Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 2068

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1 Fungos em sementes importadas de plantas olerícolas e ornamentais Thaís F Cordeiro 1,* ; Guilherme C Gouvea 1,* ; Camila S Machado 1,* ; Vanessa M A Goulart 1,** ; Carolina C Teixeira 1,** ; Paulo S T Brioso 1,* 1 UFRRJ/ IB/ Laboratório Oficial de Diagnóstico Fitossanitário (L.O.D.F.), CP 74585, , Seropédica, RJ, thafe01@gmail.com; guilhermegouvea@ig.com.br; camila-machado20@hotmail.com; nessa_mayra@hotmail.com; carolcarvalho.t@gmail.com; brioso@bighost.com.br. RESUMO No Brasil, o mercado de plantas olerícolas e ornamentais tem apresentado fluxo crescente, na demanda ou na produção das mesmas e, grande parte das sementes utilizadas são importadas por firmas multinacionais. Objetivando verificar a sanidade das sementes importadas de plantas olerícolas e ornamentais, relativo a , recebidas para a análise fitossanitária no L.O.D.F. e identificar/ isolar os fungos fitopatogênicos associados às mesmas, procedemos ao Blotter Test, observação/ identificação dos fungos ao microscópio estereoscópico e ótico, isolamento em meio de cultura (BDA), extração do DNA a partir de micélio. Das amostras recebidas correspondentes a 123 espécies botânicas oriundas da África do Sul,, Austrália, Chile, China, Dinamarca, Espanha, Estados Unidos,,, Itália, Japão, Peru, Tailândia, Taiwan verificamos que em alguns lotes a presença de 16 espécies fúngicas associadas às sementes. Embora o nível de sanidade das sementes tenha sido bem elevado, a presença dos fungos, oriundos de outros países, indica a necessidade da adoção de medidas de controle imediatas e eficazes interligado a um sistema de diagnose mais específico (por exemplo, molecular), de forma a minimizar a possível disseminação destes fitopatógenos (raças exóticas) e de possíveis danos econômicos a este crescente e importante mercado no país. Palavras-chave: Fitopatógenos, Patologia de Semente, Blotter Test ABSTRACT Fungi on imported seeds of vegetables and ornamental plants In Brazil, the market for vegetables and ornamental plants has shown increasing flow demand or production thereof, and most of the seeds used are imported by multinational firms. To ascertain the health of imported seed of vegetables and ornamentals plants, on , received for phytossanitary analysis in LODF and identify/isolate pathogenic fungi associated with them, proceeded to the Blotter Test, observation / identification of fungal to the optical and stereoscopic microscope, isolation in culture medium (PDA) and DNA extraction from mycelium. The received samples corresponding to 123 plant species originating from South Africa, Germany, Australia, Chile, China, Denmark, Spain, United States, France, Holland, Italy, Japan, Peru, Thailand, Taiwan found that in some samples the presence of 16 fungal species associated with seeds. Although the level of seed health has been very high, the presence of fungi, from other countries indicates the need to adopt control measures immediate and effective system interconnected to a more specific diagnosis (eg, molecular) of to minimize the potential spread of these pathogens (exotic races) and possible economic damage to this growing and important market in the country. Keywords: Phytopathogens, Seed Pathology, Blotter Test Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 2068

