essa edição da revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, publicamos no encarte especial dois importantes artigos.

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1 essa edição da revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, publicamos no encarte especial dois importantes artigos. Melancia sem sementes apresenta uma nova modalidade de produção de grande interesse científico, uma vez que mostra uma nova tecnologia que poderá, também, vir a ser de grande interesse econômico. Modelos Animais de Doenças Humanas é um tema cada vez mais importante na compreensão da patogenicidade de várias doenças. O excelente artigo é destinado à todos os pesquisadores da área. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento Encarte Especial 89

2 MELANCIA AGRICULTURA SEM SEMENTES Flávio de França Souza 1 Manoel Abilio de Queiróz 2 Rita de Cássia de Souza Dias 3 DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE HÍBRIDOS TRIPLÓIDES EXPERIMENTAIS DE MELANCIA 1 Eng. Agrônomo, Mestrando Bolsista UFRPE/CNPq, fsfranca@yahoo.com 2 Eng. Agr. Ph.D. em Genética e Melhoramento de plantas, Embrapa SemiÁrido, mabilio@cpatsa.embrapa.br 3 Eng. Agr. M.Sc. em Fitossanidade, Embrapa SemiÁrido, ritadias@cpatsa.embrapa.br Fotos cedidas pelos autores melancia, Citrullus lanatus (Thunb) Mansf., é cultivada em vários países do mundo, sendo sua produção mundial de, aproximadamente, 23 milhões de toneladas de frutos (Doorenbos & Kassam, 1994). No Brasil, em 1994, a área plantada foi de cerca de hectares (ANUÁRIO ESTATÍSTICO DO BRASIL, 1994). Nos últimos anos, temse observado o crescimento da participação das cultivares sem sementes no mercado de melancia. Nos Estados Unidos, até 1991, a melancia sem sementes ocupava cerca de 5% do mercado de seu fruto, com estimativa de ter potencial para ocupar de 15% a 50% (Marr & Gast, 1991). Atualmente estimase que o mercado da melancia sem sementes naquele país seja de 20%. No Brasil, a produção de melancia sem semente é incipiente. A primeira melancia híbrida sem sementes de que se tem notícia foi produzida em 1947, no Japão, sendo que os primeiros estudos se iniciaram ainda na década de 30. No entanto, o conceito de melancia sem sementes só foi bem descrito na literatura científica em 1951, com a publicação do trabalho de H. Kihara (Eighst, 1971). Desde então, vários trabalhos foram conduzidos em diversas partes do mundo, visando à obtenção da melancia sem sementes ou estimulando a produção comercial dela. No Brasil, a primeira tentativa, de que se tem registro, de se desenvolverem cultivares de melancia sem sementes foi realizada pela Embrapa Hortaliças, no início da década de 90, em convênio com centros de pesquisa do Japão (Tasaki, 1991). Desde o final de 1996, a Embrapa SemiÁrido vem estudando a obtenção de híbridos experimentais de melancia sem sementes, a partir do desenvolvimento de linhas tetraplóides e diplóides de melancia. Foto 1: Planta diplóide (esquerda) e tetraplóide (direita) de melancia Mecanismos genéticos envolvidos na ausência de sementes nos frutos de melancia Os frutos sem sementes, em melancia, são obtidos em plantas triplóides (3x=2n=33), híbridas, oriundas do cruzamento de uma planta diplóide (2x=2n=22) com uma planta tetraplóide (4x=2n=44) (Kihara, 1951). No caso das plantas normais, diplóides, a separação dos cromossomos homólogos na meiose geralmente resulta em dois conjuntos de 11 cromossomos que vão para os pólos opostos da célula, originando quatro gametas com 11 cromossomos. Na meiose dos triplóides, o número de cromossomos que migram para um pólo ou outro é variável, de maneira que são formados gametas com número de cromossomos que varia de 11 a 22. As células com número cromossômico compreendido dentro desse intervalo originarão gametas inviáveis e, portanto, óvulos que não poderão ser fecundados. Desse modo, não haverá formação de sementes, mas apenas rudimentos brancos, facilmente comestíveis. Apenas haverá formação de sementes verdadeiras quando ocorrerem óvulos com, exatamente, 11 ou 22 cromossomos. Há estimativas de que a freqüência de gametas viáveis, em frutos triplóides de melancia, é de um em 1000 (Kihara, 1951). Na 90 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento Encarte Especial

3 Tabela 1 Avaliação de características morfológicas em plantas de melancia para a identificação de indivíduos tetraplóides. PetrolinaPE, LF 1 (cm) 16,37 cd 2 19,63 b 19,80 b 18,27 bc 17,27 bcd 17,97 bcd 16,27 cd 17,90 bcd 17,57 bcd 18,50 bc 16,60 cd 23,43 a 23,33 a 15,27 d CF (cm) 15,20 bc 15,27 bc 15,83 abc 15,00 bc 16,57 abc 16,60 abc 15,67 abc 16,87 abc 16,20 abc 17,93 a 15,20 bc 17,60 ab 17,97 a 14,37 c LF/CF 1,08 1,28 1,26 1,22 1,04 1,08 1,04 1,06 1,09 1,03 1,09 1,34 1,30 1,06 DP (mm) 5,21 fg 6,88 abc 6,49 bcde 6,58 bcd 5,54 defg 5,41 efg 4,91 g 5,13 fg 5,45 efg 6,10 cdef 5,91 cdefg 7,89 a 7,55 ab 5,47 efg DC (mm) 5,40 d 7,21 abc 7,82 a 7,65 ab 5,41 d 5,22 d 5,08 d 4,87 d 6,20 bcd 6,25 bcd 5,80 cd 7,97 a 8,25 a 5,18 d CI (cm) 10,00 ab 10,00 ab 10,30 ab 10,05 ab 9,20 ab 10,20 ab 10,33 ab 11,67 a 11,20 ab 10,60 ab 9,68 ab 10,57 ab 7,61 b 10,10 ab NC/E 11,27 b 20,10 a 20,23 a 20,80 a 11,23 b 11,40 b 11,10 b 11,70 b 11,67 b 11,77 b 11,37 b 20,57 a 20,37 a 11,30 b NMS / LF = Largura da Folha; CF = Comprimento da Folha; LF/CF = Relação largura/comprimento da Folha; DP = Diâmetro do Pecíolo; DC = Diâmetro do Caule; CI = Comprimento de interno; NC/E = Número de Cloroplastos por Estômatos; NMS = Número Médio de Sementes. 2/ As médias com mesma letra, na coluna, não apresentaram diferença estatística pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. prática, pouquíssimas sementes normais são encontradas em frutos triplóides. Técnicas para obtenção de híbridos triplóides O desenvolvimento de híbridos triplóides envolve duas etapas básicas. A primeira é a obtenção das plantas tetraplóides, que compreende: a indução de poliploidia em plantas diplóides e a identificação das plantas tetraplóides resultantes. A segunda é a hibridação das plantas tetraplóides com plantas diplóides, para obtenção das sementes triplóides. A indução de poliploidia em melancia geralmente envolve a quebra da seqüência normal de acontecimentos na mitose por aplicação da colchicina. Essa substância evita a formação das fibras do fuso acromático durante a divisão celular. Desse modo, os cromossomos, após terem sido duplicados, não se movimentam para os pólos da célula. Com a formação da membrana nuclear, a célula fica com o dobro do número de cromossomos que possuía no início do ciclo (Allard, 1971). Em termos práticos, a colchicina tem sido aplicada na gema apical de plântulas ou nas sementes de cultivares diplóides de melancia (Lower & Johnson, 1969). Como nem todas as células são igualmente afetadas pelo antimitótico, além das Foto 2: Frutos tetraplóides. Aspecto externo: LT09 (esquerda) e LT07 (direita) plantas tetraplóides, há geralmente uma expressiva quantidade de plantas que permanecem diplóides ou de plantas que apresentam partes com diferentes níveis de ploidia (quimeras). Fazse necessário, portanto, que se identifiquem as plantas tetraplóides. Entre as técnicas empregadas na determinação do nível de ploidia das plantas, a análise citogenética e a citometria de fluxo apresentam os resultados mais precisos. A análise citogenética é trabalhosa, demandando muito tempo quando há muitas amostras para serem analisadas (Qin & Rotino, 1995). A citometria de fluxo, por outro lado, exige uso de equipamentos sofisticados, nem sempre disponíveis nos centros de pesquisa. A identificação das plantas tetraplóides também pode ser feita com base no tamanho e na viabilidade dos grãos de pólen (Lower & Johnson, 1969), porém essa também é uma técnica trabalhosa, considerandose o grande número de amostras que devem ser avaliadas de cada vez. Técnicas baseadas no tamanho e na densidade dos estômatos foliares e no número de cloroplastos por par de célulasguarda têm sido bastante empregadas. O número médio de cloroplastos por par de célulasguardas de plantas tetraplóides de melancia é geralmente, maior que 19, enquanto a média nas plantas diplóides

4 Tabela 2 Avaliação do nível de ploidia de plantas de melancia através da contagem de cloroplastos por célulaguarda, contagem de cromossomos e testes de progênie. Embrapa SemiÁrido, Petrolina, L7 a L9 Total Número de sementes tratadas com colchicina Número de sementes que germinaram Número de plantas com mais de 13 cloroplastos/estômato foliar Número de plantas que produziram frutos de autofecundação Número de plantas identificadas pelo método citogenético b Número de plantas submetidas ao teste de progênie Número de plantas tetraplóides c a L7 Linhagem 7 e L9 Linhagem 9 b Todas as plantas foram diplóides c Resultado do teste de progênie fica em torno de 11 cloroplastos (McCuiston & Elmstron, 1993; Compton et al., 1996). A contagem de cloroplastos em estômatos da epiderme foliar é uma técnica prática e eficiente, no entanto não possibilita, em plantas recéminduzidas, a diferenciação das quimeras, as quais são identificadas como plantas tetraplóides, mas produzem progênies diplóides. Uma forma simples e prática de identificar as plantas tetraplóides é a observação de características morfológicas. Nas Tabela 3 Evolução da fertilidade em linhagens tetraplóides de melancia em dois ciclos de auto fecundação. Petrolina, PE Linhagens tetraplóides originais 1º ciclo 1 Genótipo LT7 48 LT7 27 LT7 10 LT9 20 LT = autofecundação Nº de sementes (05 08/97) Progênie Nº de sementes Prog. 2 Prog Progênie Prog. 2 Prog. 3 Prog. 4 Prog. 2 Prog. 2 Prog. 3 Prog. 4 Prog. 2 Prog. 2 Prog. 3 Prog. 4 Prog. 5 Prog. 6 2º ciclo (07 10/98) Nº de sementes plantas tetraplóides, as folhas são mais grossas, mais largas e mais arredondadas; os caules são mais largos e as flores são maiores que nas plantas diplóides (Stoner e Johnson, 1964). Além disso, a rama apresenta crescimento lento e menor número de ramificações (Karchi et al., 1981). Os frutos tetraplóides são mais arredondados (Souza et al., 1998) e apresentam auréola (cicatriz das pétalas) mais larga (Andrus et al., 1971). As sementes tetraplóides são mais largas e o número de sementes por fruto é menor do que nas cultivares diplóides (Karchi et al., 1981). Essa técnica é rápida e fácil, o que a torna bastante adequada nos programas de melhoramento de melancia que visam à obtenção de tetraplóides. Nesse caso, é adequado o uso de plantas diplóides da mesma cultivar para possibilitar as comparações entre os genótipos. Obtémse a semente triplóide por meio da polinização controlada. O pólen das plantas diplóides deve ser conduzido ao estigma das flores tetraplóides. O cruzamento recíproco, além de apresentar baixo percentual de pegamento, resulta em poucas sementes por fruto (Kihara, 1951). Entraves da produção da melancia sem sementes A germinação das sementes tetraplóides e triplóides de melancia geralmente é baixa e as plântulas ao germinarem apresentam baixo vigor. A causa desses problemas ainda não está bem esclarecida (Yang e 92 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento Encarte Especial

5 Tabela 4 Avaliação de características quantitativas em frutos de híbridos triplóides experimentais de melancia. Petrolina, Trat Genótipo Tiffany HT71CS HT7125 HT7225 HT9125 HT9225 HT91CS Peso (Kg) 5,14 6,34 6,94 6,48 5,03 5,33 7,42 TSS 1 (ºbrix) 10,9 11,0 10,2 10,1 10,0 9,8 11,0 DF (cm) 21,1 21,5 21,9 23,1 20,3 20,8 23,4 CF (cm) 21,5 23,0 24,2 21,5 21,8 21,9 25,5 EC (cm) 1,1 1,3 1,2 1,2 1,5 1,3 1,5 PO (%) 12,5 100,0 38,0 100,0 40,0 48,0 100,0 PS (%) / TSS Teor médio de sólidos solúveis; DF = Diâmetro médio do Fruto; CF = Comprimento médio do Fruto; EC = Espessura média de casca; PO = Percentagem de frutos ocos; PS = Percentagem de plantas com oídio. Sung, 1994). Porém, muitos estudos têm demonstrado que o fraco desenvolvimento do embrião e a espessa casca da semente são os principais fatores que causam os baixos níveis de germinação em melancia poliplóides (Kihara, 1951). O aumento do tamanho do fruto em melancia é incrementado pelos hormônios promotores do crescimento produzidos pelas sementes em desenvolvimento. No caso das plantas triplóides, esses hormônios devem ser fornecidos pelo pólen. Entretanto, como elas praticamente não apresentam pólen viável, é preciso que sejam plantadas fileiras polinizadoras constituídas de plantas diplóides. Os polinizadores devem ocupar uma área equivalente a, pelo menos, um terço da área plantada com triplóides (Andrus et al., 1971). O ocamento de frutos é uma desordem fisiológica de causa desconhecida. Acreditase que fatores ambientais e de manejo da cultura que contribuem para o crescimento descontínuo do fruto possam aumentar significativamente a incidência de frutos ocados. Os fatores mais freqüentemente mencionados como promotores dessa desordem são: o excesso de fertilizantes nitrogenados, água excessiva e alternância de períodos quentes e frios durante o crescimento dos frutos. Pesquisa em andamento Desenvolvimento dos híbridos triplóides Para indução de poliploidia, foram escolhidas duas linhagens de melancia desenvolvidas na Embrapa SemiÁrido, que são resultantes de um programa de retrocruzamentos. Esse programa teve como objetivo introduzir resistência genética ao fungo causador do oídio (Sphaerotheca fuliginea), que é uma das principais doenças fúngicas das cucurbitáceas no semiárido