MANOEL DE JESUS MOURA JÚNIOR

Transcrição

1 Universidade Camilo Castelo Branco Instituto de Engenharia Biomédica MANOEL DE JESUS MOURA JÚNIOR REPARAÇÃO DO TENDÃO CALCÂNEO DE RATOS APÓS TENOTOMIA E TRATAMENTO POR LED E ULTRASSOM TERAPÊUTICO: AVALIAÇÃO PELA ESPECTROSCOPIA RAMAN DISPERSIVA E ACHADOS HISTOPATOLÓGICOS REPAIR OF ACHILLES TENDON OF RATS AFTER TENOTOMY AND TREATMENT BY LED AND THERAPEUTIC ULTRASOUND: EVALUATION BY DISPERSIVE RAMAN SPECTROSCOPY AND HISTOPATHOLOGICAL FINDINGS São José dos Campos - SP 2015

2 II Manoel de Jesus Moura Júnior REPARAÇÃO DO TENDÃO CALCÂNEO DE RATOS APÓS TENOTOMIA E TRATAMENTO POR LED E ULTRASSOM TERAPÊUTICO: AVALIAÇÃO PELA ESPECTROSCOPIA RAMAN DISPERSIVA E ACHADOS HISTOPATOLÓGICOS. Orientador: Prof. Dr. Landulfo Silveira Jr. Tese de doutorado defendida no Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica da Universidade Camilo Castelo Branco, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Doutor em Engenharia Biomédica. São José dos Campos - SP 2015

3 III

4 IV

5 V DEDICATÓRIA À Nossa Senhora das Graças por ter acompanho e concluído todo o professo de realização desta tese; À minha filha Cássia Maria Rocha Moura, amada e eterno amor; À minha esposa Sonale do Nascimento Rocha, amada, companheira e melhor amiga.

6 VI AGRADECIMENTOS A Deus, por todo o seu amor e fonte de sabedoria, que me faz seguir confiando no seu poder de Pai. À minha filha Cássia Maria, pelo seu amor. À minha esposa Sonale, pelo seu amor, compreensão e amizade. À minha mãe Carmina, por estar presente em todos os momentos de minha vida com seu amor incondicional. Aos meus irmãos Lisieux, Henrique e Lucimaura pela amizade sincera. Aos meus diretores Yara Lira, Átila Lira e Antonieta Lira, pela contribuição na minha melhoria e qualidade profissional, como também de meus colegas. Ao meu orientador, Landulfo Silveira Jr., pela competência, profissionalismo, conhecimento e contribuição dispensados na realização desta tese. Aos meus inestimáveis colaboradores Mateus, Jeferson, Danilo, Rainier, Adelmário e especialmente ao Diego pela sua disposição, coragem, sempre pronto a ajudar, não tenho palavras para lhe agradecer, como também à sua esposa Yanca que compreendeu os momentos que o mesmo era solicitado. Você é dez! Ao professor Maia Filho, pela sua ajuda na parte prática e teórica deste projeto. Aos professores Wellington e Charlynton, pela paciência em me ajudar e tirar dúvidas. E a todos que de alguma forma contribuíram para alcançar este objetivo. O Prof. Dr. Landulfo Silveira Jr. agradece à FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pelo apoio na aquisição do espectrômetro Raman (Processo 2009/ ).

7 VII REPARAÇÃO DO TENDÃO CALCÂNEO DE RATOS APÓS TENOTOMIA E TRATAMENTO POR LED E ULTRASSOM TERAPÊUTICO: AVALIAÇÃO PELA ESPECTROSCOPIA RAMAN DISPERSIVA E ACHADOS HISTOPATOLÓGICOS RESUMO Dispositivos baseados em ultrassom (US) e diodo emissor de luz (LED) têm sido estudados com o objetivo de acelerar o processo de reparação tendínea, haja vista sua complexidade, pois o tecido cicatricial neoformado tende a impedir ou dificultar o tendão de realizar suas funções normais. Este estudo objetivou comparar o efeito anti-inflamatório e de cicatrização do US terapêutico e do LED em dois comprimentos de onda diferentes em modelo experimental de tenotomia, utilizando a histomorfometria em lâminas coradas com H&E e comparando com a informação bioquímica fornecida pela espectroscopia Raman. Foram utilizados 40 ratos Wistar (235 ± 8,3 g) distribuídos em quatro grupos, em dois tempos experimentais de 7 e 14 dias: TC - tenotomia controle; US - tenotomia associada ao US (0,5 W/cm 2, 1 MHz); LV - tenotomia associada ao LED 625 nm (4 J/cm 2 ); LI - tenotomia associada ao LED 945 nm (4 J/cm 2 ). O estudo histomorfométrico indicou que no 7 o dia, ocorreu diminuição das células inflamatórias mononucleadas no grupo tratado com US em relação ao TC (p < 0,0001) e do grupo LI em relação ao grupo TC (p < 0,05), indicando ocorrência de efeito anti-inflamatório significativo. Já em relação aos grupos LV e TC, não houve diferença significativa. No 14 o dia, houve redução de células inflamatórias, principalmente macrófagos e leucócitos polimorfonucleares, no grupo US em relação ao TC (p < 0,05), indicando efeito anti-inflamatório significativo. Não houve diferença significativa nos demais grupos. A avaliação da concentração de colágeno pela espectroscopia Raman revelou que o grupo LV apresentou maior síntese de colágeno I quando comparado aos outros grupos tratados e ao grupo TC aos 14 dias (p < 0,01). A terapia com US indicou efeito adjuvante com ação anti-inflamatória, enquanto que a terapia com LED 625 nm apontou maior síntese de colágeno, ambas as técnicas contribuindo para o processo de cicatrização tendínea. Palavras-chave: tenotomia, ultrassom terapêutico, LED, espectroscopia Raman, histologia.

