INFLUÊNCIA DO RECICLO DE FERMENTO NA CAPACIDADE FERMENTESCÍVEL DE MELAÇO

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1 INFLUÊNCIA DO RECICLO DE FERMENTO NA CAPACIDADE FERMENTESCÍVEL DE MELAÇO Lima, M. C. S. (1) ; Silva, F.L.A. (1) : Leite, A.L. (1) ; Santos, F. J. A. L. (1) ; Silva, A.C.P. (1) ; Barbosa-Neto, A. G. (2,3) ; Brasileiro, B. T. R. V. (1,3) monique.souza.eng@gmail.com (1) Universidade Católica de Pernambuco UNICAP, Recife - PE; (2) Universidade Federal de Pernambuco UFPE, Recife PE; (3) Genetech Bioprodutividade, Recife - PE RESUMO O bioetanol é obtido através da fermentação alcoólica, que é a ação das leveduras de gênero Saccharomyces sobre açúcares fermentescíveis. Dentre os substratos utilizados, o melaço, que é um subproduto da produção do açúcar, é muito utilizado usinas para a produção de etanol em países tropicais como o Brasil, devido a quantidade substancial de sacarose. Assim o presente trabalho objetivou avaliar a eficiência alcoólica da fermentação com melaço de cana-de-açúcar após reciclo de células, tomando a fermentação de caldo de cana (mosto) como referência independente. Para qual foram realizados ensaios fermentativos sequenciais com o fermento reciclado a partir do ensaio anterior. Embora os resultados tenham demonstrado alta correlação entre os substratos, o melaço surpreendentemente apresentou capacidade fermentescível superior ao caldo de cana. Palavras-chave: Saccharomyces cerevisiae, Eficiência Alcoólica, Cana-de-açúcar.

2 INTRODUÇÃO O bioetanol é obtido através da fermentação alcoólica, que é a ação das leveduras de gênero Saccharomyces sobre açúcares fermentescíveis. No Brasil, utiliza-se como substrato para a fermentação alcoólica o melaço de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.), a própria cana-deaçúcar, ou a mistura destes. A sacarose presente nesses substratos pode ser transformada em etanol, ATP e CO 2, num processo que envolve 12 reações em sequência ordenada, cada qual catalisada por uma enzima específica (PACHECO, 2010; AMORIM, 2008). O Melaço é um subproduto da produção do açúcar e é aproveitado por usinas para a produção de etanol (RODRIGUES, 2011), devido à quantidade substancial de sacarose, sendo utilizado para a produção industrial de etanol em países tropicais como o Brasil (MAITI et. al., 2011). Além de possuir vitaminas e minerais, tais como, nitrogênio, fosfatos, cálcio e magnésio, zinco, manganês, carbono, cobre e ferro essenciais para a fermentação alcoólica e o melaço é considerado um substrato de baixo custo (TOKASHIKI et al., 2011). Durante o processo de fabricação de açúcar, são gerados subprodutos e resíduos da produção, sendo que praticamente todos estes podem ser aproveitados de maneira a aumenta os lucros da própria indústria e 2

3 diminuir os custos de produção e impactos ambientais (MEZAROBA et al., 2010). O melaço ou mel final se constitui no principal subproduto da indústria do açúcar, sendo produzido na proporção de 40 a 60 quilos por tonelada de cana processada. No Brasil devido ao elevado teor de açúcares totais e demais componentes, o melaço é utilizado, principalmente, na fabricação do álcool etílico (ALCARDE, 2007) A composição química tanto do caldo de cana quanto a do melaço, dependem muito da cana utilizada, portanto, são extremamente variáveis (MARQUES, 2008). A quantidade de nutrientes do melaço é maior que a do caldo de cana. Isso pode ocasionar segundo Souza (2009), o estresse induzido pelo aumento da osmolaridade externa, levando a redução em crescimento e perda da viabilidade das células das leveduras, devido às perturbações no gradiente osmótico através da membrana plasmática. O sulfito presente no melaço causa queda da viabilidade, números de células, brotamento celular e queda na eficiência alcoólica via reprodução de mais fermento para a reposição das perdas, aumento da atividade tamponante do meio, maior consumo de ácidos e bases no processo, e em casos mais graves, aumento exagerado na acidez do 3

