M. arvensis is recommended the use of leaf explants and concentration of 2 mg L -1 2,4- D. Keywords: Mentha arvensis L., culture medium, calogenesis.

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1 Indução de calos em Menta-japonesa a partir de diferentes explantes e concentrações de 2,4-D Andreisa Fabri Lima 1 ; Andreísa Flores Braga 1 ; Sâmia Torres Silva 1 ; Suzan Kelly Vilela Bertolucci 1 ; José Eduardo Brasil Pereira Pinto 1 Ivan Caldeira Almeida Alvarenga 1. 1 Universidade Federal de Lavras, Cx Postal 37, Lavras, MG, CEP , andreisafabrilima@yahoo.com.br, andreisaflores@hotmail.com, samiatorres.agronomia@gmail.com, suzan@dag.ufla.br, jeduardo@dag.ufla.br, pytchouai@yahoo.com.br RESUMO Mentha arvensis L. - Lamiaceae, conhecida como hortelã-japonesa, menta-japonesa ou hortelã-doce é uma planta de largo uso medicinal. Objetivou-se com este trabalho a indução de calos em explantes foliares e internodais de M. arvensis utilizando diferentes concentrações de 2,4-D. Os explantes foram inoculados em meio de cultura MS, suplementado com 3% de sacarose, 0,5 mg L -1 de BAP e diferentes concentrações de 2,4-D (0-controle; 1; 2; 3 e 4 mg L -1 ). O meio de cultura foi solidificado com 0,6% de ágar, o ph foi ajustado para 5,7±0,1. Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial de 2 x 5, sendo dois tipos de explante e cinco concentrações de 2,4-D, tendo 5 repetições com 5 tubos por repetição. Aos 30 dias, avaliaram-se as porcentagens de sobrevivência, tamanho (cm) e biomassa seca (mg) de calos. Para indução de calogênese em M. arvensis recomenda-se o uso de explantes foliares e concentração de 2 mg L -1 de 2,4-D. PALAVRAS-CHAVE: Mentha arvensis L., calogênese, meio de cultura. ABSTRACT Callus induction in Mint-Japanese from different explants and concentrations of 2,4-D Mentha arvensis L. - Lamiaceae, known as mint-japanese or peppermint candy is a plant-wide medical use. The objective of this study was callus induction in leaf and internode explants of M. arvensis using different concentrations of 2,4-D. The explants were cultured on MS medium supplemented with 3% sucrose, 0.5 mg L -1 BAP and different concentrations of 2,4-D (control-0, 1, 2, 3 and 4 mg L -1 ). The culture medium was solidified with 0.6% agar, ph was adjusted to 5.7±0.1. We used a completely randomized factorial 2 x 5, two types of explant and five concentrations of 2,4-D with 5 repetiton with 5 tubes per replicate design. After 30 days were evaluated the percentages of survival, size (cm) and dry weight (mg) of callus. For induction of callus formation in S007

2 M. arvensis is recommended the use of leaf explants and concentration of 2 mg L -1 2,4- D. Keywords: Mentha arvensis L., culture medium, calogenesis. A Mentha arvensis L., popularmente conhecida como hortelã-japonesa, menta-japonesa ou hortelã-doce, é uma planta medicinal e aromática pertencente à família Lamiaceae. Assim como a maior parte das espécies medicinais cultivadas no mundo, é exótica, domesticada em seus ecossistemas naturais e apresenta características de plantas heliófitas. Seu óleo essencial (frações líquidas e voláteis que contêm as substâncias responsáveis pelo aroma das plantas) é produzido em glândulas especializadas presentes nas folhas e flores e constituem-se uma rica fonte de mentol. Os óleos essenciais das mentas e seus componentes são amplamente empregados em produtos aromatizantes de uso oral (Martins et al, 1997), tais como cremes dentais, anti-sépticos bucais, antiácidos, pastilhas refrescantes, gomas de mascar, licores e cigarros. Servem à confecção de sabonetes, loções, cremes de barbear, perfumes e medicamentos. Além disso, apresentam aplicações na indústria alimentícia, como aromatizantes de alimentos e bebidas e flavorizantes. Também apresentam função fungicida e são utilizados na medicina popular no tratamento de distúrbios digestivos e verminoses, exercem ação tônica e estimulante sobre o aparelho digestivo, além de propriedades anti-sépticas e ligeiramente anestésicas, o que lhe confere uma grande importância econômica. A demanda mundial por óleos essenciais de qualidade é enorme, havendo cerca de 300 óleos essenciais de importância comercial no mundo, dentre esses se citam os óleos de plantas do gênero Mentha. O mercado mundial de óleos essenciais gira em torno de US$ 15 milhões/ano, apresentando crescimento aproximado de 11% por ano. O Brasil destaca-se na produção mundial de óleos essenciais, especialmente de frutos cítricos, mas sofre de problemas crônicos como falta de manutenção do padrão de qualidade (Bizzo et al., 2009). A disponibilidade e interação de auxinas e citocininas no meio de cultura levam ao crescimento e morfogênese in vitro, tendo uma importante influencia na formação das raízes, parte aérea e calo em cultura de tecidos. O efeito fisiológico depende da concentração de cada regulador no meio, sendo que cada parte da planta tem uma resposta diferente às alterações das concentrações de auxinas e citocininas (Pozo et al., S008

