Marcos pelo apoio com sua alegria e compreensão nos dias difíceis. A Deus, por tudo. iv

7 SUMÁRIO RESUMO... 1 SUMMARY INTRODUÇÃO COMPLEXO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDADE História Organização gênica do MHC Estrutura das moléculas HLA Herança dos alelos HLA Expressão e função imune das moléculas HLA Polimorfismo nos loci HLA Nomenclatura dos alelos HLA Aspectos clínicos relevantes envolvendo as moléculas HLA HLA e transplante HLA e doenças Doenças infecciosas Doenças autoimunes e outras História evolutiva do MHC/HLA Desequilíbrio de ligação e recombinação intergênica nos loci HLA Seleção natural nos loci HLA Seleção Balanceadora Variabilidade HLA dentro e entre as populações humanas Origem e formação da população de Minas Gerais RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos MATERIAL E MÉTODOS População Critérios de inclusão Critérios de exclusão Aspectos éticos Coleta de amostras e extração do DNA Tipificação dos loci HLA Análises estatísticas Diversidade e Heterozigosidade v

8 Equilíbrio de Hardy-Weinberg Frequências haplotípicas Desequilíbrio de ligação Teste de homozigosidade de Ewens-Watterson Estrutura genética Análise filogenética RESULTADOS Análise das famílias Aspectos gerais Frequências alélicas Frequências haplotípicas Desequilíbrio de ligação (DL) Taxa de recombinação entre os loci HLA-A e HLA-B Análise da amostra de indivíduos não aparentados Diversidade e Heterozigosidade Desequilíbrio de ligação Seleção natural Diferenciação da população Análise filogenética Disponibilização de resultados para banco de dados público DISCUSSÃO Diversidade genética nos loci HLA Desequilíbrio de ligação Seleção Natural Estrutura genética populacional Análise filogenética CONCLUSÕES ANEXOS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS vi

9 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1: Mapa gênico esquemático da região do MHC FIGURA 2: Estrutura esquemática das moléculas HLA de classe I e classe II FIGURA 3: Estrutura esquemática da molécula HLA de classe I mostrando que o polimorfismo encontra-se localizado nos domínios α1 e α FIGURA 4: Estrutura esquemática da molécula HLA de classe II mostrando que o polimorfismo encontra-se localizado no domínio β FIGURA 5: Vista frontal da PBR (Peptide binding Region) das moléculas HLA de classe I e II... 9 FIGURA 6: Descobrimento de novos alelos HLA de classe I e II no período de 1987 a FIGURA 7: Distribuição do alelo HLA-B 40 na população mundial FIGURA 8: Princípios da técnica PCR-SSOP FIGURA 9: Distribuição dos alelos HLA-A no grupo dos brancos (A), negros (B) e pardos (C) FIGURA 10: Distribuição dos alelos HLA-B no grupo dos brancos (A), negros (B) e pardos (C) FIGURA 11: Distribuição dos alelos HLA-DRB1 no grupo dos brancos (A), negros (B) e pardos (C) FIGURA 12: Dendograma gerado com base nas frequências alélicas dos loci HLA-A, -B e DRB vii

10 LISTA DE TABELAS TABELA 1: Principais assuntos sobre HLA discutidos nos WIIH TABELA 2: Número de alelos, proteínas e alelos nulos nos loci HLA-A, -B e DRB TABELA 3: Nomenclatura dos alelos HLA TABELA 4: Fenótipos e doenças associadas aos loci HLA TABELA 5: Imigração no Brasil, por nacionalidade, de 1500 a TABELA 6: Escravos africanos no Brasil de acordo com o período TABELA 7: Condições de amplificação para a realização da PCR SSOP para tipificação HLA-A, -B, -DRB TABELA 8: Frequências alélicas dos loci HLA-A e HLA-B TABELA 9: Heterozigosidade nos loci HLA-A e HLA-B TABELA 10: Frequências de haplótipos HLA-A:HLA-B, estimativas de desequilíbrio de ligação (D ) e sua significância TABELA 11: Diversidade, heterozigosidade e resultado do teste de HW para os loci HLA-A, -B e -DRB TABELA 12: Distribuição da frequência alélica por locus HLA nos grupos de Brancos, Negros e Pardos TABELA 13: Desequilíbrio de ligação global entre os pares de loci HLA TABELA 14: Teste de homozigosidade de Ewens-Watterson TABELA 15: Medidas de diferenciação genética entre os grupos TABELA 16: Matriz de distância genética obtida pelo método de Nei (1972) TABELA 17: Casamentos intergrupos observados na província de Minas Gerais de viii

11 LISTA DE ANEXOS ANEXO 1 - Poster: HLA-A, -B, -DRB1 allele and haplotype frequencies in 1000 human samples from mixed population of the Minas Gerais state, Brazil ANEXO 2 - Poster: Strong linkage disequilibria between HLA-A*2402, B*0720 and DRB1*1601 in 5000 volunteers from mixed population from Minas Gerais state, Brazil ANEXO 3 - Poster: Strong linkage disequilibrium between HLA A*0201, B*1804 and DRB1*1104 in 5000 volunteers from mixed population from Minas Gerais state, Brazil ANEXO 4 - Poster: Analysis of allelic, haplotype diversity, linkage disequilibrium and inter-loci recombination rate of the MHC Class I region of 917 families from Minas Gerais state, Brazil ANEXO 5: Parecer do Prof. Dr. Eduardo Martin Tarazona-Santos referente ao projeto de Mestrado ANEXO 6: Parecer da Professora. Dra. Maria Raquel Carvalho referente ao projeto de Mestrado ANEXO 7: Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte ANEXO 8: Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UFMG ANEXO 9: Artigo sob revisão a ser submetido ao periódico Human Immunology ix

