Paulo Augusto de Lima Filho

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA DIVERSIFICAÇÃO EVOLUTIVA DE GOBÍDEOS NO LITORAL BRASILEIRO: PADRÕES CITOGENÉTICOS E ECOMORFOLÓGICOS Paulo Augusto de Lima Filho Natal-RN 2011

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA DIVERSIFICAÇÃO EVOLUTIVA DE GOBÍDEOS NO LITORAL BRASILEIRO: PADRÕES CITOGENÉTICOS E ECOMORFOLÓGICOS Paulo Augusto de Lima Filho Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ecologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de mestre em Ecologia. Orientador: Dr. Wagner Franco Molina Natal-RN 2011

3 Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências Lima Filho, Paulo Augusto de. Diversificação evolutiva de gobídeos no litoral brasileiro: padrões citogenéticos e ecomorfológicos / Paulo Augusto de Lima Filho. Natal, RN, f. : Il. Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina. Dissertação (Mestrado) Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Ecologia 1. Gobiidae Dissertação 2. Evolução cariotípica Dissertação. 3. Morfometria geométrica Dissertação. I. Molina, Wagner Franco. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título. RN/UF/BSE-CB CDU

4 Aprender é uma coisa que nuca se cansa, nunca se tem medo e nunca se arrepende (Leonardo da Vinci)

5 Dedico aos meus pais, familiares, amigos e colegas, pelo apoio, confiança e paciência

6 AGRADECIMENTOS Não só nesta trajetória, mas durante toda minha vida, agradeço a Deus, pois me presenteou com a vida, a força e a coragem. Agradeço a minha família pelo apoio, compreensão, carinho e paciência demonstrado. Maior gratidão devo aos meus pais, Paulo Augusto de Lima, Maria da Conceição Dutra de Andrade e minha boa drasta Geovana da Silva Nascimento, pela palavra sempre oportuna. À meus tios e tias dedico gratidão adicional por ter me apoiado neste sonho, Dailva, Hugo, Dedé, Neide e Gracinete me acolhendo e auxiliando durante toda esta trajetória no Rio Grande do Norte. Agradeço também aos meus irmãos, Henrique, Ricardo, Isaura e Tatiane que me deram forte base familiar, meus sobrinhos e primos. A minha querida Dayse, agradeço pela ajuda neste projeto, pelo carinho, apoio e compreensão estando sempre presente ao meu lado. Agradeço aos meus antigos amigos e aos novos, que conquistei nesta jornada, desde o Cursinho da Poli, CEDAP, graduação e pós-graduação na Universidade Federal do Rio Grande do Norte, colegas residentes das republicas que fiz parte, especialmente a Rogerson Rodrigues, grande amigo que me apoiou e incentivou durante toda minha peregrinação acadêmica. Agradeço a todas as pessoas que realmente me ajudaram no desenvolvimento deste trabalho, os quais considero como amigos e colegas de ofício. A meu ver, verdadeiramente praticaram ciência, democratizando o conhecimento e trabalhando em equipe. Sou grato aos meus amigos de trabalho no laboratório, pelo ambiente que promoveram e pelos ensinamentos que melhoraram decisivamente minha pesquisa: Clóvis, Pantera, Gideão, Amanda, Emanuel, Uedson, Calado, Pablo, Eurico, Washington, Layse, Alyson e Guinga. Agradeço ao meu orientador, professor Dr. Wagner Franco Molina, por acompanhar e contribuir no meu desenvolvimento acadêmico, orientando-me com liberdade e exigência, permitindo o meu desenvolvimento científico e a realização deste trabalho. Agradeço ao programa de Pós-Graduação em Ecologia, pela oportunidade de mestrado, sua equipe de funcionários e docentes pelo apoio e conhecimentos adquiridos durante o decorrer deste trabalho.

7 Agradeço a Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), ao Centro de Biociências (CB) e ao Departamento de Biologia Molecular e Genética (DBMG). Agradeço a CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível Superior), pela bolsa de estudos oferecida. Ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelo financiamento deste trabalho, sob processo de número: Nº556793/ e ao IBAMA pela autorização de coleta das espécies (Processo Nº 19135/1).

8 Lista de Figuras Lista de Tabelas Lista de Abreviaturas Resumo Abstract SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO Principal componente vertebrado marinho Aspectos citogenéticos da família Gobiidae A evolução refletida na morfologia 5 2. OBJETIVOS 8 3. MATERIAL E MÉTODOS Material Métodos Técnica de estimulação mitótica Técnica de obtenção de cromossomos mitóticos Preparação das lâminas Análises cromossômicas Detecção de regiões organizadoras de nucléolos (RONs) Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda-C) Coloração com fluorocromos base-específico Análises por morfometria geométrica (MG) CAPÍTULOS Caracterização da diversidade na família Gobiidae por meio da citogenética e morfometria geométrica VIII XI XII XIII XIV Análises citogenéticas e morfométricas interpopulacionais no peixe marinho Bathygobius soporator (Gobiidae - Perciformes) CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 71

9 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Desenho morfológico esquemático de Gobiidae (gênero Bathygobius). Em destaque (a) nadadeiras dorsais separadas, primeira nadadeira dorsal com raios, olhos grandes, ausência de linha lateral; (b) nadadeiras pélvicas fusionadas presentes na maioria das espécies 2 Figura 2. Mapa com pontos de coleta dos exemplares da família Gobiidae. Litoral do Maranhão (MA), Rio Grande do Norte (RN), Bahia (BA) e Atol das Rocas. 9 Figura 3. Espécies analisadas no presente estudo: a. Ctenogobius smaragdus, b. Ctenogobius boleosoma, c. Bathygobius soporator, d. Bathygobius mystacium, e. Coryphopterus glaucofraenum. 10 CAPÍTULO I Figura 1. Imagem digitalizada de Coryphopterus glaucofraenum retratando os 11 landmarks utilizados nas análises morfológicas interespecífica em Gobiidae. Descrição esquemática dos landmarks. 1. Ponto distal do osso pré-maxilar; 2. Origem da primeira nadadeira dorsal; 3. Término da primeira nadadeira dorsal; 4. Origem da segunda nadadeira dorsal; 5. Término da segunda nadadeira dorsal; 6. Término da nadadeira anal; 7. Origem da nadadeira anal; 8. Origem da nadadeira pélvica; 9. Margem anterior ocular; 10. Margem posterior ocular; 11. Base superior da nadadeira peitoral. Barra=0,5cm. 20 Figura 2. Cariótipo de Ctenogobius smaragdus a partir de coloração convencional (a) bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (1º) corado com impregnação argêntea, CMA 3 e DAPI. Barra=5µm. 22 Figura 3. Cariótipo de Ctenogobius boleosoma a partir de coloração convencional (a). Em destaque (b) o par organizador nucleolar (1º) corado com impregnação argêntea, CMA 3 e DAPI. Barra=5µm. 22 Figura 4. Metáfase de C. smaragdus (a) e C. boleosoma (b), exibindo marcações CMA 3 + na maior parte dos cromossomos em posição centromérica e terminal. Barra=5µm. 22 Figura 5. Cariótipo de Bathygobius soporator a partir de coloração convencional (a) e bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (4º) corado com impregnação argêntea, CMA3 e DAPI. Barra=5µm. 23 Figura 6. Cariótipo de Bathygobius mystacium a partir de coloração convencional (a) e bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (5º) corado com impregnação argêntea, CMA3 e DAPI. Barra=5µm. 23

10 Figura 7. Cariótipo de Coryphopterus glaucofraenum a partir de coloração convencional (a) e bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (1º) corado com impregnação argêntea, CMA 3 e DAPI. Barra=5µm. 24 Figura 8. Distribuição dos padrões corporais das cinco espécies de Gobiidae analisadas ao longo da primeira e segunda Variável Canônica. 25 Figura 9. Gride de deformação a partir da primeira Variável Canônica, os vetores indicam a direção da deformação sofrida por cada landmark na representação espacial comparativa das cinco espécies de Gobiidae analisadas. 26 Figura 10. Análise morfométrica comparativa entre B. mystacium e B. soporator, a partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa B. mystacium e o desvio vetorial à espécie B. soporator. Figura 11. Análise morfométrica comparativa, entre as espécies do gênero Ctenogobius, à partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa C. boleosoma e o desvio vetorial a espécie C. smaragdus CAPÍTULO II Figura 1. Imagem digitalizada de B. soporator retratando os 09 landmarks definidos para análises morfológicas interpopulacionais. Descrição esquemática dos landmarks. 1. Ponto distal do osso pré-maxilar; 2. Origem da primeira nadadeira dorsal; 3. Término da primeira nadadeira dorsal; 4. Origem da segunda nadadeira dorsal; 5. Término da segunda nadadeira dorsal; 6. Término da nadadeira anal; 7. Origem da nadadeira anal; 8. Origem da nadadeira pélvica; 9. Base infra-ocular medial. Barra=1,5cm. 49 Figura 2. Cariótipo de B. soporator para populações contientais (MA, RN e BA) à partir de coloração convencional (a) bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (4º) corado com impregnação argêntea, CMA 3 e DAPI. Barra= 5µm. 50 Figura 3. Cariótipo de B. soporator população do Atol das Rocas, a partir de coloração convencional (a) bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (1º) corado com impregnação argêntea, CMA 3 e DAPI. Barra= 5µm. 50 Figura 4. Distribuição das amostras de B. soporator ao longo da primeira e segunda variável canônica (63,5% e 30,5% da variância respectivamente), a partir das variáveis morfométricas. 52 Figura 5. Distribuição das populações continentais amostradas de B. soporator ao longo da primeira e segunda variável canônica (76,2% e 23,5% da variância respectivamente). Os símbolos em destaque indicam a média morfométrica de cada população. 52

11 Figura 6. Gride comparativo entre população continental e insular de B. soporator, a partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa população do RN e o desvio vetorial população do Atol das Rocas. 53 Figura 7. Gride comparativo entre populações continentais de B. soporator, a partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa população do RN e o desvio vetorial população do Maranhão. 53 Figura 8. Gride comparativa entre populações continentais de B. soporator, a partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa população do RN e o desvio vetorial população da Bahia. 54

12 LISTA DE TABELAS CAPÍTULO I Tabela 1. Número de indivíduos utilizados para estudos morfométricos e citogenéticos. 19 Tabela 2. Dados citogenéticos das cinco espécies de Gobiidae analisadas. 21 Tabela 3. Resultados post-hoc ANOVA a partir de procrustes, classificadas com a média do centróide, efeito individual, para todos os espécimes em estudo e espécies dos gêneros Bathygobius e Ctenogobius. 24 Tabela 4. Dados citogenéticos disponíveis da família Gobiidae (Perciformes). 28 CAPÍTULO II Tabela 1. Número de indivíduos coletados, seus respectivos pontos de coleta e sua utilização para estudos morfométricos e citogenéticos. 48 Tabela 2. Porcentagem de indivíduos alocados para cada população e suas interfaces baseados na CVA. 51 Tabela 3. Resultados post-hoc ANOVA a partir de procrustes, classificadas com a média do centróide, efeito individual, entre as populações continentais. 51

13 LISTA DE ABREVIATURAS a Acrocêntrico AgNO 3 Nitrato de prata Ag-RONs Regiões organizadoreas de nucléolo evidenciadas pela impregnação com nitrato de prata ANOVA Análise de variância AR Atol das Rocas AT Adenina e Timina BA Bahia BC Bandamento C BRA - Brasil CMA 3 Cromomicina A 3 CVA Análise de variáveis canônicas DAPI 4`4,6-diamidino-2-fenilindol DNA Ácido desoxirribonucléico EUA Estado Unidos da América GC - Guanina e Citosina LGRM Laboratório de Genética de Recursos Marinhos m Metacêntrico MA Maranhão MANOVA Análise multivariada de variância MG Morfometria geométrica NE Nordeste NF Número de braços cromossômicos N-S Norte Sul p Probabilidade estatística do teste RN Rio Grande do Norte sm - Submetacêntrico st Subtelocêntrico UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte VC Variável canônica