3 2005). Na propagação in vitro a composição e a concentração dos reguladores de crescimento no meio de cultura são fatores determinantes para o crescimento e padrão de desenvolvimento da maioria dos sistemas de cultivo in vitro (Costa, 2006). O crescimento de calos é desejável para induzir variação somaclonal e estudos fisiológicos, principalmente quando se deseja relacionar a presença de metabólitos secundários com o crescimento celular. Vários fatores interferem na calogênese, tais como o tamanho do explante, composição do meio de cultura, reguladores de crescimento, órgão fornecedor do explante, idade e época do ano em que o explante é colhido e genótipo da planta doadora (Cerqueira et al., 2002). George (1996) comenta que o 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) tem efeito no metabolismo do RNA, induzindo a transcrição de RNAs mensageiros capazes de decodificar proteínas para o crescimento e que podem induzir a proliferação celular desordenada. Objetivou-se a indução de calos de Mentha arvensis a partir da interação entre o efeito da auxina 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) em diferentes dosagens com diferentes fontes de explantes. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi realizado no Laboratório de Cultura de Tecidos e Plantas Medicinais da Universidade Federal de Lavras, Lavras-MG. Os explantes (folhas e segmento internodais) foram oriundos de plantas estabelecidas in vitro. Os explantes foliares foram cortados em tamanhos de aproximadamente 1,0 cm 2 e os internodais com 1 cm. Em seguida, ambos foram inoculados em tubos de ensaio contendo 10 ml de meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962), suplementado com 3% de sacarose, 0,5 mg L -1 de BAP e diferentes concentrações de 2,4-D (0- controle; 1; 2; 3 e 4 mg L -1 ). O meio de cultura foi solidificado com 0,6% de ágar, o ph foi ajustado para 5,7±0,1 e autoclavado a 120ºC e 1 atm de pressão por 20 min. Após a inoculação, os tubos foram fechados com tampas plásticas e vedados com parafilme, sendo mantidos em sala de crescimento com fotoperíodo de 16 h luz/8 h escuro, sob intensidade luminosa de 25 μmol m -2 s -1, à temperatura de 26±0,1ºC. Aos 30 dias, avaliaram-se as porcentagens de sobrevivência de calos, tamanho (cm) e biomassa seca (mg) de calo. Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial de 2 x 5, sendo dois tipos de explante e cinco concentrações de 2,4-D, S009

4 tendo cinco repetições com 5 tubos por repetição. Os dados observados foram submetidos à análise de variância (p<0,05%) e de regressão e, quando significativos, elaboradas as curvas de regressão. As análises foram realizadas pelo software Sisvar, versão 5.0 (Ferreira, 2007). RESULTADOS E DISCUSSÃO A calogênese iniciou-se 10 dias após a inoculação em meios suplementados com 2,4-D, com formação de calos compactos de coloração verde. A interação não foi significativa para a variável sobrevivência, esta apresentou significância apenas quando avaliada individualmente. Para o segmento foliar uma maior concentração de 2,4-D, 4 mg L -1, pode ter ocasionado um efeito fitotóxico nos explantes, visto que estes apresentaram uma menor porcentagem de sobrevivência, 68%. De maneira geral, segmentos internodais expressaram alta taxa de sobrevivência em todos os tratamentos suplementados com regulador de crescimento independente da dosagem utilizada. Ressalta-se que, tanto os segmentos foliares quanto os intermodais, quando inoculados em meio de cultura na ausência de 2,4-D resultaram em 100% de necrose sem indução de calos. A indução de calos normalmente necessita de suplementação de regulador de crescimento e uma injúria física. Aos 30 dias após a inoculação, houve formação de calos nos dois tipos de explantes utilizados, estes exibiram comportamentos diferentes para as variáveis comprimento e biomassa seca de calos (Figura 1). O comprimento de calos inferiu um comportamento quadrático para ambos explantes. (Figura 2 A). Entretanto, as respostas foram opoentes em relação à concentração de regulador. Em explantes foliares o comprimento de calos foi crescente até a concentração de 2 mg L -1 com valor máximo de 1,04 cm. Enquanto que nos explantes internodais houve decréscimo do comprimento de calos com o aumento da concentração de regulador, na concentração de 3,13 mg L -1 ocasionou comprimento mínimo de 0,75 cm. No trabalho de Flores et al. (2006) observaram que segmentos nodais e raízes de Pfaffia tuberosa (Spreng.) Hicken., apresentaram melhores respostas quanto a proliferação de calos friáveis e morfogênese em relação aos segmentos foliares. Esta diferença mostra o quanto à espécie influencia nas respostas morfogenéticas. Já para a biomassa seca de calos, os segmentos apresentaram comportamentos diferentes (Figura 2 B). Para as folhas o comportamento foi cúbico com acumulo S0010

