ÓLEOS ESSENCIAIS COMO ANESTÉSICOS EM SERRALMÍDEOS E EXPRESSÃO GÊNICA DE GENES RELÓGIO E DAS ENZIMAS DIGESTIVAS EM JUNDIÁ

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIODIVERSIDADE ANIMAL ÓLEOS ESSENCIAIS COMO ANESTÉSICOS EM SERRALMÍDEOS E EXPRESSÃO GÊNICA DE GENES RELÓGIO E DAS ENZIMAS DIGESTIVAS EM JUNDIÁ TESE DE DOUTORADO Ana Paula Gottlieb Almeida Santa Maria, RS, Brasil 2018

2 Ana Paula Gottlieb Almeida ÓLEOS ESSENCIAIS COMO ANESTÉSICOS EM SERRASALMÍDEOS E EXPRESSÃO GÊNICA DE GENES RELÓGIO E DAS ENZIMAS DIGESTIVAS EM JUNDIÁ Tese apresentado ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Animal, Área de Concentração em Bioecologia e Conservação de Peixes, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS) como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas Área de Biodiversidade Animal. Orientador: Dr. Bernardo Baldisserotto Santa Maria, RS, Brasil 2018

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4 Ana Paula Gottlieb Almeida ÓLEOS ESSENCIAIS COMO ANESTÉSICOS EM SERRASALMÍDEOS E EXPRESSÃO GÊNICA DE GENES RELÓGIO E DAS ENZIMAS DIGESTIVAS EM JUNDIÁ Tese apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Animal, Área de Concentração em Bioecologia e Conservação de Peixes, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS) como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas Área de Biodiversidade Animal. Aprovado em 31 de agosto de 2018: Bernardo Baldisserotto, Dr. (UFSM) (Presidente/Orientador) Maria Amalia Pavanato, Dra. (UFSM) Everton Rodolfo Behr, Dr. (UFSM) Cândida Toni, Dra. (IFF) Alexssandro Geferson Becker, Dr. (UFPR) Santa Maria, RS, Brasil 2018

5 AGRADECIMENTOS Agradeço... A Deus por me amparar nos momentos difíceis e nunca me abandonar. Aos meus guias espirituais por estarem ao meu lado me ajudando a levantar nos momentos de queda e por nunca me deixarem desistir. Aos meus avós Maria Marlene Gottlieb e Mario Gottlieb (in memoriam) pelo amor incondicional, pelos ensinamentos, pelo apoio incondicional nos estudos e pela minha vida. Sem vocês, hoje, eu nada seria. A minha mãe por me dar a vida e aos meus irmãos pelo companheirismo. Ao meu namorado Ricardo Bianchin Gomes pelo amor, confiança, companheirismo e compreensão. Obrigada por estar ao meu lado em situações extremamente difíceis e não me deixar cair. Ao meu orientador Bernardo Baldisserotto por todos esses anos de aprendizagem, orientação e, principalmente, paciência. A Margareth Baldisserotto pelo apoio e carinho em um dos momentos mais difíceis da minha vida. Já se passaram 5 anos, mas a importância do seu gesto jamais diminuirá. Serei eternamente grata! A Gonzalo Martínez-Rodrígues e a Neda Gilannejad pelos conhecimentos adquiridos e, principalmente, pelo carinho e confiança. Obrigada a Snowy, Zoe e Trece pelas brincadeiras, carinho e ronrons. Os 5 meses que passei com vocês foram incríveis. Los echo mucho de menos! As amigas Andressa, Fernanda e Josi pela amizade. Aos colegas do LAFIPE pela amizade e conhecimentos adquiridos. Ao Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Animal, corpo docente e funcionários por possibilitar o desenvolvimento deste estudo.

6 RESUMO ÓLEOS ESSENCIAIS COMO ANESTÉSICOS EM SERRASALMÍDEOS E EXPRESSÃO GÊNICA DE GENES RELÓGIO E DAS ENZIMAS DIGESTIVAS EM JUNDIÁ AUTORA: Ana Paula Gottlieb Almeida ORIENTADOR: Bernardo Baldisserotto Data e Local da Defesa: Santa Maria, 31 de agosto de Anestésicos de origem sintética são amplamente empregados na aquicultura para minimizar o estresse decorrente das práticas envolvidas nessa atividade. No entanto, os efeitos adversos causados por essas substâncias sintéticas têm incentivado a pesquisa por alternativas naturais com propriedades sedativas e anestésicas que apresentem maior eficácia, segurança e menor risco de efeitos adversos. Estudos comprovaram que os óleos essenciais (OEs) extraídos das espécies vegetais Aloysia triphylla e Lippia alba, bem como o eugenol, um composto isolado do OE de cravo, apresentam propriedades sedativas e anestésicas em peixes, sendo considerados, portanto, alternativas promissoras aos anestésicos tradicionais. Nesse contexto, a primeira parte deste estudo objetivou investigar os efeitos desses OEs em duas espécies amazônicas, Serrasalmus rhombeus e S. eigenmanni, habitantes do Rio Negro. Já na segunda parte, avaliou-se a expressão gênica de genes relógio e de enzimas digestivas em pós-larvas e juvenis de Rhamdia quelen. O artigo 1 determinou a eficácia sedativa e anestésica dos OEs de A. triphylla e de L. alba e do eugenol em S. rhombeus e o tempo de recuperação dos animais, bem como comportamento natatório em uma exposição curta de 15 min em concentrações baixas para avaliar o possível uso dessas substâncias no transporte dessa espécie. Ambos OEs e o eugenol são eficazes, sendo recomendadas as concentrações de 150, 200 e 50 µl L -1, respectivamente, para anestesia. Para a sedação dessa espécie é recomendada a utilização de 50 µl L -1 para ambos OEs e 25 µl L -1 para o eugenol. As concentrações de 5 e 10 µl L -1 são indicadas para estudos de transporte com esses anestésicos. No manuscrito 2 foi determinada a eficácia sedativa e anestésica dos OEs de A. triphylla e de L. alba em S. eigenmanni, bem como o tempo de recuperação dos animais. Avaliou-se também o fluxo iônico líquido, parâmetros sanguíneos e o comportamento natatório em uma exposição prolongada de 4 h. Ambos OEs foram eficazes para anestesia de S. eigenmanni, sendo recomendada a concentração de 100 µl L -1 para ambos os OEs e para a sedação as concentrações indicadas são 25 e 50 µl L -1 de OEs de A. triphylla e de L. alba, respectivamente. Para o transporte sugere-se a concentração de 5 µl L -1 do OE de A. triphylla devido à diminuição da excreção de amônia e à manutenção do equilíbrio. No manuscrito 3, foi avaliado a expressão gênica de genes relógio e de enzimas digestivas em pós-larvas e juvenis de R. quelen. Em pós-larvas, alguns genes da alça positiva (artnl1a e clock) e da alça negativa (per1,2,3 e cry1,2) apresentaram diferenças nos níveis de expressão ao longo do período avaliado, sendo que a acrofase ocorreu no mesmo horário. Em juvenis, um gene da alça positiva (arntl1l) e um gene da alça negativa (cry2) apresentaram diferenças nos níveis de expressão, com diferença de 1 h entre as acrófases. Os níveis de expressão gênica das enzimas digestivas em pós-larvas foram máximos 4 h antes da alimentação e mínimos 1 h após a alimentação. No trato gastrintestinal de juvenis os níveis de expressão gênica das enzimas digestivas não diferiu no período avaliado. Em conclusão, ambos os OEs são eficazes para sedação e anestesia de S. rhombeus e de S. eigenmanni, podendo também serem utilizados em estudos de transportes para essas espécies. Tanto as pós-larvas quanto os juvenis não exibiram a interação típica entre os genes das alças positiva (arntl e clock)