4 álcool produzido, além de aumentar a acidez do meio. Para evitar esses problemas há a clarificação do melaço na indústria (NETO, 2012). No processo industrial é feito o reciclo de células, ou seja, quando a fermentação alcoólica termina, as leveduras são separadas do vinho através de centrifugação, e são reutilizadas com o objetivo de reduzir custos na reposição do fermento e melhores condições de operação, devido que os micro-organismos não precisam do consumo de substrato na fase de crescimento e já estão adaptados ao meio fermentativo (LIMA, 2004). Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo de avaliar a eficiência alcoólica da fermentação com melaço de cana-de-açúcar após reciclo de células, tomando a fermentação de caldo de cana (mosto) como referência independente. MATERIAL E MÉTODOS Como substratos da fermentação foram utilizados: o melaço de cana-deaçúcar, o qual cedido por uma unidade industrial produtora de açúcar e etanol do Estado da Paraíba, Brasil; caldo de cana de açúcar, adquirido em comercio local, Recife-PE. 4

5 Ensaio fermentativo O ensaio fermentativo segue a metodologia proposta por de Silva Filho et al. (2005), Vila Nova et al. (2009) e Barbosa-Neto et al. (2010). Para avaliar a capacidade fermentescível do mosto de melaço, foi utilizado o fermento liofilizado JP1, o qual foi ativado em solução salina durante 1h em estufa microbiológica. As fermentações tiveram duração de 6h sendo mantida na temperatura de 33ºC. Os parâmetros físico-químicos industriais e microbiológicos foram medidos antes e após a fermentação. Para determinar a viabilidade celular foi utilizada a câmara de Neübauer. O teor de fermento foi padronizado a 10% em todos os ensaios. Para o cálculo de rendimento e eficiência da fermentação foi considerado a seguinte fórmula: Rendimento = X/Y Eficiência = (rendimento/0,511)*100 X = gramas de etanol produzido Y = gramas de glicose consumido Determinação dos Açúcares Redutores Totais (ART) e Açúcar Residual (AR), Potencial Hidrogeniônico (ph), Brix e Teor Alcoólico (Silva Filho et al., 2005; Barbosa et al., 2010) Para determinação da quantidade de açúcar inicial (ART) e final (AR) foi medida através do método do ácido denitrosalisílico (ADNS). Para o 5

6 qual foi preparada uma curva de calibração com uma solução aquosa de glicose na concentração de 2g/L com diluições de 0,5g/L, 1,0g/L, 1,5g/L e 2,0g/L. Para determinação do açúcar inicial foi utilizado um alíquota do sobrenadante mosto, no qual foi adicionado 100µL de HCL 1M. Em seguida, adicionou-se 100µL de NaOH 1M e 1mL de reativo ADNS. O volume foi completado para 10mL com água destilada e foi procedida a leitura D.O. em comprimento de onda de 540nm. Quanto a medida do açúcar residual, após 6h de fermentação, 40mL da fermentação foi centrifugada durante 5 minutos para separar o vinho do mosto fermentado, da biomassa. Em seguida 10µL do vinho foi diluído em 990 µl de água destilada e adicionada 1mL de ADNS sem aquecimento. Posteriormente, foi feita a leitura da D.O em comprimento de onda de 540nm e a partir da curva de calibração da glicose e da respectiva absorbância, efetuou-se a regressão linear e a correlação (R2). O cálculo da quantidade de açúcares redutores totais foi realizado da seguinte forma: A 540nm xdiluição da amostra =0,9465x ART (g/l) + 0,0164 O ph e o Brix foram medidos através de um phmetro portátil e do refratômetro respectivamente. O teor alcoólico foi determinado pela 6