nordestino. Nele, a cultivar Crimson Sweet, que possui ampla adaptação aos diversos ecossistemas de plantio da melancia, foi utilizada como parental recorrente e compôs, assim, mais de 80% do germoplasma das linhagens obtidas. As duas linhagens escolhidas apresentam boas características agronômicas e são resistentes ao oídio. A linhagem diplóide 07 (LD07) apresenta plantas pouco vigorosas, frutos grandes, com peso acima de 7 kg, padrão de casca tipo Crimson Sweet, polpa vermelha com teor de sólidos solúveis em torno de 11 brix e sementes pequenas, lisas e pretas. A linhagem diplóide 09 (LD09) apresenta plantas vigorosas, prolíficas, de frutos de tamanho médio, com cerca de 6 kg, casca listrada sobre um fundo escuro e reticulado. A polpa é vermelha com teor de sólidos solúveis em torno de 10 brix e sementes pequenas, rugosas e de coloração castanha. No ensaio conduzido na Embrapa SemiÁrido, 100 sementes de cada linhagem foram imersas em solução aquosa de colchicina a 0,2 % por 24 h. As sementes foram plantadas em bandejas de isopor e foram mantidas em casadevegetação. Obtevese uma percentagem média de germinação de 96%. As plântulas resultantes foram avaliadas quanto ao número médio de cloroplastos por estômato da epiderme foliar. Para garantir que todos os indivíduos tetraplóides fossem selecionados, as plantas que apresentaram, em média, mais de 13 cloroplastos por estômato foram selecionadas, uma vez que os indivíduos diplóides geralmente têm, menos de 13 cloroplastos por estômato. De um total de 192 plantas obtidas após a indução de poliploidia, apenas 53 foram identificadas como prováveis tetraplóides, através do método de contagem do número de cloroplastos por par de célulasguardas em estômatos da epiderme foliar. Essas plantas foram transplantadas em campo e autofecundadas. A maioria das plantas apresentou problemas de autoesterilidade, de modo que apenas 33 produziram frutos de polinização controlada. Após a colheita, três sementes de cada fruto foram postas para germinar em placa de Petri para a realização da análise citogenética com base na metodologia Foto 3: Frutos triplóides: T01: Tiffany, T02: HT71CS e T06: HT9225 descrita por Guerra (1988). Das 33 plantas analisadas, 19 tiveram o número de cromossomos determinado por meio da avaliação citogenética, sendo que todas foram diplóides. As 14 plantas que não foram precisamente identificadas pelos métodos anteriores tiveram suas sementes plantadas para a avaliação das progênies. As progênies foram avaliadas quanto às seguintes características morfológicas: forma, espessura e dimensões das folhas; desenvolvimento e número de ramificações do caule; peso de frutos e espessura da casca e ainda número de sementes por fruto. O número de cloroplastos por estômato foliar das progênies também foi avaliado. Plantas diplóides das mesmas linhagens foram plantadas para permitirem a com Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento Encarte Especial 93

6 Foto 4: Fruto triplóide HT7125. Aspecto interno. paração entre as progênies. Durante esse experimento, as progênies foram autofecundadas e cruzadas com plantas diplóides. As plantas das progênies 02, 03, 04, 12 e 13 apresentaram folhas mais espessas, mais arredondadas e de coloração mais intensa. Os caules às vezes se apresentam retorcidos. No início, as ramas apresentaram crescimento lento e menor número de ramificações. As flores eram maiores. Os frutos apresentaram formato mais arredondado, casca mais espessa e menor número de sementes por fruto. As sementes geralmente eram mais largas e de aspecto grosseiro. As progênies 02, 03, 04, 12 e 13 apresentaram número médio de cloroplastos por estômato (NC/E), acima de 20, diferenciandose das outras, que apresentaram, em média, cerca de 11 cloroplastos por estômato foliar. Também naquelas progênies, o diâmetro médio do pecíolo (DP) e o diâmetro médio do caule (DC) foram superiores em relação à maioria das progênies. A medida da largura (LF) e do comprimento (CF) das folhas, isoladamente, não permitiram a diferenciação dos genótipos. Nas cinco progênies, o número médio de sementes por fruto autofecundado variou de 18 a 100, enquanto nas demais foram obtidas de 337 a 733 sementes por fruto. No que tange à relação Largura/Comprimento da folha (LF/CF), observouse que as progênies 02, 03, 04, 12 e 13 apresentaram valores superiores a 1,21, enquanto os demais apresentaram valores inferiores a 1,10 (Tabela 1). As sementes híbridas colhidas nas plantas avaliadas foram semeadas no semestre seguinte e apenas os híbridos das progênies 02, 03, 04, 12 e 13 produziram frutos sem sementes, confirmando a eficiência da observação de algumas características morfológicas e da contagem de cloroplastos na identificação das plantas tetraplóides. Um resumo das principais etapas envolvidas na obtenção das plantas tetraplóides é apresentado na Tabela 2. As progênies 02, 03 e 04 originaramse da linhagem LD07, enquanto as progênies 12 e 13 derivam da linhagem LD09. Esses dois grupos de linhagens tetraplóides (LT07 e LT09) apresentaram características particulares com relação ao aspecto da planta e do fruto. As três progênies da LT07 (LT710, LT727 e LT748) apresentaram plantas pouco vigorosas que produziram de um a dois frutos. Esses frutos eram redondos, às vezes oblongos, de tamanho médio a grande, com peso médio variando de 9,0 a 12,0 kg. A casca apresentou listras verdes largas sobre um fundo claro e uniforme (tipo Crimson Sweet). Os frutos apresentaram polpa vermelha, com teor de sólidos solúveis, que variaram de 11,0 a 12,0 brix, com poucas fibras e sementes de cor castanha e tegumento rugoso. O número de sementes por fruto foi de 32, 55 e 43, respectivamente. As duas progênies da LT09 (LT920 e LT924) apresentaram plantas muito vigorosas, com folhagem abundante e de dois a três frutos por planta. Esses frutos eram redondos de tamanho médio, com peso médio que variou de 5,0 a 7,0 kg, com listras verde largas sobre um fundo escuro e reticulado. Os frutos apresentaram polpa vermelha, com teor médio de sólidos solúveis em torno de 10,0 brix, geralmente fibrosa e com sementes pretas e tegumento liso. O número de sementes por fruto das duas progênies foi 100 e 87, respectivamente. Observouse que as progênies da LT09 apresentaram maior fertilidade (aqui medida pelo número de sementes por fruto) do que a LT07. As plantas do genótipo LT07 apresentaram taxa de pegamento de frutos muito baixa, sendo que foram realizadas mais de 2000 polinizações para se obterem frutos nas três progênies. Em plantas diplóides, geralmente obtémse um fruto a cada cinco autofecundações. As plantas do genótipo LT09 apresentaram melhor taxa de pegamento. As cinco progênies tetraplóides foram submetidas a dois ciclos de autofecundação para multiplicação das sementes e manutenção das linhagens (Tabela 3). No primeiro ciclo de autofecundações, do genótipo LT07, apenas uma planta da progênie LT710 produziu fruto de polinização controlada, com 32 sementes. No genótipo LT09, foram obtidos três frutos de autofecundação na progênie LT924. O número de sementes variou de 61 a 105. A progênie LT920 não apresentou frutos de autofecundação. O segundo ciclo de autofecundação foi realizado no ano seguinte, tomandose as sementes obtidas 94 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento Encarte Especial