2 Considerando que o mercado de sementes envolve a movimentação de milhões de dólares e há um potencial risco de introdução de espécies/ raças de fungos fitopatogênicos (exóticos ou não) no país tem-se que trabalhos envolvendo aspectos relacionados a patologia de sementes importadas são necessários e atuais, proporcionando desta forma uma rápida decisão na estratégia de controle à ser adotada de forma a minimizar ou eliminar possíveis perdas econômicas além do que tem potencial de gerar conhecimento relevante para a geração, a absorção, a introdução e a difusão de inovação tecnológica e produto biotecnológico, para fortalecer o desempenho científico e tecnológico do país e aumentar a competitividade internacional da pesquisa brasileira. Por exemplo, o uso de técnicas moleculares na patologia de sementes é praticamente inexistente, no país, em função da ausência de disponibilidade de kit diagnóstico no mercado bem como de informações relevantes sobre os fungos a nível de espécie ou mesmo a nível de raça nas sementes das espécies botânicas tradicionalmente importadas. Desta forma, objetivou-se identificar e extrair o DNA dos fungos associados a sementes de espécies botânicas de olerícolas e ornamentais importadas de diversos países recebidos pelo Laboratório Oficial de Diagnóstico Fitossanitário da UFRRJ. MATERIAL E MÉTODOS OBTENÇÃO E ANÁLISE DE SEMENTES As sementes utilizadas foram as regularmente recebidas (Tabela 1) pelo Laboratório Oficial de Diagnóstico Fitossanitário (L.O.D.F.) da UFRRJ, no período de janeiro de 2010 a maio de 2012, e a análise preliminar, feita através da observação direta das amostras ao Microscópio Estereoscopio Wild após o Teste de Blotter Test e/ou pelo Teste de Isolamento em meio de cultura conforme descrito no Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento (2009) e no ISTA (2012). Sendo a identificação morfológica das estruturas fúngicas, após coleta com estilete, feita no microscópio ótico binocular Olympus CX40 (200 X) montadas em lâmina de vidro, coberta de lamínula de vidro, na presença de lactofenol de Amann acrescido de azul de algodão 0,1% (p/v). após o Teste de Blotter Test e/ou pelo Teste de Isolamento em meio de cultura conforme descrito no Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento (2009) e no ISTA (2012). Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 2069

3 EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA TOTAL DOS FUNGOS Para a extração do DNA, foram retirados 100 mg de micélio fúngico sendo depositados em almofariz estéril e pulverizado, com o auxílio de pistilo estéril, sob nitrogênio líquido adicionando-se em seguida 400 µl de tampão fornecido no Dneasy Plant Mini Kit (Qiagen Brasil) seguindo-se, posteriormente, instruções do fabricante. O DNA total foi dosado em espectrofotômetro de luz ultravioleta sendo diluído a uma concentração final de 20 ng.µl -1. RESULTADOS E DISCUSSÃO Na Tabela 1, através da metodologia adotada, estão indicadas as sementes das 123 espécies botânicas e os fungos associados, tais como: Alternaria alternata, Alternaria brassicae, Alternaria brassicicola, Alternaria dauci, Alternaria porri, Aspergillus sp., Bipolaris sorokiana, Curvularia sp., Didymella bryoniae, Fusarium solani, Lewia sp., Nigrospora sp., Penicillium sp., Pestalotiopsis sp., Rhizopus sp., Stemphyllium botryossum. Foi possível fazer a extração do DNA das amostras fúngicas que será utilizado para teste molecular como o de PCR (Polymerase Chain Reaction). Embora o nível de sanidade das sementes tenha sido elevado, a presença de fungos, oriundo de outros países, indica a necessidade da adoção de medidas de controle imediatas e eficazes interligado a um sistema de diagnose mais específico (por exemplo, molecular), de forma a minimizar a possível disseminação destes fitopatógenos (raças exóticas) e de possíveis danos econômicos a este crescente e importante mercado no país. REFERÊNCIAS INTERNATIONAL SEED TESTING ASSOCIATION (ISTA) Seed Health Testing Methods. In: INTERNATIONAL SEED TESTING ASSOCIATION (eds.). International Rules for Seed Testing. Edition Bassersdorf: ISTA. p MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO Manual de Análise Sanitária de Sementes. Brasília: Mapa/ACS. 200p. Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 2070

