CITOGENÉTICA APLICADA AO ESTUDO DE BRYOPHYTAS

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1 CITOGENÉTICA APLICADA AO ESTUDO DE BRYOPHYTAS L.B. BRUM 1, S.P.S. MIOTTO 2, D.M. AYUB 3 RESUMO - Os três maiores grupos de briófitas (Anthocerotophyta, Marchantiophyta e Bryophyta) compreendem a linhagem inicial das plantas terrestres, originadas a partir de algas verdes ancestrais. A conquista do ambiente terrestre pelas plantas necessariamente passa pelas briófitas. A divisão Marchantiophyta (as hepáticas) é formada por plantas com gametófitos folhosos ou talosos. Em todas as formas, a planta haplóide é tipicamente achatada com distintas superfícies dorsal e ventral. A família Ricciaceae é constituída por hepáticas sendo o gênero Riccia o maior entre Marchantiales, com aproximadamente 150 espécies. No estado do Rio Grande do Sul, no Brasil, já foram identificadas 21 espécies. A avaliação cromossômica e genética oferece subsídios para uma melhor interpretação do parentesco entre as espécies, devido a sua grande diversidade interna na família. Visando interpretar estas diversidades e evitar o desperdício de material e tempo experimentando metodologias diferenciadas, buscou-se testar protocolos em espécies diferentes para posteriormente aplicálos em espécies da família Ricciaceae, estudos de citogenética envolvendo contagem cromossômica das mesmas estão sendo realizados, para tanto testes com a planta Allium cepa foram realizados para otimização do protocolo de coloração e obtenção de metáfases, uma vez que tal espécie possui um elevado número de células meristemáticas possibilitando melhor visualização. Tais procedimentos serão transferidos para as espécies de Riccia, sendo a primeira delas a Riccia Jovet-astie. PALAVRAS CHAVE: Riccia, cariótipo e metáfases. 1 Discente do curso de Tecnologia em Alimentos, IFRS campus Bento Gonçalves, Av. Osvaldo Aranha, 540, CEP , Bento Gonçalves, RS. Fone (54) , latoya.brum@bento.ifrs.edu.br 2 Co-orientadora, Bióloga, Ma. em Ecologia, Téc. Laboratório IFRS campus Bento Gonçalves, Av. Osvaldo Aranha, 540, CEP , Bento Gonçalves, RS. Fone (54) , paula.miotto@bento.ifrs.edu.br 3 Orientador, Biólogo, Me. em Botânica, Professor IFRS campus Bento Gonçalves, Av. Osvaldo Aranha, 540, CEP , Bento Gonçalves, RS. Fone (54) , daniayub@bento.ifrs.edu.br 1

2 INTRODUÇÃO O conhecimento sistemático de hepáticas tem se desenvolvido pelo acúmulo de informações sobre a organização e estrutura interna e externa dos grupos, utilizando as mais diversas abordagens, porém a enorme diversidade morfológica deste grupo têm constituído um grande desafio para o estudo e compreensão de sua filogenia e evolução (He-Nygrén et. al., 2006). Diversas discussões como Gradstein e Costa, 2003; Yano, 2008; Peralta, 2008; Yano e Bordin, 2009; expõem a necessidade de um conhecimento maior da diversidade das espécies de briófitos em geral e mais especificamente da família Ricciaceae, que só poderá ser alcançado com um maior número de coletas e de estudos. O estudo morfológico subsidia expressivamente os estudos taxonômicos e filogenéticos, aliando-se ao estudo genético e cromossômico, que contribuirá para o conhecimento integral da brioflora do estado buscando-se dessa forma preencher tal lacuna. Segundo Vianna (1994) o incremento no número de coletas de Riccia brasilliensis em outros estados aumentou a gama de variações de caracteres morfológicos de talos e esporos tidos como típicos para a espécie e que esta constatação seria válida para a maioria das espécies do gênero Riccia. Tal afirmação demonstra a necessidade de coletar e analisar geneticamente o material distribuído em todo o estado bem como nos diferentes ecossistemas, permitindo assim não descrever determinada espécie a partir de uma única coleta, mas sim tentar abranger, se possível, toda a variabilidade interna de cada espécie, pelo menos no estado do Rio Grande do Sul. Isso reforça a ideia de que a maioria das disjunções existentes no estudo de briófitas se deve a falta de coletas em diferentes ecossistemas (Yano, 1995). Com o objetivo de contribuir para o conhecimento da brioflora do Rio Grande do Sul, consolidar a área de pesquisa em briófitas especificamente Marchantiales no Rio Grande do Sul, descrever o cariótipo de diferentes espécies de Ricciaceae (Marchantiales), desenvolver técnicas de análise genética para aplicar em outras espécies e otimizar o protocolo de coloração e obtenção de metáfases a ser utilizada em Riccia. MATERIAL E MÉTODOS 2