8 VIII REPAIR OF ACHILLES TENDON OF RATS AFTER TENOTOMY AND TREATMENT BY LED AND THERAPEUTIC ULTRASOUND: EVALUATION BY DISPERSIVE RAMAN SPECTROSCOPY AND HISTOPATHOLOGICAL FINDINGS ABSTRACT Devices based on ultrasound (US) and light emitting diode (LED) has been studied in order to accelerate the process of tendon repair, given its complexity as the newly formed scar tissue tends to prevent or hinder the tendon to perform their normal duties. This study aimed to compare the anti-inflammatory and healing effects of the therapeutic US and LED at two different wavelengths in experimental model of tenotomy using histomorphometry on slides stained with H&E and comparing the biochemical information provided by Raman spectroscopy. We used 40 Wistar rats (235 ± 8.3 g) divided into four groups, in two experimental periods of 7 and 14 days: TC - tenotomy control; US - tenotomy associated with the US (0.5 W/cm 2, 1 MHz); LV - tenotomy associated LED 625 nm (4 J/cm 2 ); LIV - tenotomy associated with the 945 nm LED (4 J/cm 2 ). The histomorphometric study indicated that on the 7 th day, there was a decrease of inflammatory cells (macrophages and polymorphonuclear leukocytes) in the group US compared to the group CT (p < ) and the group LIV compared to the group CT (p < 0.05), indicating occurrence of significant antiinflammatory effect. In relation to the groups LV and TC, no significant difference was observed. In the 14 th day, there was a reduction of inflammatory cells, especially macrophages and polymorphonuclear leukocytes in the group US compared to the group CT (p < 0.05), indicating significant anti-inflammatory effect. There were no significant differences in the other groups. The evaluation of the collagen content by Raman spectroscopy revealed that group LV showed increased collagen type I synthesis when compared to other treatment groups and the group TC at 14 days (p < 0.01). The US indicated adjuvant therapy with antiinflammatory effect, whereas therapy with LED at 625 nm showed increased collagen synthesis, both techniques contributing to the tendon healing process. Keywords: tenotomy, therapeutic ultrasound, LED, Raman spectroscopy, histology.

9 IX LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1. Organização hierárquica da estrutura do tendão Figura 2. Efeito Piezoelétrico Figura 3. A) Espalhamento Rayleigh E=0; Ei = Energia Incidente; Es = Energia Espalhada. b) Diagrama dos níveis de energia Figura 4. A) Exposição do tendão B) Dissecação do tendão calcâneo Figura 5. Fotografia do sistema Raman Dispersivo (micro e macro Raman) utilizado na coleta dos dados espectrais Figura 6. Imagem ilustrativa dos equipamentos de captura digital - câmera digital (Nikon, Coolpix 5400, 2592 x 1944 pixels), microscópio (Nikon Eclipse e200), computador (Semp Toshiba) Figura 7. Figura ilustrativa dos comandos para análise pelo programa Image J Figura 8. Imagem ilustrativa do comando de edit, selection, specify para análise pelo programa Image J Figura 9. Imagem ilustrativa do comando de image, crop para análise pelo programa Image J Figura 10. Imagem ilustrativa do comando de plugin, analyze e cell counter para contagem de células inflamatórias pelo programa Image J Figura 11. Imagem ilustrativa do início da contagem das células inflamatórias, por meio do programa Image J Figura 12. Imagem ilustrativa da contagem e do resultado das células inflamatórias, por meio do programa image J Figura 13. Fotomicrografias indicando aspectos histológicos do tendão dos animais dos grupos tenotomizados (TC 7 o dia e 14 o dia) e grupos tenotomizados e tratados (US, LV e LI, 7 o dia e 14 o dia). H&E, 400 X Figura 14. Plotagem do número de células inflamatórias em cada grupo experimental após 7 e 14 dias de tratamento. Letras iguais em cada coluna representam grupos com diferenças estatisticamente significativas. TC - grupo tenotomizado controle; US - grupo ultrassom 7 e 14 dias de tratamento; LV - LED 625 nm (vermelho) 7 e 14 dias; LI - LED 945 nm (infravermelho) 7 e 14 dias... 53

10 X Figura 15. Média normalizada dos espectros Raman para cada um dos grupos experimentais na região espectral de cm -1. TC - grupo tenotomizado controle nos períodos de 7 e 14 dias de tratamento; US - grupo ultrassom nos períodos de 7 e 14 dias de tratamento; LV - LED 625 nm (vermelho) nos períodos de 7 e 14 dias; LI - LED 945 nm (infravermelho) nos períodos de 7 e 14 dias Figura 16. Espectros Raman dos elementos bioquímicos basais do colágeno I e colágeno III (Sigma-Aldrich) utilizados no modelo espectral Figura 17. Concentrações relativas de colágeno III e colágeno I nos grupos experimentais obtidas a partir do coeficiente de ajuste dos espectros Raman em tendão de Rattus norvegicus albinus. * indica diferença estatisticamente significativa no mesmo grupo entre 7 e 14 dias (p < 0,05) e a, b, c, d, e, f, g indicam diferença estatisticamente significativa entre os grupos aos 7 e aos 14 dias (p < 0,05)... 55

11 XI LISTA DE TABELAS Tabela 1. Densidades de potência do Ultrassom... 29

12 XII LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS. ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. ATP - Adenosina Trifosfato. bfgf - Fator de Crescimento de Fibroblasto Básico. CEP - Comitê de Ética e Pesquisa. DORT - Distúrbios Osteomusculares Relacionados ao Trabalho. ERA - Área de Irradiação Efetiva. FSA - Faculdade Santo Agostinho. H&E - Hematoxilina e Eosina. I - Intensidade. INSS - Instituto Nacional de Seguridade Social. LASER - Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation (amplificação de luz por emissão estimulada de radiação). LED - Light Emitting Diode (Luz Emitida por Diodo). LER - Lesão por Esforço Repetitivo. LLLT - Low level laser therapy (Terapia com laser de baixa potência). p - Nível de significância. PI - Piauí. UESPI - Universidade Estadual do Piauí. US - Ultrassom. VHS - Velocidade de Hemossedimentação.

