PROPRIEDADES FÍSICAS DE MICROCÁPSULAS DE Bifidobacterium BB-12 PRODUZIDAS UTILIZANDO LEITE DE CABRA E INULINA COMO AGENTES ENCAPSULANTES

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1 PROPRIEDADES FÍSICAS DE MICROCÁPSULAS DE Bifidobacterium BB-12 PRODUZIDAS UTILIZANDO LEITE DE CABRA E INULINA COMO AGENTES ENCAPSULANTES S. Verruck 1, G.R. Liz 1, B. M. Maran 2, S. G. Garcia 2, E.S. Prudencio 1,2* 1-Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos Universidade Federal de Santa Catarina, Rod. Admar Gonzaga, 1346, Itacorubi CEP , Florianópolis SC Brasil, Telefone: (55-48) Fax: (55-48) elane.prudencio@ufsc.br 2-Departamento de Engenharia Química e de Alimentos Universidade Federal de Santa Catarina, Campus Reitor João David Ferreira Lima CEP: Florianópolis SC Brasil, Telefone: (55-48) Fax: (55-48) elane.prudencio@ufsc.br RESUMO A bactéria probiótica Bifidobacterium BB-12 foi microencapsulada com leite de cabra integral em pó e o prebiótico inulina, sendo que sua sobrevivência foi avaliada após o processo de spray drying, bem como as propriedades físicas da microcápsula foram avaliadas. A contagem de Bifidobacterium BB-12 após o spray drying manteve-se elevada, portanto, o produto pode ser considerado probiótico. A atividade de água apresentou valor de 0,148 e a umidade 3,48 g/100g. Os valores de densidade aparente (0,36 g/cm³), densidade compactada (0,65 g/cm³), fluidez (44,37 %) e coesividade (1,83) apresentaram-se de acordo com o esperado para pós produzidos pela técnica de spray drying. Sendo assim, a microcápsula apresentou propriedades físicas desejáveis tanto para a manutenção da bactéria probiótica como para as características do pó. Por fim, esta microcápsula pode ser considerada um alimento funcional, podendo ser utilizada em diferentes formulações e finalidades. ABSTRACT Bifidobacterium BB-12 was microencapsulated with whole goat s milk powder and inulin, and its survival was evaluated after spray drying process, as well as, the physical properties of the microcapsule, were evaluated. Bifidobacterium BB-12 count after the spray drying remained high and thus can be considered probiotic. The water activity had a value of and the humidity of 3.48 g/100g. The values of bulk density (0.36 g / cm³), tapped density (0.65 g/cm³), flowability (44.37%) and cohesiveness (1.83) were as expected for powders produced by the spray drying technique. Thus, the microcapsule presented desirable physical properties both for the maintenance of the probiotic bacteria and for the characteristics of the powder. Finally, this microcapsule can be considered a functional food and can be used for different formulations and purposes. PALAVRAS-CHAVE: probiótico; microencapsulação; prebiótico; spray drying. KEYWORDS: probiotic; microencapsulation; prebiotic; spray drying. 1. INTRODUÇÃO Probióticos são definidos como micro-organismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios àqueles que os consomem (FAO/WHO, 2006). Os microorganismos mais comumente empregados em derivados lácteos são os do gênero Bifidobacterium e Lactobacillus, os quais proporcionam efeitos benéficos, tais como efeitos antagônicos, competição e

2 efeitos imunológicos, resultando em um aumento da resistência contra patógenos (Boylston et al., 2004). De acordo com Gomes et al. (1998), o uso de uma bactéria probiótica como um componente em derivados lácteos pode ser justificado se a viabilidade e a atividade no alimento carreador puderem ser asseguradas até o momento do consumo ou final da validade. Assim, a fim de garantir que a contagem de células viáveis dos micro-organismos probióticos permaneça em quantidades adequadas durante a passagem pelo trato gastrointestinal, processamento e armazenamento, métodos de microencapsulação têm sido empregados (Solanki et al., 2013), como por exemplo, o método spray drying (Burgain et al., 2011). Entretanto, o sucesso e a efetividade da microencapsulação estão associados ao uso de agentes encapsulantes eficientes, como a inulina, um prebiótico (Fritzen-Freire et al., 2012) ou o leite de cabra (Ranadheera et al., 2015). Entretanto, a associação destes agentes encapsulantes visando à proteção de bifidobactéria é praticamente inovadora. Os prebióticos são ingredientes alimentares não digeríveis com atividade bifidogênica, ou seja, capazes de estimular o crescimento e/ou a atividade de algumas bactérias presentes no cólon, afetando beneficamente o hospedeiro. Por outro lado, a caracterização e o monitoramento das propriedades físicas das microcápsulas são abordagens importantes para melhorar e determinar as condições ideais de utilização. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o emprego do leite de cabra e da inulina como agentes encapsulantes protetores de Bifidobacterium BB-12 através do método de spray drying e avaliação das propriedades físicas das microcápsulas. 2. MATERIAL E MÉTODOS Material A cultura probiótica liofilizada composta por Bifidobacterium BB-12 (BB-12, Chr. Hansen, Hónsholm, Dinamarca) foi utilizada como material ativo para as microcápsulas, enquanto que o leite de cabra desnatado comercial UAT (Ultra Alta Temperatura) (Caprilat, CCA Laticínios, Rio de Janeiro, Brasil) foi empregado para a preparação da cultura estoque de Bifidobacterium BB-12. Os agentes encapsulantes utilizados foram leite de cabra comercial em pó (Caprilat, Rio de Janeiro, Brasil) e o prebiótico inulina (Orafti, Tienen, Bélgica), com grau de polimerização (GP) acima de 10. Para as análises microbiológicas, foi empregado Ágar MRS (Merck, Darmstadt, Alemanha), cloreto de lítio (Vetec, Rio de Janeiro, Brasil), propionato de sódio (Fluka, Neu-Ulm, Alemanha) e AnaeroGen (Oxoid, Hampshire, Reino Unido). Todos os reagentes químicos empregados foram de grau analítico. Microencapsulação da Bifidobacterium BB-12 por spray drying A suspensão bacteriana foi preparada de acordo com a metodologia proposta por Fritzen- Freire et al. (2012), com modificações. A cultura de Bifidobacterium BB-12 foi reidratada a 25 g L 1 em leite de cabra UAT, acondicionadas em frascos de vidro estéreis e mantidas congeladas como solução estoque a 18 ± 1 C. Esta solução estoque foi inoculada (100 ml L -1 ) na solução de alimentação. A solução de alimentação para a elaboração das microcápsulas de Bifidobacterium BB- 12 foi elaborada com a combinação dos seguintes agentes encapsulantes: leite de cabra integral em pó 100 g L -1 e 100 g L -1 de inulina. A solução foi misturada e submetida a tratamento térmico a 80 ± 1 C por 30 minutos. Antes da adição da suspensão bacteriana, a solução de alimentação foi resfriada até atingir 25 ± 2 C. O processo de microencapsulação foi realizado em equipamento spray dryer modelo B-290 (Buchi, Flawil, Suíça), utilizando ar de secagem com temperatura de entrada de 150 ± 2 C e de saída de 50 ± 3 C, assim como descrito por Verruck et al. (2017). As microcápsulas foram coletadas na base do ciclone do spray dryer, colocadas em frascos estéreis e avaliadas em relação à viabilidade

3 da Bifidobacterium BB-12 após o spray drying e às suas propriedades físicas. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Avaliação da viabilidade da bactéria probiótica Para determinar as contagens de células viáveis, a microcápsula foi homogeneizada e diluída em série com água peptonada (0,1%) e plaqueada em profundidade com ágar MRS modificado com a adição de cloreto de lítio (0,2%) e propionato de sódio (0,3%), de acordo com Vinderola e Reinheimer (1999). As placas foram incubadas em jarras de anaerobiose contendo AnaeroGen a 37 ± 1ºC durante 72 h. Os resultados foram expressos em unidades formadoras de colônias por grama de amostra (log UFC g -1 ). Todas as análises foram realizadas em triplicata. Umidade e atividade de água O teor de umidade da microcápsula foi determinado em estufa a 105ºC até atingir massa constante, de acordo com a International Dairy Federation (IDF, 1993). Já a atividade de água foi medida utilizando um analisador Etec modelo Aw 43 (Etec, São Paulo, Brazil). Antes da leitura dos valores de atividade de água as amostras foram estabilizadas no equipamento por 15 min a 25 ºC. Densidade aparente e compactada As densidades aparente (ρ bulk ) e compactada (ρ tapped ) da microcápsula foram determinadas conforme método proposto por Jinapong et al. (2008), com modificações. Para o cálculo de densidade aparente, 2g de amostra foi colocado suavemente em cilindro graduado de 10 ml e o volume preenchido foi lido. O mesmo procedimento foi realizado para a densidade compactada, mas antes de ler o volume, o cilindro foi pressionado vigorosamente até que não ocorresse mais mudança de volume. As densidades aparente e compactada foram calculadas dividindo a massa do pó pelo volume ocupado no cilindro graduado. A partir da determinação da densidade aparente e densidade compactada, pôde-se calcular o índice de Carr (IC) (Carr, 1965) e a razão de Hausner (HR) (Hausner, 1967), através dos quais é possível avaliar os parâmetros de fluidez e coesividade do pó. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Após o processo de secagem por spray drying, a contagem de células viáveis de Bifidobacterium BB-12 reduziu apenas 0,53 ciclos de log em relação à contagem na solução de alimentação. A microcápsula apresentou contagem de células viáveis acima de 6 log UFC g -1 do produto e, portanto, é considerada um produto com potenciais benefícios para a saúde humana. Picot e Lacroix (2004) relataram que a sobrevivência de células probióticas durante o processo de secagem por spray drying pode ser creditada a presença de gordura do leite. Liu et al. (2015) hipotetizou que a fusão da gordura absorve parte da energia térmica, diminuindo a temperatura interna das microcápsulas e, assim, evitando a ruptura da membrana celular dos probióticos. Além disso, Fritzen- Freire et al. (2012) também encontrou uma relação do uso da inulina e uma possível termoproteção para bifidobactérias durante o spray drying. A caracterização física da microcápsula está descrita na Tabela 1. O teor de umidade apresentou-se abaixo de 4 g de 100/g. Estes valores estão de acordo com os obtidos por Heidebach et al. (2010) e Schuck (2011), que relataram que este é geralmente o valor recomendado para a manutenção adequada da viabilidade dos probióticos no leite em pó e também para a prevenção da aglomeração durante o armazenamento. Este teor máximo deve ser levado em consideração porque,

4 conforme relatado por Broeckx et al. (2016), a alta mobilidade molecular desestabiliza os componentes do leite e altera as características do pó, levando à perda da viabilidade dos probióticos. Além disso, pode haver uma diminuição da vida útil do pó armazenado. Tabela 1 Resultados (média ± desvio padrão) das propriedades físicas de microcápsulas de Bifidobacterium BB-12 produzidas com leite de cabra e inulina. Microcápsula Umidade (g/100 g) 3,88 ± 0,13 Atividade de água 0,148 ± 0,007 Densidade aparente (g/cm 3 ) 0,36 ± 0,03 Densidade compactada (g/cm 3 ) 0,65 ± 0,04 Fluidez (%) 44,37 ± 3,17 Coesividade 1,83 ± 0,10 A microcápsula apresentou valores de atividade da água abaixo de 0,3. Tonon et al. (2009) relataram que esse é o valor máximo recomendado para a estabilidade de microcápsulas durante o armazenamento. Além disso, Fritzen-Freire et al. (2012) também observaram que a atividade de água abaixo de 0,3 é melhor para a manutenção de bactérias probióticas. Outras propriedades físicas das microcápsulas são representadas pelas densidades aparente e compactada. Sharma et al. (2012) informaram que o conhecimento dos valores dessas densidades é necessário para definir o tamanho e o material da embalagem para o produto, bem como os requisitos para a maquinaria de manuseio. Além disso, a partir destes valores é possível calcular os índices de fluidez e coesividade do pó. Os valores de fluidez e coesividade (Tabela 1) obtidos para a microcápsula são considerados elevados. De acordo com Parthasarathi e Anandharamakrishnan (2016), estas propriedades de fluxo são parâmetros de qualidade importantes para a produção industrial de microcápsulas. Consequentemente, o manuseio de pós coesivos torna-se um grande desafio científico e uma questão tecnológica urgente para suas aplicações em grande escala (Zhu et al., 2016). Portanto, conhecer estas características pode ajudar a melhorar a fluidez do pó, uma propriedade que facilita a embalagem, além de aumentar a sua dispersão e a sua diluição. 4. CONCLUSÕES A utilização de leite de cabra e inulina como agentes protetores de Bifidobacterium BB-12 se mostrou eficiente após o processo de secagem por spray drying. A contagem de Bifidobacterium BB- 12 após o spray drying manteve-se elevada, bem como pode ser considerado probiótico. Além disso, a microcápsula apresentou propriedades físicas desejáveis tanto para a manutenção da bactéria probiótica como para as características do pó. Por fim, esta microcápsula pode ser considerada um alimento funcional, podendo ser utilizada em diferentes formulações e finalidades.