3 A observação de cromossomos mitóticos, tanto para análises do ciclo mitótico quanto para estudo do cariótipo, é geralmente feita pelas técnicas de coloração convencional. Essas técnicas coram os cromossomos por igual, isto é, indistintamente, sem nenhuma preferência por determinado tipo de cromatina, composição do DNA ou de proteínas. As técnicas convencionais são as mais utilizadas na citogenética vegetal e tem a vantagem de permitir uma coloração rápida e bem definida dos cromossomos. Foram realizados testes em Allium cepa, com base no protocolo de Guerra (2002), por ser uma planta consagrada na utilização em técnicas de citogenética, possuir crescimento contínuo e precoce, e apresentar estruturas de melhor identificação para o treinamento da técnica. Foram retiradas as pontas das raízes da cebola, onde existem grandes quantidades de células meristemáticas, ou seja, que estão em divisão. O material foi submetido a dois tipos de fixação: a) fixador Carnoy (etanol-ácido acético 3:1) durante 24 horas em temperatura ambiente e b) Antimitótico 8-Hidroxiquinolina (8HQ) durante 24h, seguido de fixação em Carnoy por 20h, ambos em temperatura ambiente. Na sequência foram submetidos aos corantes: Fucsina 1% e Feulgen, objetivando qual deles se adequaria melhor para a observação de cromossomos. O tecido vegetal foi trabalhado de duas diferentes maneiras: coloração/esmagamento onde há a obtenção de todas as fases da mitose e esmagamento/coloração onde só há a obtenção da metáfase mitótica. A coleta do material vegetal foi feita no período entre 9 horas e 10 horas da manhã (horário propício à mitose - período entre o início de uma divisão celular e outra). A amostra foi colocada no fixador Carnoy por 24 horas, após esse período o excesso de fixador foi retirado com água destilada e as raízes coletadas foram colocadas no ácido clorídrico 1N por 20 minutos. O material foi transferido para a lâmina retirando sua coifa e suas capas externas (ficando apenas o meristema e não células epiteliais). O tecido restante foi cortado em pedaços pequenos e duas gotas do corante foram adicionadas. Após 20 minutos, o excesso de corante foi retirado com papel toalha e foi acrescentada uma lamínula sobre o material batendo cuidadosamente com uma agulha de ponta rombuda diretamente sobre os fragmentos de meristema. Verificou-se se o espalhamento das células e observou-se no microscópio óptico. As lâminas que apresentaram metáfases foram fotografadas para documentação e as de melhor resolução foram impressas em escala de cinza e o cariótipo foi montado com a imagem de melhor contraste. 3

4 Para a espécie Riccia Jovet-astie, a coleta, tratamento e documentação do material, seguiram os mesmos parâmetros anteriormente descritos, apenas diferenciando-se na parte vegetativa da planta a ser utilizada, que neste caso foi à região anterior ventral do talo (gametófito); e na fixação do material, onde foi utilizado somente o fixador Carnoy (etanolácido acético 3:1) devido à reduzida quantidade de células em divisão desta espécie, uma vez que, o tratamento com 8HQ tornar-se mais demorado, faz com que as células terminem a divisão antecipadamente e não se encontrem em mitose. RESULTADO E DISCUSSÃO Quando utilizados em Allium cepa os corantes Fucsina 1% e Feulgen apresentaram os melhores resultados em relação à coloração e visualização cromossômica em ambas as técnicas, corando não apenas a região nuclear das células em divisão (região onde se encontram os cromossomos), mas também seu citoplasma (figuras 1 e 2), fornecendo um excelente contraste, facilitando análise, contagem e posterior montagem dos cariótipos (figura 3). Figura 1 Ciclo mitótico em Allium cepa, cromossomos corados com Fucsina 1%. (a) prófase, (b) metáfase, (c) anáfase, (d) telófase. 4

5 Figura 2 Ciclo mitótico em Allium cepa, cromossomos corados com Feulgen. (a) prófase, (b) metáfase, (c) anáfase, (d) telófase. Figura 3 Metáfase e cariótipo de Allium cepa. Para Riccia Jovet-astie (figura 4), a utilização de Fucsina 1% e Feulgen proporcionou boa coloração de cromossomos. As metáfases encontradas foram fotografadas, porém a espécie, ainda encontra-se em fase de estudo e adequação de protocolo, ou seja, ajuste do horário de coleta do material vegetativo que apresente células em metáfase, com cromossomos completos e bem definidos, sem a presença do fuso-mitótico, que permitam a montagem de um cariótipo com boa resolução, além disso, outras análises estão sendo feitas para a confirmação da morfologia e do número cromossômico da espécie. F Figura 4 A hepática Riccia Jovet-astie e no detalhe metáfases isoladas da espécie, coradas com Feulgen. CONCLUSÕES 5

6 A partir dos testes realizados com Allium cepa e posteriormente aplicados em Riccia, conclui-se que os dois protocolos (Fucsina 1% e Feulgen) demonstraram resultados satisfatórios podendo ser aplicados as demais espécies do gênero que estão em estudo. REFERÊNCIAS GRADSTEIN, S.R. & COSTA, D.P The Hepaticae and Anthocerotae of Brazil. Memoirs of the New York Botanical Garden 87: GUERRA, M. Como observar cromossomos: um guia de técnicas em citgenética vegetal, animal, e humana / Marcelo Guerra, Maria José de Souzas. Ribeirão Preto, SP : Fundação de Pesquisas Científicas de Ribeirão Preto, HE-NYGRÉN, X., JUSLEN, A., AHONEN, I., GLENNY, D., PIIPPO, S Illuminating the evolutionary history of liverworts (Marchantiophyta) -towards a natural VIANNA, E.C Variações morfológicas em Riccia brasiliensis Schiffner (Ricciaceae) no Rio Grande do Sul. Iheringia, série Bot. 44: YANO, O A new additional annotated checklist of Brazilian bryophytes. The Journal of the Hattori Botanical Laboratory, 78: YANO, O. & BORDIN, J Novas ocorrências de briófitas para o Rio Grande do Sul, Brasil. Boletim do Instituto de Botânica 18: