Toxicidade Pré-Clínica em Doses Repetidas do Óleo Essencial do Origanum vulgare L. (Orégano) em Ratas Wistar

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1 Latin American Journal of Pharmacy (formerly Acta Farmacéutica Bonaerense) Lat. Am. J. Pharm. 27 (5): (2008) Original Article Received: May 10, 2008 Accepted: July 12, 2008 Toxicidade Pré-Clínica em Doses Repetidas do Óleo Essencial do Origanum vulgare L. (Orégano) em Ratas Wistar Marlete B. CLEFF 1 *, Ana R. MEINERZ 1, Elisa S. SALLIS 2, Tatiana A.ANTUNES 2, Antonella MATTEI 2, Maria R. RODRIGUES 2, Mário C.A. MEIRELES 2 & João R.B. MELLO 1 1 Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Rua Xavier Ferreira 618, Pelotas RS, Brasil 2 Universidade Federal de Pelotas, Faculdade de Veterinária, Campus Capão do Leão, Pelotas, , RS, Brasil. RESUMO. Nas últimas décadas a propriedade inibitória dos óleos essenciais vegetais frente a Candida spp. tem sido estudada, estando a do orégano entre eles. Todavia, são escassos os trabalhos sobre a toxicidade do referido óleo. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a toxicidade do óleo essencial do Origanum vulgare administrado em ratas Wistar, adultas. Quatro grupos experimentais foram constituídos, grupo I (óleo por via oral, n = 10); grupo II (controle oral, n = 5), grupo III, (óleo por via intra-vaginal, n = 10) e grupo IV (controle intra-vaginal, n = 5). O tratamento diário foi realizado por 30 dias. Utilizou-se emulsão a 3% vol/vol do óleo essencial de O. vulgare que apresentava os seguintes constituintes: γ-terpineno (4,86 %), 4-terpineol (47,95 %), α-terpineol (7,56 %), timol (8,42 %) e carvacrol (9,43 %). Ao final do tratamento, os animais foram sacrificados, sendo realizadas necropsias. Os resultados não evidenciaram qualquer alteração macroscópica nos tecidos do trato reprodutivo e digestório, assim como em fígado, baço e rins. Nas avaliações clínicas, hematológicas e histopatológicas não foram observadas alterações. De acordo com os resultados obtidos, conclui-se que o óleo essencial do O. vulgare não causa alterações toxicológicas relevantes, quando administrado à 3% por via oral e intra-vaginal em ratas Wistar, por 30 dias. Outros estudos são necessários, incluindo um período maior de administração e, utilizando óleos com diferentes proporções de terpenos, além da avaliação da toxicidade reprodutiva. SUMMARY. Pre-clinic toxicity of the repeate-dose of Origanum vulgare L. (Origanum) essential Oil in Wistar Rats. In recent decades the inhibitory property of the essential oils against Candida spp. has been studied, and antimicrobial activities of origanum has been evaluated. However, the papers evaluating the toxicity of this oil are scarce.the objective of this work was to evaluate the toxicity of the Origanum vulgare essential oil administered orally and intravaginal in adult female Wistar rats. This study was accomplished with 4 groups of female rats, group I (oil administration orally, n = 10); group II (control orally, n = 5), group III, (oil administration intravaginal, n = 10) and group IV (control intravaginal, n = 5). The treatment for 30 days, everyday. The essential oil was used 3 % (v/v) in emulsion, and concentration of main compounds were: γ-terpinene (4.86 %), 4-terpineol (47.95 %), α-terpineol (7.56 %), thymol (8.42%) and carvacrol (9.43%). After the experimental period, necropsy of the animals was accomplished, and macroscopic alterations were not observed in the tissues of the reproductive and digestive systems, as well as in liver, spleen and kidneys. The clinical, hematological and histopathological evaluation