4 Tabela 1. Lista das sementes de espécies botânicas/ país e fungos associados (List of seeds of plant species/country and fungi associated) ESPÉCIE BOTÂNICA PAÍS FITOPATÓGENO*** Abelmoschus esculentus Ageratum houstianum Ageratum mexicanum X A. houstianum Allium cepa, Africa do Sul, Argentina, Austrália,,, Itália, Allium cepa Alternaria porri Allium cepa África do Sul Fusarium sp.; Rhizopus sp. Allium cepa Fusarium sp.; Rhizopus sp. Allium cepa Dinamarca Fusarium solani Allium cepa África do Sul Fusarium solani Allium cepa Itália Fusarium solani Allium cepa Australia Fusarium solani Allium fistulosum, Itália, Allium fistulosum Itália Alternaria porri Allium porrum Alyssum saxatile Anethum graveolens Anthriscus cerefolium Antirrhinum majus Italia Antirrhinum majus Fusarium solani Apium graveolens Italia Apium graveolens Alternaria porri Artemisia absinthium Artemisia dracunculus Alternaria alternata Arthemisia absinthus Asparagus officinalis Axonopus affinis Austrália Curvularia sp. Barbarea verna Begonia semperflorens-cultorum Bellis perennis Beta vulgaris Beta vulgaris Alternaria alternata Brassica chinensis Brassica juncea Brassica oleracea Japão, Dinamarca, Itália, Brassica oleracea Fusarium solani Brassica oleracea Dinamarca Alternaria brassicicola Brassica oleracea var. acephala Brassica oleracea var. botritys Brassica oleracea var. capitata, Chile,, Japão Itália, Japão, Brassica oleracea var. capitata Japao Chaetomium sp. Brassica oleracea var. capitata Japao Fusarium solani Brassica oleracea var. italica Chile, Itália, Japão, Brassica oleracea var. italica Japão Alternaria brassicae Brassica pekinensis Japao Alternaria alternata Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 2071

5 Brassica pekinensis Japão Calendula officinalis Alternaria alternata Calendula officinalis Calendula officinalis Alternaria alternata Callistephus chinensis Fusarium solani Callistephus chinensis Alternaria alternata Callistephus chinensis Alternaria alternata Capsicum annuum Fusarium solani Capsicum annuum Chile, China, Itália, Capsicum annuum Chaetomium sp. Capsicum annuum Tailandia Fusarium solani Capsicum frutescens, Itália Carica papaya Taiwan Carica papaya Taiwan Pestalotiopsis sp. Catharanthus roseus Celosia argentea Celosia cristata Fusarium solani Celosia cristata Celosia plumosa Centaurea cyanus Alternaria alternata Centaurea spp. Chrysanthemum carinatum Chrysanthemum carinatum Alternaria alternata Chrysanthemum leucanthemum Chrysanthemum maximum Alternaria alternata Cichorium endivia Chile, China, Cichorium intybus Italia Cineraria maritima X Senecio cinerae Citrullus lanatus Penicillium sp. Citrullus lanatus Aspergillus sp. Citrullus lanatus Citrullus vulgaris Consolida ambigua Convolvulus tricolor Convulvolus tricolor Penicillium sp. Coreopsis verticilata Coriandrum sativum Alternaria alternata Coriandrum sativum Cosmos bipinatus X Bidens bipinatus Cosmos bipinnatus Cucumis melo China, Espanha, Israel, Peru, Tailândia Cucumis melo Israel Chaetomium sp. Cucumis melo Lewia sp. Cucumis melo Espanha Didymella bryoniae Cucumis melo China Didymella bryoniae Cucumis sativus Chile, China,, Itália, Japão, Cucumis sativus Didymella bryoniae Cucurbita maxima Japao Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 2072