13 XIII SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO Objetivo geral Objetivos específicos REVISÃO DE LITERATURA Tendões Tendão calcâneo Processo inflamatório O processo de reparo do tendão Recursos no reparo tecidual Ultrassom Efeitos biológicos da aplicação do Ultrassom LED (Light Emitting Diode Diodo Emissor de Luz) Efeitos fisiológicos do LED Espectroscopia Raman Breve histórico O efeito Raman Aplicações biomédicas Aplicações biomédicas em tendões MATERIAIS E MÉTODOS Aspectos éticos Delimitação do universo da pesquisa Equipamentos Ultrassom LEDs Grupos experimentais Tempos experimentais Procedimento cirúrgico Intervenção terapêutica experimental Eutanásia dos animais Preparação das amostras para análise pela espectroscopia Raman Análise pela espectroscopia Raman... 42

14 XIV Procedimentos pós-espectroscopia Raman Avaliação histológica Avaliação histomorfométrica Análise Estatística Histológica Modelo espectral de quantificação de colágeno RESULTADOS Avaliação histológica e histomorfométrica Espectroscopia Raman visando quantificação de colágeno DISCUSSÃO CONCLUSÃO CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXO A - Certificado do Comitê de Ética ANEXO B - Certificado de Calibração do Ultrassom - Antes do Experimento ANEXO C Certificado de Calibração do Ultrassom Após Experimento... 77

15 15 1. INTRODUÇÃO Os tendões são tecidos conectivos, bem organizados e fibrosos, interpostos entre músculos e ossos, que transmitem a força gerada entre os músculos aos ossos, tornando possível o movimento articular [1]. A tendinite é um processo inflamatório que desencadeia o mecanismo de reparação tecidualdo tendão agredido [2-4]. Sob condições inflamatórias observadas na tendinite ou após uma ruptura de tendão, verifica-se a presença de uma maior população de células migratórias (macrófagos), derivadas de monócitos do sangue ou de tecidos vizinhos que fagocitam e, consequentemente, removem os fragmentos da matriz extracelular do tendão lesado, liberando citocinas e fatores de crescimento que afetam a homeostase do tendão [2-5]. Entretanto, muitas vezes esse processo tem dependência com relação à intensidade do trauma, do agente agressor e das condições imunológicas e nutricionais, que podem interferir na resposta inflamatória e acarretam complicações do tipo fibrose, que prejudicam a qualidade do tecido neoformado [2-5]. Tendinopatia é o termo genérico utilizado para descrever todas as doenças originadas nos tendões e ao redor deles[6]. O processo de reparação tecidual no tendão divide-se em três fases: inflamatória, proliferativa e remodelagem, que se sobrepõem de forma continua e temporal [7]. A fase inflamatória é caracterizada por extravasamento sanguíneo que preenche a área lesada com plasma e elementos celulares, principalmente plaquetas que promovem a coagulação sanguínea, gerando um tampão rico em fibrina após a saída das plaquetas de dentro do leito vascular, e que células inflamatórias migram em direção ao leito da ferida em resposta aos agentes quimiotáticos [7]. A fase proliferativa envolve, principalmente, a migração e proliferação de três classes celulares: células endoteliais e fibroblastos, ocorrendo ainda fibroplasia e angiogênese que compõem o chamado tecido de granulação, responsável pela ocupação do tecido lesionado [7]. A fase de remodelagem é caracterizada por uma recuperação da estrutura tecidual normal e alterações na matriz extracelular, ocorrendo o depósito de proteoglicanos e colágeno[7-9]. Dentre os recursos terapêuticos convencionais, disponibiliza-se uma infinidade de anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs) e tratamentos fisioterapêuticos convencionais, fundamentados no uso de calor profundo gerados pelo uso do ultrassom na frequência de 1 MHz; e fototerapia no vermelho (620 ± 20 nm) e infravermelho (925 nm) [10-12]. Nesta perspectiva de tratamento estimulado por ondas mecânicas, tem-se principalmente o ultrassom (US), que consiste em um emissor de ondas sonoras longitudinais

16 16 geradas por um transdutor ultrassônico [10-12]. O US utilizado como agente terapêutico vem sendo associado a ação biológica por diversos mecanismos, promovendo efeitos térmicos e não-térmicos nas células e tecidos do corpo, estimulando o processo de regeneração dos tecidos conforme os parâmetros de estimulação, tempo e técnica de aplicação [10,11]. Outra modalidade terapêutica anti-inflamatória bastante utilizada no tecido tendíneo tem sido o diodo emissor de luz (LED), que é uma fonte de radiação eletromagnética não coerente com potência de algumas dezenas de mw (baixa potência), o qual emite luz na faixa do espectro visível e infravermelho, e que apresenta baixa emissão de calor. O LED vem sendo investigado na área biomédica como agente de estímulo na aceleração da cicatrização tecidual [13-15]. Em conjunto com estas novas modalidades terapêuticas na área de reabilitação tendínea no campo de fisioterapia, tem-se o emprego da técnica de espectroscopia Raman como ferramenta diagnóstica das alterações bioquímicas em tecidos e fluidos biológicos, tanto in vitro quanto in vivo [16,17]. A utilização da espectroscopia Raman como ferramenta de diagnóstico de alterações patológicas vem sendo estudada em diferentes tecidos biológicos, entre os quais os tendões, que têm sido de grande potencial para o estudo de reparo tecidual em tendinites visando tratamento das lesões utilizando diferentes fontes de estímulo externo e tempos experimentais [18-20]. Pela sua especificidade molecular, a técnica Raman tem a capacidade de avaliar as modificações moleculares de tendões e de tecidos cartilaginosos por meio da determinação da concentração relativa de colágenos dos tipos I e III dependendo do método de tratamento utilizado, nos tecidos reparados comparativamente ao controle [19,20] Objetivo geral O objetivo desta pesquisa foi comparar o efeito anti-inflamatório do US terapêutico (0,5 W/cm 2 ) e de LEDs em dois comprimentos de onda diferentes ± 15 nm e 945 ± 20 nm, em um modelo experimental de tenotomia do calcâneo em ratos Wistar Objetivos específicos Os objetivos específicos referem-se a: - Avaliar qualitativamente o remodelamento nos ratos submetidos às terapias de US e LEDs, usando a técnica histológica.

17 17 - Avaliar quantitativamente as células inflamatórias e colágeno tipo I e III, presentes na fase inicial e tardia da reparação em função das terapias US e LEDs por meio da histopatologia, histomorfometria e espectroscopia Raman dispersiva.