7 no ciclo anterior e as sementes das progênies originais, no caso, aquelas que não produziram sementes de autofecundação no primeiro ciclo. O pegamento de frutos foi superior ao observado no primeiro ciclo, nos dois genótipos. Foram obtidos de um a seis frutos de autofecundação por progênie, com elevada variação da fertilidade (Tabela 3). Houve também segregação para outros caracteres como hábito de crescimento e características das folhas. Avaliação de híbridos triplóides experimentais Algumas plantas das duas linhagens tetraplóides foram cruzadas com a cultivar Crimson Sweet e com a linhagem diplóide LD25 do programa de melhoramento de melancia da Embrapa Semi Árido, para a obtenção de híbridos experimentais. O primeiro genótipo é largamente cultivado no Brasil, apresenta frutos grandes, polpa vermelha com elevado teor de açúcares e é suscetível às principais doenças da melancia, no Nordeste. O segundo genótipo apresenta frutos com aspecto semelhante aos do anterior, porém de tamanho médio, com peso na faixa de 6 kg. As plantas são tardias e resistentes ao oídio. Esses genótipos foram escolhidos por apresentarem frutos dentro dos padrões comerciais e serem contrastantes com relação a algumas características, tais como, resistência ao oídio, precocidade e tamanho de fruto. Dos cruzamentos realizados, resultaram seis híbridos experimentais, os quais foram avaliados em campo, com relação ao peso médio de frutos, teor de açúcar, presença de ocamento na polpa e resistência ao oídio. O híbrido triplóide Tiffany foi utilizado como cultivar de referência para as comparações de desempenho dos genótipos. Como pode ser observado na Tabela 4, entre os híbridos experimentais, o peso médio de fruto variou de 5,03 a 7,42 kg e o teor de sólidos solúveis variou de 9,8 a 11,0 brix. Os híbridos que tinham a LT 07 como progenitor apresentaram maior peso de fruto e maior teor de sólidos solúveis. A incidência de ocamento variou de 38% a 100 %. Todos apresentaram alto nível de resistência ao oídio. A cultivar Tiffany apresentou peso médio de 5,14 kg, teor médio de sólidos solúveis de 10,9 brix, 12,5 % de frutos com ocamento e foi bastante suscetível ao oídio. Visão de futuro No caso da melancia sem sementes, o mercado brasileiro é praticamente inexplorado, de modo que essa fruta é um artigo novo nas prateleiras dos estabelecimentos especializados. Acreditase que, uma vez estimulada, por meio de campanhas adequadas, a demanda por esse produto por parte dos consumidores será capaz de motivar a sua produção em terras brasileiras. Para tanto, será necessário colocar á disposição dos produtores cultivares que sejam produtivas, resistentes a doenças e que possuam as características desejadas pelos consumidores, sobretudo com relação ao peso de frutos, cor da polpa e teor de açúcares. É importante ressaltar que, para a produção de híbridos triplóides competitivos, é necessário desenvolver linhas tetraplóides e diplóides com boas características de planta e fruto, bem como resistentes às principais doenças que afetam a cultura da melancia. Entretanto, o desempenho dos híbridos triplóides irá depender da capacidade de combinação das linhas tetraplóides e diplóides disponíveis. Essa característica deverá ser estimada por avaliações experimentais feitas com uma grande quantidade de linhagens. O manejo da cultura deve ser adequado a fim de que se consiga produtividade elevada para tornar a cultura atrativa. É necessário verificar como se comportam os frutos triplóides nos diversos tipos de manejo dos frutos na colheita, póscolheita e transporte a longas distâncias. A germinação das sementes triplóides e o estabelecimento das mudas devem ser estudados e melhorados. O plantio de sementes híbridas de melancia não é muito comum nas áreas de cultivo do país. A adoção generalizada de híbridos triplóides nas regiões produtoras só se dará após a avaliação dos genótipos disponíveis em diferentes ecossistemas e, para tanto, a parceria entre Embrapa Semi Árido, Embrapa Hortaliças e outras organizações será fundamental. Superados os problemas de ajuste da metodologia, principalmente no que diz respeito à obtenção das linhas tetraplóides e á manutenção das linhagens, a meta da Embrapa SemiÁrido é desenvolver, nos próximos anos, híbridos de melancia sem sementes, produtivos, com boas características agronômicas, de planta e se fruto, e resistente às principais doenças da cultura. 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8 PESQUISA GENÉTICA DE CAMUNDONGOS MODELOS ANIMAIS DE DOENÇAS HUMANAS Ana Lúcia Brunialti Godard Profa. Adjunta do Depto. de Biologia Geral ICB Universidade Federal de Minas Gerais UFMG JeanLouis Guénet Diretor Científico e Chefe do Laboratório de Genética de Mamíferos do Instituto Pasteur de Paris França guenet@pasteur.fr Fotos cedidas pelos autores esde a descoberta, por Garrod em 1902, de que a alcaptonúria (aku) era uma desordem do metabolismo de caráter hereditário (erro inato do metabolismo), várias outras doenças ou patologias humanas têm sido caracterizadas como uma deficiência genética e tais descobertas intensificaramse ainda mais com as novas técnicas de biologia molecular. Paralelamente ao progresso da genética humana, foi criada a genética de camundongos ou o estudo de modelos animais de doenças humanas (tabela 1). Tais modelos ajudam na compreensão da patogenicidade de várias doenças e, em muitos casos, são usados para testar a eficiência e a ausência de efeitos colaterais de uma terapia gênica que busca a compensação ou a substituição da função do gene defeituoso no homem. O objetivo deste artigo é descrever como os modelos animais das doenças humanas foram descobertos ou induzidos, suas vantagens e limitações. De onde vêm os modelos animais? 