6 Cucurbita moschata Japão, Cucurbita moschata Aspergillus sp.; Penicillium sp. Cucurbita moschata Japão Cucurbita moschata x C. maxima Japao Cucurbita pepo Chile, China, Cucurbita pepo Rhizopus sp. Cucurbita pepo Alternaria brassicicola Cuminum cyminum Cynodon dactylon Dreschera sp. Cynodon dactylon Alternaria alternata; Bipolaris sorokiana Dahlia chinensis Dahlia pinnata Fusarium solani Dahlia pinnata Dahlia variabilis Fusarium solani Daucus carota Italia Alternaria dauci Daucus carota Italia Alternaria alternata Daucus carota Alternaria dauci Daucus carota Alternaria dauci Daucus carota Delphinium consolida Dianthus barbatus Dianthus caryophyllus, Dianthus caryophyllus Fusarium solani Dianthus caryophyllus Fusarium solani Dianthus chinensis Dianthus chinensis Alternaria alternata; Fusarium solani Dianthus chinensis Fusarium solani Dianthus chinensis X D. barbatus Digitalis purpurea/d.lanata Dimorphoteca sinuata/venidium fastuosum Dimorphotheca sinuata Dorotheanthus berllidiformis Eruca sativa Italia Eschischolzia californica Eucalyptus gunii Foeniculum vulgare Fusarium solani Foeniculum vulgare X Pimpinela anisum Alternaria alternata Foeniculum vulgare X Pimpinela anisum Fragaria vesca Penicillium sp. Fragaria vesca Gazania rigens Gypsophila elegans, Helianthus annus Penicillium sp.; Rhizopus sp. Helianthus annuus Helichrysum bracteatum Aspergillus sp. Helichrysum bracteatum Hypericum moserianus Hyssopus officinalis Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 2073

7 Impatiens balsamina Ipomoea purpurea Fusarium solani Ipomoea violacea/i. horsfalliae/i.purpurea Lactuca sativa Chile,, Itália, Lactuca sativa Alternaria alternata Lathyrus odoratus, Lavandula officinalis Alternaria alternata Lavatera trimestris Lavatera trimestris Lens culinaris Austrália Alternaria alternata Limonium latifolium Lobularia maritima, Lupinus polyphyllus Fusarium solani Lycopersicon esculentum China,, Peru, Tailândia, Taiwan, Lycopersicon esculentum Israel Fusarium solani Lycopersicon esculentum Japao Penicillium sp. Lycopersicon esculentum China Fusarium solani Lycopersicon esculentum Tailandia Fusarium solani Lycopersicon esculentum Peru Fusarium solani Mathiola incana Alternaria alternata Matricaria chamomila Medicago sativa Austrália Stemphyllum botryossum Melissa officinalis Mentha piperita Miralabis jalapa Myosotis alpestris Nemesia strumosa Ocimum basikicum Ocimum basilicum maximum Ocimum sp. Rhizopus sp. Origamum vulgare/o. majorana Origanum vulgare Papaver nudicaule Papaver nudicaule/ P. bracteatum Papaver nudicaule/ P.bracteatum Alternaria alternata Papaver orientale Pelargonium hortorum Pentas lanceolata Petroselinum crispum, Italia, Petroselinum crispum Italia Alternaria alternata Petroselinum crispum Pestalotiopsis sp. Petroselinum crispum Italia Alternaria alternata Petroselinum crispum Alternaria alternata Petunia x hybrida Phaseolus vulgaris Phaseolus vulgaris Phlox drummondi, Phlox drummondi Fusarium solani Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 2074

8 Phlox drummondii Fusarium solani Phlox drummondii Chaetomium sp. Portulaca grandiflora Portulaca grandiflora Fusarium solani Primula elatior Penicillium sp. Primula veris/p.obconica/ P. polyantha Raphanus sativus Itália, Raphanus sativus Alternaria alternata Raphanus sativus Italia Aspergillus sp. ***Espécie botânica sem indicação de fitopatógeno = nenhum fungo encontrado no lote analisado AGRADECIMENTOS Ao *CNPQ e ao **SINTEEG/ UFRRJ pela concessão de apoio financeiro (bolsa). Hortic. bras., v. 30, n. 2, (Suplemento - CD Rom), julho 2012 S 2075