18 18 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Tendões Os tendões são estruturas cilíndricas alongadas que conectam os músculos aos ossos e representam um conjunto típico de tecido conjuntivo denso não modelado, formado por feixes densos e paralelos de colágeno, separados por muito pouca quantidade de substância fundamental amorfa e fibroblastos, possuindo água, elastina e poucos capilares. O colágeno confere resistência e força tênsil, a elastina confere elasticidade e a água fornece capacidade de deformação elástica, com o objetivo de maximizar sua força. A principal função dos tendões é transmitir forças de tensão dos músculos para os ossos [21,22]. A inervação dos tendões, a se julgar pelo padrão encontrado no tendão de Aquiles, é fornecida por nervos dos músculos circunvizinhos e por pequenos fascículos derivados dos nervos cutâneos [23]. Os terminais nervosos podem ser classificados em quatro categorias, de acordo com suas características anatômicas e funcionais: tipo 1 - corpúsculos de Ruffini; tipo 2 - corpúsculos de Vater-Pacini; tipo 3 - órgãos tendinosos de Golgi; e tipo 4 - terminais nervosos livres. Os tipos 1 a 3 são mecanorreceptores com diferentes patamares de sensibilidade, situados na intimidade e na superfície externa dos tendões, convertendo estímulos de pressão ou tensão em sinais nervosos aferentes. Os terminais nervosos livres são responsáveis pela transmissão da sensação dolorosa [23]. Além de colágeno, a matriz extracelular contém fibras elásticas e substância fundamental, composta de proteoglicanos (principalmente decorina e hialuran), glicosaminoglicanos, glicoproteínas estruturais, além de grande número de pequenas moléculas e componentes inorgânicos [24,25]. Em decorrência de demandas funcionais, há uma grande variação entre diferentes tendões no que se refere ao conteúdo e à distribuição dos tipos de colágeno, bem como aos componentes [24,25]. A junção miotendinosa é uma região anatômica altamente especializada na unidade músculo-tendão, na qual a tensão gerada pelas fibras musculares é transmitida das proteínas contrateis intracelulares para as proteínas extracelulares do tecido conjuntivo (fibrilas de colágeno); na junção osteotendinosa, o tendão transfere a força para um osso rígido; nesta, foram descritas quatro zonas histológicas distintas: (a) tendão; (b) fibrocartilagem; (c) fibrocartilagem mineralizada; e (d) osso [26,27].

19 19 O colágeno, especialmente do tipo I, representa 65 a 80% da massa tendínea, contra 1 a 2% de elastina, sendo produzido pelos tenoblastos e tenócitos, que são, respectivamente, fibroblastos e fibrócitos alongados, localizados entre as fibras colágenas [28]. Os tenoblastos e tenócitos representam cerca de 90 a 95% da população celular, e em muito menor número se encontram condrócitos (em áreas de pressão e inserção tendinosa), células sinoviais (na bainha tendinosa) e as endoteliais e musculares lisas (nos diferentes tipos de vasos do endotendão e epitendão) [28]. Os tenócitos são células que se distribuem em um padrão longitudinal esparso entre as fibras colágenas, sendo a porção proximal do tendão mais rica em células do que a porção distal [28]. A estruturação do colágeno no tendão é altamente ordenada e complexa, contendo moléculas de tropocolágeno, que consiste de uma cadeia polipeptídica solúvel disposta em hélice tripla, formando ligações cruzadas, originando moléculas de colágeno insolúvel que se agregam em microfibrilas e em unidades visíveis sob microscopia eletrônica [28,29]. As fibrilas colágenas constituem um feixe de fibrilas, formando a fibra colágena que é o componente básico do tendão. A estrutura tridimensional dos tendões tem sido estudada tanto em humanos como em ratos. De acordo com resultados de pesquisas, a organização estrutural é ordenada de forma hierarquizada, como demonstrada pela Figura 1 [28,29]. Figura 1: Organização hierárquica da estrutura do tendão Fonte: Adaptado de Khan (1999) [6] Uma bainha delgada de tecido conjuntivo, o endotendão, forma um arcabouço que envolve cada uma das fibras de colágeno, agregando-as para constituir feixes primários de fibras, ou subfascículos, que por sua vez se agrupam em feixes secundários, ou fascículos, e os terciários, o conjunto dos quais constitui o tendão propriamente dito [28,29]. O endotendão, formado majoritariamente por colágeno tipo III, além de sua função de ligação,

20 20 constitui uma rede que permite o deslizamento dos grupos de fibras uns sobre os outros, bem como apresentam em seu interior vasos sanguíneos, nervos e vasos linfáticos, que nutrem a parte mais profunda do tendão. O tendão é inteiramente coberto pelo epitendão que, em sua face interna, conecta-se com o endotendão e, na externa, com o paratendão. O epitendão está formado por uma rede filamentosa e relativamente densa de colágeno, com fibrilas longitudinais, oblíquas e transversais. O paratendão tem como principais componentes os colágenos tipos I e III, além de fibras elásticas e é revestido na face interna por células sinoviais [28,29]. As estruturas que circundam os tendões encaixam-se em cinco categorias: (a) as bainhas fibrosas ou retinaculae; (b) as polias; (c) as bainhas sinoviais; (d) faixa peritendinosa (paratendão); e (e) bolsas sinoviais [24,25]. As bainhas sinoviais são encontradas mais freqüentemente nos tendões das mãos e pés. Sob uma camada fibrosa, há duas faixas delgadas, a parietal e a visceral, que formam um túnel peritendinoso preenchido por líquido lubrificante [24,25]. Nos tendões desprovidos de uma bainha sinovial verdadeira, pode haver o paratendão para amenizar a fricção. Como acima referido, o tendão é coberto pelo epitendão, que na sua face interna conecta-se com o endotendão, e na externa, com o paratendão, encontrado, por exemplo, no tendão de Aquiles ou do calcâneo [24,25] Tendão calcâneo. O tendão calcâneo situa-se no compartimento superficial posterior da perna, formado pela junção tendínea dos ventres musculares do gastrocnêmio e sóleo, inserindo-se na parte posterior da porção central do osso calcâneo e tem a função de transmitir a força criada no músculo gastrocnêmio e sóleo à porção posterior, determinando a flexão plantar do tornozelo [26]. O tendão calcâneo é o tendão maior e mais forte do corpo humano, e que é submetido a extensas cargas estáticas e dinâmicas e pode estar sujeito a cargas entre duas a três vezes o peso do corpo, sendo composto quase que inteiramente de colágeno tipo I [30,31]. A região proximal do tendão calcâneo é composta por uma estrutura típica do tendão e possui a função de resistir exclusivamente às forças de tração, já a região distal apresenta dois tipos de estrutura fibrocartilaginosa: a primeira uma fibrocartilagem que suporta compressão e a segunda uma fibrocartilagem, que são locais de concentração de tensão mecânica e estão sujeitas a possíveis lesões denominadas entesopatias [30,31]. As propriedades biomecânicas do tendão de Aquiles variam conforme a necessidade funcional que este tem [30,31].