didn t demonstrate any alteration. According to the results, the O. vulgare essential oil 3 %, when administered orally and intravaginal, during 30 days in Wistar rats, is not responsible for toxicological alterations. Other studies using O. vulgare oils with different terpenes concentrations are necessary. Reproductive toxicity investigations are also necessary. INTRODUÇÃO As infecções fúngicas invasivas tem tido um aumento na incidência e fatalidade nas últimas décadas, sendo descritos casos de infecção em humanos e animais, especialmente em imunocomprometidos, devidos principalmente ao gênero Candida 1-3. Estas leveduras são integrantes da microbiota oral, gastrointestinal e reprodutiva de mamíferos, sendo consideradas patógenos oportunistas 1-4. Fatores que alterem o PALAVRAS-CHAVE: Óleo essencial, Origanum vulgare, Ratos Wistar, toxicidade. KEY WORDS: Essential oils, Origanum vulgare, Wistar rats, Toxicity. * Autor a quem correpondência deve ser enviada. emebrum@bol.com.br 704 ISSN

2 Latin American Journal of Pharmacy - 27 (5) equilíbrio parasita-hospedeiro favorecem a instalação da micose podendo ocorrer quadros clínicos leves, graves ou fatais 2,4-6. Estudos demonstram que as infecções por Candida, são um fenômeno crescente a nível mundial, representando um problema de saúde pública, devido em parte, a sobrevida de pacientes transplantados e neutropênicos, do uso indiscriminado de fármacos como antibióticos e corticosteródes e das doenças imunodepressoras 2,4-7. Aliado aos crescentes casos da micose tem ocorrido resistência por parte de algumas espécies de levedura frente aos antifúngicos usuais, e relatos de recidivas da enfermidade aumentando assim, a necessidade de pesquisas de novas substâncias com atividade antifúngica 2,8. Devido a demonstrarem atividade frente a diversas espécies de fungos, os óleos essenciais têm despertado interesse, especialmente os óleos de plantas aromáticas como Origanum vulgare A atividade antimicrobiana do O. vulgare, tem sido atribuída aos compostos fenólicos que encontram-se como componentes majoritários no seu óleo essencial, sendo que os principais são os monoterpenos e sesquiterpenos, como α-terpineno, γ-terpineno, ρ-cimeno, carvacrol e timol 11, Entretanto, apesar de se observar um aumento no consumo de produtos naturais, com base no argumento de que plantas são totalmente seguras, as supostas propriedades farmacológicas muitas vezes não têm validade científica, por não terem sido investigadas quanto a esta ação em testes in vitro ou in vivo 17. Devido a serem produtos de extração de uma espécie vegetal, os óleos essenciais são mais concentrados, apresentando toxicidade mais elevada que a planta de origem 18, sendo necessário a realização de estudos toxicológicos como suporte de segurança para uso destes produtos 17,18 assim o objetivo deste trabalho foi de avaliar a toxicidade do óleo essencial do O. vulgare administrado em doses repetidas em ratas Wistar. MATERIAL E MÉTODOS Animais experimentais Foram utilizados ratos albinos (Rattus norvergicus) linhagem Wistar, fêmeas, adultas, com peso variando de 240 a 250 g, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Pelotas (BC-UFPel). O experimento foi desenvolvido na sala de experimentação do BC-UFPel, onde os animais foram acomodados em caixas, mantidos em condições controladas de umidade, temperatura e ciclo de claro e escuro, recebendo água ad libitum e dieta de acordo com peso corporal. Antes da administração do extrato, todos os animais foram adaptados ao manuseio e a sondagem pelo período de duas semanas. Todos os procedimentos respeitaram os princípios da