7 e negativa (per e cry) e somente em pós-larvas a expressão gênica das enzimas digestivas é, provavelmente, influenciada pelos genes relógio. Palavras-chave: Aloysia thiphylla. Anestesia. Ciclo circadiano. Lippia alba. mrna. Ritmo alimentar

8 ABSTRACT ESSENTIAL OILS AS ANESTHETICS IN SERRASALMDS AND GENE EXPRESSION OF CLOCK GENES AND DIGESTIVE ENZYMES IN SILVER CATFISH AUTHOR: Ana Paula Gottlieb Almeida ADVISOR: Bernardo Baldisserotto Date and Place of Defense: Santa Maria, August 31 st, Anesthetics of synthetic origin are widely used in aquaculture to minimize animal stress arising from the practices involved in this activity. However, the adverse effects caused by these synthetic substances have encouraged research for natural substances with sedative and anesthetics properties that are more effective, safer and with lower risk of adverse effects. Studies have shown that essential oils (EOs) extracted from the plants species Aloysia triphylla and Lippia alba, as well as eugenol, an isolated compound of clove oil, present sedative and anesthetic properties in fish, being considered promising alternatives to traditional anesthetics. In this context, the first part of this study aimed to investigate the effects of these EOs on two Amazonian species, Serrasalmus rhombeus and S. eigenmanni, inhabitantsof Rio Negro. In the second part, we evaluated the gene expression of clock and digestive enzymes genes in postlarvae and juvenile of Rhamdia quelen. In the article 1, the sedative and anesthetic efficacy of A. triphylla and L. alba EOs and eugenol and the recovery time was determined in Serrasalmus rhombeus, as well as the swimming behavior on a short exposure of 15 min at low concentrations to evaluate the possible use of these substances in the transport of this species. Both EOs and eugenol are effective, with concentrations of 150, 200, and 50 µl L -1, respectively, being recommended for anestesia. For sedation, it is recommended to use 50 µl L -1 for both EOs and 25 µl L -1 for eugenol. The concentrations of 5 and 10 µl L -1 are indicated for transport studies with these anesthetics. In manuscript 2, the sedative and anesthetic efficacy of A. triphylla and L. alba EOs in Serrasalmus eigenmanni, as well as recovery time of the fish were determined. The net ion fluxes, blood parameters, and swimming behavior at a prolonged exposure of 4 h were also evaluated. Both EOs were effective for anesthesia of S. eigenmanni and the concentration of 100 µl L -1 was recommended for both EOs. For sedation, the indicated concentrations are 25 and 50 µl L -1 of A. triphylla and L. alba EOs, respectively. For transport, the concentration of 5 µl L -1 of A. triphylla EO is recommended due to the lower ammonia excretion and maintenance of fish equilibrium. In post-larvae, genes of the positive loop (artnl1a and clock) and the negative loop (per1,2,3 and cry1,2) presented differences in expression levels throughout the evaluated period, with acrophase occurring in the same schedule. In juveniles, only one positive loop gene (arntl1) and one negative loop gene (cry2) showed differences in expression levels in the evaluated period, with a difference of 1 h between the acrophases. The levels of gene expression of the digestive enzymes in post-larvae were maximal 4 h before feeding and at least 1 h after feeding. In the digestive tract of juveniles the levels of gene expression of the digestive enzymes did not differ in the evaluated period. In conclusion, both OEs are effective for sedation and anesthesia of S. rhombeus and S. eigenmanni, and may also be used in transport studies for these species. Both post-larvae and juveniles did not exhibit the typical interaction between the genes of the positive (arntl and clock) and negative (per and cry) loops and only in post-larvae the gene expression of the digestive enzymes is probably influenced by the genes clock. Keywords: Aloysia thiphylla. Anesthesia. Circadian cycle. Feeding. Lippia alba. mrna.

9 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Respostas primária, secundária e terciárias ao estresse em peixes Figura 2 Aloysia triphylla...14 Figura 3 Lippia alba Figura 4 Eugenol Figura 5 Representação básica do funcionamento do relógio molecular Figura 6 Serrasalmus rhombeus Figura 7 Serrasalmus eigenmanni Figura 8 Rhamdia quelen Artigo I Figura 1 Time required for induction and recovery of anestesia in Serrasalmus rhombeus using Aloysia triphylla (A) and Lippia alba (B) essential oils and eugenol (C) Figura 2 Swimming time of Serrasalmus rhombeus exposed to low concentrations of Aloysia triphylla (A) and Lippia alba (B) essential oils and eugenol (C) Manuscrito II Figura 1 Time required for induction and recovery of anesthesia in Serrasalmus eigenmanni. a: Aloysia triphylla essential oil. b: Lippia alba essential oil Figura 2 Swimming time of Serrasalmus eigenmanni exposed to essential oils. a: Aloysia triphylla. b: Lippia alba..43 Figura 3 Net ion fluxes of Serrasalmus eigenmanni exposed for 4 hours to essential oils. a: Aloysia triphylla. b: Lippia alba. 44 Figura 4 Ammonia excretion of Serrasalmus eigenmanni exposed for 4 hours to essential oils. a: Aloysia triphylla. b: Lippia alba. 45 Manuscrito III Figure 1 Relative expression of arntl1a (A), arntl1b (B), arntl1l (C), arntl2 (D), clock (E) and per1 (F) genes in post-larvae of Rhamdia quelen..59 Figure 2 Relative expression of per2 (A), per3 (B), cry1a (C), cry1b (D), cry2 (E) and cry3 (F) genes in post-larvae of Rhamdia quelen..60 Figure 3 Relative expression of arntl1a (A), arntl1b (B), arntl1l (C), arntl2 (D), clock (E) and per1 (F) genes in gastrointestinal tract of Rhamdia quelen juveniles Figure 4 Relative expression of per2 (A), per3 (B), cry1a (C), cry1b (D), cry2 (E) and cry3 (F) genes in gastrointestinal tract of Rhamdia quelen juveniles. 62 Figure 5 Relative expression of amy2a (A), cel (B), pla2g1b (C), ctr2 (D), try2 (E) and pga2 (F) genes in post-larvae of Rhamdia quelen...63 Figure 6 Relative expression of amy2a (A), cel (B), pla2g1b (C), ctr2 (D), try2 (E) and pga2 (F) genes in Rhamdia quelen juveniles...64