12 LISTA DE ABREVIATURAS e SIGLAS AIDS CAP CEDEPLAR DL DNA EDTA EM EW F ST Fnd G' ST H0 HGDP-CEPH HLA Hobs HUGO HW IBGE IC Ile IMGT/HLA LSDB Mb MCMC MHC MG MS OMS PBR PCR PCR-SSOP PHYLIP PI PR PYPOP Síndrome da Imunodeficiência Adquirida Células Apresentadoras de Antígenos Centro de Desenvolvimento e Planejamento Regional de Minas Gerais Desequilíbrio de ligação Ácido desoxirribonucléico Ácido etilenodiaminotetracético Expectation Maximization Ewens-Watterson Índice de fixação Estatística F normalizada Medida padronizada da diferenciação genética Hipótese nula Genome Diversity Panel Centre d Etude du Polymorphisme Humain Human Leucocyte Antigen Heterozigosidade observada Gene Nomenclature Committee (HGNC) Hardy-Weinberg Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística Intervalo de confiança Isoleucina IMmunoGeneTic HLA Sequence Database Data Base Specific Locus Mega base Monte-Carlo Markov Chain Major Histocompatibility Complex Minas Gerais Mato Grosso do Sul Organização Mundial da Saúde Peptide Biding Region Polymerase Chain Reaction Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Oligonucleotide Probe Phylogeny Inference Package Piauí Paraná Python for Population Genetics x

13 SE REDOME SP SMOGD SNP TCR UFMG COEP WIIH Erro padrão Registro Brasileiro de Doadores Voluntários de Medula Óssea São Paulo Software for the Measurement of Genetic Diversity Single Nucleotide Polimorphism T Cell Receptor Conselho de ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais Workshops Internacionais de Imunogenética e Histocompatibilidade xi

14 RESUMO Análise da diversidade genética dos loci HLA-A, -B e -DRB1 e da estrutura da população humana do estado de Minas Gerais, Brasil. Belo Horizonte: UFMG, Dissertação (Mestrado em Genética, área Genética de População) Pós-Graduação em Genética do Instituto de Ciências Biológicas UFMG. Os antígenos leucocitários humanos (HLA) são codificados por um sistema altamente polimórfico designado complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Os genes HLA são herdados em blocos chamados haplótipos e expressos codominantemente em cada indivíduo. Os produtos gênicos dos loci HLA influenciam na rejeição a transplantes de órgãos e tecidos, suscetibilidade a doenças infecciosas e predisposição a um amplo espectro de doenças crônicas não infecciosas, como doenças autoimunes e câncer. O objetivo deste estudo foi analisar a diversidade genética dos loci HLA-A, -B e -DRB1 e a estrutura genética da população do Estado de Minas Gerais (MG). A amostra foi constituída com base em duas amostras distintas: (1) indivíduos de 917 famílias que buscavam um doador HLA compatível para o transplante de células tronco hematopoiética para um membro da família que possuída doença hematológica e (2) 2868 indivíduos doadores voluntários de medula óssea, saudáveis, não relacionados e aleatoriamente alocados para esta pesquisa. Na amostra de indivíduos não relacionados, foi possível categorizar a amostra em brancos, pretos e pardos segundo autoclassificação baseado nos critérios do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE). A tipificação dos loci HLA foi feita pela técnica PCR SSOP (Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Oligonucleotide Probe). Nas amostras analisadas, foram observados, em média, 20, 37 e 13 diferentes alelos para os loci HLA-A, -B e -DRB1, respectivamente. Foi observada uma elevada heterozigosidade para todos os loci HLA analisados, com percentuais chegando a 95,1% de indivíduos heterozigotos na amostra. Observou-se desequilíbrio de ligação estatisticamente significativo para todos os pares de loci HLA e, com base no estudo de segregação dos alelos HLA nas famílias, baixa taxa de recombinação entre os loci HLA-A:HLA-B. Baseado na diferença estatisticamente significativa da proporção de homozigotos observados e esperados, a seleção natural balanceadora foi inferida como fator contribuinte para a manutenção da grande variabilidade alélica e haplotípica observada nestes loci. Além disso, a seleção balanceadora foi apoiada pela distribuição de alelos HLA com frequências intermediárias em todos os loci analisados. Com base na análise da diferenciação genética das amostras, foi observada estruturação genética da população. A partir da análise filogenética, foi possível observar que a composição genética de MG foi predominantemente de genes de origem europeia e africana com pouca participação dos genes indígenas. Palavras chave: MHC, HLA, polimorfismo, frequência alélica, frequência haplotípica, recombinação inter-loci, desequilíbrio de ligação, seleção natural. 1

15 SUMMARY Analysis of genetic diversity at HLA-A, -B and -DRB1 loci and structure of human population of Minas Gerais, Brazil. Belo Horizonte: UFMG, Dissertação (Mestrado em Genética, área Genética de População) Pós-Graduação em Genética do Instituto de Ciências Biológicas UFMG. Human leucocyte antigens (HLA) are coded by a highly polymorphic system, the major histocompatibility complex (MHC). HLA genes are inherited as haplotypes and their expression is codominant. HLA gene products are related to transplant rejection, infectious disease resistance and non infectious chronic diseases, like cancer and autoimmune diseases. This study was conducted to evaluate genetic diversity at HLA-A, -B and -DRB1 loci and to analyse the genetic structure of Minas Gerais population, on the basis of two distinct samples: (1) individuals from 917 families who sought an HLA compatible donor for transplantation of hematopoietic stem cells to a family member who owned and hematologic disease (2) 2868 individuals volunteer donors of bone marrow, healthy, unrelated and randomly allocated for this research. HLA genotyping was done by PCR-SSOP (Polymerase Chain Reaction Sequence Specific Oligonucleotide Probe) technique, resulting in the detection, on average, of 20, 37 and 13 different alleles at HLA-A, -B and -DRB1 loci, respectively. The proportion of heterozygotes attained high values in the three loci, with a maximum of 95,1% at the HLA-B locus. The three pairs of loci showed statistically significant linkage disequilibrium and the estimated recombination rate between HLA-A:HLA- B loci was smaller than expected. The statistically significant difference between expected and observed homozygous proportions pointed to balancing natural selection as an important cause of the large allelic and haplotypic diversity observed in these loci. The importance of balancing selection was also supported by the intermediate allelic frequencies at the three analyzed HLA loci. Population structure was supported by genetic differentiation analysis. A predominantly Caucasian and African genetic constitution and a small contribution of Native American genes was demonstrated by phylogenetic analysis. Key words : MHC, HLA, polimorphism, allele frequency, haplotype frequêncy, inter-loci recombination, likage desequilibrium, natural selection.. 2