ética em Experimentação Animal adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (CO- BEA). Grupos Experimentais O estudo foi realizado com 30 animais que foram divididos em quatro grupos experimentais: Grupo I: Dez ratas foram tratadas com 0,5 ml de óleo por via oral, uma vez ao dia, durante 30 dias; Grupo II: Cinco ratas utilizadas como controle oral, tratadas com o veículo (Suspensão 0,001% de Tween 80) pelo mesmo período; Grupo III: Dez ratas foram tratadas com 0,5 ml de óleo por via intra-vaginal, uma vez ao dia, durante 30 dias; Grupo IV: Cinco ratas utilizadas como controle intra-vaginal, tratadas com o veículo (Suspensão de ágar 0,8%) pelo mesmo período. Dose de Ensaio, Preparo e Administração A dose utilizada no estudo foi definida á partir dos valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) obtidos nos testes in vitro frente a isolados de Candida, onde foi estabelecida uma CIM média de 0,3% para o óleo essencial do O. vulgare, sendo este valor multiplicado por dez. Nos grupos experimentais I e III, 0,5 ml do óleo essencial foi utilizado na concentração de 3% vol/vol, sendo que para a via oral foi utilizada emulsão contendo 0,001% de Tween e para a via intravaginal o óleo foi disperso em suspensão de ágar a 0,8% 9. No grupo II, foi administrado 0,5 ml de solução contendo 0,001% Tween 80 19, e para grupo IV 0,5 ml de suspensão de ágar a 0,8% 9. Para administração oral foi utilizada sonda flexível N 6, e para a via intravaginal utilizou-se como aplicador uma sonda flexível adaptada a seringa graduada de 1 ml. Obtenção do óleo essencial de O. vulgare A amostra de orégano utilizada no estudo foi adquirida em distribuidor comercial (Torrenueva Vascos Ltda., I.M.M.Reg.S.B.N 1082/08, Indústria Uruguaya) que forneceu o produto com certificado de qualidade, de origem e identificação botânica. Cerca de 40 g de folhas secas de orégano foram submetidas à extração por hidrodestilação em aparelho de Clevenger, segundo a 705

3 CLEFF M.B., MEINERZ A.R., SALLIS E.S., ANTUNES T.A., MATTEI A., RODRIGUES M.R., MEIRELES M.C.A. & MELLO J.R.B. Farmacopéia Brasileira 20, para obtenção do óleo. Após a extração, o óleo foi seco em Na 2 SO 4 anidro, grau p.a., concentrado sob N 2 ultra puro e armazenado em frascos âmbar, mantido sob refrigeração até a utilização 14. Análise do óleo essencial por Cromatografia Gasosa com detector de ionização por chama (GC/FID) O óleo essencial obtido foi analisado por GC/FID, sendo caracterizado em função dos principais constituintes químicos. Para tal 1 µl de soluções de concentrações variadas de padrões foram injetadas no cromatógrafo e, comparados com o tempo de retenção de padrões referentes aos principais compostos presentes em amostras de orégano 14. Acompanhamento clínico Os animais pertencentes aos quatro grupos experimentais foram avaliados clinicamente durante os 30 dias, de acordo com o critério clínico descrito na literatura 21, sendo feito observações quanto ao estado geral de cada animal, constatação de modificação da deambulação, piloereção, ocorrência de diarréia e de mortes, além de pesagens semanais de todas as ratas. Para os animais dos grupos I e II, ainda foram observados alterações comportamentais, como agressividade, consciência e disposição, assim como feito avaliações do sistema locomotor como presença/ausência de incoordenação e perda de equilíbrio. Nos animais dos grupos II e IV foram feitas avaliações da cavidade vaginal, sendo observados presença/ausência prurido, vermelhidão, descamação e lesão local. Avaliação hematológica No final do período experimental foi coletado sangue através de