21 Processo inflamatório. O processo inflamatório é uma resposta complexa do tecido conjuntivo, em que a inflamação gerada pela presença de um agente provocador de lesão leva a um acúmulo de fluido e leucócitos nos tecidos extravasculares, com objetivo de destruir, diluir e isolar os agentes lesivos, em que os participantes deste mecanismo são as paredes vasculares, células inflamatórias, mastócitos, fibroblastos, macrófagos residentes no tecido conjuntivo, proteoglicanos, fibras colágenas elásticas e membrana basal [2-4]. É, fundamentalmente, uma resposta de proteção cuja finalidade é eliminar o organismo ou agente causador da lesão celular [2-4]. As alterações inflamatórias se dão por mediadores químicos, cujos principais agentes inflamatórios são: mediadores de ação rápida que envolve o grupo das aminas vasoativas, que são liberadas imediatamente após a ação do estímulo agressor e têm ação principalmente sobre os vasos [2-4]. Entre estes mediadores estão as aminas vasoativas originárias do tecido agredido e que atuam sobre a parede vascular, não exercendo quimiotaxia sobre os leucócitos como alguns mediadores de ação prolongada e compreendem as histaminas e as serotoninas. A histamina sintetizada nos granulócitos basófilos, nas plaquetas, e principalmente nos mastócitos, provoca contração das células endoteliais venulares, com consequente aumento da permeabilidade vascular e vasodilatação e tem destacada participação no mecanismo de formação do edema inflamatório. A serotonina encontrada nas plaquetas e no sistema nervoso central tem uma provável ação vasodilatadora e aumento da permeabilidade vascular. Já os mediadores de ação prolongada são liberados mais tardiamente diante da persistência do agente flogístico e atuam nos vasos, principalmente nos mecanismos de quimiotaxia celular, contribuindo para a exsudação celular, compreendendo as substâncias plasmáticas e lipídios ácidos [2-4]. As substâncias plasmáticas estão divididas em três grandes sistemas: o sistema das cininas (envolvendo principalmente a plasmina e a bradicinina); o sistema complemento e o sistema de coagulação, representado pelos fibrinopéptides. Entre o sistema das cininas, a plasmina que é uma protease que digere uma ampla gama de proteínas teciduais como fibrina protrombina e globulina [2-4]. Sua forma inativa, o plasminogênio, é ativada por enzimas lisossômicas, quinases bacterianas, teciduais e plasmáticas. A presença da plasmina incrementa a permeabilidade vascular e provoca o surgimento de fibrinopeptídeos, que liberam as cininas e atuam sobre o sistema complemento [2-4]. A bradicinina ativada no

22 22 interstício promove ação vasodilatadora de pequenas artérias e arteríolas e aumento na permeabilidade vascular, por atuar em terminações nervosas, provocando o surgimento de dor. O sistema complemento é um fragmento protéico originário de uma proteína plasmática termolábel que se rompe devido a algumas reações entre proteínas plasmáticas e intersticiais, aumentando a permeabilidade vascular por provocar a liberação de histamina ou por ação direta sobre a parede vascular [2-4]. Possui também atividade quimiotática, contribuindo para a exsudação celular, principalmente de neutrófilos. O sistema de coagulação (fibrinopeptídeos) tem ação quimiotática sobre os leucócitos, evento este observado na fase de exsudação celular e que pode aumentar a permeabilidade vascular. Por fim, os lipídios ácidos, representados principalmente pelas prostaglandinas, participam das fases mais tardias da inflamação, sendo um composto de cadeias longas e formadas por ácidos graxos que provocam a contração das células endoteliais e potencializam as respostas vasculares oriundas da ação da bradicinina [2-4]. Nos primeiros dois dias da lesão tendínea ocorre a denominada fase inflamatória aguda, caracterizada pela saída de leucócitos de dentro dos capilares (diapedese) com o objetivo de fagocitar as partículas que ficam alojadas na área da lesão [2-5]. Este fenômeno permite que microorganismos, fragmentos teciduais e corpos estranhos possam ser retirados do local do trauma. A fase de inflamação aguda é uma resposta imediata e que tem curta duração, sejam minutos, horas ou poucos dias e suas principais características são: vasodilatação, levando a um aumento do fluxo sanguíneo local e mudanças estruturais na microvasculatura que permite a saída de proteínas plasmáticas e de leucócitos, resultando no edema. A fase proliferativa ocorre após um período de alguns dias e compreende neomatriz, neovasculatura, macrófagos e fibroblastos. Fibroplasia é um termo que engloba o processo de proliferação e migração de fibroblastos e o desenvolvimento de matrizes colagenosas e não colagenosas. Ao mesmo tempo em que estes fenômenos estão ocorrendo, existe uma proliferação dos capilares com um aumento do seu número, permitindo um acréscimo no conteúdo sanguíneo que chega à região [2-5]. Com o extravasamento líquido na zona da ferida ocorre um edema, que dá o aspecto externo aumentado e de cor avermelhada à zona da lesão. A fase de remodelamento começa quase ao mesmo tempo em que o novo tecido é formado, embora para melhor compreensão esse seja normalmente considerado como parte da terceira fase da regeneração. A matriz que está presente nesse estágio é substituída gradualmente e remodelada nos meses e anos subsequentes à medida que o tecido cicatricial amadurece [2-5].