10 LISTA DE TABELAS Artigo I Tabela 1 Chemical composition of essential oils Manuscrito II Tabela 1 Plasma levels of cortisol (µg dl -1 ), total T4 (µg dl -1 ), glucose (mg dl -1 ), lactate (mg dl -1 ), protein (mg ml -1 ) and lipids (mg ml -1 ) in Serrasalmus eigenmanni exposed to different concentrations of essential oils of Aloysia triphylla and Lippia alba.45 Manuscrito III Tabela 1 Primers designed for molecular identification of partial cdnas for cel, ctr2 and pga2, as well as primers used for 3 and 5 Rapid Amplification cdna Ends (RACE), in addition to pla2 and try Tabela 2 Specific primers used for real-time PCR...66 Tabela 2 Specific primers used for real-time PCR. Continued....67

11 LISTA DE ABREVIATURAS actb Gene codificante para -actina amy2a Gene codificante para α-amilase pancreática ACTH Hormônio adrenocorticotrófico arntl Gene codificante para aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like bmal Gene codificante para brain and muscle ARNT-like protein cdna DNA complementar cel Gene codificante para carboxil éster lipase ou lipase ativada por sais biliares clock Gene codificante para circadian locomotor output cycles kaput CRH Hormônio liberador de corticotrofina cry Gene codificante para cryptochrome ctr2 Gene codificante para quimotripsinogênio 2 DNA Ácido desoxirribonucleico ef1a Gene codificante para elongation factor 1ª FAA Food antecipatory activity FEO Food entrainable oscillator GIT Gastrointestinal tract HHI Eixo hipotalâmico-hipófise-interrenal LD Fotoperíodo claro/escuro LEO Light entrainable oscillator LL Fotoperíodo claro constante mrna RNA mensageiro NCBI National Center for Biotechnology Information NSQ Núcleo supraquiasmático OE Óleo essencial PCR Reação em cadeia da polimerase per Gene codificante para period pga2 Gene codificante para pepsinogênio 2a pla2g1b Gene codificante para fosfolipase 2a qpcr PCR quantitativo (PCR a tempo real) RACE Rapid amplification of cdna ends RNA Ácido ribonucleico try2 Gene codificante para tripsinogênio 2

12 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ESTRESSE E ANESTESIA EM PEIXES RITMOS BIOLÓGICOS EM PEIXES Ritmo alimentar em peixes MODELOS EXPERIMENTAIS UTILIZADOS NO ESTUDO Serrasalmus rhombeus (Linnaeus, 1766) Serrasalmus eigenmanni Norman, Rhamdia quelen (Quoy E Gaimard, 1824) OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS DESENVOLVIMENTO ARTIGO MANUSCRITO MANUSCRITO DISCUSSÃO GERAL CONCLUSÕES GERAIS REFERÊNCIAS... 72

13 9 1 INTRODUÇÃO 1.1 ESTRESSE E ANESTESIA EM PEIXES Os peixes enfrentam na natureza desafios como fuga de predador, disputa por alimento, disputa e/ou defesa de território, variações de ph, temperatura, turbidez, presença de substâncias tóxicas, patógenos, entre outros. Essas ameaças fazem com que o peixe entre em um estado diferente da homeostase, o qual podemos denominar estresse (BARTON e IWAMA, 1991; PORTZ, WOODLEY e CECH JR, 2006; BAKER, GOBUSH e VYNNE, 2013). Nesse estado, uma sequência de eventos fisiológicos é desencadeada com a finalidade de auxiliar o animal a reagir e, se possível, se recuperar. A resposta ao estresse passa por três fases distintas denominadas Síndrome Geral da Adaptação, que consiste em uma fase inicial de alerta com uma rápida resposta fisiológica, seguida de uma segunda fase de resistência, que é quando o peixe tenta se adaptar a fim de recuperar a homeostase. Caso a adaptação não seja possível devido à duração/intensidade do estresse, o peixe entra em exaustão, a denominada terceira fase na qual a saúde e até mesmo a vida do animal é comprometida (BARTON e IWAMA, 1991; GERWICK et al., 1999; TORT, 2011). A resposta imediata ao estresse consiste na ativação simpática do eixo hipotalâmicohipófise-interrenal (HHI), que desencadeará alterações fisiológicas classificadas em resposta primária, secundária e terciária (Figura 1). A resposta primária, também denominada neuroendócrina, consiste na estimulação nervosa do tecido cromafim, que libera imediatamente catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) na corrente sanguínea. De forma complementar, através da estimulação do HHI, o hipotálamo secreta o hormônio liberador de corticotropina (CRH) que age na hipófise promovendo a liberação do ACTH, que atua no tecido interrenal modulando a síntese e liberação de cortisol no sangue (REID et al., 1998; ELLIS et al., 2011; COWAN, AZPELETA e LÓPEZ-OLMEDA, 2017). O estresse também pode elevar os níveis dos hormônios tiroxina, prolactina e somatolactina e suprimir os hormônios reprodutivos (BARTON, 2002). Na resposta secundária ocorrem alterações metabólicas afim de aumentar a produção de energia. O aumento da liberação de cortisol e catecolaminas na corrente sanguínea desencadeará alterações nas reservas de glicogênio hepático e muscular, na glicemia e no ácido lático, bem como alterações dos batimentos cardíacos e no balanço hidromineral. A adrenalina liberada na corrente sanguínea altera o fluxo sanguíneo nas brânquias, bem como a sua permeabilidade, resultando em uma disfunção hidromineral (SCHRECK e TORT, 2016). A exposição ao estresse crônico e a exaustão fisiológica, desencadearão a resposta terciária, a qual