punção-cardíaca, para a realização do hemograma completo. Os exames laboratoriais foram realizados no setor de Patologia Clínica da Faculdade de Veterinária UF- Pel 27,28. Análise histopatológica Ao final dos 30 dias foi realizada eutanásia dos animais experimentais com tiopental sódico via intraperitonial na dose de 50 mg/kg. Durante as necropsias dos animais dos grupos I e II, foram feitas análises macroscópicas e colhidas amostras de tecido da mucosa oral e de órgãos internos como estômago, intestino, baço, rins, fígado. Nas ratas pertencentes aos grupos III e IV, após avaliação macroscópica foi coletado o trato reprodutivo e órgãos internos como rins, baço e fígado. Os órgãos colhidos para o exame histopatológico foram acondicionados em formol a 10%, sendo, posteriormente, incluídos em parafina e processados, utilizando-se coloração de HE (Hematoxilina-Eosina) e PAS (Ácido Periódico-Schiff), para posterior análise histológica. RESULTADOS E DISCUSSÃO A análise cromatográfica do óleo essencial utilizado no estudo demonstrou como principais componentes químicos os terpenos: 4-terpineol, γ-terpineno, α-terpineol timol e carvacrol (Tabela 1). Embora todos os órgãos de uma planta consigam acumular óleos voláteis, sua composição pode variar de acordo com a parte da planta analisada e com a espécie estudada 17. Fatores como tipo de solo, altitude, temperatura, período de insolação, cultivo, condições de secagem e estocagem entre outros, influenciam na composição, qualidade e quantidade de óleo es- Padrão Tempo retenção PM Área Concentração 1. α-tujeno 10, , Sabineno 12, , Mirceno 13, , α-phellandrene 14, α-terpineno 15, , p-cimeno 15, , Limoneno 15, , ,8-cineol 16, , cis-trans β cimene 16, , γ-terpineno 17, trans-sabinene-hidrate 18, , terpinolene 19, , cis-sabinene-hidrate 20, , Linalol 20, , trans p-menthenol 22, , cis-p-menthenol 23, , borneol 25, , terpineol 26, , α-terpineol 27, , trans-piperitol 27, , methyl-tymol-éter 30, , methyl-carvacrol-éter 30, , geraniol nerol 31, , Timol 34, , Carvacrol 35, geranil/neril acetato 40, β-caryophyllene 42, spathulenol 52, caryophyleno oxide 52, Tabela 1. Principais compostos e respectivas concentrações de terpenos encontrados no óleo essencial do O. vulgare analisado por cromatografia gasosa (CID/GSM). 706

4 Latin American Journal of Pharmacy - 27 (5) sencial presente nos vegetais 13,14,22,23. Em nosso estudo foram utilizadas as folhas e flores secas e desidratadas de O. vulgare, sendo que os resultados na análise cromatográfica foram condizentes aos dados da literatura, onde descrevem como componentes químicos majoritários os compostos ρ-cimeno, terpinoleno, γ-terpineno, α- terpineol, linalol, 4-terpineol, timol, carvacrol e germacreno-d e α-pineno, dentre outros 10,11,14,22. Durante o período de observação de 30 dias, nenhum dos animais experimentais (grupos I, II, III, IV) apresentou alterações clínicas, comportamentais, de deambulação ou morte, ao receberem o óleo essencial do O. vulgare a 3%, ou respectivos controles, não havendo diferenças estatísticas entre os grupos. Em relação a massa corporal, observou-se um ganho de peso semanal dos animais conforme o esperado para a espécie estudada (Tabela 2). A ausência de efeitos colaterais pelo o uso do Origanum vulgare foi demonstrada em outros estudos com animais domésticos 9,24,25. A adição de folhas secas da planta na dieta de suínos resultou em maior índice reprodutivo em leitoas, além de melhorar a atividade metabólica intestinal desses animais, e quando adicionou 1000 ppm do óleo essencial de O. vulgare na dieta, não foram observadas quaisquer alterações 24. Segundo os