AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DO POTENCIAL CICATRIZANTE DO EXTRATO BRUTO DA CASCA VERDE DE BANANA (MUSA SP.)

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1 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E DO POTENCIAL CICATRIZANTE DO EXTRATO BRUTO DA CASCA VERDE DE BANANA (MUSA SP.) Murilo Rangel Concianci ¹, Luciana Cristina Nowacki² 1 Acadêmico do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba PR); 2 Bióloga, Prof Ms da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba PR); Endereço para correspondência: Murilo Rangel Concianci murilo.con@gmail.com RESUMO: O estudo apresentado mostra o processo de cicatrização em dorso de camundongos (Mus muscullus), a partir do extrato da casca verde de banana (Musa sp.). Foram utilizados 40 animais de ambos os sexos, os quais foram anestesiados e retirado uma área de 1 cm² de epiderme dorsal. Após essa cirurgia, os animais foram separados em 4 grupos, sendo: GI controle, GII- Dersani, GIII- tópico com extrato da casca verde da banana e GIV tópico + via oral com extrato diluído em etanol 5%. Os resultados obtidos foram consideráveis quando comparados ao grupo controle e ao grupo da Dersani, a presença do flavonóide leucocianidina influenciou o aumento de fibroblastos na ferida, diminuindo o tempo de cicatrização da lesão, mostrando um melhor resultado no grupo tratado com o extrato bruto de casca verde de banana, tanto por tópico quanto por via oral. Palavras-chave: cicatrização, camundongos, Musa sp.. SUMARY: The presented study shows the cicatrization process in back of mice (Mus muscullus), starting from the extract of banana's green peel (Musa sp.). 40 animals of both sexes were used, which were anesthetized and solitary an area of 1 cm² of number epidermis. After that surgery, the animals were separate in 4 groups, being: GI controls, GII - Dersani, GIII - topic with extract of the banana's green peel and GIV topic + orally with extract diluted in etanol 5%. The results were significant when compared to the control group and the group DERSANI, the presence of the flavonoid leucocianidina influenced the growth of fibroblasts in the wound, reducing the injury s healing time, showing better results in the group that received brute extract of the banana s green peel, both topic and oral. Key word: healing, mices, Musa sp..

2 1. INTRODUÇÃO Uma cicatrização eficaz e indolor é o que a medicina visa, quando se trata de cortes profundos e queimaduras. A utilização de fitoterápicos para melhor cicatrização tem aumentado, tendo em vista a fácil obtenção e sua eficácia por possuir afinidade no organismo. Quando um tecido é lesionado, os fibroblastos próximos proliferam, migram para a ferida e produzem grandes quantidades de matriz rica em colágeno, que ajuda a isolar e a reparar o tecido lesado. Sua capacidade de proliferação em caso de lesão, juntamente com seu estilo de vida solitário, pode explicar por que os fibroblastos são as células mais fáceis de crescer em cultivo (ALBERTS, 2004). Pesquisas estipulam uma melhor cicatrização com base no extrato da casca de banana verde, pois, possui um flavonóide leucocianidina que induz o aumento de produção de células apicais(novak, 2003). A função de contrair a ferida é atribuída aos miofibroblastos. Quando a ferida se fecha, o número de células dos vasos sangüíneos e de miofibroblastos diminuem. Isto se deve ao fenômeno denominado apoptose, pelo qual o tecido de granulação evolui para a cicatriz. Assim minimizam a perda de líquidos, de proteínas, diminuem o processo doloroso, a contração da ferida, as cicatrizes e os quelóides, favorecendo dessa forma o processo de cicatrização (MEDEIROS, 2005). Durante a formação do tecido de granulação, fibroblastos e células endoteliais proliferam e se movem para o interior da ferida, produzindo matriz extracelular e angiogênese. Muitos fibroblastos adquirem alguns aspectos morfológicos e bioquímicos de células musculares lisas, onde essas modificações darão origem aos miofibroblastos. Os miofibroblastos participam na síntese da matriz extracelular e na produção de força mecânica, com influência na reorganização da matriz e na contração da ferida e, segundo, sua atividade contrátil é responsável pelo fechamento das feridas após as lesões, processo conhecido como contração da ferida (PAGNANO, 2008). A banana é o segundo fruto mais produzido e consumido no Brasil, segundo país no ranking da produção mundial, tanto como sobremesa como acompanhamento nas refeições, ainda que ocupe apenas 0,87% do total das despesas de alimentação dos brasileiros em geral. A maior parte da produção provém do Nordeste do país, onde são produzidos 34% do volume total nacional, seguido das Regiões Norte (26%), Sudeste (24%), Sul (10%) e Centro-Oeste (6%). Ao todo, a área plantada é de cerca de ha. Em termos gerais, ainda que as condições naturais permitam uma produção de alta qualidade, é corrente afirmar que existe baixa eficiência na produção e no manejo pós-colheita (WIKIPÉDIA, 2009). Na natureza os flavonóides atuam como sinais químicos na floração e polinização das plantas. São os responsáveis pelas cores de plantas e frutos e também pelo sabor adstringente e cor de muitas bebidas e alimentos. Possuem ação protetora de raios UV e atuam como uma barreira natural contra microorganismos patogênicos e pestes. Influenciam na fertilidade e germinação do pólen, no crescimento vegetal e ação enzimática. O fato de possuírem uma potente ação antioxidante contra radicais livres, ação estrogênica e contraceptiva, além de promover a diferenciação celular e apoptose, tudo isso, está despertando a atenção da comunidade cientifica em busca de uma cicatrização rápida e eficaz (ARAUJO, 2009).