1 As linhagens geneticamente padronizadas As linhagens consangüíneas Os roedores de laboratório suportam relativamente bem um regime de cruzamentos totalmente consangüíneo. Nos ratos e camundongos, podemos fazer acasalamentos entre irmãos durante várias gerações, obtendo assim, populações de animais muito homogêneas do ponto de vista genético. Essas populações são denominadas linhagens consangüíneas (inbred strains) e elas são muito estáveis e geneticamente padronizadas: elas têm formas alélicas homozigóticas para todos os loci do genoma e o conjunto de alelos que compõe o genoma são distribuídos de forma aleatória. Dessa forma, fica claro que toda comparação feita entre camundongos provenientes de linhagens diferentes revelará diferenças genéticas. Para termos acesso a tais diferenças devemos cruzar as diferentes linhagens e analisar a transmissão genética de um ou mais caracteres genéticos de uma geração a outra. Figura 1: Mutação alcaptonúria (aku). A urina dos animais doentes tornase escura após o contato com o ar pelo processo da oxidação. Na foto, o animal afetado está à direita e à esquerda o normal Algumas dessas linhagens consangüíneas são consideradas modelos animais para a medicina, pois elas desenvolvem doenças, como por exemplo, a linhagem NOD (Non Obese Diabetic) (Festing M.W., 1996). Nessa linhagem, 80% das fêmeas e 20% dos machos apresentam espontaneamente uma diabete autoimune insulinadependente, análoga à diabete juvenil do homem. Por outro lado, as linhagens consangüíneas podem apresentar diferenças quanto às reações a agentes infecciosos. Nesse caso, observamos que, enquanto algumas linhagens são dizimadas pela infecção de um agente patogênico, outras são resistentes. Isso foi observado com os agentes Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzi, Leishmania major ou pela bactéria Salmonela e as Micobactérias (Foote et al., 1997; Vidal et al., 1993). Entretanto, nesse caso, a noção de modelo animal é um pouco mais complicada, pois os mecanismos envolvidos no determinismo genético das diferenças de sensibilidade às infecções não são integralmente transponíveis de uma espécie a outra. Para ilustrar esta afirmação, podemos utilizar como exemplo o gene Mx (para Myxovirus resistance, mapeado no cromossomo 16). A maior parte das linhagens de camundongos de laboratório sucumbem entre 48 e 72 horas após terem sido infectadas pelo vírus da influenza, enquanto que a linhagem A2G resiste a uma dose 500 vezes mais forte. Essa diferença de sensibilidade é controlada por um único gene, o gene Mx que possuí dois alelos: o alelo de resistência Mx + e o alelo da sensibilidade Mx, o alelo primeiro é dominante sobre o segundo. A clonagem e o estudo molecular desse gene serviu para elucidar o mecanismo genético que rege a sensibilidade ou a resistência ao Myxovirus para todos os mamíferos (Haller et al., 1980). Nós podemos citar muitos outros modelos conhecidos como, por exemplo, a resistência ao vírus de Theiler. Entretanto, sabemos que essa é uma área de estudo que só tende a se desenvolver e as estratégias serão cada vez mais generalizadas de um caso para outro. Todas, no entanto, buscam o mesmo resultado, que deverá ser o desenvolvimento de vacinas ou de tratamentos para as doenças infectocontagiosas. As linhagens consangüíneas de camundongos de laboratório derivam todas de um pequeno número de genitores. Isto do ponto de vista genético, significa que não 96 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento Encarte Especial

9 existe muita diferença entre os genomas. Por exemplo, todas essas linhagens possuem a mesma molécula de DNA mitocondrial (herdado da mãe) e o mesmo cromossomo Y (herdado do pai). Tal homogeneidade é um fator positivo para o estudo da histocompatibilidade ou estudos sobre a predisposição a algumas formas de câncer. Entretanto, o uso dessas linhagens não é adequado para o mapeamento genético à alta densidade (indispensável na clonagem posicional), ou do estudo do imprinting genético, ou o estudo dos efeitos da epstasia, etc. Por essas razões que foram criadas recentemente novas linhagens derivadas de camundongos selvagens capturados na natureza. Além desse tipo de camundongos, podemos falar das linhagens congênitas, ou das recombinantes consangüíneas (derivadas de duas linhagens consangüíneas parentais). Porém, todas essas outras linhagens são produtos de cruzamentos e de seleções a partir das linhagens consangüíneas. 2. As mutações As mutações fazem surgir uma segunda forma alélica permitindo assim a identificação dos genes responsáveis. Todos os seres vivos sofrem mutações no genoma e todas essas mutações são produzidas de forma aleatória, tanto nas células somáticas, quanto nas germinativas, nas embrionárias e nas adultas. Assim que elas são transmitidas às gerações seguintes, freqüentemente os seus efeitos são deletérios ou patológicos e podem, neste momento, servirem de modelo para algumas doenças hereditárias humanas ou se tornam, simplesmente, um utensílio para a ciência As mutações como modelos para doenças humanas Nos camundongos e ratos de laboratório, existem mais de mil mutações que representam um estoque potencial de modelos animais. Pelos resultados experimentais, nós podemos admitir que a freqüência de mutações espontâneas é próxima de 5 x 10 6 por gameta e por geração para as mutações recessivas, e a freqüência em torno de 2 x 10 7 por gameta e por geração para as mutações dominantes. Isto quer dizer que um camundongo entre mais ou menos duzentos possuí uma mutação em um locus qualquer. Entre todas essas mutações que vêm sendo coletadas ao longo deste século, algumas reproduzem uma síndrome muito próxima de uma patologia humana. Este é o caso, por exemplo, da mutação alcaptonúria (aku) (Figura 1) a qual mapeamos sobre o cromossomo 16 dos camundongos (Montagutelli et al., 1994). O mesmo gene Figura 2: Mutação pmn. A fraqueza muscular dos animais pmn (à direita, na foto) se caracteriza pela incapacidade de esticar as patas posteriores quando erguemos os camundongos pelo rabo (o da oxidase do ácido homogentísico) é afetado no homem e no camundongo e os sintomas são muito parecidos nessas duas espécies (a urina tornase escura, oxidandose após o contato com ar). Muitas outras mutações como esta já foram descritas, mas acontece que os sintomas de uma mesma doença podem ser mais severos de uma espécie para outra. A distrofia muscular de Duchenne, da qual conhecemos um modelo animal que é o camundongo mdx, é a conseqüência de uma mutação em um enorme gene de estrutura mapeado sobre o cromossomo X. Tal mutação interrompe a produção de uma proteína essencial na miogênese: a distrofina. No homem, os efeitos dessa mutação são severos, enquanto que, nos camundongos, são quase imperceptíveis. Esse modelo é interessante, pois no dia em que os geneticistas descobrirem a razão dessa diferença de fenótipo entre essas duas espécies contendo a mesma mutação, nós teremos progredido muito na compreensão dessa terrível doença e talvez estejamos