7 técnica de ebuliômetria, através do ebuliômetro modelo A partir de uma curva de calibração com solução alcoólica nos tratamento de 0,0%, 2,5%, 5,0%, 10,0%, 15,0% e 20% foi possível determinar a quantidade de álcool diluído (getoh/100ml) na amostra. Onde foi obtida através da curva de calibração a seguinte equação, para medida de etanol após a fermentação: TºC = 1,0337x(ETOH(g/L)+102,81 Análises estatísticas Os dados obtidos foram tratados estatisticamente independentemente pela comparação das médias através da análise de variância (ANOVA) e o teste-t pareado, considerando 95% de intervalo de confiança. A eficiência fermentativa do caldo de cana e do melaço foram corelacionadas por regressão linear. RESULTADOS E DISCUSSÃO De forma global, pode-se representar a fermentação alcoólica pela equação de Gay-Lussac. Na qual se observa que 1 mol de glicose (180g) produz 2 moles de etanol (92g), 2 moles de dióxido de carbono (CO 2 ) (88g) e 57 kcal de energia (LEHNINGER et al., 2006). A Figura 7

8 1 agrega estes dados que de modo geral apresentou correlação dos valores observados com os valores esperados (teórico estequiométrico). Entretanto no segundo reciclo celular do Melaço (Figura 1B) este padrão estequiométrico não foi observado, que possivelmente mascarou a análise de ANOVA e o teste-t pareado, não sendo observada diferença significativa (p-value=0,168) entre o primeiro e segundo reciclo. Quanto ao caldo de cana o reciclo demonstrou significativa influencia na capacidade fermentescível do substrato (Figura 1A). Figura 1. Monitoramento do consumo do substrato e formação de produtos de fermentação (Etanol e CO 2 ) durante os ensaios de reciclos. A) Fermentação do caldo de cana-de-açúcar; B) Fermentação do Melaço. A capacidade fermentescível dos substratos, surpreendentemente, demonstrou que o melaço propiciou ao fermento condições ideal para fermentação em relação ao caldo de cana, no qual não foram observadas diferenças significativas entre os ensaios de reciclo (Figura 2A). O 8

9 melaço deu suporte ao fermento até o segundo reciclo observando diferença significativa entre o primeiro e segundo reciclo (p-value: 0,002) (Figura 2B). De modo geral, o melaço apresentou capacidade fermentescível superior a observada nos ensaios de caldo de cana, entretanto é observado em ambos os ensaios uma queda no segundo reciclo, voltando a se recuperar no terceiro reciclo (Figura 2). Que possivelmente pode estar relacionado a aclimatação do fermento. Segundo Souza (2009), a quantidade de nutrientes do melaço é maior que a quantidade de nutrientes da cana, podendo assim aumentar o estresse induzido pelo desequilíbrio osmótico, ocasionado redução do crescimento e perda da viabilidade, e como consequência tem-se uma redução da eficiência fermentativa. Os resultados acima discutidos nos mostra uma possível contrariedade a essa questão, pois o melaço teve sua eficiência fermentativa relativamente boa nos reciclos e quanto o caldo de cana não se pôde esperar o mesmo. Nesse caso o melaço foi o melhor substrato para a fermentação. A análise de regressão permitiu a significativamente a extração do coeficiente de regressão linear, permitindo inferir modelos de estudo, demonstrando alta correlação entre os ensaios. No entanto, este modelo de regressão possuiu poucos dados de inferência não sendo aplicável para análises de modelagem. 9

10 Figura 2. Capacidade fermentescível dos substratos durante os ensaios de reciclo de fermento. A) Cana de açúcar; B) Melaço. Figura 3. Regressão linear simples da eficiência fermentescível do melaço contra do caldo de cana. 10