3 O uso de substâncias tópicas para uma melhor cicatrização e aderência no organismo, esta tomando grande parte das pesquisas em base dos cicatrizantes. Pois sua manipulação e aplicação são fáceis, além da concentração local ser maior do que se fossem cápsulas ou comprimidos. O objetivo do presente estudo foi analisar os resultados de cicatrização, em camundongos, após o tratamento com o tópico de um creme a base do extrato bruto de casca verde de banana e observar o tempo de cicatrização. O extrato foi posto em comparação com o tempo de efeito de um produto comercial, DERSANI, este feito a base de Ácidos Graxos Essenciais (A.G.E.), ácidos linoléicos, Vitaminas A e E. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Animais: Para a realização do estudo foram utilizados camundongos, fêmeas (25-35g) sendo os mesmos da espécie Mus muscullus e linhagem Swiss albino, provenientes do biotério da Universidade Federal do Paraná. Os animais foram mantidos, durante todo o experimento, em caixas de polipropileno e em condições de temperatura controlada (22±2ºC), respeitando uma fase clara/escura de 12 horas e com água e ração ad libitum. 2.2 Extração da casca da banana: Em um béquer, foi pesado 100g de casca de banana verde. Foi levada a estufa por 24 horas e após a dissecação, fracionou-se a casca. Para se obter uma melhor qualidade no extrato, foi utilizado Éter de Petróleo para a deslipidificação da casca verde de banana, eliminando assim qualquer vestígio de lipídeos que eventualmente pudessem comprometer a cicatrização da ferida. Foi utilizado Acetato de Etila e/ou Clorofórmio para a extração da casca da banana no aparelho de Soxhlet por 4 horas cada extração. Após a extração, foi retirado o balão volumétrico contendo o extrato com solvente e foi depositado em uma cápsula para secagem do solvente permanecendo apenas o extrato bruto. 2.3 Formulação do creme A formulação do creme foi realizada por uma fase aquosa, composta por 74 ml de água, 1g de natrosol e 5g de propilenoglicol; e uma fase oleosa contendo 15g de cera Lanette e 5g de óleo mineral. A emulsão foi preparada ao mesmo tempo, mas separadamente a fase O (oleosa) da fase A (aquosa), sob aquecimento e agitação constante. Após as duas atingirem a temperatura de 70 ºC a fase A foi vertida sobre a fase O e manteve-se em agitação até obter um resfriamento parcial da emulsão. Sem parar a agitação foi adicionado aos poucos 10% do extrato da casca de banana. Finalizadas essas etapas, foram reservados 15 gramas de creme para serem adicionados 1,5 gramas do extrato bruto, obtendo-se assim, um creme a 10% de extrato bruto de casca verde de banana. 2.4 Formulação do extrato para via oral Após a obtenção do extrato bruto, foi diluído 10 mg/l do extrato em solução etanólica 5%, respeitando a concentração máxima permitida de etanol, onde não foi observado o efeito do etanol, apenas da solução via oral. 2.5 Procedimento Experimental para feridas