caminhando para a cura dela. Mesmo sendo abundantes, as mutações de camundongos e de ratos susceptíveis de serem modelos para os geneticistas humanos ainda são insuficientes. Nós conhecemos, por exemplo, oito mutações de camundongos cujos os efeitos afetam a sobrevivência dos motoneurônios na medula espinhal, porém nenhuma dessas mutações serve como modelo animal de uma neuropatia humana, pois, em nenhum dos casos, as localizações genéticas coincidem com o mapeamento genético humano. Esse é o caso por exemplo, da mutação progressive motor neuronopathy (pmn) (Figura 2), com a qual trabalhamos, há algum tempo, tentando clonar o gene responsável. Durante um certo tempo, ela foi considerada como sendo o modelo animal da Amiotrofia espinal humana (SMA para Spinal Muscular Atrophy) do tipo I, a mais severa. Mapeamos essa mutação na região centromérica do cromossomo 13 de camundongos (Brunialti el al., 1995), longe da região cromossômica homóloga ao cromossomo 5 local, onde foi mapeado a doença humana. Tal descoberta serviu para descartar este camundongo como sendo um modelo animal para síndrome humana. Essa constatação indica, por outro lado, que é indispensável coletarmos e mesmo produzirmos em massa novas mutações para suprir essa deficiência. Estatísticas feitas no Jackson Laboratory (a Meca da genética de camundongos) nos Estados Unidos e no nosso laboratório no Instituto Pasteur de Paris indicam que, em torno de 60% de novas mutações espontâneas ou induzidas, identificam um gene novo e não uma nova forma alélica de um gene já conhecido. Podemos deduzir, então, que o genoma de camundongos está longe de estar saturado de mutações, sendo, dessa forma, uma fonte riquíssima para o estudo de modelos animais para as doenças humanas. Podemos aumentar o número de mutações nos camundongos por meio da utilização de agentes mutagênicos químicos ou físicos. Os mutagênicos químicos são mais cômodos que os físicos, pois são mais baratos e fáceis de ser utilizados. Entre eles, o mais conhecido e também o mais eficaz é o etilnitrosouréa (ENU) (Brown S.D.M. et al., 1998). Uma única dose de 250mg/Kg do peso corporal, administrada via intraperitonial, aumenta em até 102 vezes a freqüência de mutações observadas. Com tal agente mutagênico podemos produzir um grande número de alelos mutantes do mesmo locus, e assim, estudarmos os diferentes domínios de uma mesma proteína. Nós podemos, igualmente, submeter uma população de camundongos a uma forte pressão mutagênica para procurar, na descendência, alguns fenótipos que podem ser interessantes para uma dada patologia. Esse tipo de experiência foi realizado pela primeira vez por Vernon C. Bode e colaboradores (1988), quando descobriram o modelo animal da fenilcetonúria humana. Tal experimento foi renovado pelos pesquisadores Alexandra Shedlovsky e J. David McDonald (1990), que publicaram uma lista exaustiva de mutações pontuais induzidas nos camundongos no gene da fenilalanina hidroxilase (Pah), para servir de modelo à síndrome humana da fenilcetonúria (PKU). Esse modo de utilização da mutagênese é muito interessante, pois ela demonstra o valor dos modelos animais na análise dos diferentes aspectos de uma síndrome humana. Ela também mostra que Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento Encarte Especial 97

10 é possível induzir novas mutações num mesmo locus ou em outros para proceder ao inventário de todos os caminhos implicados em uma doença metabólica. Esse é o caso da fenilcetonúria, da qual pudemos conhecer todas as vias do metabolismo por meio desse procedimento. Poderíamos citar mais exemplos onde a mutagênese foi utilizada na identificação de novas mutações que afetam um tecido ou uma função em particular. Podemos citar o exemplo de Jack Favor e colaboradores, em Munique, que isolaram mais de 75 mutações, todas afetando o cristalino dos camundongos, para provocar catarata. Ou, então, o que foi feito pela equipe do Dr. Steve Brown, na Inglaterra, onde uma experiência do mesmo tipo que a anterior foi realizada para saturar o genoma de camundongos com mutações que levam à surdez a fim de identificar os genes que estão envolvidos no desenvolvimento do ouvido interno. 2.2 As mutações como instrumentos para a pesquisa Como já foi mencionado anteriormente, as mutações permitem identificar um gene por meio de um fenótipo patológico ou anormal. Isso quer dizer que é possível clonar um gene identificado unicamente por um alelo mutado, do qual o fenótipo é, a priori, interessante, e isolar um gene cuja função é importante. Esse foi o caso de Jeffrey Friedman e colaboradores, que clonaram os genes responsáveis pela diabete (db) e pela obesidade (ob) (Zhang et al., 1994) (Figura 3) nos camundongos e que eram conhecidos unicamente pelos seus fenótipos anormais. Utilizando os camundongos exatamente como os geneticistas dos vegetais fizeram com Arabidopsis thaliana, como uma fonte de genes a serem clonados, a equipe de Friedman identificou a proteína chamada leptina, que está envolvida na regulação do metabolismo dos lipídeos e no controle da satisfação alimentar. Esse é um dos muitos exemplos que poderíamos citar da identificação e clonagem de um gene unicamente por intermédio do seu fenótipo patológico As mutações produzidas in vitro pela recombinação homóloga nas células embrionárias O antigo sonho dos geneticistas de poderem provocar mutações dentro de um gene escolhido, a priori, foi realizado em decorrência dos trabalhos realizados por Capecchi e colaboradores (1989), que conseguiram substituir in vitro, ou seja, dentro das células embrionárias em cultura, uma seqüência de DNA normal por uma seqüência homóloga mutada. Essa técnica, chamada de gene knockout permite, em teoria, inativar qualquer gene, desde que sua seqüência genômica seja conhecida. Tecnicamente podemos inativar de maneira sistemática todos os genes dos quais a seqüência seja conhecida, mas não a sua função, para podermos conhecer seus efeitos sobre o embrião e/ou o adulto. Por meio desse método já foram produzidos muitos Figura 3: Mutação obeso (ob). A massa corporal do animal obeso (à esquerda, na foto) é muito maior que a do animal normal (à direita, na foto). modelos animais de doenças humanas. Esse é o caso das doenças de Tay Sachs, Werdnig Hoffmann (Amiotrofia Espinal de Tipo I) e de muitas outras, que já possuem um modelo animal obtido pelo knockout (Sango et al., 1995). Até o presente momento, essa técnica é usada unicamente nos camundongos, pois só nessa espécie é que existem as células E.S. (Embryonic Stem cells) e, na maior parte do tempo, elas só permitem a produção de um alelo nulo de um determinado gene. Atualmente novas técnicas de inativação de genes têm