16 1. INTRODUÇÃO 1.1. COMPLEXO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDADE História O MHC (Major Histocompatibility Complex) foi descrito primariamente em camundongos, na década de 30, por Peter A. Gorer (Gorer, 1936; Gorer, 1937). Estudos demonstraram a existência de um grupo de antígenos envolvidos nos processos de rejeições dos transplantes de pele entre diferentes linhagens desses animais. Esses antígenos responsáveis pela rejeição de tecidos foram denominados antígenos de histocompatibilidade e a região foi designada de sistema H2 no camundongo estando localizada no cromossomo 17. Desde a descoberta do MHC em camundongos, o MHC se tornou uma das regiões gênicas mais estudadas no genoma dos vertebrados (Klein, 1986). Em 1958, um aloantígeno presente nos leucócitos humanos foi identificado, tornando-se o primeiro antígeno leucocitário humano (HLA) denominado HLA-A2 (Dausset, 1958; Payne e Rolfs, 1958; Van Rood, Eernisse et al., 1958) que mais tarde se denominou Complexo HLA. O estudo destes autores demonstrava a presença de anticorpos no soro humano de pacientes politransfundidos ou mulheres multíparas, que reagiam com leucócitos, mas não de todos os indivíduos testados. Os anticorpos destes soros detectavam um sistema polimórfico de antígenos nos leucócitos humanos. O crédito da descoberta do primeiro antígeno HLA foi dado a Jean Dausset, que em 1980, recebeu o Prêmio Nobel de Medicina. Ele nomeou este antígeno de MAC em homenagem a três indivíduos voluntários, cujos nomes começavam com M, A e C, respectivamente. O antígeno MAC, que mais tarde foi denominado HLA-A2, estava presente em 60% da população francesa. Finalmente, o estudo dos antígenos leucocitários adquiria grande importância em transplante de tecidos (Thorsby, 2009). Posteriormente, diversos outros investigadores fizeram identificações originais de antígenos leucocitários e atualmente centenas de novos alelos continuam a ser descobertos. Desde a descoberta do HLA-A2, Workshops Internacionais de Imunogenética e Histocompatibilidade (WIIH) são realizados, quando os investigadores da área se encontram e comparam seus reagentes, técnicas, resultados e comunicam novas descobertas. O primeiro WIIH ocorreu em 1964 em Durham, NC, Estados Unidos, e o último em 2008, em Búzios, RJ, Brasil. Várias descobertas importantes foram discutidas e publicadas nos WIIH, conforme Tabela 1 (Thorsby, 2009). 3

17 Tabela 1: Principais assuntos sobre HLA discutidos nos WIIH. Workshop Ano Principais assuntos discutidos 3º 1967 Demonstração da associação dos antígenos HLA com doenças Criação de um comitê da Organização Mundial da Saúde (OMS) para o estabelecimento da nomenclatura para os alelos HLA 4º 1970 Estabelecimento de dois loci HLA, LA (posteriormente HLA-A) e 4 (mais tarde HLA-B) e constatação de que os loci eram ligados e continham pelo menos sete e oito alelos, respectivamente 5º 1972 Descoberta de que o sistema HLA constituía-se em uma importante ferramenta para investigações antropológicas devido ao polimorfismo observado 7º 1977 Mapeamento do MHC no braço curto do cromossomo 6 (já descritos os loci HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ e -DP) 8º 1980 Papel da compatibilidade HLA em transplantes renais 9º 1984 Introdução de várias técnicas para o estudo do polimorfismo dos loci HLA 10º 1987 Estabelecimento de um painel de referência de linhagens celulares tipificadas 13º 2002 Estabelecimento da acessibilidade pública a bancos de dados sobre HLA 15º 2008 Novos dados e aplicações em medicina, antropologia etc. Em 1987, o grupo de Wiley (Bjorkman, Saper et al., 1987b), usando a técnica de cristalografia de raio-x, mostrou que parte da molécula HLA-A2 proximal à membrana celular continha dois domínios parecidos com imunoglobulinas e que o domínio distal à membrana era uma plataforma antiparalela de filamentos-β, cobertos por duas α-hélices, que juntos formavam uma grande fenda que constitui o sítio de ligação para antígenos processados. O grupo ainda mostrou que um peptídeo foi encontrado neste sítio, no cristal da molécula HLA-A2. Este mesmo grupo, também, foi o responsável por explicar o fenômeno da restrição HLA-TCR (Receptores de Células T) (Bjorkman, Saper et al., 1987b; a), discutido mais adiante Organização gênica do MHC O primeiro mapa do MHC baseado em sequência de DNA, publicado em 1999, descreveu 224 loci, dos quais 128 (57%) eram expressos (Complete sequence and gene map of a human major histocompatibility complex. The MHC sequencing consortium, 1999). 4

18 A sequência estendida do MHC foi publicada em 2004 como parte do sequenciamento completo do cromossomo 6, passando a cobrir 7,6 Mb do braço curto deste cromossomo (Horton, Wilming et al., 2004). Atualmente, os nomes dos genes e dos alelos do MHC são definidos pelo HUGO - Gene Nomenclature Committee (HGNC) - e IMGT/HLA Sequence Database (Robinson, Waller et al., 2003). O MHC é uma região poligênica e polimórfica situada no genoma humano, no cromossomo 6, na banda 6p21.3. O MHC é constituído por mais de 3,6 milhões de bases (3,6Mb) (Complete sequence and gene map of a human major histocompatibility complex. The MHC sequencing consortium, 1999; A haplotype map of the human genome, 2005), e o número de loci identificados tem aumentado desde a primeira publicação dos loci na região HLA, em O MHC é dividido de acordo com a estrutura e a função dos produtos gênicos em três regiões classificadas como: classe I, classe II e classe III (Shiina, Inoko et al., 2004) (Figura 1). Figura 1: Mapa esquemático dos genes da região do MHC. Os genes HLA clássicos estão representados em vermelho, os genes HLA não clássicos em verde, os pseudogenes em amarelo e os genes em rosa, azul e turquesa são genes relacionados com HLA, como exemplo, os gene TAP2 envolvido no processamento do peptídeo. Fonte: Site do Instituto Anthony Nolan Trust Histocompatibility Laboratories. Os loci de classe III não foram representados nesta figura esquemática. 5