5 AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e à CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pelo apoio financeiro, à Chr. Hansen por fornecer a cultura probiótica e à Clariant por fornecer a inulina. REFERÊNCIAS Boylston, T. D., Vinderola, C. G., Ghoddusi, H. B., & Reinheimer, J. A. (2004). Incorporation of bifidobacteria into cheeses: Challenges and rewards. International Dairy Journal, 14(5), Broeckx, G., Vandenheuvel, D., Claes, I. J. J., Lebeer, S., & Kiekens, F. (2016). Drying techniques of probiotic bacteria as an important step towards the development of novel pharmabiotics. International Journal of Pharmaceutics, 505(1 2), Burgain, J., Gaiani, C., Linder, M., & Scher, J. (2011). Encapsulation of probiotic living cells : From laboratory scale to industrial applications, 104, Carr, R. L. (1965). Evaluating flow properties of solids. Chemical Engineering, 72, FAO/WHO. (2006). Probiotics in food: Health and nutritional properties and guidelines for evaluation. Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization. Food and Nutrition Paper, 85, Fritzen-Freire, C. B., Prudêncio, E. S., Amboni, R. D. M. C., Pinto, S. S., Negrão-Murakami, A. N., & Murakami, F. S. (2012). Microencapsulation of bifidobacteria by spray drying in the presence of prebiotics. Food Research International, 45(1), Gomes, A. M. P., Vieira, M. M., & Malcata, F. X. (1998). Survival of probiotic microbial strains in a cheese matrix during ripening: Simulation of rates of salt diffusion and microorganism survival. Journal of Food Engineering, 36(3), Hausner, H. H. (1967). Friction conditions in a mass of metal powder. International Journal of Powder Metallurgy, 3, Heidebach, T., Forst, P., & Kulozik, U. (2010). Influence of casein-based microencapsulation on freeze-drying and storage of probiotic cells. Journal of Food Engineering, 98(3), IDF (International Dairy Federation). Dried milk and dried cream: Determination of water content., Pub. L. No. Standard 26A (1993). Brussels, Belgium: International Dairy Federation. Jinapong, N., Suphantharika, M., & Jamnong, P. (2008). Production of instant soymilk powders by ultrafiltration, spray drying and fluidized bed agglomeration. Journal of Food Engineering, 84(2), Liu, H., Gong, J., Chabot, D., Miller, S. S., Cui, S., Ma, J., & Wang, Q. (2015). Protection of heatsensitive probiotic bacteria during spray-drying by sodium caseinate stabilized fat particles. Food Hydrocolloids, 51, Parthasarathi, S., & Anandharamakrishnan, C. (2016). Enhancement of oral bioavailability of vitamin E by spray-freeze drying of whey protein microcapsules. Food and Bioproducts Processing, 100, Picot, A., & Lacroix, C. (2004). Encapsulation of bifidobacteria in whey protein-based microcapsules and survival in simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt. International Dairy Journal, 14(6), Ranadheera, C. S., Evans, C. A., Adams, M. C., & Baines, S. K. (2015). Microencapsulation of Lactobacillus acidophilus LA-5, Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 and Propionibacterium

6 jensenii 702 by spray drying in goat s milk. Small Ruminant Research, 123(1), Schuck, P. (2011). Dehydrated Dairy Products. Milk Powder: Physical and Functional Properties of Milk Powders. In J. W. Fuquay, P. F. Fox, & P. L. H. McSweeney (Eds.), Encyclopedia of Dairy Sciences (2nd ed., p. 2:117-2:124). London, UK: Elsevier Ltd. Sharma, A., Jana, A. H., & Chavan, R. S. (2012). Functionality of milk powders and milk-based powders for end use applications-a review. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 11(5), Solanki, H. K., Pawar, D. D., Shah, D. A., Prajapati, V. D., Jani, G. K., Mulla, A. M., & Thakar, P. M. (2013). Development of microencapsulation delivery system for long-term preservation of probiotics as biotherapeutics agent. BioMed Research International, vol. 2013, 21 p. Tonon, R. V., Brabet, C., Pallet, D., Brat, P., & Hubinger, M. D. (2009). Physicochemical and morphological characterisation of açai (Euterpe oleraceae Mart.) powder produced with different carrier agents. International Journal of Food Science and Technology, 44(10), Verruck, S., de Carvalho, M. W., de Liz, G. R., Amante, E. R., Vieira, C. R. W., Amboni, R. D. de M. C., & Prudencio, E. S. (2017). Survival of Bifidobacterium BB-12 microencapsulated with full-fat goat s milk and prebiotics when exposed to simulated gastrointestinal conditions and thermal treatments. Small Ruminant Research, 153, Vinderola, C. G., & Reinheimer, J. A. (1999). Culture media for the enumeration of Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus acidophilus in the presence of yoghurt bacteria. International Dairy Journal, 9(8), Zhu, X., Zhang, Q., Huang, C., Wang, Y., Yang, C., & Wei, F. (2016). Validation of surface coating with nanoparticles to improve the flowability of fine cohesive powders. Particuology, 30,