autores os efeitos positivos do vegetal na saúde e produção de suínos podem ser devido à ação antioxidante, antibacteriana e antiinflamatória 24, sendo que a propriedade anti-radical atribuída ao O. vulgare se deve a presença dos monofenóis, carvacrol e timol 11. Outros autores ao adicionar o óleo essencial do O. vulgare (300 mg/kg) á ração de aves poedeiras constataram uma diminuição na contaminação por hemoparasitas 25. Estudos da ação de compostos isolados são escassos, entretanto a avaliação de eugenol e carvacrol em ratos demonstrou que as substâncias não causaram efeitos colaterais ou tóxicos 9,16. Em relação a análise hematológica, o estudo demonstrou que o uso do óleo essencial na concentração de 3% por via tópica ou oral, assim como seus respectivos controles, não provocou alteração no hemograma, eritrograma (hematócrito, hemoglobina e contagem de hemácia) e leucograma (leucócitos, neutrófilos e linfócitos), resultando em níveis fisiológicos para a espécie estudada 26,27 (Tabela 3). O hemograma constitui o meio mais direto e prático de se estudar os elementos figurados do sangue periférico 26,27. Estes elementos celulares sofrem alterações no decurso de, praticamente, todas as enfermidades 27,28. Efetivamente, estas alterações são inespecíficas, comuns a um grande número de patologias, porém os achados hematológicos fornecem informações diagnósticas valiosas sobre o sistema hematológico e outros sistemas orgânicos, prognóstico, resposta ao tratamento e recuperação 28. A maioria dos distúrbios hematológicos podem ser identificados por anormalidades específicas desses resultados, sendo que na identificação de estados patológicos o sangue muitas vezes pode fornecer informações diagnósticas valiosas No estudo anatomopatológico dos órgãos e tecidos coletados durante a necrópsia, também não foram evidenciadas alterações macroscópicas ou morfológicas, assim como em relação ao estudo histopatológico das amostras coletadas dos animais experimentais, sem diferença entre os grupos. Segundo estudos os testes de toxicidade prolongada envolvem a avaliação patológica grosseira, nesta etapa deve-se pesar os órgãos vitais, que serve como índice útil da toxicidade 29. Os pesos dos órgãos estão listados na Tabela 4. Os resultados demonstraram que a administração deste quimiotipo de O. vulgare e dos controles, pelo período de 30 dias, na concentração e modelo animal utilizados, não causou alteração na massa dos órgãos analisados. Grupos Massa Inicial 2ª. 3ª. 4ª. Massa Final Experimentais (g) Pesagem Pesagem Pesagem (g) G I (n=10) 238,7 ± 7,99 245,2 ± 8,98 248,9 ± 8, ± 8,99 261,2 ± 8,24 G II (n=5) 237 ± 3, ± 5,83 248,2 ± 5, ± 5,79 260,4 ± 5,90 G III (n=10) 240,7 ± 4,67 245,9 ± 3,38 252,5 ± 5, ± 4,21 264,6 ± 4,19 G IV (n=5) 242,2 ± 6, ± 7, ± 7,51 257,8 ± 7,46 263,8 ± 6,68 Tabela 2. Média ± desvio padrão da massa corporal dos animais experimentais tratados com óleo essencial do Origanum vulgare a 3% por via oral, intravaginal e respectivos controles, aferidas semanalmente pelo período de cinco semanas. GI: O. vulgare via oral; G II: Suspensão 0,001% Tween 80 ; G III: O. vulgare intravaginal; G IV: Suspensão de Ágar 0,8%. 707