14 RESUMO Os peixes da ordem Perciformes caracterizam-se como um modelo importante para o entendimento da estrutura genética de populações marinhas, pois apresentam tanto exemplos de conservação cromossômica como de diversificação cariotípica para alguns grupos. Gobiidae é a família mais especiosa no ambiente marinho. Entre seus representantes, muitas espécies fazem parte de uma fauna críptica pouco percebida e estudada, apresentando ampla distribuição com características comportamentais e reprodutivas que as tornam propícias à ação de barreiras biogeográficas. Morfologicamente esta família apresenta estruturas corporais reduzidas através de simplificações e regressões. Dados citogenéticos, apesar da importância em inferências evolutivas, são incipientes frente sua diversidade de espécies, sobretudo para espécies do Atlântico Ocidental. Visando estimar a diversidade evolutiva em Gobiidae foram desenvolvidas análises citogenéticas e dos padrões corporais, através de morfometria geométrica, em cinco espécies presentes no litoral brasileiro, Coryphopterus glaucofraenum, Bathygobius mystacium, B. soporator, Ctenogobius smaragdus e C. Boleosoma. Os dados obtidos demonstram marcante diversidade cariotípica e morfológica entre as espécies. As inversões pericêntricas e fusões desempenham papel importante na evolução cromossômica desta família, ocasionando diferenças cariotípicas estruturais e numéricas em todas as espécies. Comparações cariotípicas e morfológicas entre amostras geográficas de B. soporator provenientes do litoral do Maranhão, Rio Grande do Norte e Bahia evidenciaram padrões citogenéticos comuns, mas padrões morfológicos diferentes. Uma amostra proveniente do Atol das Rocas revelou conspícua diferenciação cariotípica e morfológica das demais populações continentais, confirmando a presença de uma nova espécie insular. As abordagens empregadas revelam diversificações compatíveis com um grupo com características de baixa vagilidade e amplamente sujeito a seleção ambiental decorrente de exigências ecológicas peculiares. Palavras-Chave: Gobiidae, evolução cariotípica, morfometria geométrica, Coryphopterus, Bathygobius, Ctenogobius.

15 ABSTRACT The fishes of the order Perciformes are characterized as an important model for understanding the genetic structure of marine populations, because besides they present examples of conservation chromosomal, also they present the karyotype diversification for some groups. Gobiidae family is the most specious in the marine environment. Among its representatives, many species are part of a cryptic fauna little noticed and studied, a wide distribution with behavioral and reproductive characteristics, that make them conducive to the action of biogeographical barriers. Morphologically this family presents reduced body structures through simplification and regressions. Despite their importance in evolutionary inferences, cytogenetics data are incipient facing their species diversity, especially with western Atlantic species. In order to estimate the evolutionary diversity in Gobiidae, it were developed cytogenetic analysis and the standards body, through geometric morphometrics in five species on the Brazilian coast, Coryphopterus glaucofraenum, Bathygobius mystacium, B. soporator, Ctenogobius smaragdus e C. Boleosoma. The data show significant karyotype and morphological diversity among the species. The pericentric inversions and mergers play an important role in chromosomal evolution of this family, causing karyotypic structural and numerical differences in all species. Karyotypic and morphological comparisons among geographic samples of B. soporator from the coast of Maranhão, Rio Grande do Norte and Bahia showed cytogenetics patterns commons, but different morphological patterns. A sample from the Atol das Rocas revealed conspicuous morphological and karyotypic differentiation of another continental populations, confirming the presence of a new island species. The approaches done reveal diversification consistent with characteristics of a group of low vagile and largely able to environmental selection due from peculiar ecological requirements. Keywords: Gobiidae, karyotype evolution, geometric morphometry, Coryphopterus, Bathygobius, Ctenogobius.

16 1 1. INTRODUÇÃO 1.1 Principal componente vertebrado marinho Os peixes constituem um grupo polifilético com certa de espécies, o que corresponde a mais da metade das formas vivas de vertebrados. Deste total, cerca de 60% vive no ambiente marinho e a sua maioria habita as zonas costeiras (Nelson, 2006). Representam o grupo de vertebrados com maior êxito em termos de diversificação devido à grande variabilidade de habitats presentes no meio marinho e dulcícola. A ordem Perciformes com espécies é a mais diversificada de todas as ordens de peixes, dominantes nos oceanos e em muitos ambientes dulcícolas tropicais e subtropicais. Dentre os Perciformes a subordem Gobioidei possui um número estimado de aproximadamente espécies, distribuídas em 270 gêneros, correspondendo a aproximadamente 22% dos Perciformes (Pezold, 1984; Nelson, 2006). Nesta subordem, a família Gobiidae é a que apresenta maior número de espécies (Robertson, 1998; Nelson, 2006), considerada monofilética, possui 210 gêneros e um número estimado de espécies (Pezold, 1984; Tracker, 2003; Nelson, 2006), o que corresponde a cerca de 88% da subordem Gobioidei (Pezold, 1993). Gobiidae compartilha características crípticas, tanto morfológicas, biológicas e comportamentais, que aliadas a grande quantidade de espécies e ao número insuficiente de informações biológicas existentes, contribui para a imprecisão em algumas caracterizações taxonômicas. Anatomicamente apresentam suas nadadeiras pélvicas fundidas formando um disco de sucção que auxilia o animal em seu posicionamento no ambiente, além disso, exibem nadadeiras dorsais separadas, primeira nadadeira dorsal com espinhos, olhos grandes e ausência de linha lateral (Nelson, 2006) (Figura 1). A maior parte das espécies é bentônica, vivendo em tocas ou esconderijos em ambientes marinhos e estuarinos. Contudo, algumas formas exibem inúmeras adaptações ecológicas, como por exemplo, formas nectônicas ou habilidade para respirar o oxigênio atmosférico (Robertson,

17 2 1998; Tracker, 2003). Quanto aos aspectos biogeográficos, este grupo demonstra-se amplamente distribuído podendo ser encontrado ao longo do Atlântico, Pacífico e Índico em áreas tropicais, subtropicais e temperadas (Menezes & Figueiredo, 1985; Mendes, 2000; Tracker, 2003; Nelson, 2006). Apresenta representante em habitats estuarinos e dulcícolas, freqüentemente sendo os mais abundantes em água doce no interior de ilhas oceânicas (Nelson, 2006). a b Figura 1. Desenho morfológico esquemático de Gobiidae (gênero Bathygobius). Em destaque (a) nadadeiras dorsais separadas, primeira nadadeira dorsal com raios, olhos grandes, ausência de linha lateral; (b) nadadeiras pélvicas fusionadas presentes na maioria das espécies (adaptado de Nelson, 2006). Os Gobídeos representam elementos dominantes em habitats bentônicos nos recifes tropicais, podendo ser morfologicamente crípticos em relação a membros da própria família e outras como Labrisomidae, Blenniidae (Sale, 1991; Galvão, 2006) e Eleotridae, em áreas estuarinas. A maior parte das espécies apresenta tamanho reduzido, não ultrapassando 10 cm de comprimento, seu maior representante Glossogobius giuris, atinge cerca de 50 cm e o menor Trimmatom nanus corresponde ao menor vertebrado existente, uma fêmea madura atinge 8-10mm (Nelson, 2006). Seus hábitos alimentares são diversos, sendo em sua maioria carnívoros e onívoros, com alguns representantes herbívoros. Muitas espécies que vivem próximas a costa, se alimentam principalmente de invertebrados bentônicos e algas. Em contraste a esta situação, espécies em habitats recifais podem apresentar hábitos alimentares mais especializados. Diversas espécies são semi-pelágicas e se alimentam de copépodas planctônicos. Espécies

18 3 dulcícolas muitas vezes se alimentam de diatomáceas e microalgas (Emmanuel & Ajibola, 2010). É comum uma estreita associação entre diferentes espécies de gobídeos com outros animais, como esponjas, moréias, camarões e ouriços do mar. Espécies de pequeno porte podem estar associadas a peixes maiores, alimentando-se de ectoparasitas e realizando a limpeza destes (Colin, 1975). Os representantes de Gobiidae apresentam considerável importância ecológica e comercial, sua elevada abundância em determinadas localidades os tornam um componente fundamental na cadeia alimentar (De Sylva, 1975). Várias espécies são pescadas e comercializadas de forma significativa, onde são utilizados como iscas na pesca de peixes de maior porte (Emmanuel & Ajibola, 2010). Em diversos países Ocidentais devido suas cores exuberantes, comportamentos peculiares e tamanhos apropriados, algumas espécies são intensamente comercializadas no segmento da aquariofilia, compondo de 5 a 7 % das vendas no mercado mundial de peixes ornamentais marinhos (Wabnitiz et al., 2003). No Brasil a espécie Elacatinus figaro já foi uma das mais importantes no comércio de exportação de peixes ornamentais marinhos do país (Gasparini et al., 2005), mas atualmente encontra-se na lista de espécies ameaçadas de extinção, resguardada do extrativismo (IBAMA, 2004). A diversidade de espécies, amplo padrão de distribuição, características ecológicas e comportamentais peculiares, evidenciadas por representes da família Gobiidae demonstram a grande capacidade adaptativa dos peixes que a compõe, cuja carência de informações existentes para o grupo, os torna importante modelo para análises evolutivas no ambiente marinho. 1.2 Aspectos citogenéticos da família Gobiidae Os Perciformes apresentam tanto exemplos de conservação cromossômica, compartilhada por muitas espécies, quanto de diversificação cariotípica em alguns grupos (Brum & Galetti, 1997), dos quais, polimorfismos cromossômicos numéricos e estruturais, além de vários sistemas sexuais recorrentes (Galetti et al., 2000). Aproximadamente 8% das espécies de Perciformes foram cariotipadas (Galetti et al., 2000; Afonso & Galetti, 2005;

19 4 Galetti et al., 2006; Molina & Bacurau, 2006). Apesar da maioria dos seus representantes serem marinhos, neste ambiente apenas 2% das espécies apresentam dados citogenéticos (Almeida-Toledo et al., 1993; Brum, 1996). Cerca de 60% dos Perciformes estudados até então, apresentam um cariótipo caracterizado por 48 cromossomos monobraquiais, o que faz acreditar que este seja um caráter plesiomórfico para o grupo (Galetti et al., 2000). As informações cariotípicas disponíveis para Perciformes marinhos têm confirmado esta hipótese (Klinkhardt et al., 1995; Brum & Galetti, 1997), o que demonstra para estas espécies que a especiação em alguns grupos, parece não ter sido seguida por diferenciação cariotípica significante. A família Gobiidae destaca-se por apresentar grande diversidade cariotípica (Galetti et al., 2000), com cariótipos variando de 2n=30, em Neogobius euricephalus (Ene, 2003), a 2n=52, em Gobius niger (Vitturi & Catalano, 1989). Apesar da grande diversidade cariotípica, a família exibe com maior freqüência espécies que apresentam valores diploides com 44, 46 e 48 cromossomos (Ene, 2003). Dados cromossômicos estão disponíveis para aproximadamente 4,5% das espécies da família Gobiidae (Klinkhardt et al., 1995), sendo a sua maioria restrito a identificação dos valores diplóides e da macroestrutura cariotípica (Caputo, 1998). No litoral brasileiro são encontradas cerca de 40 espécies de Gobiidae (Menezes et al., 2003), destas apenas duas possuem dados citogenéticos, Bathygobius soporator, com 2n=48 e Awaous strigatus, com 2n=46 (Brum et al.,1996; Souza et al., 1998; Cipriano et al., 2002). Para representantes da ordem Perciformes, um dos mecanismos que permite explicar a existência de diversificação cromossômica estrutural, é a ocorrência de inversões pericêntricas, que constituem os rearranjos cromossômicos mais frequentes nessa ordem (Cano et al., 1982; Galetti et al., 2000; Ueno & Takai, 2000; Molina & Galetti, 2004). A variabilidade numérica derivada de processos de fissão e fusão tem sido relatada em algumas famílias como Pomacentridae, Labridae, Apogonidae, entre outras (Molina & Galetti, 2002; Sena & Molina, 2007; Araújo et al., 2010). Em Gobiidae rearranjos Robertsonianos estão entre os principais mecanismos de diferenciação cromossômica (Thode et al., 1988; Amores et al., 1990; Vasil ev & Grigoryan, 1993; Caputo et al., 1997; Galetti et al., 2000; Ene, 2003).