23 O processo de reparo do tendão As células estão constantemente sujeitas a lesões que podem resultar em morte celular e destruição dos tecidos [32,33]. Em condições favoráveis, a resposta inflamatória aguda é adequada para controlar o evento lesivo e preparar o local para a recuperação tecidual (fase crônica). O melhor efeito possível é a resolução do processo inflamatório, com a remoção do exsudado inflamatório e a regeneração celular, ocorrendo substituição das células originais eventualmente perdidas. O resultado final, no entanto, pode ser influenciado por vários fatores locais e sistêmicos [32,33], entre os quais se incluem o tipo, tamanho e localização da lesão; a destruição ou dano substancial do arcabouço estromal e das membranas basais; o suprimento vascular; a existência de infecção e a movimentação precoce da área lesionada. Nessas circunstâncias, a substituição do tecido lesado se dá por reparação fibrosa, um processo organizado pelo qual um dano tecidual é substituído por uma cicatriz [32,33]. A cicatrização sobrepõe-se ao processo inflamatório e apenas por motivos didáticos os dois processos são separados [32,33]. O processo de reparação tecidual é complexo e pode ser conceituado como uma cadeia de eventos, cada um completando o anterior e iniciando o subseqüente: hemostasia; inflamação; demolição; proliferação e maturação. O cenário de todo o processo é, portanto, a soma de três respostas: (a) hemostática, porque os vasos sangraram; (b) inflamatória, porque houve dano celular, com ou sem infecção; e (c) regenerativa, porque houve perda de células. A prioridade inicial é estancar o sangramento, tendo início imediato a homeostasia [32,33]. A coagulação sanguínea pode ser induzida por qualquer um destes dois mecanismos: (a) pelo contato com o colágeno e (b) por ação de fatores teciduais liberados pelas células lesadas. Além disso, as plaquetas formam tampões que ajudam a deter a hemorragia. É relevante mencionar que produtos dos mecanismos de coagulação também ajudam o processo cicatricial, em que a trombina atrai macrófagos e induz proliferação fibroblástica, enquanto que citocinas e fatores de crescimento derivados de plaquetas têm atividade mitógena e quimiotática para leucócitos e fibroblatos [32,33]. O processo inflamatório, modulado por numerosos mediadores químicos, é responsável pela remoção de restos celulares e pelo combate a possíveis agentes invasores, caracterizando-se pela presença predominante de macrófagos e linfócitos. A fase regenerativa manifesta-se por renovação celular, angiogênese, formação de matriz extracelular e retração da ferida [32,33]. Os fenômenos hemostáticos e inflamatórios reduzem-se progressivamente até desaparecerem. Na fase de maturação, a matriz temporária contendo colágeno tipo III é removida, sendo depositada a matriz definitiva, rica em colágeno tipo I, ocorrendo ligações

24 24 cruzadas no colágeno, remodelagem e reabsorção capilar [32,33]. Essas respostas são orquestradas, entre outros fatores, pelo tipo de lesão e pelo local afetado [32,33]. No que se refere ao tendão, há peculiaridades a serem consideradas [32,33]. A reparação do tendão é classicamente considerada como extrínseca e intrínseca [32,33]. Um dos modelos experimentais mais utilizados no estudo do processo de reparação é a tenotomização do tendão de Aquiles. A reparação intrínseca produz obliteração do tendão e sua bainha, tendo uma fase exsudativa e uma formativa que, em geral, são muito similares àquelas associadas à cicatrização de feridas [32,33]. A extrínseca ocorre por meio da quimiotaxia de fibroblastos especializados para a lesão a partir das extremidades seccionadas da bainha tendinosa. O processo pode ser dividido em três fases: inflamação; reparação e organização ou remodelação. Na fase inflamatória as células migram dos tecidos peritendinoso extrínsecos, como a bainha tendinosa, periósteo, tecido subcutâneo, bem como do epitendão e endotendão [32,33]. Inicialmente, a resposta extrínseca supera em muito a resposta intrínseca, resultando no preenchimento rápido do defeito com hematoma e tecido de granulação. Fibroblastos migratórios se organizam de forma radial em relação ao sentido das fibras tendíneas e começam a sintetizar o colágeno [32,33]. As fases mais importantes para uma melhor reparação tecidual se dão na proliferação e remodelamento, em que ocorre o processo de síntese de fibras de colágeno e alinhamento das mesmas no eixo longitudinal do tendão. Durante a 4 a semana, tem lugar um aumento significativo na proliferação de fibroblastos de origem intrínseca, principalmente a partir do endotendão [32,33]. Estas células assumem o papel principal no processo de cicatrização, tanto para sintetizar como reabsorver colágeno [32,33]. O tecido recém-formado começa a amadurecer e as fibras de colágeno são cada vez mais orientadas ao longo das linhas tensionais do tendão. Esta fase de reparação continua por dois meses após a lesão inicial [32,33]. A estabilidade final é adquirida durante a remodelação induzida pelo uso fisiológico normal do tendão, o que orienta ainda mais as fibras na direção da força. Uma alta expressão do colágeno tipo I parece imprescindível para uma reparação mais rápida do tendão [32,33]. Para isso, deve ocorrer uma mudança na produção inicial do colágeno tipo III para o do tipo I. Assim, durante a fase de remodelagem, o colágeno tipo I, mais forte mecanicamente, é produzido em detrimento ao de tipo III, alterando ligeiramente, assim, a proporção inicial destas fibras para aumentar a força no local da cicatrização [32,33]. Apesar da intensa atividade de remodelagem, uma regeneração completa do tendão dificilmente é obtida [26,34,35]. O diâmetro das fibras de colágeno é alterado, favorecendo as fibras mais finas com redução da força biomecânica do tendão. Assim, na tendinopatia e na

25 25 ruptura do tendão aquiliano, há uma redução na proporção de colágeno tipo I, e aumento significativo na quantidade de colágeno tipo III, resultando na redução da força de tração [26,34,35]. Além disso, microlesões recorrentes podem levar ao desenvolvimento de hipertrofia do tecido de reparação, que biologicamente é inferior ao tendão intacto. Na verdade, há evidências de que, no tendão, o processo de remodelagem matricial é contínuo, embora a taxa de renovação seja variável em diferentes localizações e uma alteração na atividade remodeladora está associada ao início da tendinopatia [26,34,35] Recursos no reparo tecidual A utilização de ondas mecânicas (US) e eletromagnéticas (LED) pode influenciar a reparação tecidual, reduzindo o tempo de cicatrização [36,37]. A aplicação destes recursos favorece o aumento da circulação sanguínea local, estimulando a angiogênese e promovendo a reparação dos tecidos moles e regeneração tissular, por meio da síntese protéica e ativação do ciclo de cálcio [12,19,37-40] Ultrassom O US vem sendo utilizado na medicina com finalidade terapêutica, revelando sua eficiência na resolução de muitas formas de lesões [41,42]. O equipamento de US terapêutico consiste de um gerador de corrente elétrica de alta frequência, conectado a uma cerâmica piezoelétrica sintética de chumbo-zinco-titânio (PZT) [10-12,41]. Os transdutores transformam energia mecânica em energia elétrica e seu reverso, elétrica em mecânica. Isso ocorre quando o cristal piezoelétrico, natural ou sintético, é comprimido ou deformado por meio mecânico, resultando em uma pequena carga elétrica dentro do cristal. De modo inverso, se um campo elétrico externo for imposto ao cristal, uma deformação mecânica da estrutura molecular do cristal na forma de vibração pode acontecer [10-12,41]. O efeito piezoelétrico (Figura 2) consiste na variação das dimensões físicas de certos materiais sujeitos a campos elétricos, fazendo com que o cristal contraia e expanda, produzindo ondas mecânicas de alta frequência por meio desta dilatação e contração [10-12,41].