14 10 interfere negativamente no desenvolvimento do animal através de mudanças na taxa de crescimento, reprodução, sobrevivência e imunidade (MAZEAUD et al., 1977; ELLIS et al., 2011; WEBER, 2011a). Na aquicultura, os animais são submetidos a práticas estressantes diariamente, como manuseio, captura, biometria, análises patológicas, implantes hormonais, bem como o transporte, que pode expor os animais a altas densidades de estocagem, variações em parâmetros da água como temperatura, ph e oxigênio dissolvido, bem como exposição a barulho excessivo (BARTON, 2000; URBINATI et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2009; BOLASINA, 2011; CUNHA et al., 2011; GOMES et al., 2011; BECKER et al., 2012). Com a finalidade de minimizar os efeitos do estresse e evitar que tais práticas interfiram na homeostase do animal afetando negativamente sua sobrevivência, substâncias com efeitos sedativos e anestésicos têm sido empregadas (COOKE et al., 2004; INOUE et al., 2005; BECKER et al., 2012). A anestesia é um procedimento que age através da depressão generalizada do sistema nervoso central. É um processo reversível que pode ser causado por um fármaco e resulta na perda de percepção de parte ou de todo corpo (SUMMERFELT e SMITH, 2000). O procedimento anestésico pode ser dividido em fases principais: indução, manutenção e recuperação. Na indução o peixe é exposto ao agente anestésico, o que pode levar a uma agitação inicial passageira. Essa fase deve ser rápida e sem grande agitação do peixe. A fase de manutenção começa quando determinado estágio de anestesia é alcançado e existe a necessidade de manter o peixe nesse estado por um tempo. No entanto, considerando a concentração (ou dose, se for injetado) e o tempo de exposição, o anestésico pode se acumular no cérebro e no músculo, o que pode levar a uma exposição excessiva, prejudicando a saúde do animal. Na fase de recuperação, o anestésico é retirado e o peixe retorna ao estado normal, retomando a natação regular e a reação a estímulos externos. Dependendo do anestésico administrado, a recuperação total pode demorar minutos ou horas (COYLE, DURBOROW e TIDWELL, 2004). Os anestésicos consistem em agentes químicos que inicialmente provocam um efeito calmante seguido de perda do equilíbrio, de mobilidade, de consciência e da ação reflexa. Os anestésicos podem agir de três modos: estabilizando os impulsos nervosos em axônios aferentes e/ou eferentes, bloqueando competitivamente os sítios receptores na membrana pós-sináptica e bloqueando a liberação de neurotransmissores na membrana pré-sináptica. O método de administração de anestésicos mais utilizado em peixes é o de banhos de imersão. A solução

15 11 anestésica presente na água é absorvida pelas brânquias difundindo-se através da corrente sanguínea até o sistema nervoso central (ROSS e ROSS, 2008). Figura 1 Respostas primária, secundária e terciárias ao estresse em peixes. Fonte: Adaptado de Schreck e Tort (2016). CRH hormônio liberador de corticotropina, ACTH hormônio adrenocorticotrópico. A maioria dos agentes anestésicos pode produzir vários estágios de anestesia. Small (2003) descreve quatro estágios para anestesia: Estágio I Sedação, com a diminuição na reatividade a estímulos externos; Estágio II Ocorre perda parcial do equilíbrio e o peixe apresenta natação errática; Estágio III Ocorre perda total do equilíbrio e a locomoção cessa;

16 12 Estágio IV Colapso medular e morte. A recuperação do peixe é definida pela retomada da natação regular e da reação a estímulos externos. O anestésico ideal é descrito como uma substância que seja eficaz em baixas concentrações, induzindo rapidamente a sedação e a anestesia no animal com mínima hiperatividade do mesmo. Além disso, deve ser de fácil manuseio, baixo custo, disponibilidade alta e ser seguro tanto para os animais a serem expostos quanto para quem o manipula, bem como para o meio ambiente (ROSS e ROSS, 2008). Os anestésicos de origem sintética mais empregados na anestesia de peixes são o metanosulfonato de tricaína (MS222), o metomidato, a benzocaína, a quinaldina, e o 2-fenoxietanol (ROSS e ROSS, 2008; MARICCHIOLO e GENOVESE, 2011). Ainda não há na legislação brasileira a regulamentação do uso de anestésicos na aquicultura, logo procura-se adotar as regras definidas pela Food and Drug Administration (FDA) para a utilização de substâncias anestésicas em peixes. A FDA recomenda a utilização do MS-222 em anestesia de peixes, todavia esse produto necessita ser importado, onerando a sua utilização (FAÇANHA e GOMES, 2005). Ademais, a exposição do peixe a esses compostos sintéticos pode causar efeitos adversos como perda de muco, acidose, alterações nos níveis plasmáticos de lactato, ureia, hormônios, colesterol, glicose e eletrólitos, imunossupressão, hipóxia tecidual e aumento do hematócrito (CARTER, WOODLEY e BROWN, 2011; GOMES et al., 2011; ZAHL et al., 2011; SNEDDON, 2012). Diante disso, alternativas naturais, tais como os óleos essenciais provenientes de plantas, têm sido exploradas com a finalidade de substituir substâncias sintéticas. Os óleos essenciais (OEs) são extratos vegetais compostos de metabólitos secundários voláteis (CARSON et al., 2006) que à temperatura ambiente são líquidos de coloração que varia do incolor ao amarelo, solúveis em solventes orgânicos e instáveis na presença de calor, umidade, luz e metais (RAUT e KARUPPAYIL, 2014). São sintetizados por plantas aromáticas, logo são caracterizados por intenso odor. Apresentam a importante função de proteger as plantas, atuando como agentes antibacterianos, antifúngicos, inseticidas e contra herbívoros, desencorajando a sua ingestão. No entanto, podem agir como atrativos para alguns insetos, auxiliando a polinização e a dispersão de sementes (BAKKALI et al., 2008). Esses extrativos vegetais apresentam vasta aplicação na produção de perfumes, cosméticos, produtos farmacêuticos, alimentícios e de higiene, por apresentarem caráter terapêutico, como flavorizantes e aromatizantes (SPEZIALI, 2012). Estudos demonstraram uma ampla gama de atividades biológicas dos OEs: antimicrobiana, virucida, antiparasitária, antioxidante, cardiovascular, antidiabética, sedativa e anestésica (BAKKALI et al., 2008).