20 5 A presença de variabilidade cariotípica intra e interpopulacional foram constatadas em algumas espécies da família como, por exemplo, Aphia minuta que apresentou cinco citótipos distintos em uma população de onze indivíduos presentes na costa de Ortona, Itália (Caputo et al., 1999). Espécies do gênero Gobius, como G. niger e G. paganellus, exibem populações cariotipicamente monomórficas (Klinkhardt, 1992; Vasil'ev & Grigoryan, 1992; Caputo et al., 1997) e populações com polimorfismo acentuado, envolvendo vários tipos de rearranjos cromossômicos (Vitturi & Catalano, 1989; Amores et al., 1990; Caputo et al., 1997). As modificações frequentes e complexas na estrutura cariotípica dos Gobídeos parecem estar ligadas ao padrão evolutivo deste grupo (Caputo et al., 1997). Embora os estudos cromossômicos em gobídeos estejam longe de ser completos, sua abrangência as espécies do oeste do Atlântico contribuirá substancialmente para o conhecimento da diversidade cariotípica e seus mecanismos regentes nesta região, o que até então é desconhecido. 1.3 A evolução refletida na morfologia Pesquisas relacionadas ao formato corporal dos organismos assumem importante papel em estudos biológicos, uma vez que podem refletir experiências biológicas e evolutivas (Bookstein, 1991; Zelditch et al., 2004), tendo como base o conceito de que o fenótipo apresentado por um organismo decorre da interação existente entre um dado genótipo e o meio ambiente em que se encontra (Ricklefs & Miles, 1994) e que a evolução de um mesmo fenótipo em populações naturais pode ser evidência de seleção natural e adaptação (Mcguigan et al., 2005). Em contrapartida, variações morfológicas podem afetar o comportamento e interação ecológica dos organismos, principalmente se levarmos em conta características físicas e químicas do ambiente (Webb, 1984). Assim, o formato corporal pode ter relevância evolutiva e ecológica para um dado organismo (Klingenberg et al., 2003). Diante disto, análises de estruturas morfológicas como as morfométricas podem ser de grande valia

21 6 (Schluter, 1993), sendo utilizada em distintas abordagens biológicas durante anos (Monteiro et al., 2002; Rosenberg, 2002). A morfometria é a análise da forma do corpo em relação ao tamanho através de métodos numéricos, propiciando a interpretação e comparação dos padrões de variação de caracteres quantitativos (Blackith & Reyment, 1971; Cavalcanti & Lopes, 1993). Historicamente, o estudo da variação corporal consistia em medidas relativas de estruturas anatômicas que eram analisadas por meio de arranjos canônicos, componentes principais e outros recursos estatísticos multivariados, configurando a técnica denominada de morfometria tradicional (Monteiro et al., 2002). A morfometria geométrica (MG) é um conjunto de técnicas computacionais e estatísticas, que no estudo da forma de estruturas biológicas possibilita, além de analisar e quantificar, visualizar graficamente a variação de forma da estrutura estudada, considerando simultaneamente várias características de uma estrutura corporal complexa, em que são utilizados marcos anatômicos ou landmarks (Rohlf, 1993; Monteiro & Reis, 1999). A utilização de landmarks comuns às amostras analisadas permite identificar as variações de forma entre as mesmas estruturas morfológicas nos diferentes exemplares em estudo. Na superposição de marcos anatômicos, a variação de forma é estudada nas próprias coordenadas dos mesmos, após a retirada dos efeitos de tamanho, orientação e posição. Logo, se as configurações estão centradas em um ponto comum, proporcionalizadas de forma que tenham o mesmo tamanho e rotacionadas, as coordenadas encontradas localizam um ponto no espaço de forma (Shape Space), chamado de espaço da forma de Kendall (Kendall, 1984;1989; Dryden & Mardia, 1998; Rohlf, 1999). Esta nova abordagem permite a descrição da variabilidade usando uma análise estatística robusta bem como a utilização de Thin-plate spline (TPS) para ilustrar e descrever os resultados em termos de deformações. Uma das principais inovações da MG foi a reformulação das idéias de D Arcy Thompson, que visualizava as formas biológicas como distorções de um sistema de coordenadas geométricas (Thompson, 1917).

22 7 O estudo da morfometria tem interessado diversas áreas do conhecimento mostrando-se de grande importância na compreensão da biologia evolutiva dos organismos (Blackith & Reyment, 1971). É considerada uma ferramenta muito útil na sistemática, descrição de estruturas populacionais, identificação de estoques pesqueiros, dimorfismo sexual e fornecimento de conhecimento sobre o grau de variação intra e interespecífico (Fonteles Filho,1989; Peres, et al., 1995; Ehliger, 1991; Vidales et al., 1997; Fairbairn, 1997; Baras, 1999; Silva, 2000; Fulford & Rutherford, 2000; Rapp Py- Daniel & Cox Fernandes, 2005; Aguirre & Shervette, 2005). No caso dos peixes da família Gobiidae, que representam um excepcional exemplo de especiação e diversificação, com alto índice de endemismos nos recifes tropicais, o conhecimento do grau de variação morfológico, seja ele interespecífico, intrapopulacional e interpopulacional, associada a ferramentas citogenéticas e de genética molecular, pode nos auxiliar na identificação dos mecanismos evolutivos atuantes na diversificação desta família.

23 8 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Diante das informações disponíveis o presente trabalho se propôs investigar aspectos de diversificação na família Gobiidae, analisando espécies do Atlântico, por meio de análises citogenéticas resolutivas, aliadas a análises dos padrões corporais existentes em níveis inter e intraespecíficos a fim de identificar a presença de processos evolutivos neste peculiar grupo de peixes. 2.2 Objetivos específicos Analisar citogeneticamente as espécies Bathygobius mystacium, B. soporator, Ctenogobius smaragdus, C. boleosoma e Coryphopterus glaucofraenum, utilizando coloração convencional, bandamento C, impregnação por nitrato de prata e coloração com fluorocromos baseespecíficos (CMA 3 e DAPI); Estabelecer uma comparação dos padrões morfológicos das espécies Bathygobius mystacium, B. soporator, Ctenogobius smaragdus, C. boleosoma e Coryphopterus glaucofraenum, por meio da técnica de morfometria geométrica, com fins de aferição ecomorfológica, taxonômica e sistemática; Analisar possíveis estruturações populacionais na espécie Bathygobius soporator ao longo do litoral brasileiro (MA, RN e BA) e Atol das Rocas, através da associação de características citogenéticas entre as populações dessas localidades e os padrões corporais de cada população.

24 9 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Material Os exemplares da família Gobiidae, foram coletados ao longo do litoral brasileiro no litoral dos estados do Rio Grande do Norte, praia de Búzios (5 41'57.41"S, 35 11'34.71"O) e Barra do Cunhaú (6 19'15.50"S, 35 2'29.31"O), da Bahia, cidade de Salvador (13 0'39.61"S, 38 31'27.21"O), do Maranhão, cidade de São Luís (2 28'14.06"S, 44 15'49.15"O) e Atol das Rocas (3º51 S, 33º49 W) (Figura 2), com o auxílio de rede de confecção própria e sacos plásticos. Figura 2. Mapa com pontos de coleta dos exemplares da família Gobiidae. Litoral do Maranhão (MA), Rio Grande do Norte (RN), Bahia (BA) e Atol das Rocas.

25 10 As espécies utilizadas nas análises foram Bathygobius mystacium (Ginsburg, 1947), n=23; Bathygobius soporator (Valenciennes, 1837), n=170; Ctenogobius smaragdus, (Valenciennes, 1837), n=04; Ctenogobius boleosoma, (Jordan e Gilbert, 1882), n=29 e Coryphopterus glaucofraenum (Gill, 1863), n=13 (Figura 2). As mesmas foram identificadas a partir da chave de classificação de Bohlke & Chaplin (1993) e Hoese & Murdy (2002). a b c d e Figura 3. Espécies analisadas no presente estudo. a. Ctenogobius smaragdus, b. Ctenogobius boleosoma, c. Bathygobius soporator, d. Bathygobius mystacium, e. Coryphopterus glaucofraenum. Barra=1 cm. Os espécimes utilizados para estudos morfológicos e citogenéticos foram mantidos em aquários aerados até serem fotografados e submetidos ao processo de estimulação mitótica. Exemplares testemunho de cada espécie se encontram preservados em formol 5% no Laboratório de Genética de Recursos Marinhos, para posterior depósito no Museu de Ciências Morfológicas da UFRN.

26 Métodos Técnica de estimulação mitótica Os exemplares foram estimulados mitoticamente através da técnica preconizada por Molina (2001) e Molina et al. (2010), que faz uso de complexos de antígenos do ar, bacterianos e fúngicos (Munolan e Aminovac ). Este procedimento consiste na inoculação intramuscular de solução do composto (2 comprimidos/1ml de água destilada); na proporção de 1ml/50g de peso corporal, por um período de 24 a 48 horas. Decorrido este tempo, os exemplares foram anestesiados com óleo extraído de cravo (Syzygium aromaticum) (Eugenol) e posteriormente sacrificados para extração do rim cefálico Técnica de obtenção de cromossomos mitóticos A técnica de obtenção de cromossomos mitóticos adotada seguiu o método preparação in vitro descrito por Gold et al. (1990). Os exemplares tiveram o rim anterior (cefálico) e posterior removidos e utilizados para obtenção de suspensão celular. Estes foram colocados em 9 ml de meio de cultura RPMI 1640 e dissociados com ajuda de seringas de vidro, transferindo o material logo em seguida para tubos falcon de 15ml, completando o volume até 10ml do mesmo. Foi adicionada solução de colchicina 0,025% por 30 minutos, para cessar a divisão mitótica, deixando agir em temperatura ambiente. Em seguida o material foi centrifugado por 10 minutos a 900rpm. Após o excedente ser removido acrescentamos 9 ml de solução hipotônica de KCl (0,075M), por 28 a 30 minutos em temperatura ambiente, ao término novamente centrifugado por 10 minutos. Solução fixadora de metanol e ácido acético (3:1) foi utilizada para fixação do material em três ciclos de centrifugação por 10 minutos, sendo o material conservado à -20ºC em tubos de 1,5ml com tampa para análises posteriores.