19 As regiões de classe I e II são altamente poligênicas e polimórficas e codificam dois grupos de proteínas estruturalmente distintas. A região de classe III encontra-se localizada entre as regiões de classe I e II e contém um grupo de genes cujos produtos estão envolvidos nas respostas inflamatórias, tais como: as proteínas da cascata do complemento (C2, C4 e Bf), citocinas (TNF-α e TNF-β, LTA e LTB), proteínas do choque térmico e muitos outros genes relacionados com a função imune e inflamatória. A região de classe III contém mais de 62 loci distribuídos dentro de 0,9 Mb de DNA (Williams, 2001; Shiina, Inoko et al., 2004). A região de classe I ocupa aproximadamente 1,8 Mb e constitui a porção mais telomérica do MHC. Contém 18 loci HLA entre os quais três são clássicos (HLA-A, HLA-B e HLA-C), expressos por todas as células nucleadas, três são não clássicos (HLA-E, HLA-F e HLA-G) e 12 pseudogenes (HLA-S/17, HLA-X, HLA-N/30, HLA-L/92, HLA-J/59, HLA-80, HLA-21, HLA-K/70, HLA-16, HLA-H/54, HLA-90 e HLA-75) (Williams, 2001; Shiina, Inoko et al., 2004). A região de classe II ocupa aproximadamente 0,7Mb de DNA e contém os genes que codificam as cadeias a e b dos loci clássicos de classe II (HLA-DP, HLA-DQ e HLA DR). Existem 34 loci identificados dentro da região de classe II com 16 genes expressos, três genes candidatos e 15 pseudogenes. A região de classe II consiste de uma série de subregiões, cada uma contendo os genes a e b codificando as cadeias α e β, respectivamente. A família de gene DR consiste de um único gene DRA e mais de nove genes DRB. O gene DRA codifica uma cadeia α invariável que se liga a várias cadeia s β codificadas pelos genes DRB. Os haplótipos HLA de certos alelos DRB1 contêm especificamente os loci DRB3, DRB4 ou DRB5. As famílias DP e DQ têm um gene expresso para as cadeias α e β e pseudogenes não expressos (Shiina, Inoko et al., 2004). Apenas nove genes estão envolvidos com a apresentação dos peptídeos e são chamados de genes HLA clássicos, sendo que na região de classe I se localizam os loci HLA-A, -B e -C e, na região de classe II, os loci DPA1, DPB1, DQA1, DQB1, DRA, DRB1 (Williams, 2001) Estrutura das moléculas HLA As moléculas HLA de classe I e II são heterodímeros, com domínios extracelulares variáveis, domínios transmembrana e intracitoplasmáticos constantes (Williams, 2001) (Figura 2). Diferentemente dos genes receptores de células T e das imunoglobulinas, a diversidade não é obtida somaticamente, mas através da manutenção de muitos alelos na população. 6

20 As moléculas HLA de classe I são glicoproteínas constituídas de uma cadeia α composta por três domínios (α1, α2 e α3) e ligada de forma não covalente a uma molécula de β-2 microglobulina, codificada fora do MHC por um gene localizado no cromossomo 15. Os genes que codificam as moléculas HLA de classe I têm uma estrutura característica na qual os diferentes domínios da proteína são codificados por diferentes exons. O polimorfismo estrutural na molécula HLA de classe I é observado nos domínios α1 e α2 (Figuras 3 e 5), os quais se ligam ao peptídeo que será apresentado aos receptores dos linfócitos T (TCR). O domínio α 1 é codificado pelo exon 2, e o α 2, pelo exon 3 (Marsh, S. G. E., Parham, P., Barber L.D., 2000). Os domínios α1 e α2 contêm as sequências variáveis de aminoácidos e determinam a especificidade antigênica das moléculas HLA de classe I. O domínio α3 e β-2 microglobulina, juntos, formam a região constante da molécula HLA. Os domínios de cadeia pesada α1 e α2 formam a fenda de ligação do peptídeo, que pode conter de oito a dez resíduos de aminoácidos (Marsh, S. G. E., Parham, P., Barber L.D., 2000). Os produtos dos genes de classe II, também, são glicoproteínas, mas formadas por duas cadeias polipeptídicas não covalentemente associadas, α e β. As cadeias α e β são transmembrana tendo a mesma estrutura geral. Uma porção extracelular composta por dois domínios de cadeia α (α1 e α2) e uma cadeia β, também com dois domínios (β1 e β2) ancorada na membrana por uma pequena região transmembrana e um domínio citoplasmático. O polimorfismo de classe II ocorre na região aminoterminal do domínio β1 (Figuras 4 e 5). Os domínios α1 e β1 formam a fenda de ligação para os peptídeos estranhos, que podem medir mais de 12 resíduos de aminoácidos. Os genes que codificam as cadeias α são designados A (por exemplo, DRA, DQA) e os genes que codificam as cadeias β são designados como B (por exemplo, DRB, DQB). Os genes que codificam as cadeias α e β do HLA-DR são DRA1 e DRB1. Quanto à organização intron-exon, as cadeias α e β êm t estrutura s similares, nas quais os exons 2 e 3 codificam os dois domínios extracelulares(marsh, S. G. E., Parham, P., Barber L.D., 2000)., é 7

21 Figura 2: Estrutura esquemática das moléculas HLA de classe I e classe II. Fonte: (Williams, 2001). Figura 3: Estrutura esquemática da molécula HLA de classe I. O polimorfismo estrutural encontra-se localizado nos domínios α1, α2. Fonte: (Janeway, 2006). 8

22 Figura 4: Estrutura esquemática da molécula HLA de classe II. O polimorfismo estrutural encontra-se localizado no domínio β1. Fonte: (Janeway, 2006). Figura 5: Vista frontal da PBR (Peptide binding Region) das moléculas HLA de classe I e II. Os peptídeos ligados estão representados em vermelho; pontes dissulfeto, em amarelo. As linhas pontilhadas indicam pontes de hidrogênio conservadas entre aminoácidos da cadeia lateral da molécula HLA e peptídeos ligados. Fonte: (Jensen, 2007). 9

23 Herança dos alelos HLA Os alelos HLA são proximamente ligados no cromossomo, e a região MHC completa é herdada como um haplótipo, com a exceção de haplótipos que sofreram recombinação, de modo Mendeliano de cada parental. A segregação dos haplótipos HLA dentro das famílias pode ser determinada por estudos de HLA nessas famílias. Dois irmãos têm 25% de chance de serem genotipicamente idênticos nos loci HLA, 50% de chance de serem haploidênticos (compartilharem 1 haplótipo) e 25% de chance de não compartilharem nenhum haplótipo. A interação entre os alelos HLA é de codominância Expressão e função imunológica das moléculas HLA Apesar de as moléculas HLA terem sido originalmente estudas devido à sua habilidade em conferir tolerância aos transplantes de tecidos e órgãos, sua função primária é fornecer proteção contra os patógenos. Isto é obtido através de sofisticadas vias, nas quais as moléculas HLA de classe I apresentam antígenos endógenos às células T-CD8+ e as moléculas HLA de classe II apresentam antígenos exógenos às células T-CD4+ (Jensen, 2007). A via de apresentação de antígenos das moléculas HLA classe I é ativa em todas as células nucleadas, fornecendo um mecanismo para apresentação, na superfície das células, de amostras de peptídeos derivados de proteínas que estão sendo sintetizadas na célula em um dado tempo. Portanto, o proteoma interno é disponibilizado para a vigilância das células T-CD8+ citotóxicas, que têm a habilidade para detectar e lisar as células que expressam proteínas virais ou antígenos de tumor. Desse modo os linfócitos T CD8+ reconhecem peptídeos endógenos apresentados pela molécula HLA de classe I e, uma vez ativados, desencadeiam uma reação citotóxica, lisando a célula alvo por meio de proteínas citoplamáticas como a granzima B e a perforina (Rock, York et al., 2004; Jensen, 2007). A via de apresentação de antígenos das moléculas HLA classe II é ativa somente nas CAP (Células Apresentadoras de Antígenos), incluindo células dendríticas, linfócitos B, macrófagos, células epiteliais do timo e linfócitos T ativados. A geração de complexos peptídeo-hla classe II e a expressão de moléculas coestimulatórias e citocinas nas CAP são altamente regulados, refletindo a importância crucial das células T-CD4+ em regular quase todos os componentes da imunidade adaptativa. Os peptídeos apresentados pelas moléculas HLA classe II são derivados de proteínas que obtiveram acesso ao compartimento endossomal, de modo a fornecer uma forma para as células T-CD4+ responderem aos antígenos processados internamente pelas CAP através da fagocitose, macropinocitose, endocitose mediada por receptor e outros mecanismos (Watts, 2004; Jensen, 2007). 10

24 As células T-CD4+ secretam citocinas capazes de recrutar e ativar um grande número de células efetoras, principalmente macrófagos e linfócitos T e B. A ativação dos linfócitos T-CD4+ tem múltiplos efeitos, propiciando a diferenciação e a proliferação dos linfócitos B, que levam à produção de anticorpos e permitem que os linfócitos T se diferenciem para as funções efetoras (Jensen, 2007). Zinkernagel e Dougherty demonstraram, em 1974, que, para induzir a resposta imune, os linfócitos T devem ter a mesma molécula HLA que a da célula apresentadora de antígeno. O fato de que os peptídeos são ligados às moléculas HLA e estes complexos são reconhecidos na superfície das células pelos TCR ficou conhecido como restrição ao MHC (Zinkernagel e Doherty, 1974). Tal descoberta resultou de experimentos mostrando que um linfócito T somente reconhecerá peptídeos quando eles estiverem ligados a uma molécula MHC específica. O descobrimento da restrição imunológica pelo MHC desempenhou papel chave na resposta imune adaptativa e permitiu que seu alto polimorfismo fosse interpretado no contexto funcional. A combinação específica MHC-peptídeo foi usada para concluir que a resposta imune de indivíduos heterozigotos nos loci MHC seria mais efetiva por responderem de forma bem-sucedida a uma maior variedade de patógenos (Hedrick, P. W., 2000) Polimorfismo nos loci HLA Uma ampla lista de alelos de cada loci dentro do sistema HLA não é possível de ser publicada porque novos alelos são descobertos e adicionados continuamente. Para pesquisar a lista mais atual destes alelos, foi acessado, em novembro de 2009, o site com banco de dados - denominado IMGT/HLA - atualizado regularmente. O IMGT/HLA, um banco de dados locus específico (LSDB) para as sequências de genes do sistema HLA, fornece os recursos para os interesses clínicos ou científicos no sistema HLA. Atualmente, armazena mais de 2850 sequências de alelos dos loci HLA-A, -B e DRB1 (Tabela 2 e Figura 6). Tabela 2: Número de alelos, proteínas e alelos nulos nos loci HLA-A, -B e DRB1. HLA Classe I HLA Classe II Genes A B DRB1 Alelos Proteínas Alelos nulos Fonte: (Robinson, Waller et al., 2003).. 11

25 Figura 6: Descobrimento de novos alelos HLA de classe I e II no período de 1987 a Fonte: (Robinson, Waller et al., 2003) Os genes HLA de classe I e II são altamente polimórficos, com o locus HLA-B sendo o mais polimórfico gene do genoma humano (Mungall, Palmer et al., 2003). Os SNPs (Single Nucleotide Polimorphism) são o tipo mais comum de variação. Mas as moléculas HLA apresentam também polimorfismos de inserção/deleção e originados da conversão gênica (Mungall, Palmer et al., 2003). As frequências dos alelos HLA exibem variação entre as regiões e entre os grupos populacionais (Figura 7), com alguns alelos sendo amplamente distribuídos entre populações e outros aparecendo quase que exclusivamente dentro de uma região ou grupo particular. 12

26 Figura 7: Distribuição do alelo HLA-B 40 na população mundial. Fonte: (Cavalli-Sforza, 1994). Imigrantes do Estreito de Bering para as Américas há mais de 100 mil anos, provavelmente trouxeram o alelo DRB1*0802 com alta frequência. Atualmente, variantes do alelo DRB1*0802, tais como *0807 e *0811, são encontradas nos nativos americanos, assim como, o DRB1*0802 (Williams, Wu et al., 1994; Mack e Erlich, 1998). Estas variantes se originaram por mutações nas linhagens germinativas em indivíduos portadores do DRB1*0802. Novos alelos aparecem regularmente em altas taxas e se tornam fixados na população, em teoria, se fornecem uma vantagem seletiva na apresentação de peptídeos de organismos infecciosos. Novos alelos são gerados via mutação de ponto, recombinação e conversão gênica (Little e Parham, 1999). A recombinação intragênica pode ser um mecanismo importante na geração da diversidade alélica nos loci HLA de classe I e II (Satta, 1997). Enquanto as mutações geram novas variantes em sítios individuais, a recombinação pode produzir múltiplas substituições 13

27 por evento com o potencial para grandes mudanças no sítio de ligação do antígeno nas moléculas HLA. Portanto, novas moléculas geradas por recombinação podem ter uma maior vantagem seletiva (Andersson e Mikko, 1995) Nomenclatura dos alelos HLA A nomenclatura dos alelos HLA é amplamente baseada em nomes sorológicos antigos desde que os grupos de epítopos públicos de antígenos HLA foram originalmente definidos com base na reação com antissoros em testes de microlinfocitotoxicidade dependente de complemento. Os alelos dentro de um grupo sorológico podem diferir um do outro por um ou por diversos nucleotídeos. Os antissoros foram, inicialmente, isolados de mulheres sensibilizadas durante a gravidez por antígenos HLA codificadas pelos haplótipos paternos. A nomenclatura do sistema HLA é formalmente estabelecida pelo Comitê de Nomenclatura da OMS. O Comitê Internacional da OMS responsável pela normatização da denominação dos alelos de histocompatibilidade se reúne regularmente em Workshops Internacionais para determinar os nomes oficiais dos alelos HLA. Uma vez que as informações das sequências de nucleotídeos dos alelos HLA se tornam disponíveis, a nomenclatura complementar para os termos sorológicos é elaborada (Tabela 3). Tornando-se disponível a sequência de nucleotídeos do alelo, a nomenclatura complementar aos termos sorológicos é necessária. Os primeiros dois dígitos do nome de um alelo se referem à especificidade sorológica, e o terceiro e o quarto dígitos indicam a sequência específica desse alelo. Múltipos alelos são encontrados dentro de um sorotipo conhecido, o B35, por exemplo, tem mais de 40 alelos descritos. Outro exemplo são os alelos HLA-A*0205 e A*0210, que codificam diferentes polipeptídios dentro do sorotipo A2. Estes dois alelos codificam um epítopo reconhecido pelo antissoro anti-a2, apesar de terem cinco nucleotídeos diferentes nos exons 2 e 3 resultando em variações de aminoácidos (Williams, 2001). 14

28 Tabela 3: Nomenclatura dos alelos HLA. Exemplos de alelos Comentários A*24 se refere a qualquer um dos 33 alelos conhecidos com sequências proximamente relacionadas aos A*24 e A*2404 antígenos de classe I codificados que usualmente reagem com o antissoro A24. A*2404 é um alelo específico dentro deste grupo. Diferem no exon 2 no códon 74: nesta posição o DRB1*0801 e DRB1*0805 DRB1*0801 tem CTG e o DRB1*0805 tem GCG codificando Leu e Ala, respectivamente. Diferem por um polimorfismo silencioso no códon 142: A*01011 e A*01012 nesta posição o A*01011 tem ATC e o A*01012 tem ATT. Ambos codificam Ile (Isoleucina). O alelo B* N (nulo) tem uma deleção de 10 pb B* e B* N próximo ao final 3 do intrón 1. O mrna é impropriamente recomposto com um polipeptídeo traduzido truncado. Fonte: (Robinson, Waller et al., 2003) Aspectos clínicos relevantes envolvendo as moléculas HLA HLA e transplante O sistema imune é capaz de responder aos órgãos e tecidos transplantados, reconhecendo os antígenos HLA incompatíveis do doador. A atual interpretação para a rejeição de órgãos e tecidos é baseada na interação de receptores de linfócitos T com as moléculas HLA, e peptídeos associados determinam a especificidade da interação. Então, se os tecidos ou órgãos transplantados carregam moléculas HLA que são diferentes daquelas do receptor, os complexos HLA-peptídeos resultantes serão reconhecidos como estranhos pelos linfócitos T do receptor. A resposta imune, assim, será montada contra o enxerto, resultando na sua rejeição (Janeway, 2006). O primeiro transplante renal foi realizado com êxito entre gêmeos univitelinos no ano de 1958, demonstrando a importância dos estudos de histocompatibilidade HLA na evolução e sobrevida do enxerto. 15

29 HLA e doenças Doenças infecciosas Descobertas de associação entre alelos HLA e doenças infecciosas mostram que a variação no sistema HLA está relacionada à resistência ou à susceptibilidade a doenças infecciosas. Como: 1) Os estudos de associação HLA e doenças infecciosas mostram casos em que os patógenos contribuem para a distribuição dos alelos HLA em populações humanas. No caso da malária, o alelo HLA-B*53 e o HLA-DRB1*1302 são superrepresentados entre os indivíduos que são resistentes à malária severa, sugerindo que eles são alelos protetores para a doença. Além disso, esses alelos são mais frequentes entre os africanos do oeste (que são expostos ao parasito que causa malária) do que em outros grupos populacionais, indicando seleção que favorece indivíduos com os alelos protetores e, desta forma, elevando a frequência de tais alelos na população (Hill, Allsopp et al., 1991; Hill, Yates et al., 1994; Carrington, Nelson et al., 1999). 2) Heterozigotos para os alelos HLA podem ser mais resistentes a algumas doenças infecciosas do que os homozigotos. No estudo de progressão para a AIDS entre indivíduos infectados pelo HIV, o tempo de manifestação da doença foi significativamente mais demorado em indivíduos heterozigotos para os alelos HLA de classe I (Carrington, Nelson et al., 1999) Doenças autoimunes e outras Além das doenças infecciosas, muitas doenças autoimunes, câncer e doenças de outras etiologias mostram associação com HLA. Em alguns casos, a associação com as moléculas HLA de classe I clássicas reflete o Desequilíbrio de Ligação (DL) com o gene real de predisposição à doença; por exemplo, a hemocromatose. Entretanto, em um número de exemplos, os riscos para as doenças estão diretamente relacionados às moléculas clássicas de classe I ou II (Thorsby e Lie, 2005). Os genes HLA clássicos de classe I e II estão associados a várias doenças (Thorsby, 1997). As moléculas são consideradas associadas com uma determinada doença se a frequência de um ou mais alelos HLA aumenta ou diminui significativamente quando os pacientes são comparados com um grupo controle. Nas doenças associadas aos loci HLA, incluem-se as doenças neurodegenerativas, psiquiátricas, metabólicas, infecciosas, dermatológicas, oncológicas e as autoimunes (Tabela 4). 16

30 Tabela 4: Fenótipos e doenças associadas aos loci HLA. Fenótipo ou doença Classe da doença Genes associados Leucemia linfoblástica aguda infantil (LLA) Câncer HLA-DRB1 Mieloma múltiplo Câncer HLA Hepatite autoimune Imune HLA-DRB1 Psoríase Imune HLA classe I Miastenia de gravis Imune HLA classe II Lupus eritematoso sitêmico Imune HLA classe II Pênfico vulgar Imune/Dermatológica HLA DQ beta Doença de Grave Imune/Endócrina HLA-DRB1, -DQA1 Tireoidite de Hashimoto Imune/Endócrina HLA-A2 Diabetes mellitus tipo 1 Imune/Endócrina/Meta HLA-DRB1*03/*04 -bólica Doença celíaca Imune/Gastrointestinal HLA classe II Doença de Crohn Imune/Gastrointestinal HLA-DRB1 Baixa resposta imune à vacina para Imune/Infecção HLA-DR14-DR52 hepatite B Uveíte anterior aguda Imune/Ocular HLA-B27 Doenças de Behcet Imune/Ocular HLA-B51 Asma Imune/Respiratória HLA-DRB1, -DQB1, - DPB1 Espondilite anquilosante Imune/Reumatológica HLA-B27 Doença do enxerto contra o hospedeiro Inume/Transplante HLA aguda (DECH) Doenças de Alzheimer Neurodegenerativa HLA-A2, DRB1 Narcolepsia Neurológica HLA-DQB*06 Autismo Psíquica HLA-DRB1 Esquizofrenia Psíquica HLA Fonte: Genetic Association Database (GAD) História evolutiva do MHC/HLA O MHC de classe I e II está presente somente nos vertebrados mandibulados, e esta distribuição filogenética é paralela à das imunoglobulinas e dos receptores de linfócitos T. Os genes HLA de classe I e II são partes do sistema imune adaptativo, assim como os receptores dos linfócitos T e as imunoglobulinas (Flajnik e Kasahara, 2001). Pelo menos 17

31 quarenta por cento dos loci MHC expressam proteínas envolvidas na resposta imune, o que pode refletir em coevolução de funções ou em coexpressão de transcritos relacionados (Meyer e Thomson, 2001). O MHC é a região mais importante do genoma humano com relação à infecção e autoimunidade, além de ser crucial na imunidade inata e adaptativa. Esta região gênica é composta por um grupo de genes ligados envolvidos funcionalmente com o sistema imune inato e adaptativo. No MHC de mamíferos, existem de dois a cinco diferentes blocos de duplicações de classe I compreendidos dentro da estrutura dos genes conservados nãoclasse I e/ou não-classe II (Flajnik e Kasahara, 2001). Compreender a história evolutiva dos loci HLA implica compreender uma complexa estrutura, afinal os loci são compostos por segmentos com diferentes níveis de diversidade nucleotídica. O comprimento da sequência genômica dos alelos HLA-DRB1 varia consideravelmente, estendendo-se de pb, para o HLA-DRB1*010101, até pb, para o HLA-DRB1* Esta variação pode ser atribuída principalmente a proporções variáveis de sequências repetidas nos introns (Marsh, S. G. E., Parham, P., Barber L.D., 2000). A idade do polimorfismo e a taxa na qual novos alelos são gerados nos loci HLA têm causado muita controvérsia. Para o locus HLA-DRB1, estudos prévios têm mostrado ser restrito a 270 pb do exon 2, que representa a parte mais variável do gene. Quando se excluiu o exon 2 da análise, a diversidade dos sítios sinônimos foi similar à diversidade dos introns. A diversidade na região não codificante foi, também, similar à média do genoma. O alelo HLA-DRB1 03 é encontrado em humanos, chimpanzés, bonobos, gorilas e orangotangos. Quatro alelos HLA-DRB1 01, 04, 07 e 10 são pré-datados da divergência de humanos e chimpanzés. Com exceção do exon 2, tanto a diversidade na região codificante quanto a não codificante sugere uma recente origem (<1 milhão de anos atrás) para a maioria dos alelos no locus DRB1. Os sítios que codificam para os aminoácidos envolvidos na PBR (Região de ligação do peptídeo) parecem ter uma origem mais remota (Gyllensten, Sundvall et al., 1991; Gyllensten, Bergstrom et al., 1996). Tomadas juntas, a recente origem da maioria dos alelos, a alta diversidade entre as linhagens e a origem mais antiga das sequências motivos do exon-2 são consistentes com a geração relativamente alta de novos alelos para eventos como conversão gênica. Alguns dos motivos nas regiões de reconhecimento antigênico podem ter sido preservados como unidades funcionais por milhões de anos. Mas a idade média da diversidade dentro das linhagens é, por uma estimativa conservativa, menos que 1 milhão de anos. Com base na similaridade dos haplótipos entre humanos e chimpanzés, ou na similaridade da região codificante, tem sido argumentado que novos alelos em muitos loci MHC são antigos (evolução transespécie) e pré-data dos hominídeos (Arden e Klein, 1982). 18