5 CLEFF M.B., MEINERZ A.R., SALLIS E.S., ANTUNES T.A., MATTEI A., RODRIGUES M.R., MEIRELES M.C.A. & MELLO J.R.B. Parâmetros avaliados G I G II G III G IV Basófilos (mm 3 ) Eosinófilos (mm 3 ) 29 ± 14, ± 46,8 0 Monócitos (mm 3 ) Linfócitos (mm 3 ) 3035 ± 95, ± ± ± 207,6 Bastonetes (mm 3 ) Segmentados (mm 3 ) 1636 ± ± 85, ± ± 212 Leucócitos Totais (mm 3 ) 4700 ± ± ± ± 110 Eritrócitos (x 10µL) 6,8 ± 0,68 7,2 ± 0,4 7,42 ± 0,92 7,23 ± 0,55 Hemoglobina (g/dl) 10,7 ± 0,97 11,3 ± 0,46 11 ± 0,65 11,6 ± 1,34 Hematócrito (%) 34 ± 3,27 36 ± 2,5 35 ± 4,63 37 ± 3 PPT (%) 7,4 ± 0,45 6,9 ± 0,5 6,6 ± 0,46 7,5 ± 0,65 Tabela 3. Valores médios ± desvio padrão referentes ao hemograma dos animais experimentais tratados com óleo essencial do Origanum vulgare a 3% por via oral, intravaginal e respectivos controles, aferidas ao final do experimento. G I: O. vulgare via oral; G II: Suspensão 0,001% Tween 80; G III: O. vulgare intravaginal; G IV: Suspensão de Ágar 0,8%. Órgão G I G II G III G IV Cérebro 2,07±0,19 2,0±0,14 1,95±0,24 2,05±0,07 Coração 1,02±0,12 1,10±0,14 1,05±0,13 1,15±0,21 Baço 0,87±0,17 0,90±0,14 0,84±0,15 0,86±0,04 Fígado 9,9±0,26 10,4±0,28 10,1±0,29 10,3±0,14 Pulmão 1,79±0,17 1,84±0,028 1,78±0,13 1,82±0,02 Rim 1,38±0,03 1,40±0,14 1,50±0,21 1,44±0,02 Tabela 4. Média ± desvio padrão da massa dos órgãos (g) dos animais experimentais tratados com óleo essencial do Origanum vulgare a 3% por via oral, intravaginal e respectivos controles, aferidas ao final do experimento. GI: O. vulgare via oral; G II: Suspensão 0,001% Tween 80 ; G III: O.vulgare intravaginal; G IV: Suspensão de Ágar 0,8%. Alguns autores têm descrito que o grau da toxicidade de um extrato depende de vários fatores, entre eles da dose utilizada e da freqüência de administração, em alguns casos baixas dosagens acarretam intoxicações devido a sensibilidade individual, provocando desde sensibilização, alergias, até problemas mais graves, principalmente quando utilizados por via oral 16,17. Os monoterpenos com diferentes grupos funcionais tais como, hidrocarbonetos, aldeídos e cetonas são inibidores in vitro das monoxigenases CYP2B1, e podem alterar a biotransformação de sustâncias tóxicas 11,30. Por outro lado, estudos clínicos têm demonstrado que Orégano spp apresenta alergenicidade, sendo recomendado evitar o consumo excessivo durante a gravidez devido a propriedades sedativas e abortivas 11. Estudo utilizando extrato aquoso a 20% de O. vulgare em fêmeas prenhes, evidenciaram pequeno atraso no desenvolvimento embrionário, porém o percentual de embriões anormais não foi significativo, o que foi atribuído ao efeito antimutagênico e antioxidante do extrato 31. O potencial anticarcinogênico parece ser devido a capacidade do óleo de O. vulgare induzir um incremento na atividade da enzima destoxificante glutation S-transferase (GST) quando administrado oralmente 32. Os efeitos adversos do uso de extratos vegetais, possível toxicidade, bem como a ação sinérgica ou antagônica com outros fármacos podem ocorrer comumente, devido a estes e outros fatores, a produção de fitoterápicos requer estudos prévios relativos a vários aspectos, dentre eles quanto ao seu efeito tóxico sobre organismos animais 17,18. Origanum vulgare demonstra ter aplicações benéficas na produção de alimentos e na saúde do homem, com custo relativamente baixo devido a uso de pequenas concentrações, sendo considerando um promissor agente antimicrobiano 10,24,25. CONCLUSÃO O óleo essencial do O. vulgare quando administrado à 3% por via oral e intra-vaginal em ratas Wistar pelo período de 30 dias, não causou efeitos tóxicos, levando em conta a ausência de alterações na massa de órgãos, da massa corporal e da ausência de alterações de hemograma. São necessários outros estudos utilizando outros óleos com diferentes proporções de terpenos, seus principais componentes químicos, além de um período maior administração aos animais experimentais, assim como avaliação da toxicidade reprodutiva. Agradecimentos. CAPES; CNPq; FAPERGS e PRO- PESC/UFRGS. 708

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