aparecido. Podemos citar o método denominado creloxp (Gu et al., 1994) (Figura 4), com o qual podemos inativar um gene de forma específica em um tecido determinado com um tempo préestabelecido. Nós podemos chamálo de inativação premeditada espaçotemporal. Essa técnica é a única que possibilita a inativação de genes essenciais durante o desenvolvimento embrionário, porém ela perde sua especificidade tissular no indivíduo adulto A transgênese Com o desenvolvimento muito rápido da engenharia genética, nós podemos hoje em dia, acrescentar um gene clonado ou um fragmento de DNA ao patrimônio genético de um animal de laboratório (Palmiter et al., 1982). Dessa forma, criamos um animal transgênico que adquiriu, de forma estável, uma informação genética que não veio pelos canais naturais da evolução. Essa manipulação do genoma representa o avanço mais importante da genética moderna. Esse método, ao contrário do anterior, pode ser aplicado a todas as espécies que possuam DNAs clonados. A técnica consiste em injetar, diretamente, um fragmento de DNA clonado e linear dentro de um dos pronúcleos, com a ajuda de uma micropipeta. A integração do transgene se faz, provavelmente, de forma aleatória e, quase sempre, durante a primeira divisão mitótica do ovócito. Dessa forma, todas as células portam o transgene no genoma. Às vezes, a integração não é homogênea e o animal que resulta é chamado de mosaico, pela justaposição de células transgênicas e normais. A transgênese permite o acréscimo de um gene suplementar no genoma. Sendo assim, podemos dizer que é uma genética de adição, opondose à genética tradicional, que é de substituição de alelos. Pela transgênese, nós podemos aumentar o número de cópias de um gene qualquer e verificar se essa modificação da dosagem tem efeitos ou não. Podemos também modificar a estrutura do transgênico e mudar, por exemplo, as seqüências reguladoras que estão, na maior parte do tempo, situadas nas extremidades 5 das seqüências codificadoras. Assim, nós podemos fazer com que o transgene seja expresso em um estado do desenvolvimento diferente do estado normal ou que ele seja expresso em um tecido diferente. Ao combinarmos todas essas possibilidades, podemos obter vários modelos animais de doenças humanas. Talvez um dos mais interessantes tenha sido o que foi feito pela equipe do Dr. Hiromichi Yonekawa, que mostrou que, ao se produzir um camundongo transgênico para o gene humano que codifica para o receptor do vírus da poliomielite, tornou o camundongo sensível à infecção viral. A mesma coisa foi feita para o vírus da hepatite C. Podemos dizer que tais trabalhos são muito importantes na pesquisa sobre essas duas doenças, pois, agora, dispomos de modelos animais. Porém, ela causa, ao mesmo tempo, um problema de biosegurança gerando novas espécies de animais sensíveis às infecções, em outras palavras, ela produziu um reservatório potencial de vírus. Vários camundongos transgênicos para os receptores do vírus da AIDS foram construídos, mas, até agora, ainda não dispomos de um modelo animal. O grande problema está em termos toda a estrutura que permita ao vírus replicarse e encapsularse de novo. Também podemos falar de animais transgênicos resultantes da regulação anormal de um gene. Talvez o melhor exemplo ainda seja o do animal que tem uma super produção do hormônio de crescimento humano (HGH). O resultado desse trabalho foi a produção de animais muito maiores que os normais e com uma série de patologias menores. 98 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento Encarte Especial

11 2.5. Modelos transgênicos resultantes da introdução de grandes fragmentos de DNA nas células germinais de camundongos Figura 4: Sistema CreLox P (CohenTannoudji M., Babinet C., 1998). (a) Introdução, em um locus, de um sítio Lox P (triângulo) e da metade do gene de seleção (Hyg). A cassete neo é usada para uma primeira seleção positiva. (b) A célula é submetida a um segundo evento de recombinação homóloga em um novo locus levando à integração do segundo sítio Lox P e da outra metade do gene de seleção (ro). A cassete puro (puromicina) é usada para a segunda seleção. (c) A expressão transitória da recombinase Cre nos dois loci resulta na ativação do gene de seleção Hygro. Quando os dois loci estão no mesmo cromossomo, a ação da recombinase leva à deleção entre os dois sítios Lox P. Inversamente, quando os loci estão separados em cromossomos diferentes, a recombinase causa uma translocação. Vários outros modelos foram obtidos pela interrupção do controle da expressão de um gene. Esse é o caso dos transgênicos construídos a partir das seqüências codificadoras das células oncogênicas, regulados por promotores não específicos. Tais animais desenvolvem um número elevado e freqüente de neoplasias, mas quando, ao contrário, o promotor é histoespecífico, o câncer ocorre em tecidos específicos. A produção de animais transgênicos talvez seja o melhor caminho para estudar os mecanismos da oncogênese, pois ela não requer uma translocação cromossômica recíproca para ativar o gene oncogênico em questão. O melhor exemplo para a afirmação anterior é o modelo animal da leucemia aguda humana que foi obtido pela construção artificial do chamado cromossomo Filadélfia humano (no homem é a translocação recíproca 9q3422q11 e nos camundongos é a junção do 1º exon em 5 do gene bcr aos exons em 3 do gene c Abelson). Infelizmente esses animais não ajudaram na elucidação da relação de causa e efeito que existe entre a presença do cromossomo Filadélfia e o desenvolvimento de uma leucemia aguda, pois tais animais morrem ainda pequenos. Várias equipes de pesquisadores têm obtido sucesso na produção de animais transgênicos com a transferência de grandes fragmentos de DNA clonados em Yeast Artificial Chromosome (YAC) ou Bacterial Artificial Chromosome (BAC) dentro das células germinais (Jacobovits et al., 1993) ou, simplesmente, através da injeção no pronúcleo do DNA de YAC purificado. Tais transgênicos são utilizados no estudo da compreensão dos efeitos de uma doença da qual não conhecemos exatamente o gene responsável mas temos a região cromossômica onde ele foi mapeado. Como exemplo, podemos citar o animal transgênico chamado olhos pequenos (Sey/+), que carrega no seu genoma um YAC de 420 Kb que possuí o gene humano PAX6. Durante esse experimento foi observado que os animais portadores desse YAC vinham super exprimindo o gene PAX6, conseqüência da integração múltipla desse gene, e que apresentavam uma desorganização nos olhos microfitálmicos. Tal resultado mostrou a importância que tem o nível de expressão do gene PAX6 para esse órgão. Dois outros modelos animais de doenças humanas também foram conseguidos usandose