4 Os animais foram divididos em grupos de 10 sendo: Grupo I para controle, tratados apenas com solução salina 0,9%, Grupo II para animais que foram tratados com o creme comercial Dersani, Grupo III para animais tratados com tópico de extrato de casca verde de banana e Grupo IV para animais tratados com extrato via oral (etanol 5%) junto com tópico de extrato de casca verde de banana. 2.6 Confecção das feridas O procedimento cirúrgico foi realizado após anestesia inalatória com éter etílico em campânula fechada. Foram considerados sob efeito anestésico pela imobilidade corporal, entretanto em condições respiratórias normais. Após a anestesia os camundongos foram posicionados em decúbito ventral e anexados a uma prancha de isopor, com contenção dos membros por barbantes. A triactomia foi realizada com auxílio de tesoura manual e lamina descartável. Para a demarcação da ferida a ser realizada foi utilizado um paquímetro e caneta hidrográfica. Com auxilio de tesoura Iris e pinça. Foram efetuadas as feridas de maneira a retirar a pele e tecido subcutâneo sem atingir o tecido muscular. Figura 1. Desenho esquemático mostrando o local da lesão na região dorsal do tórax do camundongo (Mus muscullus). A depilação do dorso dos animais foi feita através de método manual e não mecânico, pelo fato de que a tração manual dos pelos dificilmente causa lesões na pele, ao contrário do que acontece com o uso de aparelhos laminados. A região dorsal do camundongo, escolhida para produzir a lesão, teve por finalidade evitar que o próprio animal conseguisse atingi-la, e por ser modelo experimental de ferida aberta bastante conhecido. Quanto ao tamanho das lesões, foi utilizada medida constante, o que permitiu melhor acompanhamento da cicatrização, conforme já utilizada por outros autores, como Marchini et al. e Sanchez Neto et al. (GARROS, 2006). Figura 2: demarcação feita com caneta piloto no dorso do camundongo (Mus muscullus). 2.7 Avaliação macroscópica das feridas

5 A mensuração das feridas iniciou-se no terceiro dia de pós-operatório sendo efetuada com auxílio de um paquímetro, sempre considerando para as anotações o raio de maior e menor extensão das lesões. Com base nesses dados numéricos obteve-se a área das lesões considerando a equação matemática: A =. R. r Onde: A = área; = 3,14; R = raio maior; r = raio menor. Mediante o cálculo da área das lesões foi feita avaliação do percentual de contração das feridas através da equação matemática: % da contração = 100. [(Wo Wi)/ Wo] Onde: Wo = área inicial da ferida Wi = área do dia da ferida Os dias escolhidos para medir as feridas foram o 3º, 7º, 10º e 14º dia, onde foram observados maiores resultados quando comparados macroscopicamente. Por fim, as áreas de contração das feridas foram expressas em gráficos comparativos para os diferentes grupos. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Até o presente momento não há estudos que demonstrem o efeito cicatrizante a partir do extrato da casca verde de banana (Musa sp.), tendo em vista esse ponto de discussão, o trabalho foi realizado pioneiramente sem muitos pontos de referência sobre a planta e seus princípios ativos. O percussor desse estudo foi realizado por sabedoria popular (etnobotânica), e com os resultados obtidos mostrou que a casca verde da banana possui excelente ação cicatrizante em feridas epiteliais. As lesões conjuradas nos camundongos foram avaliadas macroscopicamente com o auxilio de um paquímetro, durante 14 (quatorze) dias de experimento. Durante o desenvolvimento do experimento, os animais eram avaliados diariamente sendo higienizados com água destilada, e tratados com os seus respectivos medicamentos. O grupo controle (GI) foi exposto apenas para solução salina 0,9%, o grupo Dersani (GII) foi tratado com a pomada comercial Dersani, o grupo tópico (GIII) foi submetido ao uso diário da pomada com extrato 10% de casca verde de banana e o grupo tópico + via oral (GIV) foi tratado com o tópico (10%) juntamente com a solução de etanol 5% e extrato da casca verde de banana.

6 No gráfico abaixo, é possível observar uma considerável diferença de cicatrização entre os 4 (quatro) grupos, representados pelas cores: Quadrado (controle), Triangulo (Dersani ), Pentágono (Tópico + Via Oral) e Triangulo invertido (Tópico) Área cm * * * Dias de medidas Gráfico 1: relação de dias com área em cm², com o efeito das soluções. A presença do flavonóide leucocianidina (NOVAK, 2003) proporcionou uma catalisação na formação de miofibroblastos no tecido lesionado. A formação de crostas espessas mostra que houve uma maior formação de vasos sanguíneos no local, indicando o preenchimento da ferida com fibras colágenas e infiltrados inflamatórios (MEDEIROS. 2005). Pode ser observado que o extrato administrado via oral associado à aplicação tópica mostrou maior eficiência a partir do décimo dia, quando comparado com o grupo que apenas recebeu solução tópica, provavelmente por ter a presença do extrato via oral juntamente com o tópico. Em relação aos outros grupos fica claro a maior eficácia do extrato da casca verde de banana (Musa sp.) na atuação como formador de células apicais.