17 13 Estudos revelam resultados promissores do uso de OEs e seus constituintes como anestésicos em peixes. Os OEs de cravo (Eugenia aromatica) (ROUBACH et al., 2005; CUNHA et al., 2010; INOUE et al., 2011; MOREIRA et al, 2010; WEBER et al., 2011b), Ocimum gratissimum (BENOVIT et al., 2012), Hesperozygis ringens (TONI et al., 2013; 2015a), Ocotea acutifolia (SILVA et al., 2013), Melaleuca alternifolia (HAJEK, 2011), Nectandra megapotamica (TONDOLO et al., 2013), Mentha piperita (MAZANDARANI e HOSEINI, 2018), Aloysia polystachya (FOGLIARINI et al., 2017), Nectandra grandiflora (BARBAS et al., 2017), Myrcia sylvatica e Curcuma longa (SACCOL et al., 2017) demonstraram eficácia anestésica em diversas espécies de peixes. Compostos isolados de plantas como mentol (MAZANDARANI e HOSEINI, 2017), linalol (HELDWEIN et al., 2014), mirceno (MIRGHAED et al., 2018), timol e carvacrol (BIANCHINI et al., 2017) também demonstraram eficácia nas espécies testadas. Na família Verbenaceae, podemos destacar as espécies Aloysia triphylla (L Hér.) Britton e Lippia alba (Mill.) N. E. Brown. A espécie A. triphylla é popularmente conhecida como cidró, cidrão e limonete. É nativa da América do Sul e cultivada no sul do Brasil, apresentando porte arbustivo, ramificado e ereto, podendo alcançar até 3 m de altura. Possui propriedades adstringente e aromática, rica em óleo volátil que age como sedativo brando (LORENZI e MATOS, 2008). Suas folhas apresentam grande importância medicinal, uma vez que o chá das folhas apresenta propriedades antipirética, analgésica e anti-inflamatória, bem como propriedades sedativas, antioxidantes e digestivas (EL-HAWARY et al., 2012). Também é utilizada na culinária, empregada como aromatizante de ambientes, bactericida e inseticida (LORENZI e MATOS, 2008). Estudos com OE de A. triphylla demonstraram sua eficácia anestésica em Rhamdia quelen (CUNHA et al., 2010; GRESSLER et al., 2014; PARODI et al., 2014; ZEPPENFELD et al., 2014; BECKER et al., 2015), Oreochromis niloticus (TEIXEIRA et al., 2017) e Litopennaeus vannamei (PARODI et al., 2012). A espécie L. alba é popularmente conhecida como erva cidreira de arbusto, sendo, também, nativa da América do Sul (BIASI e COSTA, 2003). Apresenta porte arbustivo muito ramificado, as brotações tendem a arquear conforme o crescimento, encostando-se ao solo e enraizando formando moita de até 2 m de altura (SILVA JUNIOR, 1998). Possui propriedades analgésica, anti-inflamatória, antipirética, antidiarreica, antiespasmódica e sedativa. Utilizada também no tratamento de doenças do trato respiratório e como tempero na culinária (PASCUAL et al., 2001). O OE de L. alba já teve sua eficácia anestésica comprovada em Hippocampus reidi (CUNHA et al., 2011), R. quelen (CUNHA et al, 2010; HELDWEIN et al., 2014; TONI et al., 2013), L. vannamei (PARODI et al, 2012), Sparus aurata (TONI et al., 2015b) e Argyrosomus regius (CÁRDENAS et al., 2016).

18 14 Na família Myrtaceae, podemos destacar a espécie Eugenia aromatica, popularmente conhecida como cravo da índia. O eugenol é o principal componente do óleo essencial de cravo e é tradicionalmente utilizado na odontologia devido a suas propriedades analgésica e antisséptica (CHAIEB et al., 2007). Estudo demonstrou a eficácia da utilização desse composto isolado para anestesia em peixes (CUNHA et al., 2010). Figura 2 Aloysia triphylla. Figura 3 Lippia alba. Figura 4 Eugenol Fonte: Fonte: Hennebelle et al., Fonte: RITMOS BIOLÓGICOS EM PEIXES Os ritmos biológicos são definidos como todo evento que repete regularmente em um organismo. Os ritmos mais explorados são os relacionados às variações ambientais cíclicas, as quais permitem ao organismo se adaptar. No caso de variações ambientais acíclicas, a imprevisibilidade interfere na expressão rítmica dos ritmos biológicos (MORGAN, 2004). Considerando que, praticamente, todos os ambientes naturais apresentam peculiaridades cíclicas, os organismos também precisam oscilar para se adaptar e sincronizar suas atividades biológicas aos ciclos ambientais. Evolutivamente, os organismos desenvolveram estratégicas comportamentais e fisiológicas que os permitem antecipar variações previsíveis no ambiente e, consequentemente, adaptar suas atividades às variações ambientais, otimizando seus processos biológicos (MARQUES e MENNA-BARRETO, 2003; VERA et al., 2009). Uma propriedade básica dos ritmos biológicos endógenos é que eles devem se manter em condições ambientais constantes, isto é, surgem no próprio organismo e não por influência externa (CYMBOROWSKI, 2010). O ritmo circadiano apresenta período de aproximadamente 24 horas, podendo ser ajustado através da mudança gradativa de fase de oscilação até se

19 15 equiparar ao ciclo ambiental e estabilizar (arrastar). O arrastamento é produzido por sinais externos, conhecidos como zeitgebers ou sincronizadores, como os estímulos ambientais (ZHDANOVA e REEBS, 2006). O sincronizador mais poderoso parece ser a luz, pois os organismos tendem a sincronizarem seus ciclos atividade/repouso com a alternância diária do ciclo claro/escuro ambiental (VERA et al., 2007). Contudo, existem outros parâmetros ambientais críticos que apresentam uma variação diária ou anual, por exemplo o risco de predação, temperatura ambiental, hierarquia social e disponibilidade de alimento que podem atuar como sincronizadores e, dependendo da espécie, exercer um papel mais importante que a luz (ZHDANOVA e REEBS, 2006). Basicamente, o sistema circadiano inclui receptores que captam a informação do ambiente e transmitem a um oscilador central localizado no cérebro que sincroniza e transmite a mensagem até os osciladores periféricos, localizados em outros órgãos. Todavia, dependendo do organismo em questão, a informação ambiental pode agir diretamente em determinado oscilador periférico sem precisar passar pelo oscilador central (CYMBOROWSKI, 2010). Nos mamíferos, o oscilador central que define a maioria dos ritmos circadianos é o núcleo supraquiasmático (NSQ). A informação fótica é percebida por células fotossensíveis presentes na retina e é transmitida através do trato retino-hipotalâmico até o NSQ, que está localizado no sistema nervoso central, ativando a transcrição de genes relógios e sincronizando a atividade neuronal. Os sinais enviados pelo NSQ controlam, por exemplo, a síntese noturna da melatonina pela glândula pineal (MAYWOOD et al, 2007; DIBNER, SCHIBLER e ALBRECHT, 2010). Em peixes, devido à ausência de uma estrutura homóloga ao NSQ de mamíferos, a glândula pineal apresenta grande importância na ritmicidade circadiana. Essa glândula é fotossensível e possui relógio intrínseco responsável pela produção e liberação da melatonina (FÁLCON et al., 2010) e pela expressão de genes relógio (NOCHE et al., 2010). A nível molecular, o funcionamento do relógio biológico está baseado na interação entre alças de retroalimentação transcricional-translacional positivas e negativas de genes relógio e o mesmo é semelhante em todos os seres vivos que apresentam um relógio circadiano (Figura 5). Os genes relógio são encontrados em várias regiões do sistema nervoso central e em vários tecidos periféricos (CYMBOROWSKI, 2010). A alça positiva é composta pelos genes circadian locomotor output cycles kaput (clock) e brain and muscle ARNT-like protein (bmal ou arntl), que são transcritos no núcleo e traduzidos em proteínas no citoplasma e interagem através do domínio PAS (Period-ARNT- SINGLE-Minded), presentes nessas proteínas, formando um heterodímero que retorna ao núcleo. No núcleo, o domínio bhlh (basic Helix-Loop-Helix) permite que o heterodímero