os YACs para as doenças de CharcotMarieTooth e a Síndrome de Down. CharcotMarieTooth tipo I é uma doença hereditária autossômica dominante, que é o resultado da duplicação de uma região que contém o gene PMP22 (proteína mielínica periférica22). O YAC humano SÍTIOS Informações Gerais Pub Med Search OMIM The Jackson Labotatory Mouse and Rat Research Home Page MGI Genes, Marcadores e Fenótipos Internet Resources for Transgenic and Targeted Muation Research Informações de todas as espécies animais OMIA Genética Camundongo Criação de Modelos MRC Mammalian Genetics Unit ENU UK Programa de Mutagênese nos camundongos The Institute of Mammalian Genetics R. Balling Programa de Mutagênese nos camundongos Lexicon Genetics, Inc Produção de modelos por encomenda Disponibilidade de Modelos ILAR Home The Jackson Laboratory Resources Interesse ENDEREÇOS Tabela 1: Fontes de informações dos modelos animais. A tabela mostra os sítios internet mais interessantes sobre a genética de camundongos e os modelos animais. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento Encarte Especial 99

12 contendo, entre outras sequências de DNA, 40 Kb do gene PMP22 humano foi introduzido nas células germinais de camundongos. O resultado foi a produção de animais que sofrem de uma dimielinização periférica similar, porém mais severa que a da doença de CharcotMarieTooth do tipo I. A Síndrome de Down ou o mongolismo é uma doença humana causada pela trissomia do cromossomo 21 e ela está associada a um certo número de defeitos e anomalias muito bem caracterizadas. Nós podemos dizer que tais defeitos são mais ou menos uma conseqüência direta das expressões anormais de uma série de genes localizados sobre o cromossomo 21 sendo a região 21q22.2 a mais crítica. Para tentar entender melhor e também poder definir um ou mais genes responsáveis por essa Síndrome, Smith e colaboradores (1997) construíram vários animais transgênicos cada um carregando um YAC diferente contendo 2 Mb da totalidade da região 21q22.2. Os camundongos que possuíam dois YACs diferentes e que não se sobrepunham no mapa físico da região, apresentaram dificuldades de aprendizado, indicando que ao menos dois genes contidos nessa região cromossômica são responsáveis por esse problema quando presentes em mais que duas cópias. Um desses dois genes foi identificado: é o gene homólogo ao gene dito minicérebro de Drosófila, responsável pelos defeitos na aprendizagem das moscas. Não temos dúvida alguma de que a tecnologia de transferência de fragmentos de DNA de vários tamanhos (pequenos, grandes ou extragrandes) para o genoma de camundongos (transgênese) terá um grande impacto na gênese de modelos animais de doenças humanas. Entretanto, ela tem seus limites. Um deles é que ela funciona pela adição de uma seqüência exógena e não pela substituição de uma informação no genoma. Isso significa que não é possível produzir uma alteração recessiva, exceto nos raros casos onde ocorre interrupção acidental da uma seqüência codificadora. Qual é o valor dos modelos animais? Várias vezes nós destacamos que os fenótipos patológicos dos modelos animais são, na maior parte do tempo, diferentes dos das doenças humanas. Geralmente a mesma mutação no camundongo e no homem provoca uma patologia mais severa neste último. Às vezes, as diferenças são extremas como, por exemplo, no caso da falta da proteína distrofina nos camundongos, que quase não tem efeito algum, enquanto que, no homem, é a causa da distrofia muscular de Duchenne. A mutação no gene hypoxantine fosforil transferase (HPRT) não tem efeito algum nos camundongos, enquanto que no homem, causa uma doença terrível chamada LeschNyhan, caracterizada por um retardamento mental. Na realidade, quando analisamos essa situação, nós não deveríamos estar surpresos com o resultado pois, a priori, nós não temos razão alguma para considerarmos o camundongo ou o rato como um homem em miniatura. Robert Erickson (1989) propõem três possíveis explicações para essas diferenças: existem (I) variações nas vias bioquímicas do metabolismo entre o do camundongo e o do homem, (II) variações no desenvolvimento e (III) a relação entre o tempo absoluto e o tempo fisiológico no desenvolvimento de uma doença, que não é a mesma entre a do homem e a do animal. Para justificar a primeira hipótese podemos retomar o caso já falado acima do modelo animal da Síndrome de LeschNyhan humana. Quanto às diferenças no desenvolvimento, podemos falar da deficiência em anidrase carbônica (CAII), que, no homem, causa osteoporose, calcificações intracraniana e retardamento mental, enquanto que a mesma deficiência nos camundongos não tem efeito patológico nenhum. Enfim, as pesquisas sobre os metabolismos tóxicos são difíceis de serem realizadas com modelos animais, pois são baseadas na acumulação dos agentes tóxicos ao longo do tempo de vida do indivíduo. Assim fica evidente que os resultados patológicos encontrados nos animais, se houverem, não serão os mesmos que os encontrados no homem. Os modelos animais, por mais úteis e numerosos que sejam, têm seus limites. Entretanto, eles são indispensáveis no estudo das doenças genéticas humanas, pois permitem, por exemplo, o estudo da patologia de uma síndrome ao longo do tempo, no desenvolvimento de terapias gênicas, na descoberta de novos genes que podem ser uma fonte para novos medicamentos (por exemplo, a descoberta do gene obese de camundongos que codifica para a leptina; essa proteína é usada atualmente no tratamento de um tipo de obesidade humana) ou nos genes modificadores que têm papéis determinantes na gravidade de um fenótipo e que constituem novos alvos para tratamentos. Ao combinarmos as diferentes técnicas que estão disponíveis hoje em dia para a modificação do genoma dos animais de laboratório, os geneticistas poderão, em breve, obter modelos que sejam mais fidedignos às doenças humanas. Podemos acabar dizendo que a experimentação animal, a partir de agora, muda radicalmente. Bibliografia Bode V.C., Mcdonald J.D., Guénet J.L., Simon D. (1988). hph1, a mouse mutant with hereditary hyperphenylalaninemia induced by ethylnitrosourea mutagenesis. Genetics 118: Brown S.D.M., Nolan P.M. (1998). Mouse mutagenesis systematic studies of mammalian gene function. Human Molecular Genetics: Brunialti A.LB., Poirier., Schmalbruch H., Guénet J.L. (1995). The mouse mutation Progressive Motor Neuronopathy (pmn) maps to chromosome 13. Genomics, 29: CohenTannoudji M.and Babinet C., Beyond knockout mice: new perspectives for the programmed modification of the mammalian genome. Mol. Hum. Reproduction 4 (10): Erickson R.P. (1989). Why isn t a mouse more like a man? 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