11 CONCLUSÃO O presente trabalho permite concluir que, ambos os substratos não influenciam a capacidade fermentativa da levedura, embora o primeiro reciclo exerce pressão sobre o fermento, período de aclimatação. Os ensaios de reciclo pouco influenciaram a eficiência e o rendimento da fermentação. O melaço apresentou maior capacidade fermentescível, comparada ao caldo de cana. O modelo estatístico proposto dá suporte ao delineamento mais robusto com a mesma abordagem. REFERÊNCIAS ALCARDE, A.R. Processamento da cana-de-açúcar. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa. 2007, Brasília, DF. Anais. BARBOSA-NETO, A.G.; BRASILEIRO, B.T.R.V. Caracterização morfológica e avaliação do potencial fermentativo de linhagens de leveduras isoladas no processo de fermentação alcoólica industrial. (Resumo) 12ª Jornada de Iniciação Científica (PIBIC CATÓLICA/CNPq/FACEPE), Recife PE, p LIMA, W. J. N.; Produção de proteínas recombinantes utilizando Escherichia coli em cultivos em alta densidade celular. Tese de doutorado. Universidade Estadual de Campinas, LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger - Princípios de Bioquímica. Editora Sarvier, 4ª edição, São Paulo, p MAITI, B.; RATHORE, A.; SRIVASTAVA, S.; SHEKHAWAT, M.; SRIVASTAVA, P. Optimization of process parameters for ethanol production from 11

12 sugar cane molasses by Zymomonas mobilis using response surface methodology and genetic algorithm. BIOENERGY AND BIOFUELS. Applied Microbiology and Biotechnology. India, MARQUES, A. S. Estudo da Influência da Complementação de Nutrientes no mosto Sobre o Processo de Fermentação Alcoólica em Batelada. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Alagoas. Maceió-AL, MEZAROBA, S.; MEGUETTI, C. C.; GROFF, A. M. Processos de produção do açúcar de cana e os possíveis reaproveitamentos dos subprodutos e resíduos resultantes do sistema. IV Encontro de Engenharia de Produção Agroindustrial. FECILCAM. Campo Mourão-PR, MOREIRA, A. L.; ALMEIDA, W.S.; SACBBIA, R. J. A.; TEXEIRA, R. R. P. Dosagem de Ácido Lático na Produção de Etanol a partir de Cana-de-açúcar. Faculdade de Ciências da Saúde de São Paulo. Biológico. V.70. SP, NETO, P. O. Efeitos de Inibidores na fermentação Alcoólica. Workshop de Etanol: Qualidade da matéria-prima. Disponível em: < Acessado em Janeiro de PACHECO, T. F. Fermentação Alcoólica com leveduras de Características Floculantes em Reator Tipo Torre com Escoamento Ascendente. Dissertação de Mestrado, Universidade Federal de Uberlândia. Uberlândia-MG, RODRIGUES, J. A. R. Do Engenho à Biorrefinaria. A Usina de Açúcar com Empreendimento Industrial para Geração de Produtos Bioquímicos e Biocombustíveis. Instituto de Química. Universidade de Campinas. Campinas-SP, SILVA FILHO, E.A. da; SANTOS, S.K.B. dos ; RESENDE, A.M. ; MORAIS, J.O.F. de ; MORAIS JUNIOR, M.A.; SIMOES, D.A. Yeast population dynamics of industrial fuel-ethanol fermentation process assessed by PCR-fingerprinting. Antonie van Leeuwenhoek, v. 88, n.1, p ,

13 SOUZA, C.S. Avaliação da produção de etanol em temperaturas elevadas por uma linhagem de Saccharomyces cerevisiae. Tese (Doutorado em biotecnologia)- Instituto Butantan-Instituto de Pesquisas Tecnológicas, São Paulo, TOKASHIKI, T.; YAMAMOTO, H. WATANABE, H; NAKAJIMA, R; SHIMA, J. A functional compound contained sugar cane molasses the fermentation ability of baker s yeast in high-sugar dough. Journal of General and Applied Microbiology. V.57. Japan, VILA NOVA, M.X.; SCHULER, A.R.P.; BRASILEIRO, B.T.R.V.; MORAIS JUNIOR, M. A.. Yeast species involved in artesanal cachaça fermentation in three stills with different technological levels in Pernambuco, Brazil. Food Microbiology, v. 26, p ,