7 No gráfico abaixo, pode-se observar a diferença na porcentagem de cicatrização da ferida dentro dos grupos estudados, identificando um melhor resultado no grupo com o extrato bruto de casca verde de banana: ,7 % % Porcentagemde cicatrização % 8 3,3 % 0 Controle Dersani Tópico Via Oral + Tópico Gráfico 2: Representação por gráfico da porcentagem de cicatrização no dorso do camundongo (Mus muscullus). A cicatrização mais rápida da ferida pode ser associada à presença do flavonóide leucocianidina catalisando a ação dos fibroblastos no local da ferida. Mas como as observações das feridas foram macroscópicas, fica inconclusivo o aumento ou não de fibroblastos, o que pode ser sugerido a próximos estudos é a utilização de cortes histológicos para a observação da formação de tecido a partir dos fibroblastos. Os fibroblastos são as principais células envolvidas na cicatrização e têm por principal função a manutenção da integridade do tecido conjuntivo, pela síntese dos componentes da matriz extracelular. Os fibroblastos são estimulados a produzir e a depositar componentes da matriz extracelular e, na pele, esses eventos são necessários para permitir e promover a reepitelização. Eles estão sujeitos a mudanças devido às forças mecânicas as quais são submetidos durante situações patológicas ou fisiológicas e, assim, organizam as fibras colágenas e estão diretamente relacionados à formação do tecido de granulação. Além de produzirem colágeno, os fibroblastos produzem elastina, fibronectina, glicosaminoglicanas e proteases, responsáveis pelo desbridamento e remodelamento fisiológico da célula (PAGNANO, 2008). O que também pode ser observado nos grupos tratados com banana foi um maior crescimento de pelos na área que foi raspada, de acordo com o trabalho do professor Novak et al a presença da leucocianidina pode influenciar no crescimento capilar como um tônico, mas não foi realizado tal estudo nesse experimento para comprovar essa idéia. Alterações comportamentais não foram analisadas, os animais continuaram agindo normalmente de acordo com os animais do grupo controle. Qualquer mudança não pode ser reportada, pois não houve tal objetivo no trabalho.

8 Houve mortes no grupo tratado com solução isotônica 0.9% e no grupo tratado com Dersani, provavelmente por conta do estresse causado pela extração do tecido epitelial do dorso dos animais. Nos grupos da banana (Musa sp.), não houve a ocorrência de mortes, mantendo 10 animais em cada grupo. 4. CONCLUSÃO Considerando o pioneirismo na pesquisa e a deficiência no banco de dados para uma boa base bibliográfica, os resultados obtidos com o experimento foram consideráveis. Tanto o tópico quanto o extrato aplicado por via oral, não mostraram um efeito colateral, sem regurgitação, espasmos abdominais, convulsões, ereção de cauda, catatonia, parada respiratória ou cardíaca e estereotipia. Superficialmente a lesão ficou 100% cicatrizada, mas é inconclusivo a formação de tecido dérmico pois seria necessário um corte histológico e analise microscópica do ferimento.

9 5. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 1. ALBERTS, B; JOHNSON, A; LEWIS, J; RAFF, M; ROBERT, H; WALTER, P. Biologia Molecular da célula. 4 ed. Porto Alegre: Artmed, NOVAK, F. R.; ALMEIDA, J. A. G.; SILVA, R. S.. Casca de banana: uma possível fonte de infecção no tratamento de fissuras mamilares. Jornal de Pediatria, Porto Alegre, v. 79, n. 3, jun ARAUJO, M. E. M.. Química dos Produtos Naturais Flavonóides. Departamento de Química e Bioquímica, Lisboa, p. 1-5, Disponível em: Aula_21_10_08.pdf. Acesso em: 10 abr BANANA, Wikipédia. Disponível em: Acesso em: 28 abr MEDEIROS, C.A.; DANTAS FILHO, A.M.; ROCHA, K.F.B.; AZEVEDO, I.M.; MACEDO, F.Y.B. Ação do fator de crescimento de fibroblasto básico na cicatrização da aponeurose abdominal de ratos. Acta Cirúrgica Brasileira, v.18.; n.1, p.5-9, GARROS, I. C.; CAMPOS, A. C. L.; TÂMBARA E. M.; TENÓRIO, S. B.; TORRES, O. J. M.; AGULHAM, M. A.; ARAÚJO, A. C. F.; SANTIS-ISOLAN, P. M. B.; OLIVEIRA, R. M.; ARRUDA, E. C. M.. Extrato de Passiflora edulis na cicatrização de feridas cutâneas abertas em ratos: estudo morfológico e histológico. Acta Cir Bras. [periódico na internet] 2006;21 Supl 3: PAGNANO, L. O.; BARALDI-ARTONI, S. M. B.; PACHECO, M. R.; SANTOS, E.; OLIVEIRA, D.; LUI, J. F.. Morfometria de fibroblastos e fibrócitos durante o processo cicatricial na pele de coelhos da raça Nova Zelândia Branco tratados com calêndula. Cienc. Rural v.38 n.6 Santa Maria set