32 Em contraste, outros têm sugerido que realmente existem linhagens alélicas antigas, mas que novos alelos dentro destas linhagens podem ser gerados rapidamente por eventos como conversão gênica (Von Salome, Gyllensten et al., 2007). O MHC é denominado de complexo principalmente porque seus genes em humanos e roedores foram descobertos agrupados dentro de uma única região genômica ou locus. Este grupamento gênico é considerado biologicamente e evolutivamente significante e tem características que permitem inferir que os loci estão sob pressão seletiva, possivelmente apoiando a expressão coordenada de alelos na forma cis e a baixa taxa de recombinação (Meyer e Thomson, 2001; Solberg, Mack et al., 2008). O MHC e o sistema imune adaptativo evoluíram principalmente por translocações, duplicações e outros eventos de recombinação (Michalova, Murray et al., 2000). Não existe um candidato definitivo para o gene MHC primordial. Entretanto, baseando-se na similaridade estrutural e funcional, é geralmente aceito que os genes MHC de classe I e II têm uma origem comum. Os genes de classe II provavelmente evoluíram dos genes de classe I por uma série de duplicações em tandem, seguida por divergência estrutural e funcional (Flajnik, Canel et al., 1991). A densidade gênica no MHC é estimada de um gene ou pseudogene a cada 16 kb, existindo diferença na proporção entre genes expressos e pseudogenes entre as regiões. Em relação à proporção de genes expressos e pseudogenes, tanto a região de classe I quanto a de classe II parecem ter sido duplicadas muitas vezes, gerando novos membros de famílias gênicas que têm divergido em novas funções. Uma explicação para manter o alto nível de pseudogenes pode ser o envolvimento deles na geração de novos alelos por conversão gênica, fenômeno que foi observado em outros loci do sistema imunológico humano. Novos alelos são gerados por mutação de ponto, recombinação e eventos de conversão gênica (Marsh, S. G. E., Parham, P., Barber L.D., 2000). Cinco por cento do genoma humano pode ser atribuído a duplicações de segmentos gênicos e que as duplicações em grande e pequena escala podem explicar a distribuição das famílias de genes humanos (Bailey, Gu et al., 2002). A duplicação de seguimentos no MHC resulta na formação de clusters de genes do sistema imune. Isto pode explicar por que nos produtos de genes fisicamente associados, como por exemplo, HLA-DRA e HLA-DRB, a ligação pode garantir que os componentes protéicos sejam coexpressos em quantidades apropriadas para a formação do heterodímero. A coordenação na expressão dos genes pode ser uma possível vantagem deste tipo de clusterização. Os genes MHC de classe I e II são submetidos a duplicação e deleção periódicas dentro e entre as espécies, possivelmente em resposta à demanda de taxa de mudança dos patógenos (Horton, Wilming et al., 2004). Os genes do sistema imune, incluindo os genes do MHC, devem estar sob forte pressão seletiva para a diversidade a fim de lidar com todas as mudanças dos 19

33 epítopos dos patógenos, e a duplicação seguida por diversificação fornece um dos meios de se obter (Hedrick, P. W., 2000) Desequilíbrio de ligação e recombinação intergênica nos loci HLA Os alelos de diferentes loci na região HLA são frequentemente encontrados nos cromossomos em combinações que ocorrem em frequências distintas daquelas esperadas (baseadas na associação aleatória de alelos em loci diferentes, resultando em DL). Os genes HLA de classe I e II apresentam significativos DL que foram observados em várias populações do mundo (Trachtenberg, Vinson et al., 2007; Tu, Mack et al., 2007; Mack, Tu et al., 2009). O DL é muitas vezes quase completo entre os loci fortemente ligados, enquanto genes menos fortemente ligados (separados por uma distância física maior) mostram valores intermediários de DL (Hedrick, P. W., 2000). Desta forma, apesar da grande quantidade de alelos expressos em cada loci HLA, o número de haplótipos observados na população é muito menor que o esperado teoricamente (Myers, Bottolo et al., 2005). Em algumas regiões do MHC a concordância entre a distância física e a taxa de recombinação é menor que o esperado, dado o padrão de 1% de recombinação por Mb de DNA na meiose. A taxa de recombinação entre os loci HLA-A e HLA-B, por exemplo, é de 0,31% (Carrington, 1999), o que é menor que o esperado para o segmento de DNA de 1,4 Mb. Esse contraste tem sido atribuído ao DL, que pode estar associado à ocorrência de sítios de recombinação não aleatórios (Carrington, 1999). A diversidade haplotípica é inversamente relacionada ao DL entre os loci HLA, e a diminuição do LD entre os loci é proporcional ao aumento da distância física e genética e, de uma forma geral, reflete sua probabilidade gradualmente aumentada de recombinação (Dawson, Abecasis et al., 2002). Sob neutralidade, uma mutação recém-introduzida inicialmente seria de baixa frequência na população, mas ao mesmo tempo mostra completo DL com o haplótipo no qual se originou. Com o passar do tempo, a freqüência deve aumentar para ele ser detectável no restante da população, mas o DL com as variantes ligadas diminuirá gradualmente devido à recombinação (Hedrick, P. W., 2000). Evidências empíricas sugerem, entretanto, que esta relação entre DL e distância não é uniforme e que o genoma humano, ao invés disso, é organizado em blocos regionais de alto DL interno, com pouco ou nenhum DL entre os blocos. Dentro dos blocos, poucos haplótipos comuns representam a maioria dos cromossomos até mesmo em diferentes populações, e os eventos de recombinação são localizados entre os blocos no chamado hotspots de recombinação (Hedrick, P. W., 2000). 20