27 Preparação das lâminas Um total de três ou quatro gotas de suspensão celular foram gotejadas sobre uma lâmina recoberta com um filme d água destilada aquecida à 60 o C, após secar ao ar, foi corada com solução Giemsa 5%, diluído em tampão fosfato ph 6,8, por um período de 08 minutos, posteriormente lavada com água destilada e seca ao ar Análises cromossômicas Lâminas previamente preparadas com as suspensões celulares de cada indivíduo foram analisadas através de microscópio óptico, sob o aumento de 1000 vezes. Uma média de 30 metáfases foi analisada para cada exemplar, visando o estabelecimento do valor diploide modal para cada espécie e a definição dos tipos cromossômicos. As melhores metáfases foram fotografadas em fotomicroscópio de epifluorescência (Olympus TM BX50), sob aumento de 1000X, por meio de sistema digital de captura (DP70, Olympus), com o uso dos software DPController, v (Olympus Optical Co. Ltd.) e utilizadas na definição da fórmula cromossômica e construção do cariótipo. Os cromossomos foram definidos quanto à posição dos centrômeros em metacêntricos (m), com a razão entre o braço maior e menor (RB) variando de 1,00 a 1,70; submetacêntricos (sm), RB = 1,71 3,00; subtelocêntricos (st), RB = 3,01 7,00; e acrocêntricos (a), RB > 7,01 (Levan et al., 1964) Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs) As regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foram evidenciadas de acordo com a técnica descrita por Howell e Black (1980), com pequenas modificações. Uma solução gelatinosa contendo 1g de gelatina incolor acrescido de 50 ml de água e 0,5ml de ácido fórmico foi depositada na lâmina, misturada a quatro gotas de nitrato de prata (Ag-NO 3 ) 50%, cobrindo-a em seguida com lamínula. Logo após foi incubada em estufa a 60ºC entre cinto a oito minutos, até que uma coloração âmbar aparecesse. Ao término do

28 13 processo a lâmina foi lavada com água destilada, seca ao ar e analisada ao microscópio Detecção de Heterocromatina Constitutiva (Banda-C) A observação de regiões de heterocromatina constitutiva foi realizada de acordo com o método desenvolvido por Summer (1972) com pequenas alterações, visando uma melhor qualidade das preparações. Inicialmente as lâminas foram imersas em HCl 0,2 N à temperatura ambiente, por 14 minutos, lavando-a logo em seguida em água destilada e seca ao ar. Após isto, as lâminas foram incubadas numa solução saturada de Ba(OH) 2.8H 2 O, à 5%, durante um período de 1 à 2 minutos à 42ºC. Após incubação foram expostas à HCl 0,2N rapidamente, lavadas com água destilada e mantidas em solução de 2xSSC à 60ºC por uma hora, sendo posteriormente coradas com solução à 5% de Giemsa diluído em tampão fosfato, ph 6,8 por 6 minutos e visualizadas ao microscópio Coloração com Fluorocromos base-específicos Para a dupla coloração com os fluorocromos CMA 3 e DAPI, as lâminas foram envelhecidas por três dias, coradas com 30 µl de CMA 3 0,5 mg/ml por 2 horas, e em seguida coradas com 30 µl de DAPI 2 µl/ml por 30 minutos, segundo metodologia preconizada por (Carvalho et al., 2005), com algumas modificações. Posteriormente as lâminas foram montadas em tampão glicerol- McIlvaine ph 7,0 (1:1), preservadas em câmara escura, por três dias e então analisadas. As metáfases foram fotografadas em fotomicroscópio de epifluorescência (Olympus TM BX50) com filtros apropriados em aumento de 1000X Análises por Morfometria Geométrica Para a análise da morfometria geométrica, imagens no formato JPEG com dimensão 3264x2448, foram obtidas da face lateral esquerda dos

29 14 espécimes, com escala métrica, utilizando-se uma câmera digital Sony H10 (8,1 megapixels) acoplada a um tripé VF WT3540. O programa tpsutil foi utilizado para ordenar as imagens dos espécimes num único arquivo com o formato TPS, possibilitando o acesso às imagens pelos demais programas da série. O software tpsdig2 (Rohlf, 2006) foi utilizado para localizar os landmarks ou marcos anatômicos nas imagens, que posteriormente foram utilizadas nas análises morfométricas. Os landmarks foram escolhidos segundo a classificação de Bookstein (1991), sendo nove utilizados para estudos interpopulacionais e onze para distinção de espécies. As coordenadas referentes ao posicionamento espacial de cada landmark foram sobrepostas utilizando-se o software CoordGen6. Com a utilização do software CVAGen6, análises das variáveis canônicas (VC) e MANOVA permitiram comparações morfométricas entre as espécies, populações e testes de alocação. O programa MorphoJ 1.02b possibilitou a quantificação do discernimento morfológico através da distância de Mahalanobis, ANOVA e a formação dos grides de deformação à partir da variável canônica que se mostrou mais significativa.

30 Capítulo I Caracterização da diversidade na família Gobiidae por meio da citogenética e morfometria geométrica Lima Filho, P. A. & Molina, W. F. Resumo A família Gobiidae é a mais especiosa no ambiente marinho, apresenta características morfológicas com simplificações e perdas em estruturas corpóreas. Tamanha diversidade parece ter sido acompanhada por alterações cromossômicas significativas quando comparada a outros representantes da Ordem Perciformes com elevado conservadorismo cromossômico. Poucas informações citogenéticas estão disponíveis para espécies sul-americanas. Neste trabalho cinco espécies de gobídeos do Atlântico foram caracterizadas citogeneticamente por meio de coloração convencional com Giemsa, bandamento C, identificação de cístrons ribossomais pela técnica de Ag-RONs, coloração com os fluorocromos CMA 3 /DAPI e comparadas morfologicamente por meio da morfometria geométrica. Identificou-se uma marcante diversidade cariotípica entre as espécies Coryphopterus glaucofraenum (2n=40; 2sm+38a; NF=42), Ctenogobius smaragdus (2n=48; 2sm+42a; NF=50), Ctenogobius boleosoma (2n=44; 2sm+42a; NF=46), Bathygobius mystacium (2n=48; 2m+4st+42a; NF=54) e Bathygobius soporator (2n=48; 2m+6st+40a; NF=56). Quanto aos padrões morfológicos todas as cinco espécies apresentam perfis morfológicos distintos, contudo exibem maior proximidade morfológica entre espécies cogenéricas. Os dados cromossômicos ressaltam o papel das inversões pericêntricas, fusões e fissão na evolução cariotípica do grupo. A diversidade cariotípica e morfológica presente nesta família sugerem uma dinâmica na evolução compatível com grupos dulcícolas sujeitos a intensas fragmentações populacionais, aliado a diversificações morfológicas adequadas a exploração de habitats peculiares. Palavras-chave: Gobiidae; diversidade cariotípica; morfometria geométrica; citogenética de peixes.

31 16 Characterization of the diversity of Gobiidae family by cytogenetics and geometric morphometrics Lima Filho, P. A. & Molina, W. F. Abstract Gobiidae family is the most specious in the marine environment, it shows morphologic features with simplifications and losses on body structure. Such diversity seems to have been accompanied by chromosomal changes significantly when compared to others representatives of the order Perciformes with high chromosomal conservatism. Few cytogenetic informations are available for South American species. In this study five species of Atlantic gobídeos were characterized cytogenetically by conventional Giemsa staining, C banding, identification of ribosomal cistrons by the technique of Ag-NORs, staining with the fluorochromes CMA 3 /DAPI, and also compared morphologically and by means of geometric morphometry. It was identified a remarkable karyotypic diversity among species Coryphopterus glaucofraenum (2n=40; 2sm+38a; NF=42), Ctenogobius smaragdus (2n=48; 2sm+42a; NF=50), Ctenogobius boleosoma (2n=44; 2sm+42a; NF=46), Bathygobius mystacium (2n=48; 2m+4st+42a; NF=54) e Bathygobius soporator (2n=48; 2m+6st+40a; NF=56). Against to the morphologic patterns, all five species have distinct morphological profiles, but exhibit greater proximity among morphological species co-generics. Chromosomes data underscore the role of pericentric inversions, merges and fission in karyotype evolution of the group. The karyotypic and morphological diversity present in this family suggests a dynamic evolution compatible with freshwater groups vulnerable to intense population fragmentation, morphological diversification with appropriate exploration of peculiar habitats. Keywords: Gobiidae, karyotypic diversity, geometric morphometrics, cytogenetics of fishes.

32 17 Introdução Os peixes da família Gobiidae estão distribuídos nas regiões tropical, subtropical e temperada em habitats costeiros e dulcícolas. Com cerca de espécies, representam a maior família de peixes marinhos (Nelson, 2006), componente importante e predominante da fauna de peixes em ambientes recifais. Devido à ocorrência de espécies morfologicamente crípticas e de difícil amostragem, a biologia deste grupo permanece pouco estudada (Thacker, 2003). Na costa brasileira existem cerca de 40 espécies (Menezes et al., 2003), sendo a sua maioria compartilhada com a fauna caribenha. Contrastando com outros grupos de Perciformes marinhos, a família Gobiidae apresenta elevada diversidade cariotípica, o que a torna um modelo particularmente importante para o entendimento da estrutura genética de populações marinhas (Brum & Galetti, 1997). No que diz respeito aos aspectos citogenéticos, a maioria das informacões para este grupo estão resumidas prioritariamente a descrições numéricas e de morfologia cromossômica que apesar da pouca ajuda no esclarecimento de relações filogenéticas (Ene, 2003; Caputo et al., 1997), contribui substancialmente para o conhecimento da sua diversidade para família (Vasil ev & Grigoryan, 1993). Estudos citogenéticos demonstraram uma tendência à ocorrência de translocações Robertsonianas para a família, com demonstrações de variações cromossômicas intra e interpopulacionais (Ene, 2003). A dificuldade em classificar e identificar representates da família Gobiidae, ocorre devido às características morfológicas escassas e marcante variação morfológica interpopulacional (Springer, 1983; Winterbottom, 1984), gerando para muitas espécies confusões taxonômicas e de nomenclatura (Kottelat, 1997). No entanto, o uso de análises por morfometria geométrica já utilizada com sucesso em diversos grupos de peixes (e. Ibañez et al., 2007; Maderbacher et al., 2008; Chizinski et al., 2010), que permite identificar variações geométricas da forma, com base numa configuração de pontos anatômicos com redução dos efeitos inerentes ao tamanho, a localização e a posição estrutural ocupada (Monteiro et al., 2002; Parsons et al., 2003), não foi aplicada em espécies desta família com vistas a estabelecer comparações ecomorfológicas e identificar diferenciações entre populações e espécies.