20 16 clock/bmal se ligue aos elementos E-box dos genes da alça negativa, induzindo sua transcrição. A alça negativa é formada pelos genes period (per1, per2 e per3) e cryptochrome (cry1 e cry2), que são transcritos no núcleo e traduzidos em proteínas no citoplasma que interagem formando um heterodímero per/cry que retorna ao núcleo e, quando presente em níveis elevados, interagem fisicamente, inibindo a transcrição mediada pelo complexo clock/bmal. Simultaneamente, o complexo clock/bmal inicia uma alça auxiliar de retroalimentação para ativar a transcrição dos genes rorα (ROR-related orphan receptor α) e rev-erbα que são traduzidos no citoplasma e suas proteínas (RORα e REV-ERBα, respectivamente) competem pela ligação em RORE (Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Reponse Element) localizado na região promotora do gene bmal. As proteínas desses genes executam ações opostas em bmal: enquanto RORα ativa a transcrição, REV-ERBα a inibe. Assim, níveis elevados de bmal inibem sua transcrição através da elevação dos níveis dos genes rev-erbα, per e cry, enquanto que a ausência das proteínas desses genes ativa a transcrição de bmal, o qual irá formar novamente o complexo clock/bmal reiniciando o ciclo (ROSBASH, 1995; PEREIRA, TUFIK e PEDRAZZOLI, 2008; CECCON e FLÔRES, 2010; VATINE et al., 2011). Figura 5 Representação básica do funcionamento do relógio molecular. Fonte: Autor

21 Ritmo alimentar em peixes Os ciclos claro/escuro e alimentar são considerados os zeitgebers mais fortes dos ritmos biológicos em animais. Na natureza não há uma oferta continua de alimento, mas restrita quanto ao local e ao horário (LÓPEZ-OLMEDA e SÁNCHEZ-VÁZQUEZ, 2010). A maioria dos animais, quando expostos à disponibilidade periódica de alimento, apresenta um aumento da atividade locomotora momentos antes do fornecimento do alimento, comportamento conhecido como atividade alimentar antecipatória (ou food anticipatory activity FAA). A aquisição de alimentos, frequentemente, está vinculada ao ciclo claro/escuro devido à dependência da visão para a captura das presas (MADRID et al., 2010). Em estudos com mamíferos pressupõe-se a existência de dois osciladores: um arrastado pela luz (light entrainable oscillator LEO), localizado no NSQ do hipotálamo; e outro arrastado pelo alimento (food entrainable oscillator FEO), cuja localização anatômica é incerta. Em mamíferos foi demonstrada a existência de um FEO independente do LEO, pois lesões no SNC não abolem a FAA (CYMBOROWSKI, 2010). Em peixes, não podemos descartar a influência do LEO sob o FEO e o grau de influência entre eles pode variar entre as espécies, conforme os padrões de atividade e hábitos alimentares. A luz será o sincronizador mais forte para uma espécie diurna que utiliza a visão para a captura de presas. Contudo, a disponibilidade de alimento exercerá influência maior em uma espécie noturna que utiliza, por exemplo, barbilhões para detectar o alimento (BOLLIET, ARANDA e BOUJARD, 2001). A influência do ciclo claro/escuro (LD) e do horário de alimentação na expressão dos genes relógio no cérebro (oscilador central) e em órgãos periféricos de peixes já foi estudada em várias espécies. Estudo com dois grupos de robalos (Dicentrarchus labrax) submetidos a um fotoperíodo LD 12:12 h (light:dark), um alimentado na fase diurna e outro na fase noturna, demonstrou que tanto a luz quanto o alimento influenciaram a expressão gênica de per1 no fígado (DEL POZO et al., 2012). Semelhante ao robalo, o ritmo de expressão de per1 no fígado de zebrafish (Danio rerio) alimentados em diferentes horários foi alterado pelo horário de alimentação (SÁNCHEZ-VÁZQUEZ, ZAMORA e MADRID, 1995; SÁNCHEZ e SÁNCHEZ-VÁZQUEZ, 2009). Por outro lado, a expressão de genes relógio em dourada (Sparus aurata) é influenciada somente pelo alimento e o horário de alimentação pode mudar a fase do ritmo diário da expressão desses genes (VERA et al., 2013). Em robalo, o FEO e o LEO parecem estar acoplados, no entanto em dourada parece ocorrer um desacoplamento. No caso do peixinho dourado (Carassius auratus) foi demonstrado que os ritmos da expressão dos genes relógio per3 e cry3 no fígado dessa espécie, quando exposta a fotoperíodo LL, estão em

22 18 fase com a expressão desses genes no fígado e intestino dessa espécie quando exposta a um fotoperíodo 12:12 LD e alimentados diariamente no mesmo horário. Sugerindo que, nessa espécie, o horário de alimentação é um forte sincronizador desses genes mesmo quando submetidos a um ciclo LD (VELARDE et al., 2009; FELICIANO et al., 2011). Quanto à expressão gênica no cérebro, nos estudos acima citados somente o ciclo LD afetou a expressão dos genes relógio no oscilador central (cérebro) enquanto que os osciladores periféricos (fígado e intestino) podem ser afetados tanto pela luz e pelo alimento como somente pelo alimento. As enzimas digestivas também podem apresentar uma ritmicidade na sua atividade demostrando que o ritmo circadiano pode exercer um importante controle funcional no sistema digestório (SCHEVING et al., 2000). Mata-Sotres et al. (2016) demonstrou que tanto a atividade quanto a expressão gênica das enzimas digestivas apresentam variações diárias dependentes do ciclo LD em larvas de S. aurata durante a ontogenia. Também demostrou uma tendência ao aumento na expressão gênica das enzimas pancreáticas no período escuro, o qual pode estar associado a uma preparação para a próxima ingestão de alimentos, uma vez que essas larvas foram alimentadas diariamente no período claro. A enzima amilase demonstrou um ritmo diário em Semaprochilodus taeniurus, com maiores níveis de atividade quando o estômago dos animais estava vazio como uma preparação para a próxima ingestão de alimento (LÓPEZ- VÁSQUEZ, CASTRO-PÉREZ e VAL, 2000). A atividade dessa mesma enzima apresentou sincronização com o regime alimentar em C. auratus alimentados diariamente no mesmo horário (VERA et al., 2007). 1.3 MODELOS EXPERIMENTAIS UTILIZADOS NO ESTUDO Serrasalmus rhombeus (Linnaeus, 1766) Espécie amazônica pertencente à ordem Characiformes e família Serrasalmidae. (JEGU E INGENITO, 2007). É uma espécie onívora, com preferência por peixes pequenos, invertebrados e plantas (SANTOS et al., 2006). Figura 6 Serrasalmus rhombeus