26 26 Figura 2: Efeito piezoelétrico Fonte: Prentice (2004) [42] As ondas sonoras possuem frequência entre 20 e Hz e quando a frequência está abaixo de 20 Hz, classifica-se como infrassônica ou subsônica e acima de Hz, classifica-se como ultrassônica [10-12,41]. Podem ser produzidos três tipos de ondas no tecido: estacionárias, que decorrem da sobreposição das ondas refletidas do músculo/osso sobre as ondas incidentes; longitudinais, em que as partículas se deslocam paralelamente à direção do som, sofrendo uma série de compressões e dilatações, sendo transportada em meios líquidos e sólidos; e as ondas transversais, que são ondas que se deslocam perpendicularmente à onda sonora e podem atravessar apenas sólidos. Como os tecidos moles são compostos principalmente por líquidos, o US propaga-se primariamente como uma onda longitudinal; porém, quando atinge o osso, transforma-se em onda transversal [10-12,41]. A velocidade com que a onda ultrassônica é transmitida para um meio depende da elasticidade e densidade desde meio e é de fundamental importância, pois a velocidade de propagação é variável importante para calcular-se a impedância acústica, que é uma variável chave para a absorção do US pelo tecido. Materiais mais densos e mais rígidos promovem maior velocidade de transmissão, consequentemente maior absorção [10-12,41]. A intensidade da onda ultrassônica apresenta duas regiões distintas, uma proximal ou zona de Fresnel em que acontecem os picos e depressões dos feixes e os efeitos terapêuticos, e um campo mais distante ou zona de Fraunhöfer em que existe menor uniformidade e maior divergência da

27 27 onda. Em geral, a energia produzida pela onda ultrassônica percorre uma linha reta, entretanto quando percorre um meio material (sólido, liquido ou gasoso), seu trajeto sofre alterações devido à densidade desses meios, sendo que a energia que atinge a interface entre estes dois meios com densidades diferentes pode ser refletida ou refratada. A reflexão ocorre quando a impedância acústica dos tecidos for diferente [10-12,41]. A intensidade de emissão da onda ultrassônica não é uniforme em toda a superfície do transdutor. Este comportamento heterogêneo é expresso pelo coeficiente de não uniformidade do feixe (BNR - beam non-uniformity ratio ), e representado pela razão entre o pico de intensidade do feixe e a intensidade média da onda ultrassônica. Quanto menor o valor de BNR, mais uniforme é o feixe [11,43]. Um valor aceitável do BNR é 8. Para segurança do tratamento, o cabeçote deve ser mantido sempre em movimento durante o tratamento, de modo que a energia ultrassônica se irradie adequadamente, evitando pontos quentes que podem ser produzidos em uma emissão estacionária [11,43]. As ondas ultrassônicas podem ser emitidas de dois modos: contínuo e pulsado [10-12,41]. No modo contínuo, a intensidade da onda sonora permanece constante sem modulação, em que a energia sonora é aplicada em 100% do tempo de tratamento, gerando no tecido efeitos térmicos, alteração de pressão, micromassagem, aquecendo com eficiência tecidos localizados a 5 cm de profundidade ou mais, dependendo da frequência utilizada [10-12,41]. No modo pulsado, a emissão da energia sonora é intermitente, com aplicação intercalando pausas, com a finalidade de dissipar o calor gerado durante o impulso, caracterizando-se por ondas sônicas pulsadas, moduladas em amplitude com frequências de 16 a 100 Hz, em que os ciclos de trabalhos podem variar conforme a relação entre o intervalo de emissão e o repouso das ondas ultrassônicas em 10, 20 ou 50%, produzindo efeitos não térmicos e micromassagem [10-12,41]. O teste de cavitação fornece uma indicação da potência emitida pelo transdutor e deve ser realizado periodicamente para indicar a emissão ou não da energia ultrassônica. No teste, a cavitação deve ser visível a partir de uma densidade de potência de 0,1 W/cm², no modo contínuo, observado através da nebulização da água [10-12,41] O equipamento de US necessita de calibração em períodos regulares, com o primeiro passo sendo a verificação do sistema elétrico por meio do analisador de eletricidade, seguido pela análise do frequencímetro em 1 MHz e 3 MHz [10-12,41]. Realiza-se a calibração do aparelho utilizando-se uma balança de calibração nas medidas de densidades de potência de 0,5 a 7,0 W/cm 2, adotando-se uma forma de onda senoidal nas frequências de l e 3 MHz, nos modos contínuo e pulsado, em que cada medida de potência é repetida cinco vezes [10-12,41]. A