33 18 Em alguns grupos de peixes a estrutura cariotípica parece ter sofrido poucas mudanças evolutivas quando comparadas às mudanças morfológicas (Molina et al., 2002; Motta Neto & Molina, 2010). Não está claro se entre os Gobiidae, diferentemente de inúmeras outras famílias de Perciformes (Molina, 2006), existem divergências nas taxas evolutivas entre os padrões cromossômicos e morfológicos. Neste sentido, a fim de se obter melhor compreensão da diversificação cromossômica e mofológica desta família, aqui são apresentados os primeiros registros citogenéticos de cinco espécies do Oeste do Atlântico, cujos padrões são comparados citogeneticamente em associação com seus caracteres ecomorfométricos. Material e métodos Foi coletado um total de 119 exemplares de cinco diferentes espécies de Gobiidae (Tabela 1) provenientes do litoral do Estado do Rio Grande do Norte (RN) (Praia de Búzios - 5º 46 S, 35º 12 W) e estuário de Barra do Cunhaú (6 19'15.50"S, 35 2'29.31"O), NE do Brasil. Deste total apenas a espécie Ctenogobius smaragdus foi coletada no estuário de Barra do Cunhaú e as demais proveniente da praia de Búzios. Os espécimes foram capturados com uso de rede de confecção própria, transferidos às dependências do laboratório de Genética de Recursos Marinhos na UFRN e mantidos em aquários aerados até serem fotografados para análises morfológicas e se procedesse à realização de preparações cromossômicas. Análises citogenéticas Precedente aos métodos de obtenção de cromossomos metafásicos, os exemplares foram submetidos à estimulação mitótica, in vivo com duas aplicações intramuscular/peritoneal de Aminovac (complexo de antígenos bacterianos e fúngicos) na razão de um comprimido diluído em 0,5 ml de água na proporção de 100 g de peso do animal (Molina et al., 2010). Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de células do rim anterior, segundo Gold et al. (1990). Cerca de trinta metáfases foram

34 19 analisadas de cada exemplar para se estabelecer o número modal, sendo que, as melhores metáfases foram fotografadas em um microscópio Olympus TM BX50, (1000x), acoplado à uma câmera digital (Olympus, modelo DP70), e utilizadas na confecção do cariótipo. A morfologia cromossômica foi determinada de acordo com Levan et al. (1964). As regiões heterocromáticas foram evidenciadas a partir da metodologia desenvolvida por Sumner (1972), enquanto que a detecção das Ag-RONs foi realizada conforme a técnica descrita por Howell & Black (1980). A coloração com os fluorocromos CMA 3 e DAPI seguiu o protocolo de Carvalho et al. (2005). Tabela 1. Número de indivíduos utilizados para estudos morfométricos e citogenéticos. Espécies Análises citogenéticas Análises morfométricas Coryphopterus glaucofraenum (05, 03 ) 13 Ctenogobius boleosoma (02, 03 ) 29 Ctenogobius smaragdus (02, 02 ) 04 Bathygobius mystacium (02, 02 ) 23 Bathygobius soporator (09, 11 ) 50 Total Análises morfológicas Para as análises por morfometria geométrica (MG), imagens no formato JPEG com dimensão 3264x2448, foram obtidas da face lateral esquerda dos espécimes, com escala de métrica, utilizando-se uma câmera digital Sony H10 (8,1 megapixels) acoplada a um tripé VF WT3540. O programa tpsutil foi utilizado para ordenar as imagens dos espécimes num único arquivo com o formato TPS. O software tpsdig2 (Rohlf, 2006) foi utilizado para localizar 11 landmarks nas imagens (Figura 1), escolhidos segundo a classificação de Bookstein (1991). As coordenadas referentes ao posicionamento espacial de cada landmark foram sobrepostas utilizando-se o software CoordGen6.

35 20 Com a utilização do software CVAGen6, análises das variáveis canônicas (VC) e MANOVA permitiram comparações morfométricas entre as espécies, testes de alocação e agrupamentos. Para realizar o teste estatístico ANOVA, D 2 (distância de Mahanalobis) e gerar matrizes (Gride) de deformação comparativa, utilizou-se o programa MorphoJ 1.02b. Figura 1. Imagem digitalizada de Coryphopterus glaucofraenum retratando os 11 landmarks utilizados nas análises morfológicas interespecífica em Gobiidae. Descrição esquemática dos landmarks. 1. Ponto distal do osso pré-maxilar; 2. Origem da primeira nadadeira dorsal; 3. Término da primeira nadadeira dorsal; 4. Origem da segunda nadadeira dorsal; 5. Término da segunda nadadeira dorsal; 6. Término da nadadeira anal; 7. Origem da nadadeira anal; 8. Origem da nadadeira pélvica; 9. Margem anterior ocular; 10. Margem posterior ocular; 11. Base superior da nadadeira peitoral.barra=0,5cm. Resultados As análises citogenéticas realizadas nos gobídeos C. glaucofraenum, C. boleosoma, C. smaragdus, B. mystacium e B. soporator, indicaram um número diplóide que variou de 40 a 48 cromossomos, com diferentes números fundamentais, e cariótipos constituídos por elementos metacêntricos, submetacêntricos, subtelocêntricos e na sua maioria acrocêntricos (Tabela 2). Em todas as espécies analisadas pôde-se observar Ag-RONs simples em posição terminal no braço curto de um dos maiores pares do cariótipo. A única exceção foi observada em B. mystacium, cujos sítios ribossomais ocupam posição intersticial. A coloração com os fluorocromos evidenciou um padrão CMA + 3 /DAPI - verificando-se a presença de regiões ricas em bases GC nas porções correspondentes às regiões organizadoras de nucléolos para todas as espécies. Regiões heterocromáticas ricas em GC (CMA + 3 /DAPI - )

36 21 estavam presentes na maioria dos cromossomos nas regiões centroméricas e terminais, das duas espécies do gênero Ctenogobius (Figura 4). O bandamento C revelou a presença de blocos heterocromáticos evidentes nas espécies C. smaragdus, B. soporator e B. mystacium e reduzidos em C. glaucofraenum, preferencialmente localizados na região centromérica da maioria dos cromossomos, com a presença de alguns blocos em regiões terminais para todas as espécies e em posição pericentroméricas em alguns cromossomos de B. mystacium. A espécie C. glaucoraenum apresentou seus primeiros pares acrocêntricos com tamanhos relativamente superiores (Figura 7), que configura a seu cariótipo uma redução desequilibrada de tamanho cromossômico, diferente do padrão de redução proporcional apresentado pelas demais espécies analisadas. Tabela 2. Dados citogenéticos das cinco espécies de Gobiidae analisadas. Espécies 2n Fórmula Cariotípica NF Ag-RONs Banda C CMA 3 + DAPI - Coryphopterus glaucofraenum 40 2sm+38a 42 Simples (1º T) C e T 1º T Ctenogobius boleosoma 44 2sm+42a 46 Simples (1º T) - Múltiplas Ctenogobius smaragdus 48 2sm+46a 50 Simples (1º T) C e T Múltiplas Bathygobius mystacium 48 2m+4st+42a 54 Simples (5º I) C, T e I 5º I Bathygobius soporator 48 2m+6st+40a 56 Simples (4º T) C e T 4º T Tipos cromossômicos, m=metacêntrico, sm=submetacêntrico, st=subtelocêntrico, a=acrocêntrico; T=terminal, C=centromérica, I=intersticial, NF= número fundamental, - técnica não disponível.

37 22 a b c 1º CMA3 DAPI Figura 2. Cariótipo de Ctenogobius smaragdus a partir de coloração convencional (a) bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (1º) corado com impregnação argêntea, CMA 3 e DAPI. Barra=5µm. a b 1º CMA3 DAPI Figura 3. Cariótipo de Ctenogobius boleosoma a partir de coloração convencional (a). Em destaque (b) o par organizador nucleolar (1º) corado com impregnação argêntea, CMA 3 e DAPI. Barra=5µm. a b Figura 4. Metáfase de C. smaragdus (a) e C. boleosoma (b), exibindo marcações CMA 3 + na maioria dos cromossomos em posição centromérica e terminal. Barra=5µm.

38 23 a b c 4º CMA3 DAPI Figura 5. Cariótipo de Bathygobius soporator a partir de coloração convencional (a) e bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (4º) corado com impregnação argêntea, CMA3 e DAPI. Barra=5µm. a b c 5º CMA3 DAPI Figura 6. Cariótipo de Bathygobius mystacium a partir de coloração convencional (a) e bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (5º) corado com impregnação argêntea, CMA3 e DAPI. Barra=5µm.

39 24 a b c 1º CMA3 DAPI Figura 7. Cariótipo de Coryphopterus glaucofraenum a partir de coloração convencional (a) e bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (1º) corado com impregnação argêntea, CMA 3 e DAPI. Barra=5µm. O teste de MANOVA utilizando as variáveis canônicas demonstraram alto poder discriminante onde as variáveis 1 e 2 explicaram a maior parte da variação morfológica observada (53%) para as espécies. A variação morfológica foi significante (Wilks Lambda=0.0002; X 2 = ; df=72; p<0,001; distância de Mahalanobis >6.0) entre as espécies, permitindo ainda agrupar com total precisão todos representantes das cinco espécies (Figura 8). Obteve-se maior proximidade morfológica entre as espécies cogenéricas pertencentes aos gêneros Bathygobius e Ctenogobius (Mahalanobis equivalente a 8,36 e 14,24, respectivamente), no entanto, significativamente distintas para Bathygobius. As espécies destes dois gêneros são discriminadas entre si ao longo da variável canônica 1. Os exemplares de C. Glaucofraenum são perfeitamente discriminados de B. soporator e B. mystacium pela variável canônica 2. Tabela 3. Resultados post-hoc ANOVA a partir de procrustes, classificadas com a média do centróide, efeito individual, para todos os espécimes em estudo e espécies dos gêneros Bathygobius e Ctenogobius. Grupos p F df Todos os espécimes <0, ,55 4 Bathygobius <0, ,58 1 Ctenogobius 0,36* 0,88 1 * Valor não significativo.

40 25 O gride de deformação das cinco espécies (Figura 9) evidencia variações entre todos landmarks, com modificações mais expressivas quanto ao posicionamento da boca e altura corporal. No gride referente as diferenças morfológicas entre espécies do gênero Bathygobius (Figura 10), verificamos maiores modificações quanto ao posicionamento da boca, altura corporal e base superior da nadadeira peitoral. O gride comparativo entre espécies do gênero Ctenogobius (Figura 11), demonstrou variações quanto ao tamanho do olho, posição da boca, altura corporal e tamanho da nadadeira anal. Figura 8. Distribuição dos padrões corporais das cinco espécies de Gobiidae analisadas ao longo da primeira e segunda Variável Canônica.

41 26 CV1 Figura 9. Gride de deformação a partir da primeira Variável Canônica, os vetores indicam a direção da deformação sofrida por cada landmark na representação espacial comparativa das cinco espécies de Gobiidae analisadas. CV1 Figura 10. Análise morfométrica comparativa entre B. mystacium e B. soporator, a partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa B. mystacium e o desvio vetorial à espécie B. soporator. CV1 Figura 11. Análise morfométrica comparativa, entre as espécies do gênero Ctenogobius, á partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa C. boleosoma e o desvio vetorial a espécie C. smaragdus.

42 27 Discussão Os gobídeos analisados demonstraram marcante diversidade cariotípica, tanto numérica exibido por C. boleosoma (2n=44) e C. glaucofraenum (2n=40), quanto estrutural entre as espécies C. smaragdus, B. mystacium e B. soporator, que apresentam mesmo número cromossômico (2n=48), mas divergências quanto ao número de elementos bibraquiais (NF=50, 54 e 56). As espécies já analisadas citogeneticamente da família Gobiidae demonstram cariótipos altamente variáveis (Galetti et al., 2000). Através do levantamento de dados citogenéticos disponíveis para o grupo (Tabela 4), encontram-se descrições citogenéticas de 81 espécies, o que corresponde a 4,15%, referente ao total de espécies da família, destas os números diplóides mais frequentes correspondem a 2n=44 e 46, ambos com frequência aproximada de 33%, seguido por 2n=48, com cerca de 10%. Acompanhado da diversificação numérica, identifica-se notável variação na macroestrutura cariotípica identificada por largos valores de variação para o número de braços cromossômicos (NF= 38 a 98), com valor modal de 24,7% para espécies com NF=46. Os estudos cromossômicos em gobídeos estiveram concentrados nas décadas de 70-90, desenvolvidos basicamente no continente europeu e asiático. Diante das metodologias vigentes na maioria dos casos se restringiram ao estabelecimento dos valores diplóides e macroestrutura cariotípica, oferecendo informações limitadas ao uso de abordagens filogenéticas (Caputo, 1998). Apesar disso, os dados disponíveis sugerem diferentes mecanismos envolvidos na diferenciação cariotípica deste peculiar grupo de peixes. Os principais mecanismos são as inversões pericêntricas, fissões e fusões cêntricas, comum a muitos grupos de peixes (Amores et al., 1990; Phillips & Rab, 2001), estes últimos responsáveis pelas intensas divergências numéricas em Gobiidae (Cataudella et al., 1973; Thode et al., 1985; Amores et al., 1990, Klinkhardt, 1992; Caputo et al., 1996, 1997). Entre os rearranjos cromossômicos, as fusões robertsonianas têm sido apontadas como um dos mecanismos mais comuns envolvidos na diferenciação cariotípica deste táxon (Thode et al.,1988; Galetti et al., 2000), responsável por modificações no número e estrutura cromossômica, relatado