5 máximo de massa seca de 25,6 mg na concentração de 1,62 mg L -1 de 2,4-D. Na dosagem de 3,22 mg L -1 o acumulo foi mínimo de biomassa seca, 17,5 mg. Já os segmentos internodais apontaram comportamento quadrático com biomassa seca mínima de 4 mg na concentração de 4,83 mg L -1 de 2,4-D. Estes resultados coincidiram parcialmente com o de Castro et al. (2009) obtiveram maiores valores de matéria seca de calos de Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville em meios suplementados com 2 mg L -1 e 4 mg L -1 de 2,4-D. Com os resultados observados pela analise de regressão e interpretação dos gráficos, recomenda-se para o estabelecimento in vitro de calos de Mentha arvensis, a utilização de explantes foliares e concentração de 2,0 mg L -1 do regulador 2,4-D. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao CNPq, FAPEMIG e CAPES, pelo apoio de bolsas (de estudo, produtividade e apoio técnico) e suporte financeiro. REFERÊNCIAS BIZZO, H.R., HOVELL, M.C., REZENDE, C.M. Óleos essenciais no Brasil: aspectos gerais, desenvolvimento e perspectivas. Quim.Nova, Vol. 32, No. 3, , CASTRO, A. H. F.; PAIVA, R.; ALVARENGA, A. A. de, VITOR, S. M. M. Calogênese e teores de fenóis e taninos totais em barbatimão [Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville]. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 33, n. 2, p , mar./abr., CERQUEIRA, E. S.; PINTO, J. E. B. P.; MORAIS, A. R. de; CASTRO, N. E. A. de; CARDOSO, M. DAS G.; LAMEIRA, O. A. Indução de calos em erva-de-touro (Tridax procumbens L.) utilizando diferentes reguladores de crescimento e tipos de explantes. Ciência agrotecnologia, Lavras, v. 26, n.2, p , mar./abr., COSTA, A. S Sustentabilidade da produção de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.): micropropagação visando à conservação in vitro. Aracaju: Universidade Federal de Sergipe. 56f (Dissertação de Mestrado) FERREIRA, D. F. SISVAR: sistema de análise de variância versão 5.0. Lavras: Departamento de Ciências Exatas, FLORES, R.; NICOLOSO, F. T.; VASCONCELLOS, N. J. S. Indução de calos e aspectos morfogenéticos de Pfaffia tuberosa (Spreng.) Hicken. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, Botucatu, v. 8, n. 3, p , GEORGE, E. F. Plant propagation by tissue culture: part 1: the technology. Edington: Exegetics, p. S0011

6 MARTINS, E. R.; CASTRO, D. M.; CASTELLANI, D. C.; DIAS, J. E. Plantas medicinais.viçosa, MG: UFV, p. MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, v. 15, p , POZO, J. C. D.; LOPEZ-MATAS, M. A.; RAMIREZ-PARRA, E.; GUTIERREZ, C. Hormonal control of the plant cell cycle. Biologia Plantarum, v. 123, p , S0012

7 Figura 1: Calos provenientes de segmentos nodais e internodais de Mentha arvensis aos 30 dias de cultivo. (Callus from nodal and internodal segments of Mentha arvensis after 30 days of culture). UFLA, Lavras, MG, S0013

8 Figura 2: Influência das concentrações de 2,4 D e diferentes explantes na produção de calos de Mentha arvensis. A-comprimeno de calos. B-Biomassa seca de calos. (Influence of 2,4-D concentrations and different explants in the callus production of Mentha arvensis. A- callus-length. B-dried biomass callus.). UFLA, Lavras, S0014