23 19 Fonte: I. Mikolji, retirada do FishBase Serrasalmus eigenmanni Norman, 1929 Espécie amazônica pertencente à ordem Characiformes e família Serrasalmidae, com hábito alimentar carnívoro (POUILLY et al., 2003). Figura 7 Serrasalmus eigenmanni Fonte: Arquivo pessoal Rhamdia quelen (Quoy E Gaimard, 1824) Espécie pertencente à ordem Siluriformes e família Heptapteridae. Distribui-se em praticamente todas as bacias hidrográficas brasileiras (BOCKMANN, 2007). Espécie bentônica, noturna e com hábito alimentar onívoro (GOMES et al., 2000). Figura 6 Rhamdia quelen Fonte: Alexssandro Geferson Becker.

24 20 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Avaliar os efeitos dos óleos essenciais de Aloysia triphylla e Lippia alba em Serrasalmus rhombeus (Linnaeus, 1766) e Serrasalmus eigenmani Norman, 1929 e a expressão gênica de enzimas digestivas e de genes relógios em Rhamdia quelen (Quoy E Gaimard, 1824). 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Determinar a concentração ideal em cada óleo essencial e de eugenol para anestesia de S. rhombeus e S. eigenmanni. - Investigar o tempo de indução e recuperação anestésica em S. rhombeus e S. eigenmanni. - Analisar o comportamento natatório de S. rhombeus durante curta exposição aos anestésicos. - Analisar o comportamento natatório e fluxo iônico corporal durante a exposição prolongada aos óleos essenciais em S. eigenmanni. - Avaliar a expressão gênica das enzimas digestivas e de genes relógios em R. quelen em período de 24 h.

25 21 3 DESENVOLVIMENTO 3.1 ARTIGO 1 Essential oils and eugenol as anesthetics for Serrasalmus rhombeus Artigo publicado no periódico Boletim do Instituto da Pesca, Online version: March 2018, DOI: /

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33 MANUSCRITO 2 Manuscrito a ser resubmetido a Neotropical Ichthyology Essentials oils of Aloysia triphylla and Lippia alba as stress-reducing and anesthetics for Serrasalmus eigenmanni Ana Paula Gottlieb Almeida¹, Tiago Gabriel Correia²,4, Berta Maria Heinzmann³, Adalberto Luis Val 4 and Bernardo Baldisserotto 5 1 Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Animal, Universidade Federal de Santa Maria, , Santa Maria, RS, Brazil. anapaulagottlieb@hotmail.com ²Universidade Federal do Amapá, , Macapá, AP, Brazil. correia.tg@gmail.com 3 Departamento de Farmácia Industrial, Universidade Federal de Santa Maria, , Santa Maria, RS, Brazil. berta.heinzmann@gmail.com 4 Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Av. André Araújo, 2936, , Manaus, AM, Brazil. dalval@inpa.gov.br 5 Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brazil. (corresponding author) bbaldisserotto@hotmail.com Abstract This study evaluated if the acidic ph and high temperature of the Amazonian blackwaters can alter the anesthetic and stress-reducing effects of the essential oils (EOs) of Aloysia triphylla and Lippia alba. The fish were placed in aquaria containing EOs of A. triphylla or L. alba (25 to 200 µl L -1 ). Then, fish were transferred to aquaria containing EO-free water to evaluate the recovery time. In another experiment, fish were transferred to aquaria containing EOs of A. triphylla or L. alba (3 to 10 µl L -1 ) and swimming behavior was analyzed up to 240 min of exposure. Water samples were collected at 0 and 240 min and blood samples at 240 min. The tested concentrations induced all stages of anesthesia, except 25 µl L -1 A. triphylla EO and 50 µl L -1 L. alba EO, which only induced sedation. The prolonged exposure to both EOs reduced swimming time compared to control in all evaluated times. The fish exposed to 3 µl L -1 A. triphylla EO showed lower net K + efflux compared to ethanol-exposed fish and in those

34 30 exposed to 5 µl L -1 ammonia excretion reduced. The blood parameters did not show significant difference among treatments. Keywords: Amazonian blackwaters, Anesthesia, Ion fluxes, Piranha, Stress Resumo Este estudo avaliou se o ph ácido e a alta temperatura das águas negras amazônicas poderiam alterar os efeitos anestésico e redutor de estresse dos óleos essenciais (OEs) de Aloysia triphylla e Lippia alba. Os peixes foram colocados em aquários contendo OEs de A. triphylla ou L. alba (25 a 200 µl L -1 ) para determinar o efeito anestésico. Após, peixes foram transferidos para aquários com água sem anestésicos para avaliar o tempo de recuperação. Em outro experimento, peixes foram transferidos para aquários contendo OEs de A. triphylla e L. alba (3 a 10 µl L -1 ). Comportamento natatório foi analisado até 240 min de exposição. Foram coletadas amostras de água em 0 e 240 min e de sangue em 240 min. As concentrações testadas induziram todos os estágios de anestesia, exceto 25 µl L -1 OE de A. triphylla e 50 µl L -1 OE de L. alba, que causaram somente sedação. Exposição prolongada a ambos OEs reduziu o tempo de natação comparado ao controle. Peixes expostos a 3 µl L -1 OE de A. triphylla apresentaram menor efluxo de K + comparado a expostos ao etanol e nos expostos a 5 µl L -1 a excreção de amônia reduziu. Parâmetros sanguíneos não diferiram entre tratamentos. CONCLUSÂO Palavras-chave: Águas pretas da Amazônia, Anestesia, Estresse, Fluxo iônico, Piranha Running head: Anesthetics for fish in Amazonian blackwaters