43 28 para várias espécies de Gobiidae presentes no Mar Negro e Mediterrâneo (Ene, 2003). Tabela 4. Dados citogenéticos disponíveis para a família Gobiidae (Perciformes). Subfamília Espécie 2n Fórmula cariotípica NF Referências Amblyopinae Odontamblyopus rubicundus** (=Gobioides 46 2m+26sm+10st+8a 84 Manna & Prasad (1974) rubicundus) O. rubicundus 46 4m+16sm+26st/a 66 Arai & Sawada (1975) Trypauchen vagina 46 12m+6sm+10st+18a 74 Khuda-Bukhsh (1978) Oxudercinae Apocryptes bato 46 24m+10sm+12a 80 Nayak & Khuda-Bukhsh (1987) Boleophthalmus boddarti 46 46m/sm 92 Subrahmanyan (1969) B. glaucus 46 12m+20sm+2st+12a 80 Manna & Prasad (1974) B. pectinirostris 46 46st/a 46 Arai & Sawada (1975) Periophthalmus modestus** 46 18m+12sm+16st/a 76 (=Periophthalmus cantonensis) Pseudapocryptes elongatus** (=Apocryptes Nayak & Khuda-Bukhsh 38 14m+22sm+2st 76 lanceolatus) (1987) Sicydiinae Sicyopterus japonicus 44 10m+10sm+24a 64 Arai & Fujiki (1979) Gobiinae Acentrogobius pflaumi 50 48m/sm+2st/a 98 Nogusa (1960) Amblygobius albimaculatus 44 2m+42st/a 46 Nishikawa et al. (1974) Aphia minuta a 44 Caputo et al. (1999) 43 42a+1st m+1st+40a M+1m+40a M+1st+38a 44 Bathygobius fuscus 48 48a 48 Arai & Sawada (1975) B. mystacium 48 2m+4st+42a 54 Presente estudo B. soporator 48 2m+46a 50 Brum et al. (1996) 2m/sm+46a 50 Cipriano et al. (2002) B. soporator 48 2m+6st+40a 56 Presente estudo Coryphopterus glaucofraenum 40 2sm+38a 42 Presente estudo Elacatinus macrodon** (=Gobiosoma macrodon) E. zebrella** (=Gobiosoma zebrella) 38 38a 38 Musammil (1974) 38 38a 38 Glossogobius fasciatopunctatus 44 10m+28sm+2st+4a 84 Fei & Tao (1987) G. giuris 46 46a 46 Rishi & Singh (1982) Gobiodon citrinus 44 2m+42st/a 46 Arai & Sawada (1974) 43 1m+42st/a 44 G. quinquestrigatus 44 44a 44 Arai & Fujiki (1979) G. rivulatus 44 44a 44 Gobius bucchichi 44 2sm+42a 46 Thode & Alvarez (1983) G. cobitis 46 46a 46 Caputo et al. (1997) G. cruentatus 46 2st+44a 48 Thode & Alvarez (1983) G. fallax m/sm+30a 46 Thode et al. (1988) 39 7m/sm+32a m/sm+34a m/sm+33a m/sm+36a m/sm+38a m/sm+40a 46 G. niger m+4sm+16st+30a 74 Vitturi & Catalano (1989) 51 3m+4sm+16st+28a 74 Caputo et al. (1997) 50 4m+4sm+16st+26a m+4sm+16st+24a 74 G. paganellus sm+46a 50 Gobiusculus flavescens 46 6m/sm+40a 52 Klinkhardt (1992) Mesogobius batrachocephalus 30 16m+14a 46 Ivanov (1975) Neogobius melanostomus** (=N. cephalarges) 46 46a 46 Vasil ev (1985) N. fluviatilis 46 46a 46 N. gymnotrachelus a 46 Vasil ev & Grogoryan(1992) N. melanostomus 46 46a 46 Vasil ev (1985) N. rhodioni 46 46a 46 Vasil ev & Vasilieva (1994)

44 29 Padogobius bonelli** (= P. martensi) 46 1m+3sm+2st+40a 52 Cataudella et al. (1973) Pomatoschistus lozanoi 37 3m+12sm+10st+12a 62 Webb (1980) P. microps 46 4m+16sm+20st+6a 86 Klinkhardt (1989) P. minutus 46 4m+16sm+16st+10a 82 18sm+18st+10a 82 P. norvegicus 32 10m+10sm+8st+4a 60 Webb (1980) P. pictus 46 22m/sm+12st+12a 80 Klinkhardt (1992) Ponticola constructor** (=Neogobius constructor) m/sm+38a 46 Vasil ev & Vasilieva (1994) P. cyrius** (=Neogobius cyrius) P. eurycephalus** (=Neogobius 1 eurycephalus) 32 12m+2sm+18a 46 Ene (2003) 31 13m+2sm+16a 46 Ene (2003) 30 14m+2sm+14a 46 P. kessleri** (=Neogobius kessleri) 46 46a 46 Vasil ev (1985) Proterorhinus marmoratus 46 46a 46 Rab (1985) Rhinogobius similis** (=Gobius similis) Nogusa (1960) Zosterisessor ophiocephalus (=Gobius 1 ophiocephalus) 46 2m/sm+44a 48 Caputo et al. (1996) Z. ophiocephalus 46 46a 46 Vasil ev (1985) 45 1st+45a 47 Gobionellinae Acanthogobius lactipes** (=Aboma lactipes) 40 40a 40 Arai & Sawada (1974) A. flavimanus 44 44st/a 44 36st+8a 80 Arai & Kobayashi (1973) 10m/sm/st+34a 54 Arai & Sawada (1975) Awaous grammepomus 46 46st/a 46 Khuda-Bukhsh & Barat (1987) A. strigatus 46 ( ) X1X1X2X2 -- Souza et al. (1998) 45 ( )X1X2Y -- A. tajasica 46 46a 46 Stange & Passamani (1986) Chaenogobius annularis 44 18sm+26st/a 62 Arai & Sawada (1975) 36m/sm+8a 80 Arai et al. (1974) 44a 44 Nogusa (1960) Gymnogobius castaneus** (=Chaenogobius castaneus) 44 36m/sm/st+8a 80 Nishikawa et al. (1974) G. isaza**(=chaenogobius isaza) 44 12sm+32st/a 56 Arai & Sawada (1975) G. urotaenia** (=Chaenogobius urotaenia) Nogusa (1960) 42 14sm+28a 56 Yamada (1967) Chaenogobius annularis** (=Chasmichthys dolichognatus) 44 44st/a 44 Arai & Sawada (1975) Chasmichthys gulosus 44 44st/a 44 16m/sm/st+28a 60 Nishikawa et al. (1974) Ctenogobius boleosoma 44 2sm+42a 46 Presente estudo C. smaragdus 48 2sm+46a 50 Presente estudo C. shufeldti** (=Gobionellus shufeldti) 48 48a ( ) 48 Pezold (1984) 47 46a+1m ( ) 48 Mugilogobius abei** (=Gobius abei) Nogusa (1960) Gillichthys mirabilis 44 12sm+32a 56 Chen & Ebeling (1971) Luciogobius grandis Arai (1981) L. guttatus Arai & Kobayashi (1973) Pterogobius elapoides 44 14sm+30st 88 P. zonoleucus 44 14sm+30st 88 Arai & Sawada (1975) Quietula guaymasiae 42 6m+4sm+32a 52 Cook (1978) Q. y-cauda 42 42a 42 Rhinogobius brunneus 44 44a 44 Nishikawa et al. (1974) R. flumineus 44 44a 44 Arai & Kobayashi (1973) R. flumineus** (=Tukugobius flumineus) 44 44a 44 Nadamitsu (1974) R. giurinus 44 44a 44 Nishikawa et al. (1974) Tridentiger obscurus 44 10m/sm+34a 54 Arai et al. (1974) T. trigonocephalus 44 28m/sm/st+16a 72 Arai et al. (1973)

45 sm+6st+24a 68 Fei & Tao (1987) Yongeichthys criniger** (=Ctenogobius criniger) 50 34m/sm+6st+10a 90 Arai & Sawada (1974) **Nomenclatura válida para a espécie; 1 Espécies que apresentam polimorfismos cromossômicos decorrentes de fusão Robertsoniana. Os rearranjos cromossômicos aparentemente envolvidos na diversificação de Gobiinae (e. B. soporator, B. mystacium e C. glaucofraenum) e Gobionellinae (e. C. boleosoma e C. smaragdus) são as inversões pericêntricas, mecanismo de diversificação mais frequente em Perciformes (Molina & Galetti, 2004), e fusões em tandem ou robertsonianas. Sugere-se um cariótipo basal para Gobiidae caracterizado por 2n=46 cromossomos acrocêntricos, a partir do qual o aumento do número de cromossomos bi-braquiais representaria cariótipos mais derivados (Vasil ev & Grigoryan, 1993). Apesar de C. glaucofraenum apresentar 2n=40, número inferior ao considerado basal, os primeiros pares acrocêntricos apresentam tamanho superior de forma desproporcional em relação aos demais, indicando a ocorrência de fusão em tandem para a formação dos mesmos, mecanismo comum observado na diversificação cariotípica de outros gobídeos como G. paganellus (Amores et al., 1990). Apresentando cariótipos caracterizados por 2n=48, as espécies C. smaragdus, B. mystacium e B. soporator, possuem padrões cariotípicos considerados derivados para família, com possibilidade de ação de diferentes processos à estruturação cromossômica dessas espécies. É provável que inversões pericentroméricas seguidas de fissões cromossômicas, tenham fornecido um passo crucial no estabelecimento do valor diplóide destas espécies e influenciado à formação dos valores diplóides presentes nas espécies Yongeichthys criniger (Arai & Sawada, 1974), Ctenogobius shufeldti (Pezold, 1984), Gobius niger (Vitturi & Catalano, 1989) e G. paganellus (Caputo et al., 1997). As divergências na macroestrutura cariotípica entre B. mystacium (2n=48; 2m+4st+42a) e B. soporator (2n=48; 2m+6st+40a), podem ser explicadas pela ocorrência de uma inversão pericentromérica, envolvendo as regiões portadoras dos sítios ribossomais. A presença de um número maior de elementos acrocêntricos no cariótipo de B. mystacium (NF=54) poderia indicar a ocorrência de um cariótipo basal em relação ao de B. soporator (NF=56).