28 28 propagação da energia ultrassônica nos tecidos biológicos depende principalmente de dois fatores: características de absorção dos tecidos e reflexão da energia ultrassônica nas interfaces teciduais de diferentes impedâncias acústicas [10-12,41]. Como o ar apresenta alta impedância a propagação das ondas ultrassônicas há necessidade da utilização de um meio de acoplamento entre o transdutor do aparelho gerador e a pele. O agente de acoplamento deve ser aplicado entre a pele e o transdutor a fim de casar as impedâncias acústicas dos diferentes meios, sendo que o meio de acoplamento mais utilizado e encontrado é o método direto à base de gel hidrossolúvel [10-12,41]. Uma camada de gel deve ser aplicada na área de tratamento em quantidade suficiente para manter um bom contato e lubrificação entre o transdutor e a pele, mas não tanto que permita a formação de bolhas de ar pela movimentação do transdutor, aplicando uma pressão constante e firme para manter a fonte de US em contato com a pele, sem perdas por reflexão [10-12,41]. Em todos os métodos é importante mover o cabeçote continuamente em relação aos tecidos devido à grande irregularidade do feixe ultrassônico, evitando assim a formação e ondas estacionárias que podem se formar devido a um mau contato entre o cabeçote e a pele, causando estase temporária das células sanguíneas circulantes e dano endotelial e aquecimento excessivo devido às altas intensidades, que podem levar a dano tecidual. O transdutor deve ser movimentado lentamente, cobrindo a área de tratamento que corresponda à área de irradiação efetiva (ERA) do transdutor [10-12,41]. O US terapêutico caracteriza-se por apresentar uma frequência de 1 a 5 MHz, sendo disponível atualmente no mercado equipamentos com frequência de 5 MHz. O US de 1 MHz é transmitido por meio de tecidos mais superficiais e absorvido primariamente nos tecidos mais profundos entre 2 e 5 cm, enquanto que o US de 3 MHz a energia da onda ultrassônica é absorvida nos tecidos mais superficiais, apresentando profundidade de penetração entre 1 e 2 cm, tornando-o ideal para tratar condições superficiais. A ERA é a porção da superfície do transdutor que efetivamente produz a onda sonora e corresponde a área de superfície do cristal piezoelétrico [10-12,41]. A ERA, geralmente, é menor que a área da face metálica do transdutor, e isso ocorre porque o elemento piezoelétrico não vibra uniformemente. Alguns equipamentos dispõem de cabeçotes menores com área que variam de 0,8 a 2 cm 2, ideal para regiões pequenas como tendões, falanges e outros tecidos de pequeno tamanho [10-12,41]. Na maioria dos equipamentos, a densidade de potência do feixe ultrassônico varia entre 0,01 a 2,0 W/cm 2, e a partir do valor da densidade de potência pode-se obter o valor da potência da radiação ultrassônica emitida [10-12,41]. Esse valor é obtido multiplicando-se a potência desejada do aparelho pela ERA do transdutor. A Organização Mundial de Saúde

29 29 limitou a densidade de potência dos equipamentos de US terapêuticos em, no máximo, 3,0 W/cm 2, visando proteger o paciente contra efeitos biológicos desfavoráveis como cavitação, que é a formação de nanobolhas nos fluidos biológicos [10-12,41]. Existem dois tipos de cavitação: cavitação estável, que acontece quando as bolhas de ar mudam de direção dentro das ondas de pressão do US, aumentando e diminuindo de volume, porém permanecendo intactas, em que este efeito é desejável e não causa nenhum dano aos tecidos e a cavitação instável, no qual ocorre uma violenta implosão das bolhas, podendo causar danos ao tecido por meio das altas temperaturas e pressões geradas em razão da liberação de energia no instante da ruptura da bolha de ar. No colapso destas bolhas, há produção de radicais livres, íons hidrogênio (H + ) e íons hidroxila (OH - ) [10-12,41]. Na fase inflamatória, usa-se densidades potências mais baixas (US pulsado), evitando-se com isso, efeitos térmicos indesejáveis, já fase proliferativa, recomenda-se densidade de potências mais altas (US contínuo), observando a agudicidade e cronicidade das fases, conforme Tabela 1 [43]. Tabela 1: Densidades de potência do Ultrassom. Segmento Densidade de potência (W/cm 2 ) Nervos 0,8 1,2 Músculos 0,7 0,9 Cápsulas 0,5 0,7 Tendões 0,4 0,7 Ligamentos 0,3 0,6 Fonte: Agne (2009) [43] Bursas 0,3 0,5 Para Kitchen (2002)[10], Low e Reed (2006)[11], Olsson et al. (2006)[39] e Watson (2009) [12], a duração do tratamento depende da dimensão da área a ser tratada, recomendando que seja despendido um tempo de tratamento total máximo de 10 min., em função do tipo de lesão e da área a ser tratada. Entre as indicações da onda ultrassônica para o tratamento de diversas patologias, pode-se citar: tendinites, miosites, derrames articulares, distensões, luxações, fraturas, contraturas, entre outras, sejam elas agudas ou crônicas [10-12,41]. Já para Lehmann et al. (1974) [44], Lele (1979) [45] e Hynynen et al. (1981) [46],

30 30 entre as contraindicações e precauções tem-se útero gravídico, tecidos neoplásicos, olhos e espinha bífida entre outros Efeitos biológicos da aplicação do Ultrassom Dentre os tratamentos não invasivos, a energia ultrassônica é um dos procedimentos adjuvantes mais utilizados em Fisioterapia para o tratamento de diversas alterações [10-12,41]. A utilização do US terapêutico demonstra qualidades biofísicas, químicas e térmicas, induzindo mudanças fisiológicas como ativação de fibroblasto, colágeno e diminuição de células inflamatórias por aceleração do metabolismo celular. As alterações fisiológicas nos tecidos podem ser agrupadas em duas classes, efeitos térmicos e não térmicos, porém há sobreposição entre elas. Se todo o calor gerado pelo US não for dissipado pelos meios fisiológicos normais, ocorrerá o aumento da temperatura local, que resulta em efeitos térmicos. Se a dissipação do calor equivale à geração de calor, não há uma elevação resultante na temperatura, os efeitos que podem ocorrer são denominados não térmicos. Os efeitos térmicos e não térmicos não ocorrem de forma isolada no organismo, mas a proporção e a magnitude de cada um deles dependem do ciclo de fornecimento e da densidade da potência de saída do cabeçote. Quanto maior for o ciclo de fornecimento de potência (densidade de potência), maiores serão os efeitos térmicos. A prevalência de efeitos térmicos do US sobre os organismos ocorre nas densidades de potência superiores a 1 W/cm 2, no ciclo de fornecimento em modo contínuo e nas frequências de 1 e 3 MHz. Existem muitas situações em que o US produz efeitos biológicos sem, contudo envolver mudanças significativas da temperatura no local de aplicação [10-12,41]. Chan et al. (2010) [47] realizaram estudo experimental de tendinite em ratos, divididos em cinco grupos de oito animais cada, aplicando frequência de 1 MHz e densidade de potência de 0,5 W/cm 2, demonstraram que o US foi capaz de aumentar a regeneração de fibras musculares após laceração, reduzindo o tempo de cicatrização de 7, 14, 21 e 28 dias. No experimento realizado por Olsson et al. (2006) [39], utilizando 45 ratos em três grupos experimentais com 15 ratos por grupo no tempo de 0, 48, 96 e 144 h após a intervenção cirúrgica, com aplicação de densidade de potência de 1 W/cm 2, frequência de 1 MHz nos modos contínuo e pulsado, e estimulação ultrassônica pulsada em ratos submetidos a celiotomia, mostrou maior proporção volumétrica de células mononucleares e fibroblastos no grupo pulsado quando comparado com o grupo controle e com o grupo que recebeu