35 31 Introduction Stress is a condition in which fish loses physiological homeostasis and can be lethal if not reversed. Exposure to stressors is unavoidable in aquaculture because fish are routinely submitted to practices such as handling, transportation, high stocking density, among others (Sampaio & Freire, 2016). Synthetic anesthetic substances have been used in order to prevent stress in fish (Pramod et al., 2010; Small, 2003; Weber et al., 2009). However, several of these substances can cause loss of mucus, increase of serum cortisol levels, immunosuppression, acidosis, tissue hypoxia (Zahl et al., 2012; Sneddon, 2012), and be aversive (Readman et al., 2013). Tricaine methanesulfonate (MS-222), the only anesthetic approved by the FDA for use in fish for consumption, induced hepatic lipoperoxidation in silver catfish Rhamdia quelen (Gressler et al., 2012). Due to adverse effects, there has been an increase in research involving natural products such as essential oils (EO) extracted from plants to replace the anesthetics of synthetic source. In addition, these products are allowed in organic aquaculture by Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) (Bansemir et al., 2006) and also by Brazilian legislation (Brasil, 2011). Studies have shown the efficacy in anesthesia and in prevention of stress damage of essential oils extracted from plants, such as: Ocimum gratissimum (Boijink et al., 2016; Silva et al., 2012), Hesperozygis ringens (Silva et al., 2013), Nectandra megapotamica (Tondolo et al., 2013), Hyptis mutabilis and Ocotea acutifolia (Silva et al., 2013). The EOs of L. alba and A. triphylla showed anesthetic efficacy and stress-reducing effect in Centropomus parallelus (Parodi et al., 2016), R. quelen (Cunha et al., 2010; Parodi et al., 2014; Becker et al., 2016), Hyppocampus reidi (Cunha et al., 2011) and did not induce aversiveness in fish (Bandeira Junior et al., 2018). Almeida et al. (2018) demonstrated the anesthetic and sedative efficacy of A. triphylla and L. alba EOs in Serrasalmus rhombeus, an Amazonian fish living in the blackwaters of the Negro river, but did not evaluate if these EOs prevent stress damage such as ionoregulatory and blood disturbances when applied in blackwaters. The Amazonian blackwaters have high concentration of humic and fulvic acids from the dissolved organic matter decomposition, resulting in acidic ph close to 5,0-6,0 (Küchler et al., 2000; Mortatti & Probst, 2003; Matsuo & Val, 2007) and with average annual temperature of 30,6 C (Fonseca et al., 1982). Knowing that the ph and temperature of the water can affect the anesthetic induction and recovery times (Gomes et al., 2011), the aim of this study was to evaluated if A. triphylla and L. alba EOs can be used as anesthetics and transport stress-reducing agents in fish that live in the Amazonian blackwaters.

36 32 Material and Methods Essential oil extraction and analysis. The plants A. triphylla and L. alba were cultivated at the campus of the Universidade Federal de Santa Maria in the city of Frederico Westphalen, southern Brazil. A voucher specimen (SMDB No ) was deposited in the herbarium of the Biology Department. The EO extraction and analysis was made as described previously by Almeida et al. (in press). The main compounds of the EO of A. triphylla were geranial (24.3%), limonene (21.7%) and cis-carveol (Z-carveol) (18.5%) and of the EO of L. alba were linalool (66.3%) and eucalyptol (10.6%) (Almeida et al., in press). Animals. Specimens of Serrasalmus eigenmanni ( ± 6.38 g; ± 0.39 cm) (voucher number: INPA-ICT 53105) were collected during an expedition to Anavilhanas Islands of the Rio Negro, 110 km upstream from Manaus ( S, W). Fish were maintained in tanks supplied with flow trough water, pumped directly from Rio Negro (30 C, ph 5.1) continuously aerated for a few hours before testing. Experiment I: Anesthesia induction and recovery in Serrasalmus eigenmanni exposed to A. triphylla and L. alba EOs. The fish were transferred individually to aquaria containing 5 L (30 ± 0.81 C, ph 5.1 ± 0.09) of water with the L. alba or A. triphylla EOs in the μl L -1 concentration range first diluted in ethanol at a proportion of 1:10. These concentrations were chosen based on a previous study with these EOs in S. rhombeus (Almeida et al., 2018). The time for anesthesia induction was evaluated according to Small (2003): the stage I corresponds to sedation, when the reactivity to external stimuli decreased; in stage II occurs partial loss of equilibrium and erratic swimming and in stage III occurs total loss of equilibrium and cessation of locomotion. In recovery, the fish returns to regular swimming and reaction to external stimuli. Eight fish were used for each concentration tested and each fish was tested only once. The maximum observation time was 15 min. Control experiments was performed using aquaria containing only water and aquaria containing water and ethanol at a concentration equivalent to the highest dilution (1800 µl L -1 ). After induction of anesthesia, fish were transferred to a tank containing water only to evaluate the recovery time. The animals were considered recovered when showed regular swimming and reaction to external stimuli (the peduncle caudal fin was pressed with a glass rod).

37 33 Experiment II: Prolonged exposure of Serrasalmus eigenmanni to the A. triphylla and L. alba EOs. The fish were placed into tanks containing 15 L of water and A. triphylla (3 and 5 μl L -1 ) or L. alba (5 and 10 μl L -1 ) EOs, first diluted in ethanol at a proportion of 1:10, and kept for 4 hours. Control experiments was performed using aquaria containing only water and aquaria containing water and ethanol at a concentration equivalent to the highest dilution (90 µl L -1 ) These concentrations were chosen based on Almeida et al. (2018). Three fish per aquaria were used for each concentration (three replicates for each concentration). Analyses of behavior The fish were filmed for 30 s for analysis of the total swimming time and equilibrium (partial or total loss of equilibrium or normal) at 0, 5, 30, 60, 120, 180 and 240 min of exposure. Water sampling and analyses Water samples were collected at 0, 5, 30, 60, 120, 180 and 240 min of exposure. The total ammonia levels were checked according to Eaton et al. (2005). The levels of Na + and K + were determined with a flame photometer (Analyzer) and the chloride levels were determined using the colorimetric method described by Zall et al. (1956). The net ion fluxes and ammonia excretion were calculated according to Gonzalez et al. (1998): Jnet (ammonia excretion) = V ([ion]1-[ion]2) (M.t) -1, where [ion]1 and [ion]2 are the ion or ammonia concentrations in the water in which the fish were kept at the beginning and at the end of the experiment period, respectively; V is the volume of the water (in L); M is fish mass (in kg); and t the duration of the exposure (in h). Blood sampling and analyses After 240 min of exposure to EOs, blood samples were collected using heparinized syringes. The blood was centrifuged for five minutes at g and the obtained plasma was frozen in liquid nitrogen. All these samples were kept in freezer at -80 C until further analysis. Plasma concentrations of cortisol (DBC Diagnostics Biochem Canada, ON, Canadá) and total thyroxine (T4) (Symbiosys-Alka Tecnologia, SP, BR) were quantified in triplicate by the enzyme immunoassay method (ELISA) in a microplate reader (Molecular Devices, CA, USA). Lactate was determined by reacting the lactate dehydrogenase enzyme (LDH Kit-Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, USA) according to Gutmann and Wahlefeld (1974). Total lipids concentration was determined by colorimetric spectrophotometry method according to Frings et al. (1972), using cod liver oil (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, USA) as standard. The