46 31 Entretanto a presença de RONs intersticiais em um par cromossômico acrocêntrico em B. mystacium (5 o par) indica que inversões pericêntricas ocorreram tanto em cromossomos acrocêntricos como, neste caso, podem ter ocorrido em cromossomos bibraquiais. Outras espécies de gobídeos têm demonstrado marcações cromossômicas de Ag-RONs intercaladas a regiões heterocromáticas ricas em bases GC (Mandrioli et al., 2001; Ene, 2003), fato observado para as espécies C. glaucofraenum, C. boleosoma, C. smaragdus, B mystacium e B. soporator, podendo favorecer a ocorrência de rearranjos envolvendo os pares portadores destas regiões (Vicari et al., 2003). É provável que o cariótipo mais basal dentre as espécies analisadas, seja o de C. boleosoma (NF=46), o qual apresenta RONs em cromossomos bibraquiais, como as demais apresentam cariótipos considerados derivados para o grupo, é possível que esta localização de RONs seja uma característica plesiomórfica entre as espécies analisadas. Registros de RONs disponíveis para gobídeos são escassos, entretanto indicam diferentes padrões de disposição (Ene, 2003). Caputo (1998) identificou quatro fenótipos de RONs para gobídeos: (1) posição terminalcentromérica em braços curtos de um par de cromossomos acrocêntricos/subtelocêntricos em G. fallax (Thode et al., 1983), Potamoschistus minutus (Klinkardt, 1992; Caputo, 1998), P. pictus (Klinkardt, 1992), P. marmoratus (Caputo, 1998); (2) braços curtos de dois pares de cromossomos submetacêntricos em Gobiusculus flavescens (Klinkardt, 1992) (3) porção terminal no braço longo em Zosterisessor ophiocephalus (Caputo, 1998) e (4) intersticial/pericêntrica em um par de cromossomos acrocêntricos Gobius cobitis (Caputo, 1998). Ene (2003) aponta mais dois possíveis fenótipos, que corresponderia: (5) região pericentromérica em um par acrocêntrico Proterohinus marmoratus (Ra b, 1985) e (6) posição pericentromérica em cromossomo metacêntrico N. eurycephalus (Ene, 2003). Apesar da constatação de RONs múltiplas em Gobius fallax (Thode et al.,1983), G. paganellus (Caputo, 1998), Gobiusculus flavescens (Klinkardt, 1992) e Gobius niger (Mandrioli et al., 2001) o padrão encontrado caracterizado por marcações do tipo simples nas espécies analisadas é considerado um caráter comum não apenas aos teleósteos, como também para a maioria dos

47 32 vertebrados (Ameniya & Gold, 1986). Mesmo com total distinção entre as espécies, a partir da macroestrutura cariotípica, o mapeamento de regiões heterocromáticas, heterocromatinas GCricas e cístrons ribossomais, fornece indícios da existência em algum grau de homeologias cromossômicas entre as espécies. A presença destas regiões associadas configurando marcações simples em cromossomos de tamanho e configuração semelhante pode ser indício de uma provável manutenção de regiões cromossômicas sintênicas ao longo da diferenciação de linhagens filéticas para família Gobiidae. A presença de grandes blocos heterocromáticos nas porções terminais dos cromossomos como nos cariótipos das espécies de Gobiidae, poderia ter um papel facilitador em eventos de fusões em tandem ou robertosonianas. Nesta família, heterocromatinas heterogêneas tem sido identificadas em diversas espécies, como G. paganellus, G. niger, G. cobitis e Zosterisessor ophiocephalus (Caputo et al., 1997), o que associa a variabilidade cromossômica encontrada no grupo às características estruturais e composicionais das heterocromatinas centroméricas e teloméricas. A existência de heterocromatinas GC-ricas localizadas em posição centromérica e terminal dos cromossomos das espécies do gênero Ctenogobius, C. boleosoma e C. smaragdus, é similar aquelas encontradas na maioria dos cromossomos mono e bi-braquiais de Neogobius eurycephalus, que exibe cariótipos com 2n=30, 31, 32 e mesmo número de braços cromossômicos (NF=46), resultado de múltiplas fusões entre elementos monobraquiais (Ene, 2003). Para os peixes marinhos, onde o isolamento geográfico é menos comum que em sistemas de água doce, o surgimento de cromossomos sexuais pode ter desempenhado um papel decisivo no processo de especiação (Galetti et al., 2000), sendo gerados frequentemente por eventos robertsonianos (Almeida & Toledo, 1984; Brum et al., 1992). Em outras espécies do gênero Ctenogobius, como C. shufeldti o mecanismo de translocação robertsoniana está envolvida na origem de um sistema sexual múltiplo X 1 X 1 X 2 X 2 \X 1 X 2 Y (Pezold, 1984). De forma geral a presença de heterocromatinas ricas em bases GC equilocalmente à sítios ribossomais, têm sido também apontadas como precursoras de rearranjos em outras espécies (Vicari et al., 2003).

48 33 Diferentemente de outros grupos Perciformes (Molina, 2006), em Gobiidae existe uma estreita relação entre rearranjos cromossômicos e processo de especiação. Um fator decisivo para grande diversidade cromossômica que a família Gobiidae apresenta, parece estar relacionado à sua diversidade ecológica e evolutiva que propiciou ocupação de múltiplos habitats. A maioria dos membros desta família são bentônicos, habitantes de recifes de corais cuja alta produtividade (Fraser & Currie, 1996), elevada complexidade espacial (Lingo & Szedlmayer, 2006) e complexidade ecológica tem sido implicada nos altos níveis de diversidade (Bellwood & Wainwright, 2002). Estes fatores associados levam a uma alta taxa de cladogênese que aliado a eventos vicariantes paleogeográficos favorecem a especiação dos peixes residentes (Alfaro et al., 2007). Adaptações ecológicas se traduzem em modificações morfológicas substanciais. Muitas espécies de peixes apresentam grande variação morfológica, entretanto possuem cariótipos crípticos (Molina et al., 2005). Análises citogenéticas e de morfometria geométrica em cinco espécies da família Haemulidae, demonstraram elevada constância citogenética, e completa diversidade morfológica relacionada a adaptações ecomorfológicas funcionais para cada espécie (Motta Neto & Molina, 2010). Associadas, técnicas genéticas e de comparações morfológicas vêm sendo crescentemente utilizadas na família Gobiidae (Taylor & Hellberg, 2003; Tornabene et al., 2010), auxiliando na compreensão dos processos envolvidos na diversificação filogenética de diferentes espécies. A perfeita distinção dos padrões corporais entre as cinco espécies, associada a cariótipos conspicuamente diversos indica que o processo de especiação na família atrelou processos adaptativos a eventos alopátricos em populações capazes de fixar novos rearranjos. Esta diversidade cariotípica presente associada à morfológica, sugerem uma dinâmica na evolução cariotípica compatível com grupos dulcícolas (Cipriano et al., 2008) sujeitos a intensas fragmentações populacionais, aliado a diversificações morfológicas adequadas a exploração de habitats peculiares (Pouilly et al., 2003; Freitas et al., 2005; Ready et al., 2006; Concheiro-Pérez et al., 2007). Morfologicamente as modificações encontradas entre as espécies estão relacionadas à altura corporal, posicionamento da boca e posição da nadadeira

49 34 peitoral. Alterações no posicionamento da nadadeira peitoral e aumento da altura, refletem adaptações relacionadas ao processo de natação, com implicações diretas sobre o uso de habitat (Wainwright et al., 2002) e interações bióticas (Werner, 1977). As demais adaptações, referentes ao posicionamento ou tamanho da boca, indicam diferentes graus de especialização alimentar para as espécies, podendo estar relacionado ao tamanho potencial da presa (Piorski et al., 2005). Espécies do mesmo gênero demonstraram maior proximidade morfológica como B. soporator/ B. mystacium e C. smaragdus/ C. boleosoma, sendo as últimas não significantemente discriminadas entre si. Os perfis ecomorfológicos para Bathygobius e Ctenogobius, sugerem diferenças no padrão alimentar, devido a modificações no posicionamento da boca e características natatórias, com diferenças no posicionamento das nadadeiras peitorais, responsáveis pela elevação da parte anterior do corpo por estar à frente do centro de gravidade (Gosline, 1971) e altura corporal menor, garantindo a B. mystacium e C. boleosoma maior maneabilidade, agilidade (Breda et al., 2005) e estabilidade local (Horn & Gibson, 1988). Os representantes da família Gobiidae estudados demonstraram diversidade cariotípica e morfológica, evidência para o grupo de relação entre processo especiativo e modificação cromossômica. Devido a grande diversidade de espécies e imprecisões taxonômicas, a utilização de ferramentas citogenéticas e de morfometria geométrica associadas, podem auxiliar a identificação da composição real desta família e processos evolutivos que permitiram tamanha diversificação.

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59 Capítulo II Análises citogenéticas e morfométricas interpopulacionais no peixe marinho Bathygobius soporator (Gobiidae - Perciformes) Lima Filho, P. A. & Molina, W. F. Resumo Bathygobius soporator, também conhecido como amboré, espécie bentônica de baixa vagilidade, habitante de zonas intertidais apresenta uma extensa distribuição anfi-atlântica. Diante de condições propícias ao fracionamento populacional e indícios de ausência de coesão genética em toda sua área de distribuição, persistem dúvidas sobre o real status desta espécie. Aqui são comparadas por meio de técnicas citogenéticas e de morfometria geométrica quatro populações geograficamente distribuídas em largo espaço oceânico, ao longo do litoral brasileiro, no Maranhão (MA), Rio Grande do Norte (RN), Bahia (BA) e Atol das Rocas (AR), único atol do Atlântico. Exceto para a amostra do AR, todas as amostras exibiram um cariótipo similar, com 2n=48 cromossomos, composto por 2m+6st+40a (NF=56). As Ag-RONs são simples localizadas em posição terminal no braço curto do 4 o par (st). Blocos heterocromáticos estão distribuídos em regiões centroméricas e terminais da maioria dos pares cromossômicos. A população do AR exibe uma fórmula cariotípica diferenciada (2n=48; 28st+20a; NF=76) com ausência do par metacêntrico característico de outras populações da espécie. Os sítios ribossomais nesta amostra se apresentam sobre o braço curto do 1 o par cromossômico (st). Morfologicamente as populações continentais (MA, RN e BA) apresentam médias significativamente distintas, com alguma sobreposição em parte da amostra, entretanto exibem total distinção com a população do AR. A combinação de dados citogenéticos e morfométricos sugere que as populações continentais aparentemente se encontram respondendo a regimes seletivos distintos, mas sem indicações de divergências cromossômicas dentro do nível de análise empregado, por outro lado, os padrões conspicuamente diversos na população do Atol das Rocas, parecem confirmar a existência de uma nova espécie. Palavras-chave: Gobiidae; citogenética de peixes; Atol das Rocas; morfometria geométrica; nova espécie.

60 45 Cytogenetics and morphometric analyses interpopulation in marine fish Bathygobius soporator (Gobiidae Perciformes) Lima Filho, P. A. & Molina, W. F. Abstract Bathygobius soporator, also known as Amboró, benthic specie of low vagile, it lives in intertidal zones and it has an extensive distribution amphi-atlantic. Given the conditions conducive to population fragmentation and lack of evidence of genetic cohesiveness throughout its distribution area, there remain doubts about the real status of this species. Here, they are compared by means of cytogenetic techniques and geometric morphometric four populations geographically distributed in wide ocean, along the Brazil's coast: Maranhao (MA), Rio Grande do Norte (RN), Bahia (BA) and Atol das Rocas (AR), the only atoll in the Atlantic. Except for the sample from AR, all samples showed a similar karyotype with 2n=48 chromosomes, consisting by 2m +6 st +40 a (FN=56). As Ag-RONs are simply located in terminal position on short arm of 4 o pair (st). Heterochromatic blocks are distributed in centromeric regions and terminals of the most of the chromosomes pairs. The population from AR displays dinstinctive karyotype (2n=48; 28st+20a; NF=76) without metacentric pair, characteristic of the populations from the specie. The ribosomal sites in this sample are presented on the short arm from chromosome first pair (st). Morphologically, the continental populations (MA, RN and BA) have significantly different averages, with some overlap in the sample, however they show total distinction from AR population. The combination of cytogenetic and morphometric data suggests that continental populations are apparently responding to different selective regimes, but there are not indications of chromosomal differences within the analysis level considered, on the other hand, conspicuously different patterns in the population from Atol das Rocas, seem to confirm the new specie existence. Keywords: Gobiidae; fishes cytogenetics; Atol das Rocas, geometric morphometrics, new specie.

61 46 Introdução A família mais especiosa presente no ambiente marinho, Gobiidae é composta por indivíduos de pequeno porte presentes em todos os mares tropicais e subtropicais, sendo constituída por cerca de espécies (Nelson, 2006). Dentre os gobídeos a espécie Bathygobius soporator (Valenciennes, 1837), apresenta distribuição anfi-atlântica, no oeste do Atlântico distribui-se da Flórida (EUA) ao Rio Grande do Sul (BRA) (Cervigo n, 1966; Robins & Ray, 1986; Miller & Smith, 1989; Burns et al., 2010), e no Atlântico leste, pode ser encontrado na costa da África, do Senegal a Angola (Cervigo n, 1966; Miller & Smith, 1989; Afonso et al., 1999). Apesar da ampla distribuição geográfica, B. soporator apresenta deslocamento limitado, é uma espécie bentônica sedentária, euritérmica, eurialina (Fanta, 1997). Litorâneo residente (Demartini, 1999), pode ser encontrado em poças de maré na zona intertidal de regiões costeiras e ilhas oceânicas. Apresenta acentuado comportamento de homing (Gibson & Yoshiyama, 1999) e provavelmente quando em habitat adequado se limite a uma área reduzida por toda sua vida, uma vez que os adultos exibem fidelidade à poça ou toca (Martins et al., 2006). A princípio, tamanha distribuição geográfica pode ser explicada pela difícil caracterização de barreiras físicas absolutas no ambiente marinho, que associado a fase larval livre natante e influência de correntes marinhas, altas taxas de dispersão seriam promovidas (Imron et al., 2007), ocasionando conectividade entre as populações marinhas e possibilitando processos genéticos evolutivos interdependentes (Luttikhuizen, 2003). No entanto, com o deslocamento limitado de B. soporator associado a características reprodutivas como ovos adesivos, curto período pelágico larval (Tavolga, 1953; Peters, 1983) e características ambientais locais, sua capacidade de dispersão e efetivação em fluxo gênico torna-se questionável e o isolamento de populações, seguido de especiação, possível. Diante de condições propícias ao fracionamento populacional, não pode ser descartada a possibilidade que B. soporator constitua um complexo de espécies, como muitas outras marinhas, que a princípio detinham de grande distribuição geográfica, e foram consideradas sob um exame minucioso,

62 47 complexos morfologicamente similares, mas geneticamente distintas (Knowlton, 2000). Uma vez que a família Gobiidae apresenta elevada diversidade cariotípica (Galetti et al., 2000), e que especiações são frequentemente associadas a rearranjos cromossômicos (Mandrioli et al., 2001), visando identificar possíveis diferenciações populacionais cariotípicas e morfológicas, o presente trabalho compara populações de B. soporator geograficamente distribuídas no atlântico sul, ao longo do litoral brasileiro e no Atol das Rocas, por meio de técnicas citogenéticas e de morfometria geométrica. Material e métodos Foram coletados um total de 170 exemplares de Bathygobius soporator provenientes de quatro áreas da costa nordeste brasileira, praia do Araçagi, em São Luís (MA) (2 28'14.06"S, 44 15'49.15"O), praia do Farol da Barra, em Salvador (BA) (13 0'39.61"S, 38 31'27.21"O), praia de Búzios, em Nísia Floresta (RN) (5 41'57.41"S, 35 11'34.71"O) e Atol das Rocas (3º51 S, 33º49 W) (Tabela 1). Os espécimes foram capturados com uso de rede de confecção própria, submetidos aos protocolos de obtenção de cromossomos mitóticos e fotografados em campo, ou acondicionados em sacos plásticos com água e oxigênio e transportados às dependências do Laboratório de Genética de Recursos Marinhos na UFRN, sendo mantidos em aquários aerados até serem fotografados para análise morfológica e se procedesse à realização de preparações cromossômicas. Para identificação taxonômica utilizou-se a chave de classificação de Bohlke & Chaplin (1993). Preparações cromossômicas Precedente aos métodos de obtenção de cromossomos metafásicos, os exemplares foram submetidos à estimulação mitótica, in vivo com duas aplicações intramuscular/peritoneal de Aminovac (complexo de antígenos bacterianos e fúngicos) na razão de um comprimido diluído em 0,5 ml de água na proporção de 100g de peso do animal (Molina et al., 2010). Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de células do rim

63 48 anterior, segundo Gold et al. (1990). Cerca de trinta metáfases foram analisadas para cada exemplar para se estabelecer o número modal, sendo que, as melhores metáfases foram fotografadas em um microscópio Olympus TM BX50 (1000x), acoplado à uma câmera digital (Olympus, modelo DP70), e utilizadas na confecção do cariótipo. A morfologia cromossômica foi determinada de acordo com Levan et al. (1964). As regiões heterocromáticas foram definidas segundo Sumner (1972), a detecção das marcações Ag-RONs foi realizada conforme a técnica descrita por Howell e Black (1980). A coloração com os fluorocromos CMA 3 e DAPI seguiu o protocolo de Carvalho et al. (2005). Tabela 1: Número de indivíduos coletados, seus respectivos pontos de coleta e sua utilização para estudos morfométricos e citogenéticos. Análises Análises Pontos de Coleta morfométricas citogenéticas Maranhão (09 / 05 ) Rio Grande do Norte (09 / 11 ) Bahia (10 / 06 ) Atol das Rocas (06 / 04 ) Total *Todos os espécimes coletados foram utilizados para análises morfométricas. Análises morfológicas Para as análises por morfometria geométrica (MG), imagens no formato JPEG com dimensão 3264x2448, foram obtidas da face lateral esquerda dos espécimes, com escala métrica, utilizando-se uma câmera digital Sony H10 (8,1 megapixels) acoplada a um tripé VF WT3540. O programa tpsutil foi utilizado para ordenar as imagens dos espécimes num único arquivo com o formato TPS. O software tpsdig2 (Rohlf, 2006) foi utilizado para localizar nove landmarks nas imagens (Figura 1), escolhidos segundo a classificação de Bookstein (1991). As coordenadas referentes ao posicionamento espacial de cada landmark foram sobrepostas utilizando-se o software CoordGen6. Com a utilização do software CVAGen6, análises das variáveis canônicas (VC) e MANOVA permitiram comparações morfométricas entre as

64 49 populações, testes de alocação e agrupamentos. Para realizar o teste estatístico ANOVA, D 2 (distância de Mahanalobis) e gerar matrizes (Gride) de deformação comparativa utilizou-se o programa MorphoJ 1.02b. Figura 1. Imagem digitalizada de B. soporator retratando os nove landmarks definidos para análises morfológicas interpopulacionais. Descrição esquemática dos landmarks: 1. Extremidade distal do osso pré-maxilar; 2. Origem da primeira nadadeira dorsal; 3. Término da primeira nadadeira dorsal; 4. Origem da segunda nadadeira dorsal; 5. Término da segunda nadadeira dorsal; 6. Término da nadadeira anal; 7. Origem da nadadeira anal; 8. Origem da nadadeira pélvica; 9. Base infra-ocular medial. Barra=1,5cm. Resultados As populações de B. soporator provenientes da costa brasileira (litoral do MA, RN e BA) apresentaram características citogenéticas semelhantes, com 2n=48, e fórmula cariotípica consistindo de 2m+6st+40a (NF=56). Sítios Ag-RONs foram localizados no braço curto do quarto par cromossômico subtelocêntrico (Figura 2). Estas regiões se mostraram heterocromáticas apresentando um padrão CMA + 3 DAPI -. Além destas, o bandamento C evidenciou segmentos heterocromáticos em regiões centroméricas na maioria dos cromossomos e terminal em alguns, estendendose nos braços curtos de cromossomos subtelocêntricos. Os espécimes provenientes do Atol das Rocas demonstraram 2n=48, estrutura cariotípica de 28st+20a (NF=76) e padrões diferenciados quando submetidos aos diferentes bandamentos, comparados aos apresentados pelas demais populações. A impregnação com nitrato de prata revelou sítios Ag- RONs em posição terminal no braço curto do 1º par cromossômico (Figura 3), intercalado a blocos heterocromáticos ricos em GC (CMA + 3 /DAPI - ). O

65 50 bandamento C revelou a presença de conspícuos blocos heterocromáticos em posição centromérica em grande parte dos cromossomos, de forma mais evidente em braços curtos em todos os cromossomos subtelocêntricos. a b c 4º CMA3 DAPI Figura 2. Cariótipo de B. soporator para populações contientais (MA, RN e BA) à partir de coloração convencional (a) bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (4º) corado com impregnação argêntea, CMA 3 e DAPI. Barra= 5µm. a b c 1º CMA3 DAPI Figura 3. Cariótipo de B. soporator população do Atol das Rocas, a partir de coloração convencional (a) bandamento C (b). Em destaque (c) o par organizador nucleolar (1º) corado com impregnação argêntea, CMA 3 e DAPI. Barra= 5µm.

66 51 As populações continentais exibiram médias morfométricas significativamente diferentes (Figura 5), embora apresentem indivíduos com morfologia intermediária entre os grupos (Tabela 2). A população do Atol das Rocas por sua vez, apresentou total distinção morfológica (distância de Mahalanobis >4,9) em relação a todas as populações continentais (Figura 4). Tabela 2. Porcentagem de indivíduos alocados para cada população de B. soporator e suas interfaces baseados na CVA. Origem da População Identidade comum* Intermediários** N Pop. MA 76% 24% 50 Pop. RN 90% 10% 50 Pop. BA 82% 18% 50 Pop. Atol das rocas 100% 0% 20 *Porcentagem de indivíduos da população que compartilham um morfotipo comum; **morfótipos correspondentes a outras populações. Através de MANOVA, as variáveis canônicas 1 e 2 utilizadas para o estudo mostraram-se significativas para F (p<0,0001), explicando cerca de 63,5% e 30,5% respectivamente, da variação morfológica observada para as populações. Os resultados da ANOVA a partir de análises procrustes confirmaram a distinção morfológica das populações continentais (Tabela 3). Tabela 3. Resultados post-hoc ANOVA a partir de procrustes, classificadas com a média do centroide, efeito individual, entre as populações continentais. População p F df RN x MA < 0, ,69 1 RN x BA < 0, ,15 1 MA x BA < 0, ,24 1

67 52 Figura 4. Distribuição das amostras de B. soporator ao longo da primeira e segunda variável canônica (63,5% e 30,5% da variância respectivamente), a partir das variáveis morfométricas. Figura 5. Distribuição das populações continentais amostradas de B. soporator ao longo da primeira e segunda variável canônica (76,2% e 23,5% da variância respectivamente). Os símbolos em destaque indicam a média morfométrica de cada população. Ao verificarmos os grides de deformação comparativos, a partir da primeira variável canônica entre as populações, verificamos modificações em todos os landmarks. O gride comparativo formado para populações do RN x

68 53 Atol das Rocas (Figura 6) demonstra um morfotipo para espécies do AR com significativa redução no conjunto de nadadeiras dorsais e anal estabelecendo modificações no seu posicionamento, aumento corporal e da região anterior. Entre as populações do RN x MA (Figura 7) observa-se para a população do MA redução na altura corporal e modificações no posicionamento da boca e base infra-ocular medial. A comparação entre as populações RN x BA (Figura 8) aponta modificações expressivas na altura corporal, região anterior mais fusiforme e alterações no posicionamento da nadadeira anal e pélvica para população da BA. Figura 6. Gride comparativo entre população continental e insular de B. soporator, a partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa população do RN e o desvio vetorial população do Atol das Rocas. Figura 7. Gride comparativo entre populações continentais de B. soporator, a partir da variável canônica 1. Ponto médio central representa população do RN e o desvio vetorial população do Maranhão.